República Federativa do Brasil M inistério do Desenvolvimento, Indústria
e do Comércio Exterior I nstituto Nacional da Propriedade Industrial
(22) Data de Depósito: 17/06/2004 (43) Data de Publicação: 25/07/2006
(RPI 1855)
(51) Int. C17.:
A61K 47/48 A61P 37/02
(54) Título: USO DE UM COMPOSTO, MÉTODO PARA MODULAR A RESPOSTA IMUNE DE UM INDIVÍDUO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, VACINA,
COMPLEXO, E, KIT PARA A CAPTURA DE UMA MOLÉCULA BIOLOGICAMENTE ATIVA
(30) Prioridade Unionista: 18/06/2003 US 60/479,185;
25/09/2003 US 60/505,638; 21/01/2004 US 60/537,553; 19/02/2004 US 60/545,505
(71) Depositante(s): Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem (IL) , Biolab Ltd (IL)
(72) Inventor(es): Yechezkel Barenholz, Aviva Joseph, Eliezer Kedar
(74) Procurador: Momsen, Leonardos & Cia.
(86) Pedido Internacional: PCT IL2004/000534 de 17/06/2004
(87) Publicação Internacional: WO 2004/110496 de 23/12/2004
(57) Resumo: "USO DE UM COMPOSTO, MÉTODO PARA MODULAR A RESPOSTA IMUNE DE UM INDIVÍDUO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, VACINA, COMPLEXO, E, KIT PARA A CAPTURA DE U MA MOLÉCULA BIOLOGICAMENTE ATIVA". A presente invenção refere-se ao uso de um conjugado esfingóide-polialquilamina como um agente de captura de moléculas biologicamente ativas, tais que antígenos.
Em uma modalidade particular, polialquilaminas e esfingóides são usados para a preparação da composição farmacêuticas para modular a resposta i mune de um indivíduo. Outros aspectos da invenção referem-se a métodos para modular a resposta imune de um indivíduo através do uso do conjugado, complexos que compreendem o conjugado esfingóide- polialquilamina em combinação com uma molécula biologicamente ativa, capaz de modular uma resposta imune de um indivíduo, composições que compreendem o conjugado, assim como kits, que utilizam o referido conjugado. Um conjugado preferido de acordo com a invenção é N- palmitoil D-eritro esfingosil 1 carbamoil espermina.
• o • • .8 ••• •
"USO DE UM COMPOSTO, MÉTODO PARA MODULAR A RESPOSTA IMUNE DE UM INDIVÍDUO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, VACINA, COMPLEXO, E, KIT PARA A CAPTURA DE UMA MOLÉCULA BIOLOGICAMENTE ATIVA"
5 CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se à vacinação utilizando conjugados polialquilamina de esfingolipídeos para o fornecimento efetivo de materiais biologicamente ativos, em particular de moléculas antigênicas.
LISTA DA ARTE ANTECEDENTE
10 A que se segue é uma lista da arte antecedente, que é considerada como sendo pertinente para descrever o estado da arte no campo da invenção.
US 5.334. 761: "Cationic lipids";
US 2001/ 048939: "Cationic reagents of transfection";
15 US 5.659.11: "Agents having high nitrogen content and high cationic charge based on dicyanimide diciandiamide or guanidine and inorganic ammonium salts";
US 5.674. 908: "Highly packed polycationic ammonium, sulfonium and phosphonium lipids";
20 US 6.281.3171: "Lipopolyamines, and the preparation and use thereof ';
US 6.075.012: "Reagents fo intracellular delivery of macromolecules";
US 5. 783. 565: "Cationic amphiphiles containing spermine ou 25 spermidine cationic group for intracellular delivery of Therapeutic
molecules";
Marc Antoniu & Alexandru T. Balaban, Expert Opin. Ther, Patents 11 (11) : 1729-1752 (2001);
Miller AD. Chem. Int. Ed. Eng. 37: 1768-1785 (1998);
Brunel F. et al. Vaccine 17: 2192-2193 (1999);
Guy B. et al. Vaccine 19: 1794 - 1805 (2001);
Lima KM et al. Vaccine 19: 3518 - 3525 (2001).
