UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
VIKTÓRIA KÖVESDY RIBEIRO
ANÁLISE DAS RESERVAS DE SEMENTES DE
ESPÉCIES ARBÓREAS DA RESTINGA
DO MUNICÍPIO DE IPOJUCA - PE
Tese apresentada ao Instituto de Biologia para obtenção do Título de Mestre em Biologia Celular e Estrutural, na área de Biologia Celular.
Orientador: Prof. Dr. Angelo Luiz Cortelazzo
“A Fé é a certeza de coisas que se esperam (em relação às coisas futuras), a
convicção de fatos que se não vêem (em relação a realidades invisíveis).”
(Hebreus 11.1)
AGRADECIMENTOS
A Deus pelo amor incondicional e pelas bênçãos sem medida.
Ao meu querido marido Marcos Vinícius pelo incentivo, dedicação, amor e companheirismo. Aos meus pais pela educação primorosa.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Angelo Luiz Cortelazzo pela dedicada orientação para o enriquecimento deste trabalho, através de um relacionamento amigo, com o qual muito aprendi sobre o mundo da bioquímica e morfologia das sementes da restinga.
Aos Professores / Pesquisadores José Francisco, Heidi e Vilma, membros da pré banca, pelas valiosas sugestões.
À Profª Carmem Zickel da Universidade Federal de Pernambuco pela atenção e informações que enriqueceram o desenvolvimento do trabalho.
Ao aluno da Pós Graduação Carlos André pela troca de idéias e companheirismo no desenvolvimento das microfotografias.
À aluna da Graduação Lívia pela colaboração no desenvolvimento do trabalho.
Aos amigos Divina e José Francisco pela atenção nos momentos: alegres, de desafios e no enfrentamento de algumas dificuldades.
À minha irmã Andréa pelo apoio nas traduções e aulas de Inglês.
Aos colegas, Professores e funcionários do Programa de Pós Graduação de Biologia Celular e Estrutural, pelo apoio e colaboração.
ÍNDICE
Resumo ... 01 Abstract... 02 1. Introdução... 03 2. Objetivos... 11 3. Material e Métodos ... 12 3.1. Material Vegetal... 12 3.2. Coleta... 12 3.3. Fixação... 14 3.4. Processamento... 14 3.5. Colorações... 15 3.5.1. Azul de Toluidina... 15 3.5.2. Xylidine Ponceau (XP) ... 15 3.5.3. Método do PAS... 15 3.5.4. Floroglucinol acidificado... 15 3.5.5. Sudan black B ... 16 3.5.6. Lugol ... 163.6. Métodos bioquímicos de análise ... 16
3.6.1. Extração de lipídios, açúcares livres e aminoácidos... 16
3.6.2.Extração de proteínas ... 17
3.6.3. Extração de amido ... 17
3.6.4. Dosagem de lipídios... 17
3.6.5. Dosagens de açúcares... 17
3.6.6. Dosagem de proteínas totais e aminoácidos... 18
3.7. Análise estatística ... 18
4. Resultados e Discussão ... 19
4.1. Espécies com resultados citoquímicos e de dosagens ... 19
4.1.1. Coccoloba laevis Casar. (Polygonaceae). ... 19
4.1.2. Licania cf rigida Benth (Chrysobalanaceae) ... 26
4.1.4. Simaba cuneata A.St. – Hill.& Tul. (Simaroubaceae) ……...……….... 42
4.1.5. Análise comparada entre as quatro espécies ... 49
4.2. Espécies com resultados citoquímicos de análise ... 51
4.2.1. Manilkara salzmannii (A.DC.) H.J.Lam (Sapotaceae) ... 51
4.2.2. Maytenus impressa Reiss (Celasteraceae) ... 55
4.2.3. Ocotea gardneri (Meisn.) Mez. (Lauraceae) ... 58
4.2.4. Serjania sp (Sapindaceae) ... 61
4.3. Espécies processadas para a microscopia ... 63
4.3.1. Apocynaceae - Hancornia speciosa Gomes ... 63
4.3.2. Burseraceae - Protium heptaphyllum (Aubl.) Marchand... 63
4.3.3. Chrysobalanaceae - Couepia impressa Prance; Licania sp... 65
4.3.4. Clusiaceae - Vismia guianensis (Aubl.) Pers. ... 68
4.3.5. Elaeocarpaceae - Sloanea cf guianensis (Aubl.) Benth ... 71
4.3.6. Fabaceae - Andira fraxinifolia Benth... 71
4.3.7.Humiriaceae - Sacoglotis mattogrossensis var. mattogrossensis f. glabra Cuatrec. ... 75
4.3.8. Lecythidaceae - Escheweilera ovata (Cambess.) Miers... 75
4.3.9. Malpighiaceae - Byrsonima cf. coccolobifolia Humbolt……… 78
4.3.10. Mimosaceae - Abarema filamentosa (Benth.) Pittier; Inga flagelliformis (Vell.) Mart... 78
4.3.11.Myrtaceae - Eugenia punicifolia (Kunth) DC. ... 83
4.3.12. Ochnaceae - Ouratea fieldingiana (Gardner) Engl.(Ducke 1959)... 83
5. Considerações Finais ... 86
6. Referências Bibliográficas... 87
Resumo – As restingas da região nordeste são pouco estudadas em todos os seus aspectos. Assim, o presente trabalho teve como objetivo analisar sementes de espécies de grande ocorrência na restinga da Reserva Particular do Patrimônio Nacional (RPPN) de Nossa Senhora do Outeiro de Maracaípe em Ipojuca, no litoral pernambucano, dentro de uma perspectiva mais ampla de análise para contribuir com o conhecimento de sua estrutura e das potencialidades de utilização econômica junto à população local. Foram coletadas sementes de 22 espécies, que foram fixadas em solução de FAA 70 ou fixador de Karnovsky para processamento e análise microscópica. Destas, oito espécies foram incluídas em historesina Leica ou em parafina, seguindo-se corte em micrótomo com 5 a 8 µm de espessura, conforme o meio de inclusão: Coccoloba laevis Casar. (Polygonaceae),
Licania rigida (Chrysobalanaceae), Myrcia guianensis (Aulb.) DC. (Myrtaceae), Simaba cuneata A.St.-Hil. & Tul. (Simaroubaceae), Manilkara salzmannii (A.DC.) Lam
(Sapotaceae), Maytenus impressa Reiss. (Celastraceae), Ocotea gardneri (Meisn.) Meiz (Lauraceae) e Serjania sp (Sapindaceae). Os materiais foram corados por diversos métodos gerais e citoquímicos, visando a determinação de proteínas, polissacarídeos, lipídios, radicais aniônicos totais e compostos fenólicos. Para as quatro primeiras espécies citadas, foram dosadas as principais reservas presentes nas sementes. Os resultados citoquímicos foram confirmados pelas dosagens bioquímicas revelando que C. laevis é uma espécie onde predomina o amido, L. rígida tem maiores teores de proteínas e S. cuneata é oleaginosa. M
guianensis mostrou-se moderadamente rica em carboidratos e proteínas. Chamou a atenção
a incomum quantidade de açúcares livres presentes nas sementes, que variou de 10% em C.
laevis até 25% em L. rígida, podendo representar fator adaptativo interessante à falta de
água. Cristais de oxalato, presença de taninos e tegumento lignificado também foram características encontradas na maioria das espécies e também podem estar relacionadas à defesa e estratégias de dispersão das sementes. Os testes citoquímicos revelaram ainda que
O. gardneri e Serjania sp são ricas em amido e proteínas, enquanto que M. salzmannii
apresenta lipídios em quantidades apreciáveis. Finalmente, pôde ser notado que M.
impressa apresenta endosperma bem desenvolvido, possivelmente com hemiceluloses
como sua principal reserva; seus cotilédones apresentaram quantidades apreciáveis de proteínas. As demais espécies coletadas encontram-se processadas para inclusão e corte para futura análise e caracterização citoquímica.
