Universidade Estadual de Santa Cruz
SILVIA PATRÍCIA BARBOSA ARAÚJO
NOVAS FONTES DE INÓCULO PARA Phytophthora capsici E NOVOS OOMICOTAS ASSINALADOS EM SOLOS DE
SISTEMA AGROFLORESTAL SERINGUEIRA x CACAUEIRO, NO BRASIL
ILHÉUS-BAHIA
2016
NOVAS FONTES DE INÓCULO PARA Phytophthora capsici E NOVOS OOMICOTAS ASSINALADOS EM SOLOS DE
SISTEMA AGROFLORESTAL SERINGUEIRA x CACAUEIRO, NO BRASIL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Produção Vegetal da Universidade Estadual de Santa Cruz como parte dos requisistos para a obtenção do título de Mestre em Proteção Vegetal.
Área de Concentração: Proteção de Plantas Orientadora: Dra. Edna Dora Martins Newman Luz
Co-orientador: Dr. José Luiz Bezerra
ILHÉUS-BAHIA
2016
SILVIA PATRÍCIA BARBOSA ARAÚJO
NOVAS FONTES DE INÓCULO PARA Phytophthora capsici E NOVOS OOMICOTAS ASSINALADOS EM SOLOS DE SISTEMA
AGROFLORESTAL SERINGUEIRA x CACAUEIRO, NO BRASIL
Ilhéus, Bahia, 24/02/2016
Dra. Edna Dora Martins Newman Luz – DSC CEPLAC/CEPEC/SEFIT
(Orientadora)
Dr. Jadergudson Pereira – DSC DCAA/UESC
Dr. Thiago Alves Santos de Oliveira – DSC UFRB
“ O Senhor é a minha luz e a minha eterna salvação; a quem temerei? O Senhor é a força da minha vida; de que me recearei? Quando os malvados meus adversários e meus inimigos, investirem contra mim, para comerem as minhas carnes, tropeçaram e caíram.
Ainda que um exército me cercasse, o meu coração não temeria: ainda que a guerra se levantasse contra mim, nele confiaria.”
Salmos 27 vs. 1-3
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela sua infinita bondade e misericórdia para comigo em todos os momentos da minha vida.
Aos meus pais, meu esposo e meus familiares pelos constantes incentivos, apoio, orações, amor e carinho.
A minha orientadora, Dra. Edna Luz, pelo carinho, orientação, oportunidade, dedicação, confiança e paciência a mim atribuídos.
Ao Dr. José Luiz Bezerra meu co-orientador e ao Dr. Jadergdson Pereira pelos primeiros ensinamentos na área científica, pela confiança, oportunidade, colaboração e amizade concedida.
A Joel Feitosa, companheiro de viagem em coletas, pelo auxílio, apoio e cuidado.
A Cenilda da Silva Serra Rocha e Edarcy Primo pelos ensinamentos e assessoramento nas tarefas de laboratório e identicação dos isolados.
A Ananias (Nani), Orlando (Orlandão), Valmir Araújo pelos constantes auxílios nos trabalhos em campo e na casa de vegetação.
A José Renato do escritório local da CEPLAC em Ituberá pela disponibilidade e importante apoio durante as coletas realizadas para este estudo.
Ao pessoal das Fazendas visitadas, em especial a Ricardo da fazenda Ondulada e a Anderson da fazenda Morro Alto, pela atenção e disponibilidade durante as visitas.
A equipe do laboratório de biologia molecular da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia, em especial a Dra. Elizabeth Duarte, pela parte molecular.
A Carol Benjamim e a Giselle Rodrigues pela paciência, atenção e importante ajuda na parte estatistica.
A todos do laboratório PHYTOLAB e laboratório de Biodiversidade de Fungos, em especial, Francis, Tarcila, Tami Ito e Antônio Neto pelas orientações, apoio e constantes auxílios.
A UESC pelo curso.
A CAPES pela concessão da bolsa de estudo.
A CEPLAC pelo uso de suas dependências, equipamentos, laboratórios e casa de vegetação, para realização desta pesquisa.
A todos citados e não citados, obrigado!
SUMÁRIO
EXTRATO... xi
LISTA DE FIGURAS... xii
LISTA DE TABELAS... xv
1 INTRODUÇÃO... 1
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 3
2.1 Consórcio cacau e seringueira... 3
2.2 O Filo Oomycota... 4
2.3 Phytophthora capsici ... 5
2.4 Gênero Phytopythium... 8
3 CAPÍTULO 1 - FONTES DE INÓCULO DE Phytophthora capsici EM PLANTAÇÕES DE CACAUEIRO E SERINGUEIRA NO SUL DA BAHIA, BRASIL... 10
RESUMO... 10
3.1 INTRODUÇÃO... 12
3.2 MATERIAL E MÉTODO... 15
3.2.1 Área de estudo... 15
3.2.2 Coletas... 15
3.2.3 Isolamento de Phytophthora... 16
3.2.4 Caracterização morfobiométrica... 17
3.2.5 Determinação do tipo de compatibilidade... 17
3.2.6 Estudos moleculares dos isolados de solo... 17
3.2.7 Teste de patogenicidade realizados com os isolados coletados em frutos e folhas de cacaueiro e em folhas de seringueira... 18
3.3.2 Determinação do tipo de compatibilidade... 23
3.3.3 Teste de patogenicidade... 23
3.3.3.1 Inoculações em seringueira... 23
3.3.3.2 Inoculações em frutos de cacau... 29
2.3.3.3 Inoculações em disco de folhas de cacau... 30
2.3.4 Caracterização molecular dos isolados de Phytophthora da rizosfera... 31
3.4 DISCUSSÃO... 32
3.5 AGRADECIMENTOS... 37
3.6 REFERÊNCIAS... 38
4 CAPÍTULO 2 - Vriesea procera (BROMELIACEAE) NOVO HOSPEDEIRO DE Phytophthora tropicalis... 45
RESUMO... 45
4.1 INTRODUÇÃO... 47
4.2 MATERIAL E MÉTODO... 48
4.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 51
4.4 AGRADECIMENTOS... 55
4.5 REFERÊNCIAS... 55
5 CAPÍTULO 3 - PRIMEIRO RELATO DE Phytophthora tropicalis EM Ageratum conyzoides NA BAHIA, BRASIL... 59
RESUMO... 59
5.1 INTRODUÇÃO... 61
5.2 MATERIAL E MÉTODO... 62
5.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 65
5.4 AGRADECIMENTOS... 67
5.5 REFERÊNCIAS... 67
6 CAPÍTULO 4 - OOMICOTAS DO GÊNERO Pythium E Phytopythium DA RIZOSFERA DE PLANTAS EM CONSÓRCIO DE SERINGUEIRA E CACAUEIRO NO BRASIL... 69
RESUMO... 69
6.1 INTRODUÇÃO... 71
6.2 MATERIAL E MÉTODO... 72
6.2.1 Área de estudo... 72
solo... 73
6.2.4 Caracterização morfobiométrica dos isolados ... 73
6.2.5 Estudos moleculares... 74
6.2.6 Teste de patogenicidade dos isolados em cacau e em seringueira... 75
6.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 76
6.4 AGRADECIMENTOS... 81
6.5 REFERÊNCIAS... 83
7 CONCLUSÕES... 87
8 REFERÊNCIAS COMPLEMENTARES... 88
NOVAS FONTES DE INÓCULO PARA Phytophthora capsici E NOVOS OOMICOTAS ASSINALADOS EM SOLOS DE SISTEMA AGROFLORESTAL
SERINGUEIRA x CACAUEIRO, NO BRASIL
RESUMO
O cacaueiro e a seringueira são duas culturas de elevada importância econômica mundial. A Bahia lidera a produção nacional de cacau e ocupa o 3°
lugar na produção de seringueira. Devido a importância econômica destas culturas no estado, é imprescindível o controle de doenças e pragas, a inspeção fitossanitária e a eliminação de fontes de inóculo nas plantações, visando diminuir os danos econômicos causados por elas. Entre patógenos comuns as duas culturas encontramos espécies de Phytophthora, responsáveis pela podridão parda nos frutos de cacau e requeima das brotações novas, cancro no painel, podridão em frutos e a queda anormal das folhas em seringueira. Entre as espécies relacionadas destaca-se P. capsici, um patógeno polífago e cosmopolita que é a principal espécie Phytophthora ocorrendo em seringueira. Em outras culturas, hospedeiras desta espécie, das famílias Solanaceae e Cucurbitacea, já são conhecidas as fontes de inóculo em que P. capsici pode sobreviver, mas para a cultura da seringueira principalmente, as fontes de inóculo ainda não foram determinadas. Visando encontrar as possíveis fontes de inóculo de P. capsici em consórcios de cacaueiro e seringueira no Sul da Bahia, realizou-se coletas em fazendas ali localizadas, de material vegetal de ambas culturas, rizosfera, plantas espontâneas ao redor das plantações e epífitas que apresentassem sintomas