5 FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
Muitas moléculas biológicas e seus análogos, incluindo proteínas e polinucleotídeos, substâncias estranhas e drogas, que são capazes de influenciar a função celular em nível sub- celular ou molecular são preferivelmente incorporadas ao interior da célula de modo a produzir o seu 10 efeito. Para estes agentes, a membrana celular apresenta uma barreira seletiva, que é impermeável a eles. A composição complexa da membrana celular compreende fosfolipídeos, glicolipídeos, e colesterol, assim como proteínas intrínsecas e extrínsecas, e suas funções são influenciadas pelos componentes citoplásmicos, que incluem Ca++ e outros íons metálicos, ânions, ATP, 15 microfilamentos, microtúbulos, enzimas, e proteínas de ligação Ca++ (e
também pelo glicocalix extracelular (proteoglicanos, glicose aminoglicanos e glicoproteínas). Interações dentre os componentes celulares citoplásmicos e estruturais e suas respostas a sinais externos formam os processos de transporte responsáveis pela atividade de membrana exibida no interior e 20 dentre os tipos de célula.
A distribuição bem sucedida de agentes não absorvidos naturalmente pelas células ao interior das células foi investigada. A barreira da membrana pode ser ultrapassada pelos agentes de associação em complexos com formulações de lipídeo, que simulam aproximadamente a 25 composição de lipídeo das membranas celulares naturais. Estas formulações podem se fundir com as membranas celulares mediante contato, ou, o que é mais comum, podem ser absorvidas mediante pinocitose, endocitose e/ou fagocitose. Em todos estes processos, as substâncias associadas podem ser fornecidas às células.
Complexos de lipídeo podem facilitar as transferências intracelulares também ultrapassando as repulsas de carga entre a superfície celular, que, na maioria dos casos, está carregada negativamente. Os lipídeos das formulações compreendem um lipídeo anfipático, tais que os 5 fosfolipídeos das membranas celulares, e formam várias camadas ou agregados, tais que micelas ou vesículas de lipídeo ocas (lipossomas), em sistemas aquosos. Os lipossomas pode ser usados para capturar a substância a ser distribuída no interior dos lipossomas; em outras aplicações, a molécula da droga de interesse pode ser incorporada ao interior da vesícula de lipídeo 10 como um componente da membrana intrínseco, preferivelmente que a capturado dentro do interior aquoso oco, ou ligado eletrostaticamente à superficie do agregado. No entanto, a maioria dos fosfolipídeos usados são ou zwiteriônicos (neutros) ou negativamente carregados.
Um avanço na área da distribuição intracelular foi a descoberta 15 de que um líquido catiônico sintético positivamente carregado, cloreto de N- [1-(2,3-dioleilóxi) propil]-N,N,N-trimetilamônio (DOTMA), sob a forma de lipossomas, ou de pequenas vesículas, poderia interagir espontaneamente com DNA ou com complexos de lipídeo-DNA, que são capazes de adsorção às membranas celulares e de serem absorvidos pelas células, seja por fusão ou 20 mais provavelmente através de endocitose adsortiva, resultando na expressão do transgene [Felgner, P. L. et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84: 7417 (1987) e Patente U.S. 4. 897. 355 de Epstein, D. et ali. Outros usaram, de modo bem sucedido, um análogo DOTMA, 1,2-bis(Oleiloxi)-3- (trimetilamônio) propano (DOTAP) em combinação com um fosfolipídeo 25 para forma vesículas de complexação com DNA. O reagente LipfectinTM (Bethesda Research Laboratories, Gaithersburg, MD), um agente efetivo para o fornecimento de polinucleotídeos altamente aniônicos ao interior de células de cultura de tecido vivo, compreende lipossomas positivamente carregados, compostos do lipídeo positivamente carregado DOTMA e de um lipídeo
neutro dioleil fosfatidil etanol amina DOPE) referido como a lipídeos auxiliares. Estes lipossomas interagem espontaneamente com ácidos nucleicos negativamente carregados para formar complexos, referidos como a lipoplexos. Quando é usado excesso de lipossomas positivamente carregados 5 em relação a cargas negativas de DNA, a carga líquida dos complexos resultantes é também positiva. Complexos positivamente carregados preparados deste modo se ligam espontaneamente a superfícies celulares negativamente carregadas ou são introduzidos ao interior das células, seja através de endocitose adsortiva ou de fusão com a membrana plasmática, 10 ambos os processos distribuindo o polinucleotídeo funcional ao interior, por exemplo, das células de cultura do tecido. DOTMA e DOTAP são bons exemplos de lipídeos monocatiônicos [Illis et al, 2001, ibid].