Abstract –
Restinga of the northeast have been barely studied in all their aspects. Thus, this work was as objective analyzes seeds of arboreal species of great occurrence in the “Reserva Particular do Patrimônio Nacional (RPPN) de Nossa Senhora do Outeiro de Maracaípe” in Ipojuca, located at the sea coast of Pernambuco to contribute with the knowledge of structure and these economic potentialities. Twenty-two species of fruits were harvested and the seeds were fixed in FAA70 or Karnovsky solutions and processed for microscopic analysis. Of these, eight species were embedded in Leica Historesin or paraffin and sectioned (5-7µm thick): Coccoloba laevis Casar. (Polygonaceae), Licaniarigida (Chrysobalanaceae), Myrcia guianensis (Aulb.) DC. (Myrtaceae), Simaba cuneata
A.St.-Hil. & Tul. (Simaroubaceae), Manilkara salzmannii (A.DC.) Lam (Sapotaceae),
Maytenus impressa Reiss. (Celastraceae), Ocotea gardneri (Meisn.) Meiz (Lauraceae) and Serjania sp (Sapindaceae). After removing the paraffin and hydration, the materials were
stained using several cytochemical methods to detect anionic residues, proteins, polysaccharides, starch, lipids and lignin. The stained sections were examined by light microscopy, using polarized light in some cases. The first four mentioned species of seeds were submitted to extraction to detect their principal reserves. The cytochemical results were confirmed by biochemical dosage revealing that C. laevis is a species where the starch is predominant; L. rigida has got higher contents of proteins and S. cuneata is oleaginous.
M guianensis showed moderately rich in carbohydrates and proteins. Free and soluble
sugars presented an unusual quantity in the seeds, with variation from 10% in C. laevis up to 25% in L. rigida , showing an possible and interesting adaptative factor to lack of water. Oxalate crystals, presence of tannins and lignified teguments were also characteristics found in most of the species and can be related to the defense and strategies of dispersion of the seeds. The cytochemical analysis revealed that although O. gardneri and Serjania sp are rich in starch and proteins, M. salzmannii presents lipids in appreciable amounts. Finally, it could be found that M. impressa presents endosperm well developed, possibly with hemiceluloses as the principal reserve while their cotyledons presented appreciable amounts of proteins. The other harvested fruits and seeds were processed for embebition and cut for future analysis and cytochemical characterization.
1. Introdução
O termo restinga, nos mais variados conceitos, é empregado tanto para designar somente o tipo de vegetação que recobre as planícies, quanto para designar o sistema substrato-vegetação como um todo. Neste caso, o substrato sobre o qual desenvolvem-se os diferentes tipos vegetacionais é geralmente a planície costeira (Suguio & Tessler 1984). Para este trabalho adotamos a palavra restinga no sentido botânico que considera a “vegetação de restinga” o conjunto de comunidades vegetais fisionomicamente distintas, sob influência marinha e flúvio-marinha, distribuídas em mosaico e que ocorrem em áreas com grande diversidade ecológica (Sugiyama 1998).
A restinga ocorre desde as dunas até as planícies costeiras, cujas fisionomias variam do herbáceo reptante praiano a floresta fechada (Oliveira-Filho & Carvalho 1993). Veloso (1992) reconheceu para as áreas litorâneas os tipos de vegetação fanerogâmica arbóreo, arbustivo e herbáceo, procurando contemplar as principais variações fisionômicas observadas desde a praia até os pontos mais interiores da planície costeira.
Segundo Decreto Federal 750/93 a Restinga é considerada como um dos ecossistemas associados da Floresta Atlântica, sendo constituída por sedimentos eminentemente arenosos, enquadrados como areias quartzosas marinhas (Pereira & Araújo 2002)
O litoral brasileiro, está compreendido entre os paralelos 04o52’35” lat. N e
33o45’ lat. S, se estendendo do rio Oiapoque no estado do Amapá até o Arroio Chuí no estado do Rio Grande do Sul (Araújo & Lacerda 1992), possuindo uma linha costeira, cuja extensão de mais de 9.000 km, caracteriza-se por apresentar poucas reentrâncias, sendo portanto, relativamente reduzida em vista da grande extensão do continente (Suguio & Tessler 1984). As restingas e dunas de areia cobrem cerca de 5.000 km do litoral brasileiro (Araújo & Lacerda 1992). As zonas litorâneas compreendem os ecossistemas formados pelas faixas de praias, cordões litorâneos, dunas, antedunas, planícies litorâneas, planícies fluvio-marinhas, planícies de mares, pântanos salgados, estuário, zonas deltáticas e regiões de plataforma continental interna (Moraes 1996).
A zona costeira do Brasil possui uma grande diversidade de ecossistemas e, entre estes, cerca de 79% era formado por formações de restinga (Lacerda et al. 1993). Entretanto, a especulação imobiliária, a poluição, o extrativismo e a agricultura foram os principais fatores responsáveis pela grande destruição desses ambientes. Estes impactos antrópicos têm levado diversas comunidades a se extinguir em muitos pontos da costa, apesar destes estarem protegidos pela legislação federal e estadual (Araújo & Henriques 1984).
Fora da região Nordeste, as restingas têm sido descritas florística, fitossociológica e fisionomicamente sendo classificadas quanto ao agrupamento e/ou formações de blocos ou moitas (Araújo & Henriques 1984, Araújo 2000, Pereira & Araújo 2000, Zaluar & Scarano 2000). No Nordeste, porém, não há um padrão vegetacional descrito e analisado como existe para as restingas das regiões Sul e Sudeste, gerando dificuldade quanto à caracterização fisionômica das áreas de restinga da região (Zickel et
al. 2004).
A necessidade de estudos sobre o ecossistema de restinga em Pernambuco é de suma importância para o conhecimento e conservação das poucas áreas remanescentes (Andrade-Lima 1979). Com isso, faz-se necessário, um melhor conhecimento das espécies pertencentes a esse ecossistema e como tais espécies se comportam do ponto de vista reprodutivo, o qual inclui estudos fenológicos (Morellato et al. 2000). Nesse contexto, a descrição de frutos e sementes pode formar um banco de dados mais completo que possibilite recuperar áreas já totalmente degradadas ou, pelo menos, documentar as espécies e formas de propagação existentes para uma futura recuperação.
O presente trabalho se insere num estudo mais amplo, que está sendo desenvolvido na Reserva Particular do Patrimônio Natural Nossa Senhora do Outeiro de Maracaípe, localizada no litoral Sul de Pernambuco, no Distrito de Nossa Senhora do Ó, município de Ipojuca, entre as coordenadas 08031’48’’ S e 35001’05’’ W e ocupa uma área
de 130ha, sendo 76,2ha de vegetação de restinga. Apresenta, segundo a classificação de Koeppen, clima do tipo As', tropical chuvoso, com verão seco e menos de 60 mm de chuva no mês mais seco e precipitação pluviométrica anual aproximada de 2533mm (Fonte Inmet 2005).
Almeida (2006) caracteriza a restinga de Maracaípe em três formações fisionômicas: a floresta fechada não inundável, o campo não inundável e o campo inundável. A proporção das formas de vida é determinante para a separação dessas fisionomias sendo as que mais se destacam são: as fanerófitas com 45,85%, terófitas 13,81% e caméfitas com 12,07%. Entre as fanerófitas 44,18% (38 ssp) são de indivíduos arbóreos e essa quantidade de indivíduos possui melhor representação na fisionomia floresta fechada não inundável (figura 1). O campo não inundável apresenta maior número de espécies caméfitas (95%), terófitas (73%) e criptófitas (70%), confirmando a separação ou divisão das fisionomias. No campo que permanece inundado (no período chuvoso devido ao afloramento do lençol freático) também há plantas herbáceas (caméfitas 25%, terófitas 23% e criptófitas 23%), porém em menor proporção (Almeida 2006).
Quanto ao estado de Pernambuco, apresenta um litoral com 187 km de extensão, o qual engloba uma multiplicidade de ecossistemas extremamente produtivos, onde podem ser encontrados, além das praias arenosas de largura variável, estuários com extensos manguezais, pontais rochosos, recifes de corais, coroas, ilhas e restingas, entre outros (CPRH 1997).
As restingas encontradas no litoral pernambucano possuem cobertura vegetal predominantemente herbácea e esparsa, apresentando-se por vezes arbustiva e/ou arbórea densa, quando em direção ao continente, e com características semelhantes à Floresta Atlântica, com a qual conflui. Corroborando com a idéia de Rizzini (1979) o qual propôs, que a flora da restinga teve sua origem na flora da Floresta Atlântica e que um melhor conhecimento da distribuição das espécies tidas como endêmicas pode revelar que algumas destas também são de origem florestal. Para o autor, quase não existem espécies próprias da flora das restingas, devido a sua origem tão recente. Freire (1990) e Araújo & Lacerda (1992) consideram as restingas como áreas de extensão de espécies vegetais encontradas nos diferentes ecossistemas, desde a Floresta Atlântica à Amazônica. Estas características ocorrem em razão da diversidade das condições físicas que elas apresentam.