típicos de Phytophthora. Foram obtidos 50 isolados de Phytophthora sp., sendo 42 de P. capsici. Isolou-se P. capsici de folhas de bromélias [Vriesea procera (Mart. Ex SchultF.) Wittm.], de folhas de mentrasto (Ageratum conyzoides L.) e da rizosfera em solos cultivados com estas culturas, sendo este o primeiro relato de P. capsici causando doenças nestes hospedeiros. Os isolados obtidos destes hospedeiros quando inóculados em frutos de cacau e em folhas de seringueira, ficaram entre os que causaram as maiores lesões. Provando que estas plantas podem estar servindo como hospedeiros alternativos e fonte primária de inóculo para o início das epidemias de doenças de P. capsici nas plantações de seringueira e também em cacaueiro. Além de P. capsici foram isolados do solo P. heveae e outros oomicotas: Phytopythium vexans, Phytopythium cucurbitacearum, Pythium acanthophoron e Pythium splendens. Não há registro da ocorrência destas espécies no Brasil, exceto P. splendens. Assim a ocorrência destas espécies no Brasil, estar sendo relatada pela primeira vez no presente trabalho. Testes de patogênicidade foram realizados com alguns isolados Phytopythium, no entanto, apesar do gênero abrigar algumas espécies patogênicas, as espécies encontradas não são consideradas uma ameaça ao cacaueiro e a seringueira, visto que nos testes de patogenicidade não provocaram lesões nos frutos de cacau e nem em folhas de seringueira.
Palavras-chave: Hevea brasiliensis, Theobroma cacao, hospedeiros alternativos, Phytophthora tropicalis, epidemiologia, Pythium spp. Phytopythium spp.
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO 1
Figura 1. Inoculações em folhas destacadas de seringueira (a) e frutos de cacau (b) com isolados obtidos nesta pesquisa... 20 Figura 2. Inoculação dos discos de folhas (a), escala de notas desenvolvida por Nyasse et al. (1999) para avaliação de genótipos de cacaueiros quanto a resistência à podridão-parda em discos de folhas e usada neste experimento (b) ... 20 Figura 3. Frutos de cacau inoculados com isolados de Phytophthora cinco e sete dias após a inoculação: A-B isolado 2652 de P. capsici, cinco (a) e sete (b) dias;
C-D isolados de P. palmivora, (c) isolado 2687 e (d) isolado 2683... 29
CAPÍTULO 2
Figura 1. Vriesea procera (a) e plantas de V. procera sobre planta de seringueira... 48
Figura 2. A-B Colônias de P. capsici (a) rosacea, (b) estelar e esporângios papilados e com pedicelos longos (c)...51
Figura 3. Lesões causadas por isolados de Phytophthora em folhas destacadas de V. procena 11 dias após as inoculação: (a) com o isolado 2690 de P. capsici de seringueira; (b-d) com os isolados 2676, 2638 e 2674 obtidos de V. procena;
(e-f) lesão causada pelo isolado 1211, aos sete (e) e aos 11 (f) dias após as inoculções... 52
CAPÍTULO 3
Figura 1. Mudas de mentrasto cultivadas em casa de vegetação (a) e mudas em câmara úmida (b)... 64 Figura 2. Mudas de mentrastro 7 dias após a inoculação, com sinais típicos de Phytophthora: escurecimento das nervuras foliares (a); requeima (b);
tombamento e morte de mudas (c)... 66
CAPÍTULO 4
Figura 1. Isolado 2659: Esporângios limoniformes, papilados(a); Oogônios com anterídios paraginos (b-1) e Clamidósporos terminais (b-2); Esporângio evidenciando a expansão da papila (c)... 77
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO 1
Tabela 1. Número de culturas semelhantes a Phytophthora obtidos do solo da rizosfera e parte aérea das plantas, por data e município de coleta nos anos de 2014 e 2015, em plantios de consórcio seringueira e cacaueiro no Sul da Bahia... 21
Tabela 2. Características morfobiométricas dos isolados de Phytophthora obtidos de seringueira, quando cultivados por sete dias em meio cenoura-ágar... 24
Tabela 3. Características morfobiométricas dos isolados de Phytophthora obtidos de cacaueiro, quando cultivados por sete dias em meio cenoura-ágar... 26
Tabela 4. Área média das lesões (cm2) em folha de seringueira dos clones FX3864 e SIAL1005, causada por 17 isolados de P. capsici... 27
Tabela 5. Área média das lesões (cm2) em folha de seringueira dos clones FX3864 e SIAL1005, causada por 5 isolados de P. palmivora... 28
Tabela 6. Área média das lesões (cm2) causadas por P. citrophthora em folhas de seringueira dos clones FX3864 e SIAL1005... 28
Tabela 7. Área média das lesões (cm2) em frutos de cacau comum, causada por 6 isolados de P. palmivora, sete dias após a inoculação... 30
Tabela 8. Índice de severidade da doença causados por 14 de isolados de P.
capsici, em disco de folhas de cacaueiro Catongo... 30
Tabela 9. Índice de severidade da doença causados por 7 isolados de P.
palmivora, em disco de folhas de cacaueiro Catongo... 31
Tabela 10. Identificação molecular de isolados de Phytophthora sp. obtidos da rizosfera de T. cacao e H. brasiliensis de fazendas do Sul da Bahia, Brasil... 31
CAPÍTULO 2
Tabela 1. Identificação molecular do isolado obtido de bromélia... 53
CAPÍTULO 3
Tabela 1. Identificação molecular do isolados obtido de A. conyzoides... 65
CAPÍTULO 4
Tabela 1. Números dos isolados de oomicetos obtidos da rizosfera de plantas de cacaueiro e seringueira, por local de coleta, utilizados para a inoculação em folhas de seringueira e frutos de cacaueiro... 75
Tabela 2. Número de isolados de oomicetos obtidos do solo por fazenda e município de coleta. ... 76
Tabela 3. Características morfobiométricas dos isolados de Phytopythium obtidos do solo da rizosfera de cacaueiro e seringueira, quando cultivados por sete dias em meio cenoura-ágar... 78
Tabela 4. Características morfobiométricas dos isolados de Pythium obtidos do solo da rizosfera de cacaueiro e seringueira, quando cultivados por sete dias em meio cenoura-ágar... 79
Tabela 5. Identificação molecular dos isolados da rizosfera de T. cacao e H.
brasiliensis de fazendas do Sul da Bahia, Brasil... 82
1 INTRODUÇÃO
O cultivo consórciado de seringueira (Hevea brasiliensis (Wild. Ex. A.
Juss.) Muell. Arg.) e cacaueiro (Theobroma cacao L.) tem sido adotado por muitos produtores do Sul Bahia. Na região vem se destacando os municípios de Ituberá, Camamu, Uruçuca e Una com muitas áreas cultivadas. As principais vantagens deste consórcio são a consideravél redução nos custos de implantação das culturas, aumento da produtividade, sombreamento para o cacaueiro, geração de emprego e, ainda, possibilita que o produtor tenha uma fonte de renda, enquanto espera o seringal crescer (PEREIRA et al., 1996).