Foi demonstrado que os cátions multivalentes em si mesmos (incluindo poliaminas, sais inorgânicos e complexos e solventes de 15 desidratação) facilitam a distribuição de macromoléculas ao interior das células. Em particular, os cátions multivalentes provocam o colapso de oligo e poliânions (moléculas de ácidos nucleicos, moléculas de aminoácido e os similares) a formas estruturais compactadas, e facilitam a compactação destes poliânions sob a forma de vírus, a sua incorporação em lipossomas, a sua 20 transferência ao interior das células [Thomas T. J. et al. Biochemistry 38:
3821-3830 (1999). Os menores policátions naturais, capazes de compactar o DNA, são as poliaminas espermidina e espermina. Pela ligação de uma âncora hidrofóbica a estas moléculas através de um agente de ligação, foi desenvolvida uma nova classe de vetores de transfecção, os lipopolímeros 25 policatiônicos.
Lipídeos catiônicos e polímeros catiônicos interagem eletrostaticamente com os grupos aniônicos do DNA (ou de qualquer outra macromolécula polianiônica) que forma os complexos de DNA- lipídeo (lipoplexos) ou os complexos de DNA-policátion (poliplexos). A formação do
complexo está associada com a liberação de contraíons dos lipídeos ou polímero, que é a força de ação termodinâmica para a formação espontânea do lipoplexo e do poliplexo. Os lipídeos catiônicos podem ser divididos em quatro classes: (i) lipídeos de sal de amônio quaternário (por exemplo, 5 DOTMA (LipofectinTM) e DOTAP) e congêneres fosfônio/ arsônio; (ii) lipopoliaminas; (iii) lipídeos catiônicos, que contêm ambas as porções poliamina e amônio quaternário e (iv) lipídeos do sal heterocíclico, guanidínio e amidínio.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
10 De acordo com um de seus aspectos, a presente invenção refere-se ao uso de um conjugado esfingóide-polialquilamina para a preparação de uma composição farmacêutica para modular a resposta imune de um indivíduo.
De acordo com uma modalidade preferida, o conjugado 15 esfingóide-polialquilamina compreende uma espinha dorsal esfingóide que porta, através da ligação carbamoíla, pelo menos uma cadeia polialquilamina.
O conjugado esfingóide-polialquilamina, tal como aqui usado, denota a conjugação química (ligação) entre uma base esfingóide (também referida aqui pelo termo "espinha dorsal esfingóide") e pelo menos uma 20 cadeia polialquilamina. A conjugação entre a base esfingóide e pelo menos uma cadeia polialquilamina é através de uma ligação carbamoíla, como detalhado adicionalmente a seguir.
A espinha dorsal /base esfingóide, tal como aqui usada, inclui aminas alifática de cadeia longa, contendo dois ou três grupos hidroxila, a 25 cadeia alifática podendo ser saturada ou insaturada. Um exemplo de uma base esfingóide não- saturada é aquele contendo uma ligação trans-dupla distinta na posição 4.
O termo modulação, como aqui usado, denota qualquer efeito bioquímico ou regulador mensurável, exibido pelo material biologicamente
ativo fornecido pelo conjugado, em uma resposta imune do indivíduo, incluindo a resposta celular e/ou a resposta humoral. A modulação inclui a inibição ou, por outro lado, a estimulação ou a melhora de qualquer ou de ambos os tipos de respostas quando o conjugado esfingóide-polialquilamina é 5 administrado ao referido indivíduo em combinação com uma substância bilogicamente ativa. A modulação refere-se, de modo preferido, ao estímulo ou melhora em um fator de dois ou mais, em relação àquele produzido pela molécula biologicamente ativa administrada sem o conjugado. A invenção refere-se também à modulação de uma reposta imune em casos em que o 10 material biologicamente ativo administrado sem o conjugado é
substancialmente ineficaz em produzir uma tal resposta.
Ainda adicionalmente, a modulação refere-se à inibição ou supressão da resposta imune de um indivíduo, por exemplo, para o tratamento de doenças autoimunes, assim como para o tratamento de alergia.
15 Deste modo, o termo, molécula biologicamente ativa, como aqui usado, denota qualquer substância que, quando administrada em combinação com o conjugado esfingóide-polialquilamina, possui um efeito sobre o sistema imune de um paciente. O material biologicamente ativo é, de modo preferido, uma proteína antigênica, peptídeo antigênio, polipeptídeo 20 antigênico ou carboidrato antigênico.