Algumas das mais belas paisagens do litoral brasileiro estão nas restingas, que podem apresentar longas faixas de areia que formam baías e lagoas e agregam ecossistemas especiais (Menezes et al. 1998). Entretanto, por conta da ocupação humana em áreas litorâneas, muitas estão parcial ou totalmente descaracterizadas. Este é o caso do estado de
Pernambuco, que possui poucas áreas remanescentes de restinga e a maior parte encontra-se completamente descaracterizada das paisagens naturais devido a intensa ação antrópica, seja pelas monoculturas da cana-de-açúcar e do coco, que ocupam de forma extensiva grande parte dessas áreas, seja pela intensificação dos processos de ocupação da zona costeira, além do turismo predatório e da especulação imobiliária, que foram consideravelmente ampliados com a abertura de estradas de acesso ao litoral (CPRH 1997, 2002).
Embora a maioria dos trabalhos abordando a flora das restingas brasileiras faça referência às regiões Norte, Sul e Sudeste, estes estudos contribuem consideravelmente para uma melhor caracterização e entendimento das restingas da região Nordeste, como também na determinação das semelhanças e diferenças entre as floras. Apesar dos vários trabalhos que vêm sendo desenvolvidos gradativamente, os dados florísticos para as restingas nordestinas ainda são uma lacuna a ser preenchida (Almeida Jr. 2006).
Os trabalhos de cunho florístico para as restingas pernambucanas tiveram basicamente duas fases. A primeira teve como precursor os trabalhos de Andrade-Lima (1951; 1953) para a flora da praia de Boa Viagem, resultando em um levantamento florístico de 39 espécies e para o Cabo de Santo Agostinho, registrando a ocorrência de 55 espécies, ambos para o litoral sul de Pernambuco.
A segunda fase é marcada por trabalhos que enfocaram não só a composição florística, como também estudos relacionados com a palinologia, fisionomia e estrutura das restingas. Esta fase teve início no final da década de 70 e os estudos desenvolvidos foram ampliados, não só para o litoral sul, como também para o litoral norte, o qual ainda não havia sido estudado (Andrade-Lima 1979).
Mais recentemente, Sacramento (1996) realizou estudo florístico através de um gradiente nas cristas arenosas até a vegetação arbustivo-arbórea da restinga do Lance dos Cações, na praia do Sossego, Ilha de Itamaracá, Pernambuco. O levantamento florístico resultou em 46 famílias e 83 espécies, sendo 38 espécies identificadas apenas genericamente. As famílias que mais se destacaram foram: Fabaceae (9), Rubiaceae (6), Asteraceae (5) e Cactaceae (4).
fisionômicos: floresta não inundável e fruticeto não inundável. Obtendo-se uma listagem com 54 famílias, 95 gêneros, 115 espécies.
Finalmente, Cantarelli (2003) estudou a flora vascular e caracterizou a fisionomia de uma restinga de Área de Proteção Ambiental de Guadalupe, Sirinhaém. Este levantamento resultou em uma lista florística com 121 espécies, 96 gêneros e 56 famílias. Para esta área mostrou três tipos vegetacionais distintos: o fruticeto inundável, o fruticeto não inundável e o campo não inundável. As famílias que apresentaram um maior número de espécies foram: Myrtaceae (10), Cyperaceae (7), Fabaceae (6), Euphorbiaceae (6), Rubiaceae (6), Malpighiaceae (5).
Além desses estudos, um trabalho mais recente de Almeida Jr. (2006) foi feito com as restingas do litoral pernambucano, caracterizando a vegetação de Restinga de Maracaípe, Pernambuco, com base na fisionomia, flora e fatores abióticos. De acordo com o levantamento florístico foram amostradas 187 espécies, distribuídas em 148 gêneros e 71 famílias. As famílias mais representativas em número de espécie foram Poaceae (13spp), Cyperaceae e Myrtaceae (12spp), Orchidaceae e Rubiaceae (9spp), Bromeliaceae e Fabaceae (7spp), Mimosaceae e Caesalpiniaceae (6spp), Euphorbiaceae (5spp), Annonaceae e Chrysobalanaceae (4spp).
Myrcia sp e Coccolaba sp estão dentro do grupo de gêneros com maior número
de espécies, com 4 e 3 representantes respectivamente. Dentre as espécies com maior número de indivíduos em toda a área estão Myrcia bergiana e Coccolaba laevis (Almeida Jr. 2006).
As famílias citadas anteriormente também são representativas para outras restingas do Nordeste (Esteves 1980, Pinto et al. 1984, Oliveira-Filho & Carvalho 1993, Freire & Monteiro 1993, Matias & Nunes 2001, Almeida Jr. 2003). Na região Sul, as famílias mais representativas foram Apiaceae, Salicaceae, Convolvulaceae, Myrtaceae, Asteraceae e Fabaceae (Dorneles & Waechter 2004, Souza et al. 1991; 1992). Essa diversidade de habitats favorece a variação de famílias encontradas, propiciando uma flora rica e variada (Araújo & Henriques 1984).
Em Maracaípe (Almeida Jr. 2006) foi constatado um número significativo de gêneros, fato também encontrado por Sacramento (2000), Cantarelli (2003) e Lira (2004). A elevada proporção de gêneros em relação ao número de espécies é um indicativo de
riqueza, já que muitos gêneros possuem apenas uma espécie, colonizando diferentes habitats, reforçando assim a idéia de riqueza e diversidade elevadas (Leitão-Filho 1994).
A restinga de Maracaípe contribuiu com um grande número de espécies para as áreas litorâneas do estado de Pernambuco (Almeida Jr. 2006) e as famílias foram similares às encontradas nos estudos realizados no Cabo de Santo Agostinho (Andrade-Lima 1953), Janga-Maranguape (Andrade-Lima 1979), Praia do Paiva (Sacramento 2000), Sirinhaém (Cantarelli 2003) e Ariquindá (Lira 2004). Tiveram destaque as famílias Myrtaceae, Cyperaceae, Poaceae, Fabaceae, Caesalpiniaceae, Rubiaceae, Euphorbiaceae e Orchidaceae que apresentaram variações específicas entre as áreas, porém mostraram-se importantes quanto à riqueza nessas restingas.
Na literatura, não há trabalho científico que vise à caracterização e análise bioquímica das sementes de restinga e, portanto, tais estudos se fazem necessários para contribuir com o conhecimento que vem sendo acumulado para esse tipo de vegetação. Além disso, tais trabalhos poderão contribuir para um potencial aproveitamento econômico de algumas espécies, impedindo a sua exploração de forma predatória, ou sua remoção para a colocação de espécies mais utilizadas pelo ser humano, além da conscientização educacional na preservação dessas áreas que são exploradas sem controle.
A maioria dos estudos para a caracterização das reservas em sementes são feitos em espécies cultivadas, especialmente de cereais e legumes, que são as mais importantes fontes de alimento utilizadas pelo homem, apresentando como principais substâncias de reserva: proteínas, carboidratos e lipídios (Mayer & Poljakoff-Mayber 1989). A proporção dessa composição pode variar de espécie para espécie e até entre espécies de uma mesma família.
Os carboidratos podem ser armazenados na forma de amido, em organelas chamadas amiloplastos. Bewley & Black (1982) descrevem a molécula de amido, composta de dois polímeros de D-α-glicose: a amilose e a amilopectina. A proporção dos dois polímeros varia entre sementes de diferentes espécies e pode variar mesmo dentro da mesma espécie. A amilose é um polímero linear formado por ligações glicosídicas α (1→4) e apresenta um peso molecular em torno de 60.000 Daltons, sendo considerada o menor dos dois componentes. A amilopectina é um polímero ramificado, composto também de
pontos de ramificação sendo que nesses locais, as unidades de glicose são do tipo α (1→6). É considerada uma grande molécula, com peso em torno de 1 bilhão de Daltons (Annison & Topping 1994). As propriedades funcionais do amido são decorrentes desses dois componentes e na sua organização granular.
Em leguminosas, o amido é uma forma de reserva bastante comum, normalmente depositada nas células dos cotilédones, podendo atingir mais de 50% da massa seca, como em Pisum e Vicia faba (Halmer 1985). Seno et al. (1996), caracterizaram o material de reserva de sementes de três espécies de leguminosas e confirmaram a predominância de amido como reserva principal, seguido de proteínas em todas elas.
Em certas sementes, porém, a maior quantidade de carboidratos de reserva não é formada por amido, mas por outros polissacarídeos como mananos, galactanos e xiloglicanos. Os mananos são encontrados normalmente no endosperma de algumas espécies de Palmae, Umbiliferae e Leguminosae (Buckeridge & Dietrich 1990); galactomananos ocorrem em cotilédones, sendo muito abundantes no gênero Lupinus (Crawshaw & Reid 1984), enquanto que os xiloglicanos aparecem em grandes quantidades em cotilédones de sementes de leguminosas da sub-família Caesalpinoideae (Meier & Reid 1982, Reis et al. 1987, Buckeridge et al. 1992, Tiné et al. 2000).