As duas culturas possuem uma elevada importância econômica no cenário mundial. Os países do Sudeste Asiático, principalmente Malásia, Tailândia e Indonésia, são responsáveis por 90% da produção mundial de borracha. A produção nacional está concentrada nos estados de São Paulo (34%), Mato Grosso (29%) e Bahia (15%). Na produção de cacau, o Brasil ocupa a 5° posição no ranking mundial, perdendo apenas para a Costa do Marfim, Gana, Nigéria e Camarões. E no ranking nacional a Bahia lidera a produção (AGROLINK, 2015).
Tanto a seringueira quanto o cacaueiro, são atacados por uma grande diversidade de doenças, que reduzem a produção de frutos e de látex. Um tipo de patógeno comum entre elas, causador de doenças em ambas culturas, corresponde às espécies do gênero Phytophthora. Entre as espécies relacionadas destaca-se Phytophthora capsici Leonian, patógeno polífago, cosmopolita e muito agressivo (LUZ et al., 2003).
Na seringueira o patógeno pode causar requeima das brotações novas, cancro no painel, podridão em frutos e a queda anormal e prematura de folhas, sendo a última predominante nos seringais do sul da Bahia (CERQUEIRA et al.,
2011). No cacaueiro P. capsici é uma das espécies responsáveis pela podridão parda ou podridão de phytophthora, atacando principalmente os frutos da planta, mas podendo também ocorrer em outras partes da planta, sem causar prejuízos econômicos (OLIVEIRA & LUZ, 2005). Em condições favoráveis ao desenvolvimento da doença podridão parda, perdas na produção de até 80% já foram registradas (LUZ et al., 1997).
Em outras culturas atacadas por P. capsici já é comprovado a sua sobrevivência na rizosfera, restos de culturas e em plantas espontânea. Mas para o cacaueiro e a seringueira nunca foi verificado, a sua presença no solo e se haveriam outras plantas que serviriam como hospedeiros alternativos para sobrevivência desta espécie. Esta importante lacuna no patossitema da espécie demonstra a necessidade de pesquisar especificamente, as possíveis fontes primárias de inóculo nestas culturas.
Os objetivos deste trabalho foram: (i) estudar as possíveis fontes de inóculo de P. capsici em plantações de seringueira e cacaueiro, e testar a patogenicidade dos isolados encontrados às duas culturas; (ii) relatar novos hospedeiros para o patógeno na parte áerea da seringueira e no em torno das plantações entre as plantas nativas; (iii) comprovar a patogenicidade dos isolados desses hospedeiros à eles próprios, ao cacaueiro e à seringueira; (iv) isolar e identificar os principais oomicotas encontrados em solo das plantações consorciadas.
2 REVISÃO BIBLIOGRÀFICA
2.1 Consórcio cacau e seringueira
A seringueira é originária da região Amazônica e é a principal fonte de borracha natural do mundo. O gênero Hevea pertence á família das Euforbiácea, sendo a espécie H. brasiliensis a mais produtiva e plantada comercialmente, com superior qualidade de látex. Os países do Sudeste Asiático, principalmente Malásia, Tailândia e Indonésia, dominam a produção mundial de borracha natural, responsbilizando-se por 90% dela. No Brasil, São Paulo (34%), Mato Grosso (29%) e Bahia (15%), são os principais estados produtores.
O cacaueiro, por ser uma espécie neotropical, pode ser encontrado em praticamente todas as regiões do mundo. O Brasil, que já foi o 2° maior país produtor de cacau do mundo, ocupa atualmente a 5° posição seguindo a Costa do Marfim, Gana, Nigéria e Camarões. Cerca de 90% de todo o cacau brasileiro é exportado, sendo o Estado da Bahia considerado o maior produtor (AGROLINK, 2015).
Os sistemas agroflorestais (SAFs) representam um conjunto de técnicas alternativas de uso da terra, que implicam na combinação de espécies florestais com cultivos agrícolas e com atividades pecuárias, ou ambas. Nos últimos anos, o desenvolvimento de SAFs tem sido bastante encorajado, defendido e recomendados aos processos de produção como uma forma de praticar uma agricultura ambientalmente correta, mais produtiva e sustentável em regiões tropicais (PEREIRA et al., 1996).
O Sul da Bahia foi a região pioneira, a adotar a modalidade de cultivo consorciado de seringueira (Hevea brasiliensis (Wild. Ex. A. Juss.) Muell. Arg.) e
cacaueiro (Theobroma cacao L.), culturas de relevante importância econômica no cenário mundial. Inicialmente os produtores decidiram introduzir cacaueiros sob o dossel de seringais decadentes, parcialmente desfolhados, que permitiam uma melhor penetração da luz para o cacaueiro. Este consórcio deu certo e vem sendo bastante difundido pelos produtores da região (MARQUES, 2006).
Segundo Pereira et al. (1996), há muitas vantagens em consorciar o cacaueiro e a seringueira, e destaca como principais a redução nos custos de implantação, o aumento da produtividade e maiores oportunidades de emprego e renda. Contudo, segundo esses autores, um fator importante deve ser levado em consideração ao se escolher as espécies a serem consorciadas: as espécies escolhidas não devem apresentar problemas fitossanitários comuns. Mas tanto a seringueira quanto o cacaueiro são hospedeiras e sofrem com o ataque de um patógeno bastante agressivo, Phytophthora capsici Leonian.
2.2 O Filo Oomycota
O Filo Oomycota, um grupo monofilético, engloba os organismos pertencentes ao Reino Straminipila com características semelhantes aos fungos verdadeiros e por isso, as vezes denominados “pseudo fungos”. Entre as características similares aos fungos verdadeiros, estão a forma de nutrição, zoósporos flagelados, parede celular contendo quitina, presença de hifas, formação de estruturas de resistências e ocupação dos mesmos ninchos ecológicos (NEAHAUSER et al., 2012; MARANTO et al., 2014; BEAKES et al., 2014).
Segundo Adl et al. (2012) aprofundando a tentativa de Adl et al. (2005) de agrupamento dos reinos em Super grupos, o filo Oomycota pertence ao Super grupo SAR, composto pelos Reinos Straminipila, Alveola e Rhizaria. Beakes et al. (2014), em recente revisão filogenética e taxonomica levando em consideração as sequências moleculares e analizando simultaneamente a biologia e a história evolutiva do Reino Straminipila, propuseram a divisão do filo Oomycota, até então considerado por Kirk et al. (2008) como possuindo uma única classe – Oomycetes, em três classes: Peronosporomycetes, Saprolegniomycetes e outra considerada Incertae sedis. A classe
Peronosporomycetes, engloba as ordens Albuginales, Peronosporales sensu lato e Rhipidiales.
Na ordem Peronosporales, permanecem duas famílias segundo Beakes et al. (2014) Peronosporaceae sensu lato e Pythiaceae sensu lato. A família Peronosporaceae sensu lato, incluindo os oomicotas evolucionariamente superiores e mais ricos em espécies, teria além dos gêneros com muitas espécies patogênicas às plantas como: Plasmopora; Peronospora;
Pseudoperonospora; Bremia e outros gêneros que causam os chamados mildios pulverulentos; Phytophthora com dois clados, um para os patógenos que atacam a parte aérea e outro para os que causam podridões de raízes;
Holophythophthora e Phytopythium. Já a família Pythiaceae sensu lato teria como integrantes o gênero Pythium, também com dois clados para as espécies globosas e filamentosas, e as espécies Lagenidiaceas spp. e Salisipitiaceae.
Assim, na mais moderna revisão filogenética (BEAKES et al., 2014) o gênero Phytophthora petence à família Peronosporaceae e não mais a Pythiaceae como considerados anteriormente (KIRK et al., 2008).