De acordo com outro aspecto, a presente invenção refere-se a um método para modular a resposta imune de um indivíduo, o método compreendendo prover o referido indivíduo com um conjugado esfingóide- polialquilamina com uma molécula biologicamente ativa, o referido 25 conjugado esfingóide-polialquilamina compreendendo uma espinha dorsal esfingóide, que porta, através de uma ligação carbamoíla, pelo menos uma cadeia polialquilamina.
De acordo ainda com outro aspecto, a presente invenção refere-se a uma composição farmacêutica para modular a resposta imune de
um indivíduo, a composição compreendendo: (i) pelo menos um conjugado esfingóide-polialquilamina; e (ii) pelo menos uma molécula biologicamente ativa associada com o referido conjugado.
De acordo com ainda um outro aspecto, a invenção provê um 5 complexo, que compreende: (i) um conjugado esfingóide-polialquilamina e (ii) um material biologicamente ativo, capaz de modular uma resposta imune
de um indivíduo.
Finalmente, a invenção refere-se ao uso de:
Finalmente, a invenção refere-se ao uso de um conjugado 10 esfingóide-polialquilamina conforme definido, como um agente de captura de moléculas biologicamente ativas (por exemplo, moléculas antigênicas). Neste contexto, o conjugado esfingóide-polialquilamina pode fazer parte de um kit para capturar moléculas biologicamente ativas, de modo preferido moléculas antigênicas e/ ou imunoestimulantes, e/ ou imunossupressores, o kit 15 compreendendo, em adição ao referido conjugado, instruções para o uso do mesmo para a captura de moléculas biologicamente ativas. O conjugado no kit pode estar em uma forma seca, em cujo caso, o kit pode também incluir um fluido adequado, com o qual o conjugado é misturado antes do uso de modo a formar uma suspensão ou emulsão ou solução, ou pode já estar sob a 20 forma de um fluido (suspensão, emulsão, solução, etc.). O kit pode ter numerosas aplicações. Por exemplo, o kit pode ser usado para investigar a função de diferentes moléculas imunomoduladoras na modulação de respostas imunes, para o isolamento de moléculas biologicamente ativas, e identificação das mesmas. Aqueles versados na arte saberão como fazer uso de um tal 25 agente de captura também para propósitos de pesquisa.
O termo agente de captura, como aqui usado, refere-se ao conjugado, que é capaz de se associar com moléculas biologicamente ativas, as últimas tendo uma carga negativa, um dipolo negativo ou uma carga negativa local (uma área dentro de molécula que porta uma carga negativa
líquida), em virtude da estrutura policatiônica do conjugado. A captura per se envolve a interação eletrostática entre a molécula a ser capturada, ao transporte da referida carga negativa, dipolo negativo ou carga negativa local e o conjugado positivamente carregado da invenção.
5 O conjugado da invenção pode ser também usado como um veículo de distribuição, transportando, pela captura ao mesmo, moléculas biologicamente ativas a um sítio alvo e a uma célula alvo.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
De modo a que a invenção seja entendida e para observar 10 como ela pode ser executada na prática, algumas modalidades serão agora descritas, por meio de exemplos não- limitativos apenas, com referência às figuras anexas, nas quais:
As figuras 1A-1D apresentam várias estruturas químicas possíveis, de lipídeo "linear", ramificado", ou "cíclico", tais como compostos 15 catiônicos (LLC), que são abrangidos pela definição geral de conjugado esfingóide-polialquilamina da fórmula (I), em que a Fig. IA apresenta uma espinha dorsal esfingóide (ceramida) ligada a uma cadeia polialquilamina única, a Fig. 1B e a Fig. 1C apresentam a mesma espinha dorsal esfingóide ligada a duas cadeias polialquilamina, a Fig. 1D apresenta novamente a 20 mesma espinha dorsal, no entanto, no qual uma única cadeia polialquilamina é ligada por meio das duas porções hidroxila para formar um conjugado polialquilamina cíclico.
As Figs. 2A- 2F apresentam a biodistribuição e a farmacocinética de várias formulações de lipídeo rotuladas de modo 25 fluorescente no GI - -, pulmões -•- ou baço --- com não-recuperados -0 -; a Fig. 2 apresenta a distribuição de DMPC: DMPG vazio (razão molar 9: 1); a Fig. 2B apresenta a distribuição de DMPC: DMPG: HN; a Fig. 2C apresenta a distribuição de DOTAP: colesterol vazio; a Fig. 2D apresenta a distribuição de DOTAP: colesterol : HN; a Fig. 2E apresenta a distribuição de CCS:
HN.