As proteínas de reserva normalmente se encontram em organelas denominadas corpos protéicos e são classificadas em função da sua solubilidade. A sua principal função é a de fornecer aminoácidos ou nitrogênio para as plântulas (Pernollet & Mossé 1983). Albuminas, Globulinas, Glutelinas e Prolaminas são as classes de proteínas de reserva presentes nas diferentes sementes analisadas (Bewley & Black 1982).
Os lipídios constituem o terceiro composto de reserva encontrado em sementes, como as de Arachis, Helianthus e Glycine. Eles são normalmente presentes na forma de triglicerídeos ou lipídios neutros que constituem a maior parte das reservas da semente. Outros tipos de lipídios, que podem ter função estrutural ou metabólica nas membranas celulares, seriam os fosfolipídios, os glicolipídios e os esteróides (Bewley & Black 1982; Slabas et al. 1988; Mayer & Poljakoff-Mayber 1989, Silva et al. 1998).
A utilização de técnicas citoquímicas de análise para a determinação das reservas em sementes vem se mostrando adequada, pois possibilita uma determinação precisa de compostos macromoleculares nas sementes, nos diferentes tecidos da mesma e,
via de regra, com amplas possibilidades de quantificação in situ ou in vitro (Cortelazzo & Vidal 1991, Cortelazzo 1992, Cortelazzo et al. 2005)
A morfologia de sementes nativas ainda é pouco estudada, tornando restritos os conhecimentos sobre as mesmas, tendo em vista que uma maior preocupação está voltada para as espécies de interesse econômico, principalmente alimentar. Assim sendo, este estudo poderá contribuir para o estabelecimento quantitativo e qualitativo das principais reservas presentes em sementes de plantas de larga ocorrência no local, além de subsidiar futuros estudos sobre germinação e manejo das mesmas.
Além disso, os dados que serão obtidos com este estudo servirão de subsídio para pesquisas ecofisiológicas do local que, atualmente é uma Reserva Particular do Patrimônio Natural (RPPN) por ser considerada de relevante importância pela sua biodiversidade, ou pelo seu aspecto paisagístico, ou ainda por suas características ambientais que justificam ações de recuperação (CPRH 2002).
2. Objetivos
Geral:
• Contribuir para o conhecimento de espécies nativas de restingas, a partir da análise das sementes nelas encontradas.
Específicos:
• Caracterizar sementes de frutos do maior número possível de espécies visando estudos e levantamentos futuros e mantendo banco de materiais para processamento e análise microscópicos.
• Caracterizar, a partir de diferentes métodos citoquímicos, o conteúdo de reserva das sementes de oito espécies da restinga de Ipojuca – PE.
• Extrair e dosar os principais componentes de reserva das sementes de quatro espécies consideradas mais abundantes na restinga de Ipojuca - PE.
3. Material e Métodos
3.1. Material vegetal
Foram utilizadas sementes coletadas em Pernambuco e identificadas por Zickel, C.S. e colaboradores, da Universidade Federal Rural de Pernambuco.
A análise das sementes foi realizada no Laboratório de Biologia Celular Vegetal do Departamento de Biologia Celular – IB – UNICAMP.
3.2. Coleta
A coleta das sementes foi realizada na Reserva Particular do Patrimônio Natural Nossa Senhora do Outeiro de Maracaípe, município de Ipojuca, localizado na litoral sul de Pernambuco no Distrito de Nossa Senhora do Outeiro, no mês de fevereiro de 2005 (Fig. 1 e 2). Os frutos foram coletados, quando maduros, diretamente da árvore, seguindo-se registro fotográfico, limpeza e retirada das sementes. O material foi trazido para Campinas e guardado em geladeira.
Foram coletadas sementes de diferentes espécies, classificadas e identificadas conforme se segue: 1. Abarema filamentosa (Benth.) Pittier (Mimosaceae); 2. Andira
fraxinifolia Benth, (Fabaceae); 3. Byrsonima cf. coccolobifolia Humbolt, Bonplan e Kunth
(Malpighiaceae); 4. Coccaloba laevis Casar. (Polygonaceae); 5. Couepia impressa Prance (Chrysobalanaceae); 6. Escheweilera ovata (Cambess.) Miers (Lecythidaceae); 7. Eugenia
punicifolia (Kunth) DC. (Myrtaceae); 8. Hancornia speciosa Gomes (Apocynaceae); 9. Ingaflagelliformis (Vell.) Mart. (Mimosaceae); 10. Licania cf rígida Benth
(Chrysobalanaceae); 11. Licania sp (Chrysobalanaceae); 12. Manilkara salzmannii (A.DC.) H.J. Lam (Sapotaceae); 13. Maytenus impressa Reiss (Celastraceae); 14. Myrcia guianensis (Aubl.) DC. (Myrtaceae); 15. Ocotea gardneri (Meisn.) Mez. (Lauraceae);
1
2
Figuras 1 e 2. Aspecto geral da Reserva Particular do Patrimônio Natural Nossa Senhora do Outeiro de Maracaípe, município de Ipojuca – PE.
16. Ouratea fieldingiana (Gardner) Engl. (Ochnaceae); 17. Protium heptaphyllum (Aubl.) Marchand (Burseraceae); 18. Saccoglotis mattogrossensis f. glabra Cuatrec (Humiriaceae); 19. Serjania sp (Sapindaceae); 20. Simaba cuneata A. St. –Hil.&Tul. (Simaroubaceae); 21.
Sloanea cf guianensis (Aubl.) Benth. (Elaeocarpaceae); e 22. Vismia guianensis (Aubl.)
(Clusiaceae).
3.3. Fixação
Os diferentes materiais coletados foram submetidos à fixação em solução de FAA70, contendo formol 5% e ácido acético glacial 5% em etanol 70 GL 90% (Krauss, 1997), ou solução de Karnovsky (1965), contendo paraformaldeído a 4% e glutaraldeído a 2,5% em tampão fosfato 0,1 M pH 7. A fixação se deu a 5oC durante 48h, seguindo-se lavagem do material e estocagem em etanol 70%.
Os materiais foram processados para a microscopia conforme descrito abaixo, submetendo-se aos procedimentos de fixação e emblocamento para cortes histológicos. Os materiais das espécies citadas com os números 4, 10, 12, 13, 14, 15, 19, e 20 foram submetidos aos cortes e colorações conforme se segue. Os demais, estão estocados para posterior análise e processamento.
3.4. Processamento
Após a fixação e estocagem em etanol, os materiais foram subdivididos em dois lotes:
O primeiro, foi desidratado em bateria de etanol com concentrações de 70 a 100%, diafanizado em xilol e incluído em parafina a partir de três banhos a 60oC. Após o emblocamento dos materiais, eles foram cortados em micrótomo rotativo R.Jung Heidelberg com 8 µm de espessura e desparafinizados.
O segundo, foi desidratado em bateria de etanol com concentrações crescentes, de 70 a 95%, seguindo-se banho em mistura de etanol 95% e historesina Leica®, dois banhos de historesina pura e inclusão durante 240 horas (10 dias) a 48oC. Os materiais
3.5. Colorações
3.5.1. Azul de Toluidina (AT)
Para a visualização dos radicais aniônicos totais in situ foi utilizado azul de toluidina 0,025% em tampão McIlvaine (ácido cítrico e fosfato dibásico sódico) a pH 4,0. Em alguns casos, salientados no texto, foi utilizado o corante em pH 2,5. Os materiais foram corados durante 15 min e rapidamente lavados em água destilada, secados e montados em entelan (Vidal 1977).
3.5.2. Xylidine Ponceau (XP)
A detecção de radicais catiônicos totais in situ foi feita através da coloração dos cortes pelo xylidine ponceau a 0,01% em ácido acético a 3%, pH 2,5 durante 15 min, seguindo-se um banho em ácido acético a 3% por 30 min e uma rápida desidratação em etanol 95 e 100% (Cortelazzo & Vidal 1991). A diafanização foi feita em xilol e a montagem em entelan.
3.5.3. Método de PAS
Para serem evidenciados polissacarídeos, os materiais foram oxidados em ácido periódico 0,5% durante 9 min. Em seguida os cortes foram lavados em água destilada, secados ao ar e colocados em Reativo de Schiff durante 20 min, no escuro. Após a coloração, os materiais foram submetidos a 3 banhos consecutivos de 3 min cada em água sulfurosa (18 partes de água destilada, 1 parte de HCl e 1 parte de metabissulfito de sódio 10%) seguidos de uma rápida desidratação em etanol 95 e 100% e montagem em entelan (Cortelazzo 1992).