2.3 Phytophthora capsici
Phytophthora capsici Leonian pertence ao Reino Straminipila, Filo Oomycota, Classe Oomycetes e Família Peronosporaceae (BEAKES et al., 2014). A espécie foi assinalada pela primeira vez no Novo México (USA), causando a doença denominada de requeima ou mela de pimentão (Capsicum annuum L.), sendo considerada patógeno específico dessa cultura (TUCKER, 1931). No cenário atual, sabe-se que P. capsici é patogênica a mais de 50 gêneros de plantas, inclusive espécies vegetais de elevada importância econômica em todo o mundo. Devido a isto, a palavra especificidade tem sido abolida como característica de P. capsici, sendo considerado um patógeno polífago e cosmopolita (LUZ et al., 2003).
Dentre a vasta gama de hospedeiros de P. capsici destacam-se hortaliças, como o pimentão, tomate, pimenta-do-reino, berinjela, abóbora, melancia e várias outras espécies das famílias Solanaceae e Curcubitaceae. No Sul da Bahia duas culturas de comprovada relevância econômica, sofrem com o
ataque de P. capsici, o cacaueiro (Theobroma cacao) e a seringueira (Hevea brasiliensis) (CERQUEIRA et al., 2011; OLIVEIRA & LUZ, 2005; REIS et al., 2007, REIS e HENZ, 2008).
No cacaueiro, P. capsici juntamente com outras espécies de Phytophythora é responsável por causar a podridão parda ou podridão de phytophthora (CAMPELO & LUZ, 1981; LUZ, 1989; DANTAS et al., 2005;
BAHIA, 2007; GUEST, 2007; CERQUEIRA et al., 2011). O dano econômico causado no cacaueiro é evidente, pois a doença ataca principalmente os frutos da planta, mas podendo também ocorrer em outras partes da planta, sem causar sérios prejuízos econômicos (OLIVEIRA & LUZ, 2005). Em condições favoráveis ao desenvolvimento da podridão parda na Bahia, perdas na produção de até 80% já foram registradas (LUZ et al., 1997).
De acordo com Dantas et al. (2005) embora as perdas causadas pela podridão-parda sejam menores do que as ocasionadas por outras doenças como a vassoura-de-bruxa (Moniliophthora perniciosa (Stahel) Singer), a monilíase (Moniliophthora roreri (Cif.) Evans et al.) e a murcha-vascular-estriada (Oncobasidium theobromae Talbot & Keane), estas estão restritas a determinadas regiões do mundo, enquanto que a podridão-parda ocorre em todos os países produtores de cacau. Sendo assim, a podridão parda é considerada atualmente a doença mais importante em termos mundiais (DANTAS et al., 2005; BAHIA, 2007; CERQUEIRA et al., 2011).
A seringueira é outra cultura importante na região sul baiana, e um dos seus principais patógenos é P. capsici. O patógeno pode causar requeima ou queima das brotações novas, cancro no painel, podridão em frutos e a queda anormal e prematura de folhas, sendo a última predominante nos seringais do Sul da Bahia (CERQUEIRA et al., 2011) e que vem causando danos significativos na produção de látex. No entanto, assim como ocorre no cacaueiro, outras espécies do gênero Phytophthora também podem ser patogênicas à seringueira, tais como: P. palmivora, P. botryosa, P. citrophthora, P. nicotiniae var. parasítica, P. citricola, P. meadii e P. cactorum (GASPARETTO, 1997).
Em um primeiro momento, todos os isolados de Phytophthora encontrados em cacau foram classificados como P. palmivora (BRASIER &
GRIFFIN, 1979), sendo esta espécie posteriormente dividida em quatro grupos (MF1, MF2, MF3 e MF4) baseados em caracteres morfológicos (GRIFFIN,
1977). Depois de mais estudos a espécie teve sua descrição novamente alterada, passando então o grupo MF4 a ser considerado P. capsici Leonian (ZENTMYER et al., 1981; TSAO & ALIZADEH, 1988; ERWIN & RIBEIRO, 1996).
Atualmente isolados P. capsici são raramente encontrados infectando frutos de cacaueiros no Sul da Bahia, predominando espécies de P. palmivora nos isolamentos (LUZ et al., 2003). Este fato vem ocorrendo de maneira inversa e paralela na cultura da seringueira, em que existe uma predominância de P.
capsici relacionada as doenças causada por Phytophthora na cultura (CERQUEIRA et al., 2011).
Regiões e épocas do ano com temperaturas amenas e alta umidade do ar e do solo, favorecem o crescimento e desenvolvimento de P. capsici. Sua reprodução compreende duas fases, sendo uma fase somática ou assexual e uma fase sexual. Na reprodução assexuada, formam-se esporângios e zoósporos e na reprodução sexuada, oósporos (LUZ & SILVA, 2001). Sua disseminação no campo se dá via água de irrigação ou chuva, implementos agrícolas, vento, a partir de lesões esporulantes em frutos, ramos e folhas (REIS et al., 2007).
A principal estrutura de sobrevivência de P. capsici no solo são os oósporos (LAMOUR & HAUSBECK, 2002; MARQUE, et al., 2002; REIS et al., 2007), uma vez que as formas de esporângio ou zoósporos deste patógeno tem vida muito curta no solo, além disso, não se tem observado a formação de esporos de resistência (clamidósporos) por isolados de P. capsici (REIS et al., 2007). Em seringueira no estudo de mais de 370 isolados nenhum apresentou formação de clamidósporos (CERQUEIRA, 2014).
Em culturas de Solanaceae e Cucurbitaceae já é comprovado que P.
capsici pode sobreviver na rizosfera, em sementes, restos de culturas e utilizando plantas espontâneas como hospedeiro alternativo. No entanto, para o cacaueiro e a seringueira essa teoria nunca foi experimentalmente comprovada, sendo necessário pesquisar especificamente os locais e as plantas de sobrevivência desta espécie, capazes de servir como fonte primária de inóculo.
Recentemente estudos feitos por Santos e Luz (2011) e Santos et al.
(2013 e 2014) relataram a ocorrência de espécies de Phytophthora na rizosfera de cultivos agrícolas no Sul da Bahia, bem como a descoberta de novos hospedeiros de P. nicotianae na mesma região. Tais evidências sustentam a
hipótese de que P. capsici, assim como ocorre com outras espécies de Phytophthora e também com a própria espécie em outras culturas, utilize o solo como meio de sobrevivência nas culturas de seringueira e cacaueiro. O isolamento de Phytophthora do solo e raízes muitas vezes é dificultado pela presença de Pythium spp., além disso as espécies de Phytophthora apresentam taxa de cresimento relativamente baixa quando cultivadas em meios de cultura comumente usados em micologia, como BDA (batata-dextrose-agar). Dessa forma é recomendado o uso de meios seletivos suplementados com hymexazol para inibir a presença de várias espécies de Pythium, ou o uso de hospedeiros específicos colocados no solo como iscas (LUZ et al., 2008). No entando estas técnicas não possuem 100% de eficiência, fazendo com que o isolamento de Phytophthora do solo seja por vezes sabotado pela presença de outros menbros do filo Oomycota.
2.4 Gênero Phytopythium
Phytopythium é um gênero pertencente ao Reino Straminipila, Filo Oomycota, Classe Oomycetes, Ordem Peronosporales e Família Peronosporaceae (BEAKES et al., 2014). O gênero foi descrito recentemente por Bala et al. (2010), como a espécie tipo Phytopythium sindhum A.M. Lodhi, Shahzad & Lévesque, e atualmente existem cerca de 22 espécies registradas no Index Fungorum (2016). A maioria das espécies é saprobiota de ambientes naturais (água e solo), mas algumas são patógenos de plantas (DE COCK et al.
2015), incluindo P. helicoides e P. vexans, que já foram relatadas causando podridão da raiz e podridão do colmo em plantas de Kiwi, evidenciando sua importância agrícola (YANG et al., 2013; WANG & XIE., 2015).
O gênero foi descrito após resultados de estudos filogenéticos, baseados em análises moleculares que destinguiu o táxon anteriormente classificado como pertencente ao clado k do gênero Pythium (LÉVESQUE & DE COCK, 2004). O gênero Pythium foi dividido por Lévesque e De Cock (2004) em 11 clados de A- K, com base em análises sistemáticas moleculares. Tal divisão, embora bem apoiada por características morfológicas (DE COCK et al. 2015), tem sido contestada por vários autores (BRIARD et al., 1995; BAILEY et al., 2002; VILLA
et al., 2006; PALMUCCI, 2011; MARANO, 2014; DE COCK et al. 2015), que através de estudos filogenéticos, com base nas sequências de ITS, citocromo c oxidase (coxII), e os genes de β-tubulina, observaram que as espécies pertencentes ao clado K eram filogeneticamente distintas do resto daquelas consideradas como pertencentes ao gênero Pythium e apresentavam características combinadas dos gêneros Pythium e Phytophthora. De Cock et al.
(2015) estabeleceram quais espécies pertenciam ao clade K e fez 14 novas combinações taxonômicos para estas espécies, além da descrição de uma nova espécie Phytopythium mirpurense Lodhi, De Cock, Lévesque & Shahzad, sp.
nov.
As principais características morfológicas comuns a Phytopythium são:
esporângios ovóides a globosos com papilas exceto para P. vexans, proliferação interna semelhante a Phytophthora e modo de descarga de zoósporos semelhante ao Pythium, formando um tubo de descarga com uma vesícula na ponta; oogônios grandes, oósporos de paredes espessas e anterídio parágino com células ligadas lateralmente ao oogônio (BATEN, 2015; DE COCK et al., 2015). O gênero também é caracterizado por temperaturas ótimas de crescimento variando ente 30-40 °C (LÉVESQUE & DE COCK, 2004).
3 CAPÍTULO 1
FONTES DE INÓCULO DE Phytophthora capsici EM PLANTAÇÕES DE CACAUEIRO E SERINGUEIRA NO SUL DA BAHIA, BRASIL
RESUMO
O cacaueiro e a seringueira são considerados as culturas mais importantes economicamente no Sul da Bahia. Muitas vezes cultivadas de forma consorciada, ambas são hospedeiras de um fitopatógeno muito agressivo:
Phytophthora capsici Leonian. No cacaueiro P. capsici pertence ao complexo de espécies que causam a podridão-parda, doença mundialmente importante. Na seringueira P. capsici é o principal agente causal da requeima, do cancro do painel, da podridão dos frutos e da queda anormal e prematura das folhas. No entanto, não se sabe ao certo como P. capsici sobrevive nestas plantações, especialmente para causar as epidemias anuais em seringueira. Objetivou-se neste trabalho estudar as possíveis fontes de inóculo de P. capsici em plantações, de cacaueiro e seringueira no Sul da Bahia e aprofundar os conhecimentos sobre os aspectos ecológicos, epidemiológicos e patológicos das interações P. capsici com estes hospedeiros. Realizou-se coletas em fazendas localizadas no Sul da Bahia, de material vegetal de ambas culturas,solo da rizosfera, plantas espontâneas ao redor das plantações e epífitas sobre seringueira, que apresentassem sintomas típicos de Phytophthora. Foram obtidos 50 isolados de Phytophthora sp., sendo 42 de P. capsici (37 de seringueira, três de epífitas, um de planta espontânea e da rizosfera), seis de P.
pamivora (cinco de cacaueiro e um de seringueira), um de P. citrophthora (do
cacaueiro) e um de P. hevea (da rizosfera). Os isolados foram caracterizados morfologicamente e realizados testes de patogenicidade, em frutos de cacaueiro e folhas de seringueira com todos os isolados obtidos de cacaueiro, epífitas, e planta espontânea e com 13 isolados de seringueira. Nos teste de patogenicidade, os isolados das epífitas e da planta espontânea se mostraram patogênicos. Dessa forma, estas plantas podem estar servindo como hospedeiros alternativos de P. capsici nas plantações de cacau e seringueira.
Três fontes de inóculo de P. capsici foram assinaladas: o solo, uma epífita e uma planta espontânea. A repercussão ecológica e epidemiológica desses achados é discutida.
Palavras-chave: podridão parda; queda anormal das folhas; epidemiologia;
Theobroma cacao; Hevea brasiliensis
3.1 INTRODUÇÃO
Phytophthora capsici Leonian pertence ao Reino Straminipila, Filo Oomycota, Classe Oomicetes e Família Peronosporaceae (BEAKES et al., 2014). É considerado um patógeno polífago, cosmopolita (LUZ et al., 2003) e muito agressivo, causando sérios danos e grandes perdas econômicas em várias culturas em todo o mundo. Regiões e épocas do ano em que ocorrem temperaturas inferiores a 18 °C e alta umidade do ar e do solo, favorecem o desenvolvimento e a esporulação de P. capsici e, consequentemente, as epidemias das doenças causadas por esta espécie. P. capsici por ser uma espécie heterotálica (LEONIAN, 1922) é disseminada nas plantações principalmente por zoósporos e esporângios (ciclo assexual) que são dispersados pelo vento, água e insetos (LUZ et al., 1995; LUZ e SILVA, 2001) dando origem nas plantações à populações clonais, pela predominância de apenas um tipo de compatibilidade sexual (A1) (CERQUEIRA, 2014).
No entanto, em culturas onde os dois tipos sexuais estão presentes, como a do pimentão (Capsicum annuum L.), a principal estrutura de sobrevivência de P. capsici no solo são os oósporos (LAMOUR & HAUSBECK, 2002; REIS et al., 2007), uma vez que a forma de esporângio ou zoósporos deste patógeno tem vida muito curta no solo, além disso, não se tem observado a formação de esporos de resistência (clamidósporos) por isolados de P. capsici (CAMPÊLO &
LUZ, 1981; LUZ & CAMPÊLO, 1985; LUZ, 1989; REIS et al., 2007).
A espécie P. capsici encontra-se amplamente distribuída no país, podendo ser encontrada em todas as regiões geográficas (SANTOS et al., 2014b), é a segunda espécie de Phytophthora com maior número de hospedeiros registrados (21), perdendo apenas para a P. nicotianae com 34 hospedeiros relatados (MENDES et al., 1998; LUZ & MATSUOKA, 2001;
SANTOS et al., 2014b). Dentre a vasta gama de hospedeiros de P.capsici destacam-se hortaliças, como o pimentão (Capsicum annuum L.), tomate (Solanum lycopersicum L.), pimenta-do-reino (Piper nigrum L.), berinjela (Solanum melongena L.), abóbora (Cucurbita pepo L.), melancia [Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum & Nakai] e várias outras espécies das famílias Solanaceae e Curcubitaceae. Além desses, outros hospedeiros de relevância econômica, principalmente para o Sul da Bahia, sofrem com o ataque de P.
capsici, como é o caso do cacaueiro e da seringueira (CERQUEIRA et al., 2011;
OLIVEIRA & LUZ, 2005; REIS et al., 2007).
O cacaueiro (Theobroma cacao L.), por ser uma espécie neotropical, pode ser encontrado em praticamente todas as regiões do mundo. Várias doenças de importância econômica estão relacionadas ao cultivo do cacaueiro.
A podridão parda ou podridão de phytophthora é uma doença causada por um complexo de espécies do gênero Phytophthora que inclui as espécies P.
palmivora, P. citrophthora, P. heveae e P. capsici (CAMPELO & LUZ, 1981; LUZ, 1989; DANTAS et al., 2005; BAHIA, 2007; GUEST, 2007; CERQUEIRA et al., 2011). Estes patógenos atacam além dos frutos do cacaueiro, outras partes da planta como ramos, chupões, almofadas florais e até o tronco causando o cancro do cacaueiro (LUZ & SILVA, 2001), no entanto os danos econômicos importantes são ocasionados nos frutos (OLIVEIRA & LUZ, 2005). Durante a década de 80, estudos relacionados sobre a virulência, distribuição populacional, e predominância das espécies de Phytophthora no cacaueiro, demonstraram que P. capsici apesar de ser a menos virulenta das espécies causadoras da podridão parda, era a mais prevalente devido principalmente a seu bom crescimento nas epócas de maior ocorrência da doença na Bahia (LAWRENCE et al., 1982; CAMPÊLO et al., 1982; CAMPÊLO & LUZ, 1982; LUZ & CAMPÊLO, 1983). Mas, atualmente P. capsici parece ter decrescido das plantações de cacau, pois raros tem sido os isolados de P. capsici obtidos desta cultura, predominando P. palmivora nas plantações (CERQUEIRA, 2014).