3.5.4. Floroglucinol acidificado
Com o objetivo de identificar a lignina, os cortes foram tratados com uma solução de cloreto de cálcio a 20%, floroglucinol 1% e ácido clorídrico 16%. A solução recém preparada, filtrada em lã-de-vidro, foi gotejada sobre os cortes, que rapidamente foram
cobertos com lamínula. O excesso de solução corante foi removido com o auxílio de papel de filtro e as lamínulas vedadas com esmalte (Herr 1992).
3.5.5. Sudan black B
Os materiais foram tratados com solução 1% de Sudan black B em álcool 70% durante 30 min, seguindo-se lavagem rápida em etanol a 70% e montagem em glicerina, com as lamínulas vedadas com esmalte (Silva et al. 1998).
3.5.6. Lugol
Os materiais foram tratados com solução 1,5% de Iodeto de potássio e 3,5% de Iodo para a detecção de amido, imediatamente recobertos com lamínula e posterior vedação com esmalte (Krauss 1997)
3.6. Métodos bioquímicos de análise
As extrações foram feitas a partir de 2g de sementes moídas e homogeneizadas diretamente em 30 mL da solução de extração (Metanol/Clorofórmio/Água, 12:5:3 v/v/v).
3.6.1. Extração de lipídios, açúcares livres e aminoácidos
A cada repetição, foram adicionados 30 mL de uma mistura de metanol, clorofórmio e água – MCW – (12:5:3 v/v/v), para extrair lipídios, açúcares livres, aminoácidos e outras micromoléculas. Após a homogeneização com Polytron, procedeu-se a centrifugação por 15 min a 3.000 rpm, em centrífuga de mesa Excelsa 3. Foram realizadas centrifugações até obtenção de um sobrenadante límpido (mínimo de três vezes para cada tipo de semente).
Após cada centrifugação os precipitados foram ressuspendidos em 20 ml de MCW. Os sobrenadantes tiveram os seus volumes medidos e registrados e foram colocados em funil de separação por 48 h. Para cada quatro volumes de sobrenadante acrescentou-se
coletada e reservada para a dosagem de lipídios, conforme descrito no item 3.6.4. A fração superior foi recuperada e utilizada para as dosagens de açúcares livres conforme descrito no item 3.6.5 e de aminoácidos, conforme item 3.6.6.
3.6.2.Extração de proteínas
O precipitado (fração insolúvel), restante da extração com MCW, foi ressuspendido em 20 mL de NaOH 0,1 N, com o objetivo de extrair proteínas totais. Após as centrifugações nas mesmas condições descritas anteriormente, os sobrenadantes foram mantidos a 4ºC para posterior dosagem, conforme descrito em 3.6.6.
3.6.3. Extração de amido
Ao precipitado obtido após a centrifugação com NaOH 0,1N para cada uma das espécies analisadas, foram adicionados 10 ml de ácido perclórico 30% (PCA), segundo método de McCready et al. (1950). Esse conteúdo foi deixado durante 12h a 3ºC e, em seguida, submetido a duas centrifugações de 15 min cada, à 5000 rpm. O volume do sobrenadante foi medido e armazenado em geladeira para posterior dosagem, conforme descrito em 3.6.5.
3.6.4. Dosagens de lipídios
O material recolhido na fração inferior após extração com MCW foi evaporado em dessecador à vácuo e o resíduo foi pesado em balança analítica para a determinação gravimétrica de lipídios (Leung et al. 1981).
3.6.5. Dosagem de açúcares
As dosagens de açúcares foram realizadas utilizando-se o reagente de Antrona, obtido a partir de 200 mg de antrona e 100 ml de ácido sulfúrico a 95% (McCready et al. 1950). Alíquotas de 1mL de cada extrato foram acrescidas de 2 mL do reagente em tubos de ensaio, agitados vigorosamente, mantidas a 100ºC por 5 min e resfriadas em água, segundo Scott & Melvin (1953).
As leituras de todas as amostras foram feitas em espectrofotômetro, a 620 nm. Quando necessário, foi utilizada água destilada para as diluições. Os cálculos para as dosagens foram feitos a partir da reta padrão obtida de soluções com 10, 30, 50 e 70 µg de glicose/ml. Para o cálculo da quantidade de amido, os valores obtidos foram multiplicados pelo fator 0,9 (McCready et al. 1950).
3.6.6. Dosagem de proteínas totais e de aminoácidos
As dosagens do material protéico foram realizadas segundo o método do Coomassie Blue (Bradford 1976). A solução de dosagem foi preparada com 10 mg de Coomassie Brilliant Blue G – 250 (Sigma B–1131) em 5 ml de etanol 95%. A essa mistura, foram acrescentados 10 ml de ácido ortofosfórico a 85%, completando-se o volume com água destilada para 100 ml.
Os cálculos para as dosagens foram feitos utilizando-se a reta padrão obtida a partir de soluções com 10, 30, 50 e 100 µg/ml de soro albumina bovina (BSA) ou de glicina, para proteínas e aminoácidos, respectivamente. As alíquotas obedeceram a distribuição de 100 µL da amostra e 1000 µL de solução corante nos tubos que, após agitação e 10 min de repouso, foram lidos a 595 nm em espectrofotômetro.
3.7. Análise estatística
Os resultados obtidos foram analisados estatisticamente segundo o teste F, calculando-se a diferença mínima significativa (DMS) a 5% pela tabela Tukey (Snedecor 1962). As leituras obtidas foram relacionadas com as leituras dos seus respectivos padrões pelo cálculo de correlação e regressão.
4. Resultados e Discussão
4.1. Espécies com resultados citoquímicos e de dosagens bioquímicas
Os resultados das análises citológicas e dosagens bioquímicas serão apresentados por espécie, facilitando assim a sua caracterização geral. Tais análises e dosagens foram realizadas em quatro espécies de grande ocorrência e assim, representativas da Restinga de Ipojuca.
4.1.1. Coccoloba laevis Casar. (Polygonaceae)
Coccoloba é o gênero com maior número de espécies dentro da família
Polygonaceae. Seus ramos são subdicotômicos; com folhas coriáceas, largamente ovadas a ovada-arredondada, subcordado, de margem subrevoluta, glabras em ambas as faces e apresentado brilho; suas nervuras são pouco delgadas e, freqüentemente, pouco evidentes.
C. laevis é uma espécie arbustiva que apresenta distribuição ampla e pode ser
encontrada em dunas e regiões litorâneas em geral no Brasil e América Central (Howard 1992; Brito et al. 1993). Suas folhas e frutos têm sido estudados em diferentes regiões e têm uso na medicina popular, principalmente devido à sua atividade anti-bacteriana (Facey
et al 1999). Seus frutos são dispersos por macacos (Yumoto et al. 1999) e atingem cerca de
2 cm de diâmetro, apresentando coloração preta quando maduros. Suas sementes, com cerca de 0,5 cm de diâmetro são únicas por fruto (Fig. 3A-E).
Os resultados dos cortes obtidos para C. laevis após a coloração pelo Azul de toluidina a pH 4,0 podem ser visualizados na Fig. 4 (A-C). Nota-se praticamente apenas as paredes celulares se coraram pelo Azul de Toluidina (Fig.4A). A casca da semente, entretanto, apresenta material rico em compostos fenólicos, possivelmente decorrente da lignificação das paredes celulares, o que confere proteção mecânica às sementes da espécie (Fig. 4B). Nas regiões que apresentam vascularização, as células adjacentes a estes vasos tornam-se mais alongadas e se coram mais intensamente pelo AT. No sistema vascular,
percebe-se a coloração dos elementos de xilema com coloração esverdeada, em função da deposição de lignina nas paredes dessas células (Fig. 4C).
Há muitos grânulos não corados no interior das células sugerindo ser o amido a principal reserva dessas sementes (Fig. 4A-C).
O material de reserva das sementes corou-se intensamente após a submissão ao método do PAS (Fig. 4 D) e a natureza desse polissacarídeo foi comprovada através de análise do material, corado pelo Azul de Toluidina pH 2,5, com luz plano polarizada, com analisador e polarizador do microscópio cruzados, revelando a estrutura cristalina típica do amido, com formato em cruz-de-malta (Fig. 4E). Além disso, houve forte coloração quando os cortes foram submetidos à coloração pelo Lugol, confirmando tratar-se de polissacarídeo formado por ligações do tipo alfa, que permitem a entrada do Iodo em sua estrutura helicoidal (Fig. 4F-G). Além disso, pôde ser observado que próximo aos vasos os grãos de amido são de menor tamanho, sugerindo estágio metabólico diferenciado e já preparado para a mobilização dessas reservas em direção ao eixo hipocótilo-radicular. Resultados semelhantes foram obtidos em sementes de soja em seu estado quiescente (Cortelazzo & Vidal 1989).
As proteínas são a segunda fonte de reserva dessas sementes e estão dispersas pelo citoplasma das células (Fig. 5A-B), sem a formação de corpos protéicos isolados como é comum ser observado em leguminosas (Cortelazzo & Vidal 1991; Silva et al. 1997). Nas proximidades da epiderme dos cotilédones pôde ser observada uma maior intensidade na coloração, com um maior conteúdo de material protéico nesses locais (Fig. 5A)
Conforme esperado, praticamente não houve coloração das células quando submetidas ao corante Sudan black B para lipídios, reserva menos expressiva nessas sementes (Fig. 5C).
Os cortes contendo células da região paliçádica das sementes revelaram uma intensa birrefringência nesses locais (Fig. 5D), além de uma reação positiva ao método do floroglucinol ácido, indicando tratar-se de material lignificado (Fig. 5E). Tal lignificação tem sido observada em inúmeras outras sementes e têm sido responsável, em muitos casos, pela dormência das mesmas devido à sua impermeabilidade à água (Amaral et al. 1995)
Os resultados referentes às dosagens são apresentados na Tabela 1. Pode-se observar uma expressiva quantidade do amido presente nas sementes, confirmando assim os dados citoquímicos.
C
A B
D E
Figura 3: Aspectos do material herborizado e do fruto núcula e semente de Coccoloba laevis. A-B. Material herborizado, detalhando aspecto da inflorescência. C. Fruto maduro, mostrando a coloração preta e tamanho pouco superior a 1 cm. D. Detalhe do fruto maduro. E. Sementes, com coloração castanha e cerca de 0,5 cm de diâmetro. Barra = 1 cm
A B E C D E G F
Figura 4. Cortes de sementes de Coccoloba laevis analisados em microscopia de luz. A-C. Cortes corados pelo Azul de Toluidina a pH 4. Nota-se praticamente apenas as paredes celulares coradas. A. Detalhe do centro do endosperma. B. Região da periferia do endosperma, mostrando o tegumento, fortemente corado em verde. C. Região de vasos, mais intensamente corados, mostrando xilema com coloração levemente esverdeada (seta). D. Coloração pelo PAS, mostrando células com conteúdo intensamente corado. E. Coloração pelo Azul de Toluidina a pH 4, visualização na microscopia de polarização, salientando a forma em cruz de malta dos grãos de amido. F. Coloração pelo Lugol, confirmando tratar-se de reserva de amido não homogeneamente distribuído pelas células de reserva. Notar vasos sem conteúdo corado. G. Detalhe da Figura anterior. Aumento: A, D e E: 400 X; B, C, F: 100 X; G = 800 X.
A B
C
D
E
F
Figura 5. Cortes de sementes de Coccoloba laevis analisados em microscopia de luz. A-B. Cortes corados pelo
Xylidine Ponceau pH 2,5. A. Região periférica, mostrando acúmulo de material protéico nas células mais externas do endosperma (seta). B. Região central, com baixa resposta ao corante, apenas na região das paredes celulares (seta). C. Corte corado pelo Sudan black B, mostrando a pequena quantidade de lipídio. D. Microscopia de polarização da região da casca, mostrando a forte birrefringência da camada paliçádica; E-F. Floroglucinol ácido, mostrando que as regiões dos vasos (E) e do tegumento (F) apresentam paredes celulares lignificadas. Aumento: A, D: 100X; C: 200X; B, E, F: 1000X.
Tabela 1: Dosagens realizadas para a detecção de aminoácidos, açúcares livres, lipídios, amido e proteínas, em sementes de Coccoloba laevis, em mg/g e em porcentagem com relação à massa de matéria fresca.
Reserva Quantidade (mg/g) % Aminoácidos 19,917 2,0 + 0,08 Açúcares livres 100,485 10,0 + 1,88 Lipídios 27,000 2,7 + 0,38 Amido 603,686 60,4 + 1,95 Proteínas totais 110,760 11,1 + 0,11
4.1.2. Licania cf rigida Benth (Chrysobalanaceae)
Árvore de copa ampla, densa e baixa, que pode atingir 15 metros de altura, com tronco curto, grosso e canelado, com 50 a 80 cm de diâmetro, formando uma copa de 15 a 20 m de circunferência. É nativa da caatinga e mata de galeria do nordeste brasileiro. Apresenta folhas simples, inteiras, alternas, com lâmina fortemente coriácea, glabra, opaca, com a face inferior esbranquiçada e com nervação proeminente e com até 16 cm de comprimento e 6 cm de largura (Lorenzi 1992).
A madeira é branca, com fibras entrelaçadas, muito resistente ao esmagamento; O seu valor, no passado, provinha das sementes, ricas em substâncias com utilização na indústria de tintas e vernizes de alto poder secativo. Em média, um indivíduo de Licania
rigida Benth produz 75 kg de frutos secos por safra, mas foram registrados exemplos com
produção de até 1.500 quilogramas.
Tem utilização medicinal, sendo indicada para o tratamento de diabetes (Almeida & Agra 1986). Rica em flavonóides, apresenta quantidades apreciáveis de miricetina, que tem inclusive valor taxonômico para o gênero e, em menor grau, para a Família Chrysobalanaceae (Coradin et al. 1985).
Suas flores são amareladas e estão dispostas em espigas ramosas; O fruto é do tipo drupáceo, fusiforme ou ovalado, com semente envolta em massa amarelada rala, mas fibrosa, de cheiro pouco agradável; A casca do fruto é verde, mesmo quando maduro, mas se torna amarelo-escuro quando seca, apresentando de 3 a 5 cm de comprimento e contendo uma única semente de igual formato. Os frutos e sementes da L. rigida são apresentados na Figura 6A-F.
Os cortes de sementes de L. rigida submetidos às diferentes colorações revelaram uma grande quantidade de tanino, que pode ter um importante papel na defesa contra herbivoria. Muitos trabalhos têm tratado do aspecto antinutricional de cultivares com altos teores de taninos e sua resistência a pragas, principalmente em espécies de interesse econômico (Monteiro et al. 2005).
Os resultados com AT (Fig. 7A-B) mostraram o aspecto característico dos compostos tânicos, que se coram em verde mais escuro do que os fenóis formadores das
ligninas presentes em muitas paredes celulares. Resultados semelhantes foram obtidos em sementes de pitanga por Bordignon (2000).
Além dos compostos fenólicos, as reservas de L. rigida são constituídas de proteínas, evidenciadas pelo Xylidine Ponceau (Fig. 7C-D). Merece destaque a característica dos núcleos das células dos cotilédones, bastante evidentes quando corados por este método (Fig. 7D). O método do PAS para a espécie corou praticamente apenas as paredes celulares, sugerindo uma baixa quantidade de polissacarídeos como fonte de carbono para as suas sementes (Fig. 7E).
O método do floroglucinol ácido para ligninas confirmou que os compostos fenólicos presentes nas sementes não se tratam do emaranhado polímero de fenilpropenóides, que compõe as ligninas, pois não houve resposta positiva ao mesmo (Fig. 8A-B).
Quando tratados pelo Lugol, os cortes exibiram a coloração azul marinho intensa e característica do comportamento dos grãos de amido (Fig. 8C-D). Tal comportamento deve-se à entrada e interação do Iodo com as moléculas em espiral formadas pela amilose e amilopectina, devido às ligações α1-4 entre os seus resíduos de glicose formadores (Tiné et al. 2000). Os resultados obtidos pelo Lugol foram confirmados quando o material foi observado ao microscópio de polarização, com analisador e polarizador cruzados, mostrando a característica forma em cruz de malta, birrefringente, dos grãos de amido. Tais grânulos, em quantidades de uma a duas dezenas por célula, se apresentaram com pequeno tamanho (Fig. 8E).
A não detecção dos grãos de amido pelo método do PAS pode ser decorrente do processamento realizado para o material analisado. Aqueles que foram incluídos em parafina, dada a dureza das sementes, não geraram cortes de boa qualidade. Assim, apenas os cortes obtidos da inclusão em histo-resina foram tratados pelo ácido periódico. Sabe-se que as histo-resinas podem afetar os resultados de alguns métodos citoquímicos, seja pela maior dificuldade de penetração dos reagentes nos tecidos cortados e sem ter tido a remoção da resina, seja por interferência direta desta sobre as reações citoquímicas a serem levadas a cabo. Resultados semelhantes foram obtidos por Begnami (1998) em sementes de café e por este motivo foram realizados os testes com Lugol e microscopia de polarização.