De acordo com Dantas et al. (2005) embora as perdas causadas pela podridão-parda sejam menores do que as ocasionadas por outras doenças como a vassoura-de-bruxa (Moniliophthora perniciosa (Stahel) Singer), a monilíase (Moniliophthora roreri (Cif.) Evans et al.) e a murcha-vascular-estriada (Oncobasidium theobromae Talbot & Keane), estas estão restritas a
determinadas regiões do mundo, enquanto a podridão-parda ocorre em todos os países produtores de cacau. Sendo assim, a podridão parda ainda é considerada como a doença mais importante do cacaueiro em termos mundiais (DANTAS et al., 2005; BAHIA, 2007; CERQUEIRA et al., 2011).
A seringueira (Hevea brasiliensis (Wild. Ex. A. Juss.) Muell. Arg.) é outra cultura importante na região sul baiana, e um dos seus principais patógenos é P. capsici. No entanto, assim como ocorre no cacaueiro, outras espécies do gênero Phytophthora também podem ser patogênicas para a seringueira, tais como: P. palmivora, P. botryosa, P. citrophthora, P. nicotianae var. parasítica, P.
citricola, P meadii e P. cactorum (GASPARETTO, 1997).
A requeima ou queima das brotações novas, o cancro do painel, a podridão dos frutos e a queda anormal e prematura das folhas, são as doenças causadas por P. capsici nos seringais do Sul da Bahia (CERQUEIRA et al., 2011).
O principal meio de sobrevivência de P. capsici em outras culturas é o solo, mas o patógeno também pode sobreviver em sementes, restos de culturas e plantas espontâneas. Sua disseminação no campo se dá via água de irrigação ou chuva, implementos agrícolas, vento, a partir de lesões esporulantes em frutos, ramos e folhas (REIS et al., 2007). No entanto, para o cacaueiro e especialmente para a seringueira é necessário esclarecer a forma de sobrevivência desta espécie, e, se existem outras plantas hospedeiras do patógeno e, existindo, se elas são capazes de servir como fonte primária de inóculo.
O objetivo deste trabalho foi portanto, estudar a existência de possíveis fontes de inóculo de P. capsici em plantações de cacaueiro e seringueira no Sul da Bahia para aprofundar e esclarecer os aspectos epidemiológicos dos patossistemas P. capsici x seringueira e P.capsici x cacaueiro.
3.2 MATERIAL E MÉTODO
3.2.1 Área de estudo
O Sul da Bahia apresenta ótimas condições edafoclimáticas para o desenvolvimento tanto da cultura de cacau quanto da seringueira. A coleta de materias para o estudo desse trabalho foi realizada em 11 fazendas com cultivo em SAF contemplando as duas culturas, nos municípios: Ituberá (faz.
Plantações Michelin, faz. Ondulada, faz. Morro alto, faz. Revolta, faz. Lagoa Santa e faz. São Francisco); Camamu na fazenda Cultrosa; Una (faz.
Bolandeira, faz. Ghislaine e Estação EDJAB) e Uruçuca na fazenda Porto Seguro.
3.2.2 Coletas
As coletas foram realizadas em épocas diferentes considerando os períodos propícios (baixas temperaturas e alta umidade) e adversos (altas temperaturas e baixa umidade) ao patogéno. Assim, foram feitas três coletas em cada área, sendo a primeira nos meses de julho a setembro de 2014, a segunda entre os meses de dezembro de 2014 a março de 2015 e a terceira durante os meses de junho a agosto de 2015.
No cacaueiro foram coletadas bilros, chupões, frutos, solo da rizosfera e plantas espontâneas ao redor da plantação. Na seringueira foram coletados materiais da copa (folhas e plantas epífitas), solo da riszosfera e plantas espontâneas ao redor da plantação. Para a coleta do solo da rizosfera utilizou-se um trado com 20 cm de profundidade e retirando amostras em aproximadamente 1m de distância do caule. Foram coletadas três amostras simples de cada árvore e misturadas em um saco de polietileno formando uma amostra composta.
3.2.3 Isolamento de Phytophthora
Os materiais coletados foram trazidos para o Laboratório de Phytophthora (PHYTOLAB) do Centro de Pesquisa do Cacau (CEPEC), da Comissão Executiva do Plano da Lavoura Cacaueira (CEPLAC). Fragmentos de folhas, peciolos, caules e frutos com lesões foram superficialmente esterilizados em álcool 70%, hipoclorito e água destilada esterilizada, e semeados em placas de Petri contento meio seletivo PARPH (KANNWISCHER E MITCHELL, 1978). As placas foram mantidas no escuro a uma temperatura de 22 ± 1 °C por quatro a cinco dias e posteriormente, discos das bordas das colônias puras em meio seletivo foram transferidos para placas de Petri contendo meio cenoura-ágar (CA) onde foram cultivados para melhor crescimento e esporulação dos isolados.
Para o solo retirado da rizosfera utilizou-se a técnica de plaqueamento em meio seletivo (LUZ et al., 2008), que consistiu em pesar 10 g de cada amostra de solo, diluí-la em 90 mL de ágar-água a 0,25% e homogeneizar a mistura no agitador por cerca de dois minutos. Uma vez homogeneizada, foi retirado da suspensão uma alíquota de 1 mL com uma pipeta de pasteur e espalhada na superfície de cada uma das 10 placas contendo meio seletivo PARPH (KANNWISCHER e MITCHELL, 1978), e em seguida incubadas no escuro a 24 ± 1 °C. Após 48h foi realizada a lavagem em água corrente para retirar o solo (LUZ et al., 2008), e feita a observação sob luz da presença de culturas morfologicamente similares a Phytophthora spp. em cada placa (LUZ et al., 2008). As culturas foram repicadas novamente em meio seletivo para serem purificadas e em seguida passadas para placas de Petri contento meio cenoura ágar (CA) para as análise morfobiométrica.
Todos os isolados obtidos foram mantidos em tubos de Penicilina contendo meio batata-dextrose-ágar (BDA) e água estéril, de onde foram retirados para os demais testes.
3.2.4 Caracterização morfobiométrica
Após o crescimento de cada isolado em CA e também em meio cenoura líquido, sob luz contínua e temperatura de 25 °C durante cinco a sete dias foi realizada a caracterização morfológica dos isolados, determinando-se a forma das colônias, o tipo de micélio formado, presença ou ausência de clamidósporos, esporângios e oósporos. Dos esporâgios observou-se o comprimento e largura, a forma, a caducidade e o comprimento do pedicelo, medindo-se 50 esporângios.
3.2.5 Determinação do tipo de compatibilidade
O tipo de compatibilidade dos isolados obtidos foi determinado pareando- os consigo e com os isolados 1191 (A1 de P. palmivora ), 216 (A2 de P.
palmivora), 1211 (A1 de P. capsici) e 229 (A2 de P. capsici), todos da coleção Arnaldo Medeiros do Cepec, utilizando a técnica de sanduíche descrita por Luz e Silva (2001). As placas contendo os sanduíches dos diferentes cruzamentos foram incubadas no escuro, à 24 °C. Após cinco dias do pareamento os discos de CA colocados entre os discos de cultura dos isolados testadores foram colocados em lâminas e examinados ao microscópio para observar a formação de oósporos.
3.2.6 Estudos moleculares dos isolados de solo
A identificação molecular dos isolados do solo foi realizada no laboratório de biologia molecular da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia. A extração do DNA genômico foi realizada a partir da cultura pura em placa utilizando o kit UltraClean® Microbial DNA Isolation (MoBio, USA), seguindo as recomendações do fabricante. A integridade e a quantidade do DNA foram verificadas usando eletroforese em gel de agarose a 0,8% e o Qubit® 2.0 Fluorometer (Invitrogen), respectivamente.
As amplificações por PCR foram realizadas com os primers ITS4 (TCCTCCGCTTATTGATATGC) e ITS5 (GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG) da
região ITS-28S (Internal Transcribed Spacers) do DNA ribossomal (WHITE, 1990). E também com os primers LROR (ACCCGCTGAACTTAAGC) e LR6 (CGCCAGACGAGCTTACC) da região LSU 25-28S (Large subunit RNA) do RNA ribossomal (RIETHMULLER et al., 2002). As reações foram preparadas com os seguintes reagentes e concentrações: 60 ng de DNA de cada amostra;
1x de tampão da enzima Taq DNA polimerase; 3,7 mM de MgCl2; 0,6 pmol/μL de dNTPs; 0,4 pmol/μL de cada primer; 2,5 U de Taq DNA polimerase, com volume final ajustado para 50 μL com água ultra pura. Os ciclos de amplificações foram realizados no Veriti Thermal Cycler PCR (Appplied Biosystems) sob as seguintes condições térmicas: 94 ºC por 2 minutos, 35 ciclos de 94 ºC por 1 minuto, 48 e 53 (ITS e LSU, respectivamente) 56 ºC por 1 minuto, 72 ºC por 1 minuto e extensão final de 72 ºC por 10 minutos concluindo com o resfriamento a 8 ºC. Os produtos amplificados foram visualizados em gel de agarose a 1%, corados com brometo de etídio e sob luz ultravioleta. Em seguida os amplicons foram purificados utilizando o kit Illustra® GFX PCR DNA and Gel Band Purification (GE Healthcare Life Sciences) para posterior identificação nucleotídica utilizando o sequenciador automático ABI-Prism 3500 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) da empresa ACTGene Análises Moleculares LTDA. A edição e montagem das sequências foi realizada com o programa Sequencher 4.1.4 (Gene Code Corporation). A identidade taxonômica dos isolados foi estudada a partir do banco de dados GenBank, utilizando o BLASTn “basic local alignment search tool” (BLAST) do NCBI.
3.2.7 Teste de patogenicidade realizados com os isolados coletados em frutos e folhas de cacaueiro e em folhas de seringueira
Apartir das características morfobiométricas, foram escolhidos 17 isolados de P. capcisi (2636, 2637, 2638, 2639, 2652, 2674, 2676, 2689, 2690, 2691, 2692, 2696, 2697, 2698, 2699, 2700 e 2701) seis isolados de P. palmivora (2680, 2681, 2682, 2683, 2687e 2695) e um isolado de P. citrophthora (2693) para inoculações em: folhas destacadas de seringueira dos clones FX3864 (mais susceptível a Phytophthora) e SIAL1005 (considerado resistente a Phytophthora); discos de folhas de cacau Catongo e em frutos de cacau comum.
O critério da escolha dos isolados baseou-se em inocular pelo menos um isolados de cada uma das fazendas.
Utilizou-se três folhas destacadas de seringueira (sendo, cada folha com três folíolos, dois pontos de inoculação por folíolo e um total de 18 pontos de inoculação) e quatro frutos de cacau (quatro frutos x três pontos de inoculação = 12 pontos de inoculação) para cada isolado, inoculando-os com disco de micélio de 0,5 cm de diâmetro dos isolados cultivados em CA. Os inóculos foram cobertos com um chumaço de algodão embebido em água destilada para manter a umidade (Figura 1). Após a inoculação as folhas foram colocadas em caixas contendo espuma embebidas com água destilada para manter a umidade e os frutos foram colocados em sacos plásticos de polietileno transparentes borrifados com água destiladas formando câmaras-úmidas (LUZ et al., 2001).
Três, cinco e sete dias após as inoculções foram feitas as avaliações, medindo- se o comprimento e a largura das lesões para o cálculo da área das mesmas.
Os discos de folhas de cacau Catongo, foram inoculados com suspensão de zoósporos na concentração 3x105 zoósporos/ml, utilizando os mesmos isolados dos testes anteriores e seguindo a metologia descrita por Nyassé et al.
(1995). Utilizou-se 20 discos de folha para cada isolado. Os discos foram arrumados em caixas forradas com espuma embebida com água destilada para manter a umidade, formando assim uma câmara-úmida (Figura 2a). Sete dias após a inoculação procedeu-se a avaliação usando uma escala de notas desenvolvida por Nyasse et al. (1999), com valores variando de 0 – 5 (Figura 2b). A partir das notas foram determinados os índices de serveridade da doença (ID) através da fórmula de Mckinney (1923), conforme Equação:
( ) ∑( ) ( ) em que,
ID = índice de doença variando de 0 a 100;
f = número de disco de folhas com determinada nota;
v = grau de infecção (nota);
n = número total de discos de folhas avaliadas;
x= grau máximo de infecção (nota).
Os experimentos foram montados em delineamento inteiramente casualizados e as análises dos índices de severidade da doença causados pelos isolados em disco de folhas e a área média das lesões em folhas e frutos foram comparadas pelo teste de Scott Knott a 5% de probabilidade, utilizando o software SISVAR® versão 5.6.
Figura 1. Inoculações em folhas destacadas de seringueira (a) e frutos de cacau (b) com isolados obtidos nesta pesquisa.
Figura 2. Inoculação dos discos de folhas (a), escala de notas desenvolvida por Nyasse et al. (1999) para avaliação de genótipos de cacaueiros quanto a resistência à podridão-parda em discos de folhas e usada neste experimento (b).
a b
a a
3.3 RESULTADOS
Foram encontrados isolados de Phytophthora em todas as fazendas visitadas nos quatro municípios. No presente estudo foram obtidos 50 isolados de Phytophthora, sendo 46 de material vegetal e quatro encontrados no solo da rizosfera. Ituberá foi o município onde encontrou-se a maioria dos isolados, 31.
Todos os isolados de material vegetal foram encontrados apenas no período propício ao patógeno, entre os meses de julho a setembro e os de solo nos meses mais quentes (Tabela 1).
Tabela 1. Número de culturas semelhantes a Phytophthora obtidas do solo da rizosfera e parte aérea das plantas, por data e município de coleta nos anos de 2014 e 2015, em plantios de consórcio seringueira e cacaueiro no Sul da Bahia.
DATA
Ituberá Camamu Uruçuca Una
Parte
aérea Solo Parte
aérea Solo Parte
aérea Solo Parte
aérea Solo
jul/14 4 - - 1 - - 8 2
ago/14 12 3 2 1 - - 1 -
set/14 5 5 - - - -
out/14 - 3 - - - -
mar/15 - 6 - 4 - 3 - -
abr/15 - 10 - - - 3 - 2
jul/15 5 - 3 - 1 1 - -
ago/15 5 - - 1 - - - -
TOTAL 56 12 8 13
*- não encontrados.
A maioria dos isolados de material vegetal (36) foi oriunda de seringueira, sendo 23 do clone FX3864, três de SIAL1005, dois de PUA, três de IAN873, um
de MDF180 e quatro de policlones em viveiro. Foram obtidos cinco isolados de frutos de cacaueiro, três em folhas de epífitas e um isolado em folhas de uma planta espontânea.
O meio seletivo PARPH (KANNWISCHER E MITCHELL, 1978), inibiu o crescimento de muitos fungos Oomycota de outros gêneros, mas não todos.
Principalmente do solo, onde existe uma microbiota enorme, muitas espécies de Pythium e outros Oomycota são também isolados. Foram obtidos 43 isolados do solo rizosferico, com crescimento semelhante a Phytophthora porém, apenas dois foram confirmados até o momento como Phytophthora. Os demais, pertencem aos gêneros Pythium e Phytopythium, os quais serão abordados no capítulo 4.