Estas sementes de L. rigida apresentam também quantidades significativas de lipídios, que foram evidenciados pelo Sudan black B (Fig. 8F e 8G). Pode-se notar que os lipídios encontram-se dispersos pelo citoplasma das células cotiledonares e, próximo à epiderme, há uma maior concentração de moléculas hidrofóbicas, possivelmente com funções impermeabilizadoras e proteção à semente (Fig. 8G).
Os resultados das dosagens de proteínas, açúcares e lipídios encontram-se descritos na Tabela 2. Pode-se notar uma maior quantidade de amido em relação às proteínas, também abundantes e aos lipídios presentes nas células das sementes desta espécie.
Destaque-se a presença de grande quantidade de açúcares livres, representando mais de 20% do material de reserva analisado.
B A
C D
E F
Figura 6: Frutos drupa e sementes de Licania rigida. A. Frutos verdes, com cerca de 2,5
cm de comprimento. B. Fruto maduro. C. Fruto cortado mostrando a semente. D. Semente.
E. Diversidade de sementes retiradas de frutos imaturos e maturos. F. Corte de semente.
A
B
C
D
E
*
*
*
*
Figura 7: Cortes de sementes de Licania rígida. A-B. Cortes corados pelo Azul de toluidina a pH 4. Note o material tânico corado em verde (*), em contraposição ao conteúdo mais azul-arroxeado das paredes celulares e núcleos (seta). C-D. Cortes corados pelo Xylidine Ponceau pH 2,5. C. Vista geral mostrando os inúmeros grãos de tanino em cor mais abóbora-avermelhada. D. Detalhe mostrando a presença de núcleos bem evidenciados pelo método (seta) e algum conteúdo protéico no citoplasma. E. Método do PAS. Nota-se a coloração arroxeada das paredes celulares, coradas pelo método. Aumento: A: 40X; C: 100 X; B, D e E: 400 X.
A
B
C
D
E
F
G
Figura 8: Cortes de sementes de Licania rígida. A-B. Material submetido ao floroglucinol ácido. A. Visão geral, mostrando aspecto levemente avermelhado do material fenólico. B. Detalhe mostrando que o método não apresentou a coloração atribuída à lignina.C-D. Material tratado pelo Lugol. Note a reação positiva ao amido, que se cora em azul-marinho a negro. Os taninos apresentam sua coloração natural característica. C. Vista geral. D. Detalhe. E. Corte visualizado em microscópio de polarização, revelando a birrefingência das paredes celulares e o aspecto em cruz de malta dos grãos de amido. F-G. material corado pelo Sudan black B revelando algum conteúdo hidrofóbico no interior das células (F, seta) e na periferia da semente (G, seta). Aumento: A: 100 X; C = 40 X; B e D, E = 400 X; F e G = 1000 X
Tabela 2: Dosagens realizadas para a detecção de aminoácidos, açúcares livres, lipídios, amido e proteínas, em sementes de Licania rigida, em mg/g e em porcentagem com relação à massa de matéria fresca.
Reserva Quantidade (mg/g) % Aminoácidos 17,578 1,8 + 0,60 Açúcares livres 252,128 25,2 + 2,83 Lipídios 78,000 7,8 + 1,50 Amido 50,139 5,0 + 0,57 Proteínas totais 348,432 34,8 + 1,37
4.1.3. Myrcia guianensis (Aubl.) DC. (Myrtaceae)
Myrcia guianensis pertence à Família das Myrtaceae, extremamente importante
em termos econômicos e de larga distribuição por todo o país, principalmente nas áreas de restinga (Oliveira-Filho et al. 2004; Pinto et al. 2005). Sua altura pode chegar até 6m.
Suas folhas são simples, opostas, de margem inteira, peninérveas e com uma nervura marginal e com contorno foliar elíptico (Fig. 9A-C). Há pontos translúcidos, devido a presença de canais oleíferos. As células epidérmicas têm contorno onduloso, com paredes anticlinais fortemente espessados em forma de rosário. A epiderme adaxial possui células pequenas e ausência de glândulas oleíferas, epiderme abaxial com estômatos também paracíticos, sendo a folha hipoestomática. O mesofilo é do tipo dorsiventral, com uma camada de parênquima paliçádico e esporadicamente apresenta oxalato de cálcio no mesofilo (Jorge et al. 1997). As células epidérmicas são recobertas por cutícula lisa. As folhas possuem nervura central de contorno côncavo-convexo mostrados no corte transversal.
As flores de M. Guianensis são andróginas, actinomorfas, diclamídeas, dialipétalas, apresentando-se em inflorescências. Os frutos são do tipo baga e, quando amadurecem, passam a apresentar coloração amarela, que se torna vermelha na plena maturação. Apresentam uma semente cada, sendo raramente encontradas duas sementes por fruto (Fig. 9 E-F).
Os cortes obtidos para a análise microscopica das sementes de M. guianensis mostram que ela apresenta cotilédone foliáceo, com eixo embrionário mais central e protegido, com células coradas pelo AT (Fig. 10), denotando a presença de material aniônico no pH utilizado. O eixo embrionário apresenta uma estrutura radialmente organizada, com feixes vasculares na porção hipocótilo-radicular e muitas estruturas secretoras, com características glandulares, com material não corado pelo AT (Fig. 10A, C, H e I).
O amido apresentou-se em todas as células do cotilédone e eixo embrionário e não foi corado pelo AT (Fig. 10G), mas revelou seu formato em cruz-de-malta quando observado sob luz polarizada, com analisador e polarizador cruzados (Fig. 10B, E, G e I)
No eixo embrionário os núcleos das células se mostraram bastante evidentes com nucléolos ocupando boa parte de seu volume (Fig. 10 D). Nos cotilédones foliáceos pôde ser observada a estrutura epidérmica preservada, com uma paliçada mais evidente em uma das regiões, que deverá, possivelmente, originar a porção adaxial das folhas da plântula no início de seu desenvolvimento (Fig. 10 H). Estruturas semelhantes foram observadas em cortes de cotilédones de rabanete por Coutinho et al. (2003).
As observações em microscopia de polarização revelaram a presença de numerosos cristais de oxalato de cálcio, com forma de drusas, em diferentes locais das estruturas cotiledonares. Tal fato pode significar um importante mecanismo de defesa à predação realizado por esta espécie, a exemplo do que ocorre em inúmeras outras espécies vegetais (Kajiki 2004).
O material presente nas glândulas, não foi evidenciado pelo floroglucinol ácido, nem apresentou birrefringência em toda a sua extensão (Fig. 11 A-B). O conteúdo de amido foi novamente evidenciado pela utilização do reagente de Lugol, corando-se intensamente em preto e mostrando uma distribuição regular no interior das células cotiledonares e do eixo embrionário (Fig. 11C).
Células coradas pelo Xylidine Ponceau ficaram bastante coradas, mostrando uma grande quantidade de material protéico, principalmente nos cotilédones (Fig. 11D), em relação ao eixo embrionário (Fig. 11 E), cujas células apresentaram-se menos coradas e mais vacuolizadas.
O método da impregnação pela prata corou intensamente as células das sementes, como esperado, dada a presença do amido como uma das reservas de importância para a mesma e do fato de que a maior parte das proteínas de reserva serem glicoproteínas (Cortelazzo & Vidal 1991) e, portanto, reagirem também à impregnação pela prata (Fig. 11F). O mesmo se deu nos cortes tratados pelo PAS, que também cora o amido e a porção glicídica das glicoproteínas (Fig. 11G).
A coloração pelo Sudan black B mostrou resultados pífios, revelando que o lipídio não é uma reserva de importância para estas sementes (Fig. 11H). Além disso, o uso do floroglucinol combinado ao Lugol provocou uma interferência na cor deste último método, sugerindo a presença de compostos fenólicos espalhados pelos espaços celulares e
em alguns casos, coradas em marrom (Fig. 11I). Em alguns cortes submetidos aos demais métodos de coloração, materiais de diferentes naturezas foram detectados, corroborando a idéia de produção e transporte de substâncias por essas estruturas.
Finalmente, as células da região paliçádica da testa das sementes foram intensamente coradas pelo método do floroglucinol ácido, indicando a presença de grande quantidade de lignina nas suas paredes (Fig. 11J).
Os resultados das dosagens dos materiais de reserva dessas sementes, encontram-se sumarizados na Tabela 3.
A B C
D E F
Figura 9: Aspecto geral de ramos herborizados de Myrcia guianensis. A-B. ramos mostrando
inflorescência; C. Detalhe mostrando formato da folha. D. Frutos bacáceos em diferentes estágios da maturação, passando da cor verde, para verde-amarelada, amarela e vermelha na maturação. E. Visão geral das sementes, com cerca de 0,7 cm de diâmetro. F. Corte dos cotilédones, mostrando ainda o eixo embrionário. Barra: A-C: 10cm; D-F: 1 cm.