3.3.1 Caracterização morfobiométrica
Os isolados de Phytophthora foram separados por espécies de acordo com a caducidade dos esporângios e o tamanho dos pedicelos. Esporângios não caducos P. citrophthora e se caducos com pedicelos longos P. capsici e com pedicelos curtos P. palmivora (LUZ & MATSUOKA, 1996).
No estudo das características morfobiométricas, observou-se que nos isolados de seringueira houve predominância de colônias do tipo rosacea (mas com algumas do tipo petalóide e estelar), esporângios do tipo limoniforme medindo 44,5 x 23,6 μm (22-68 x 14-30 μm), papilas com média de profundidade do poro apical (PPA) de 4,3 μm e com largura do poro apical (LPA) de 6,1 μm, pedicelo 47μm (20-82 μm). Características estas similares a P.
capsici (Tabela 2) e de acordo com as chaves taxonômicas (WATERHOUSE, 1963, 1983; STAMPS et al., 1990). Em seringueira observou-se apenas um isolado de P. palmivora, com colônia do tipo colapsada, esporângios obpiriforme com média 40,6 X 24,1 μm, papilas com PPA de 5,6 μm e LPA de 6,8 μm, com a presença de clamidósporos com diâmetro médio de 24,7 μm (19-29,5 μm).
Nos isolados de P. palmivora de cacaueiro houve predominância de colônias do tipo colapsada, esporângios do tipo obpiriforme medindo 44,4 x 29,5 μm (21,8-67,8 x 18,7-36,4 μm), papilas com PPA de 5,3 μm e LPA de 9,5 μm, pedicelos 3,5 μm (1,8-5,5 μm), clamidósporos 28,5 μm (17-49 μm). No cacaueiro
apenas um isolado de P. citrophthora foi obtido com colônia do tipo colapsada, esporângios do tipo obpiriforme medindo 50,9 x 27,8 μm (35-65 x 21,7-35 μm), papilas com PPA de 5 μm e LPA de 7,3 μm, clamidósporos com 27 μm (17,9- 39,8 μm) (Tabela 3) .
Os isolados obtidos do solo da rizosfera foram homotálicos sendo que o isolado de P. capcisi apresentou colônias do tipo estelar, oogônios com média 18 μm (17-19,6 μm), anterídios parágino e não foi observado a presença de esporângios e clamidósporos. O isolado de P. heveae apresentou colônias do tipo colapsada, oogônio com média 24,3 μm (18,2-34,1 μm), anterídios anfígenos com média 12,8 x 10,3 μm (9,3-16-9 x 7,3-14,7 μm), clamidósporos terminais com 29,8 μm de diâmetro (25,6-32,9 μm) e não foi observada a presença de esporângios.
3.3.2 Determinação do tipo de compatibilidade
Os isolados de P. capsici formaram oogônio, anterídios e oósporos quando pareados com o isolado 229, de P. capsici, do tipo compatível A2. Essas estruturas não foram observadas no auto-pareamento dos isolados e nem nos pareamentos com o isolados do tipo compatível A1, comprovando que os isolados de P. capsici obitidos no presente estudo são heterotálicos do tipo compatível A1. Todos os isolados de P. palmivora, formaram oogônio, anterídios e oósporos quando pareados com o isolado 1191 do tipo compatível A1.
3.3.3 Teste de patogenicidade 3.3.3.1 Inoculações em seringueira
Todos os isolados de P. capsici inoculados nos dois clones de seringueira causaram lesões. No entanto, houve variação no grau de agressividade entre os isolados. No clone FX3864 os isolados de P. capsici 2636, 2699, 2700, 2691, 2692 e 2639 apresentaram menores valores de área de lesão variando de 0,9 a 2,72 cm2.
Tabela 2. Características morfobiométricas dos isolados de Phytophthora obtidos de seringueira, quando cultivados por sete dias em meio cenoura-ágar.
Continua
N° do
ISOLADO LOCAL¹ ÓRGÃO ESPÉCIE TIPO DE COLÔNIA
TIPO DE ESPO.
ESPORÂNGIO
Comp. X Largura C/L² PAPILA
PEDI.5 CLAM.6 PPA3 LPA4
2636 1 Peciolo P.capsici Rosacea limoniforme 44±5,6 X 23,2±1,7 1,9:1 3,6±0,8 6±0,5 41±22,8 - 2637 2 Folhas P.capsici Estelar limoniforme 42±5,3X 23,3±2,1 1,8:1 3,6±0,4 5,8±0,6 44,6±8,2 - 2639 1 Folhas P.capsici Rosacea limoniforme 42,6±7 X 23,3±1,8 1,9:1 4,3±1,5 6,5±1,7 25,6±6,7 - 2641 3 Hastes P.capsici Petalóide limoniforme 39,9±5,9 X 21,5±1,6 1,9:1 4,3±1,2 5,9±0,7 37,5±13,2 - 2642 1 Caule P.capsici Rosacea limoniforme 48,1±5,4 X 24,4±3,4 1,9:1 4±0,7 6,4±0,7 43,8±15,7 - 2662 5 Folhas P.capsici Estelar limoniforme 41,4±5,2 X 21,7±1,5 2,0:1 3,9±7 6,6±0,5 20±9,8 - 2663 4 Peciolo P.capsici Rosacea limoniforme 39,4±6,5 X 22,1±2 1,9:1 4,1±0,6 6,3±0,6 22,9±12,2 - 2664 4 Folhas P.capsici Estelar limoniforme 41,6±7,1 X 22,6±2,8 1,9:1 4,4±0,9 6,8±0,9 18,9±7,1 - 2666 4 Peciolo P.capsici Estelar limoniforme 37,7±4,1 X 23,1±2,3 1,6:1 3,8±3,5 6,6±0,8 34,2±10,3 - 2667 6 Folhas P.capsici Rosacea limoniforme 36,8±4,9 X 21,6±2,2 1,7:1 3,5±0,5 6,7±0,8 30,6±11,8 - 2668 2 Folhas P.capsici Rosacea limoniforme 37,4±6,1 X 21,6±2,9 1,7:1 4±0,6 5,6±0,6 46,8±17,1 - 2669 3 Folhas P.capsici Estelar limoniforme 41,9±7,3 X 20,4±2,9 2,1:1 4,1±0,7 5,8±0,6 46,7±16,5 - 2670 2 Peciolo P.capsici Estelar limoniforme 39,5±6,3 X 23,4±3,5 1,7:1 3,8±0,7 7,5±0,6 34,4±11,2 - 2671 4 Peciolo P.capsici Rosacea limoniforme 44,2±4 X 23,5±1,1 1,8:1 4,8±0,7 6,7±0,7 43,7±12,8 - 2672 4 Peciolo P.capsici Estelar limoniforme 37,8±5,4 X 21,7±2 1,8:1 7±0,7 3,6±0,5 28,2±8,9 - 2675 4 Folhas P.capsici Rosacea limoniforme 36,7±5,7 X 22,2±3,1 1,7:1 4±0,7 7,3±0,7 30,1±10,7 - 2677 6 Peciolo P.capsici Rosacea globoso 42,8±4,1 X 29,9±4,8 1,4:1 4,3±1 7,8±1 24,4±9,6 - 2678 3 Peciolo P.capsici Estelar limoniforme 46,8±6,2 X 23,2±3,1 2,0:1 4,1±0,6 6±0,8 49,3±14,3 - 2679 2 Folhas P.capsici Estelar limoniforme 39,4±10,7 X 23,1±2,6 1,9:1 3,7±0,8 7±0,8 36,8±11,1 - 2682 1 Peciolo P.palmivora Colapsada obpiriforme 40,6±5,1 X 24,1±2,4 1,7:1 5,6±1,2 6,8 ± 1 - 24,7±2,3 2684 2 Peciolo P.capsici Petalóide limoniforme 48,9±7,8 X 24,4±2,4 2,1:1 4±0,5 6,4±0,7 47,4±9,9 -