Figura 10: Cortes de Myrcia guianensis visualizados ao microscópio de luz comum ou polarização após coloração pelo Azul de Toluidina pH 4,0. A-B. Corte transversal do eixo hipocótilo-radicular. A. Notar feixe vascular, mais fortemente evidenciado e a presença de estruturas secretoras na periferia do corte (seta). B. Mesma imagem, sob luz plano-polarizada, exibindo forte birrefringência. C. Região do cotilédone foliáceo cortado longitudinalmente. D-E. Imagens da região do eixo mostrando vasos condutores cortados longitudinalmente. D. Nota-se a presença de núcleos que exibem grandes nucléolos. E. Mesma imagem, sob luz plano polarizada mostrando os grãos de amido. F-I. Cortes dos cotilédones foliáceos observados sob luz comum (F e H) ou polarizada (G e I) mostrando a presença de cristais de oxalato de cálcio (F-G) e os ductos já visualizados no eixo embrionário (H-I). Aumento: A, B, C: 40X; H,I: 100X; D, E, F, G: 400X.
A B
C
D E
F G
Figura 11: Cortes de sementes de Myrcia guianensis visualizados em microscopia de luz comum e de polarização. A. Material submetido ao floroglucinol, mostrando reação negativa ao método. B. Mesma imagem, visualizada sob luz polarizada, mostrando grãos de amido e conteúdo não birrefringente no interior das glândulas secretoras. C. Corte após reação com Lugol mostrando os grãos de amido em preto. D. Cotilédones após coloração pelo Xylidine Ponceau pH 2,5. Notar conteúdo XP-positivo no interior das células cotiledonares. E. Corte corado pelo XP pH 2,5, na região do eixo embrionário mostrando um conteúdo protéico significativamente menor do que nos cotilédones. F. Impregnação pela prata, salientando os radicais vic-glicóis presentes nos grãos de amido e nas glicoproteínas de reserva. G. Método do PAS confirmando as colorações obtidas pelo método anterior. H. Sudan black B mostrando a pequena quantidade de lipídios desta semente. I. Floroglucinol + Lugol, mostrando alteração no padrão do amido corado e mostrando material da secreção em marrom. J. Floroglucinol mostrando que a paliçada do tegumento é lignificada. Aumento: H, I: 40X; A, B, F, G: 100X; C: 200X; D, E: 400X; J: 1000X.
A
B
C
D
E
H
D
F
G
J
I
Tabela 3: Dosagens realizadas para a detecção de aminoácidos, açúcares livres, lipídios, amido e proteínas, em sementes de Myrcia guianensis, em mg/g e em porcentagem com relação à massa de matéria fresca.
Reserva Quantidade (mg/g) % Aminoácidos 19,60 2,0 + 0,020 Açúcares livres 167,53 16,8 + 1,11 Lipídios 94,00 9,4 + 1,10 Amido 279,38 27,9 + 0,53 Proteínas totais 135,30 13,5 + 0,50
4.1.4. Simaba cuneata A. St. –Hil.&Tul. (Simaroubaceae)
A Família Simaroubaceae tem importância decorrente da alta produção de alguns terpenos para a área farmacológica (Rodrigues Filho et al. 1992).
Simaba cuneata é uma espécie arbórea ocorrente em regiões tropicais e
subtropicais. Planta semidecídua, heliófita, secundária, característica de Floresta Atlântica e de restingas. Quando alcança a idade adulta atinge uma altura média de 4 a 5 metros. Conhecida popularmente como cajarana, sua madeira é muito utilizada no ramo de confecção de solados de sapatos. Possui caule anguloso e glabro; suas folhas são compostas, imparipinadas (com 2 a 3 jugas), coriáceas, glabras. Apresentam um pecíolo cilíndrico e de coloração variante de verde a púrpura.
Os frutos carnosos de S. cuneata são rugosos, com pequenos pêlos esparsos e possuem forma oblongo-clavada sendo pouco comprimidos na lateral. Apresentam uma única e grande semente em seu interior (Fig. 12).
Os cortes obtidos nas sementes de Simaba cuneata revelaram que as paredes celulares foram bem coradas pelo Azul de Toluidina que, entretanto, corou fracamente os conteúdos citoplasmáticos das células dessas sementes (Fig. 13A-C). A coloração pelo Xylidine Ponceau se revelou intensa (Fig. 13D) identificando as proteínas como uma das reservas abundantes das sementes dessa espécie. Em relação às demais espécies estudadas, no caso de S. cuneata, o material protéico não se distribui homogeneamente, sendo mais abundante nas regiões mais periféricas da semente (Fig. 13E) em relação aos locais mais internos (Fig. 13F), que apresentam regiões de maior concentração (Fig. 13G).
Em contrapartida, praticamente não houve resultado positivo quando o material foi submetido à reação do floroglucinol acidificado (Fig. 14A) e foi positivo quando submetido ao Sudan black B para lipídios (Fig. 14B-C) revelando ser esta outra reserva de importância para a espécie. Do mesmo modo, houve coloração pelo PAS, revelando a presença de carboidratos (Fig. 14D-F), muitas vezes corando o material XP positivo, o que denota sua natureza glicoprotéica (Fig. 14F). Em sementes, a presença de glicoproteínas é bastante comum e já foi detectada em inúmeras espécies como Dalbergia miscolobium
Os cortes visualizados após coloração pelo Lugol (não mostrados) e pelo método da prata, apresentaram baixa coloração. Neste último caso, foram coradas apenas aquelas estruturas já visualizadas pelo Xylidine Ponceau, confirmando sua natureza glico-protéica (Fig. 14G). Além disso, a observação do material em microscopia de polarização com polarizador e analisador cruzados, confirmou que as sementes são pobres em amido, confirmando que os resultados PAS-positivos são, antes de tudo, referentes à natureza glico-protéica das reservas da semente (Fig. 14H). Em alguns cortes foram observados cristais em forma de drusas (Fig. 14I), possivelmente de oxalato de cálcio e com possível papel de defesa, como nos demais casos já relatados no presente trabalho.
Os resultados referentes às dosagens das reservas presentes na semente estão mostrados na Tabela 4, que confirma aqueles obtidos para o material in situ, principalmente no que diz respeito à pequena quantidade de amido nas sementes desta espécie.
C D
E F
B A
Figura 12: Imagens de Simaba cuneata. A. Árvore em período de frutificação. B. Detalhe
de fruto na planta. C. fruto maduro com aproximadamente 4 cm de diâmetro maior e 3 cm de diâmetro menor. D. Semente mostrando cotilédones e eixo embrionário. E-F. Cotilédones abertos, mostrando aspecto interno e externo da semente. Barra = 1 cm.
Figura 13: Cortes de sementes de Simaba cuneata visualizados em microscopia de luz. A-C. Coloração pelo Azul de Toluidina pH 4,0. Notar as paredes celulares coradas e pouco conteúdo citoplasmático reativo ao corante. A. Região periférica. B. Região central do cotilédone. C. Detalhe da imagem anterior. D-G. Coloração pelo Xylidine Ponceau pH 2,5 mostrando intensa coloração do material cotiledonar. D. Cotilédone, vista geral. E. Região periférica. F. Região Central. G. Eixo embrionário. Aumento: B: 40X; A, G: 100X; D, E, F, G: 400X C: 1000X.
A
B
C
E
F
G
D
E
F
G
A B C
D E F
I H
G H
Figura 14: Cortes de sementes de Simaba cuneata visualizados em microscopia de
luz comum ou de polarização. A. Floroglucinol acidificado, sem nenhuma reação positiva. B-C. Sudan black B para lipídios, mostrando diferenças de intensidade entre região central (B) e periférica (C) do cotilédone. D-F. Método do PAS. D. Região periférica. E. Região Central. F. Detalhe de material PAS positivo que também foi corado pelo Xylidine Ponceau. G. Impregnação pela prata mostrando pouco material corado. H. Visualização em microscopia de polarização da região central dos cotilédones, mostrando praticamente a birregringência das paredes celulares. I. Polarização, mostrando a presença de cristais de oxalato (*). Aumento: D, G: 100X; A, B, C, E: 200X; H, I: 300X; F: 400 X.
Tabela 4: Dosagens realizadas para a detecção de aminoácidos, açúcares livres, lipídios, amido e proteínas, em sementes de Simaba cuneata, em mg/g e em porcentagem com relação à massa de matéria fresca.
Reserva Quantidade (mg/g) % Aminoácidos 5,927 0,60 + 0,18 Açúcares livres 140,690 14,10 + 0,42 Lipídios 255,000 25,50 + 2,80 Amido 32,903 3,29 + 0,18 Proteínas totais 173,177 17,30 + 0,13