As Figs. 3A - 3D apresentam a biodistribuição de várias formulações conjuntas de lipídeo carregado com 125I-HN no GI -a-,
5 pulmões -•- ou baço — com não- recuperados - x-; e, de modo particular, a Fig. 3A apresenta a biodistribuição de 125I-HN; A Fig. 3B apresenta um conjunto de lipídeo carregado com 1251-HN, composto de DOTAP:
Colesterol; a Fig. 3C apresenta um conjunto de lipídeo carregado com 1251- RN composto de DMPC: DMPG e a Figura 3D apresenta um conjunto de 10 lipídeo carregado com 125I-HN composto de CCS; Colesterol.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se ao uso de conjugados esfingóide-polialquilamina como agentes de captura para transportar moléculas biologicamente ativas, que são eficazs na modulação das respostas 15 imunes de um indivíduo.
Os conjugados esfingóide-polialquilamina são compostos catiônicos tipo lipídeo (LLC), que podem ser sintetizados do modo que se segue. Bases de cadeia longa N-substituídas, em particular esfingóides N- substituídos ou bases esfingóides são acoplados junto com diferentes 20 polialquilaminas ou seus derivados, para formar uma entidade polialquilamina
- esfingóide, que é usada como tal, ou adicionalmente alquilada.
A protonação em pH adequado ou a alquilação da entidade polialquilamina - esfingóide atribui aos compostos tipo lipídeo uma carga
• positiva desejada para a interação com moléculas biológicas biologicamente 25 ativas a serem distribuídas ao interior de células alvo e com as células objetivadas. Os conjugados esfingóide-polialquilamina podem ser eficientemente associados com as moléculas biologicamente ativas em virtude de interações eletrostáticas entre o caráter aniônico das moléculas biologicamente ativas e as porções polialquilamina do conjugado para formar
complexos (lipoplexos).
Em alternativa, os conjugados esfingóide-polialquilamina podem formar conjuntos carregados com as moléculas biologicamente ativas.
O conjugado esfmgóide-polialquilamina pode estar sob a 5 forma de moléculas tipo lipídeo individuais ou sob a forma de um conjunto.
Um exemplo de um conjunto adequado inclui a formação de micelas ou vesículas, e, em particular, lipossomas. Outros exemplos de conjuntos incluem a formação de micelas, fases invertidas, fases cúbicas e os similares.
De modo evidente, o conjugado polialquilamina esfmgóide pode ser 10 combinado em forma de vesícula/ micela ou qualquer outra combinação de
conjuntos.
Conjunto de lipídeo, como aqui usado, denota uma coleção organizada de moléculas de lipídeo, que formam, inter alia, micelas e lipossomas. O conjunto de lipídeo estável, como aqui usado, denota um 15 conjunto, que é química e fisicamente estável sob condições de
armazenamento (4°C, em um meio fisiológico) durante pelo menos um mês.
Quando os conjuntos estão sob a forma de vesículas (por exemplo, lipossomas), a molécula biologicamente ativa pode ser encapsulada no interior da vesícula, parte de sua bicamada lipídica, ou adsorvida à 20 superficie da vesícula (ou qualquer combinação destas três opções). Quando os conjuntos são micelas, as moléculas biologicamente ativas podem ser inseridas nos anfifilos que formam as micelas, e/ ou associadas com ela eletroestaticamente, de um modo estável.
Deste modo, como aqui usados, os termos "encapsulado em", 25 "contido em", "carregado sobre" ou "associado com" indica uma ligação
física entre o conjugado e a molécula biologicamente ativa. A ligação fisica pode ser ou a retenção ou a captura da molécula dentro dos conjuntos (por exemplo, vesículas, micelas ou outros conjuntos) formados a partir do conjugado; a ligação não covalente da molécula biológica à superficie de tais
conjuntos, ou o embutimento da molécula biológica entre os conjugados polialquilamina esfingóides, que formam tais conjuntos. Deve ser notado que, devido à carga positiva ou ao dipolo positivo do conjugado polialquilamina esfingóide sob condições fisiológicas, a associação preferida entre o 5 conjugado e o material biologicamente ativo é efetuada através de interações
eletroestáticas, de dipolo ou de ácido-base.
Não obstante o acima, a invenção não deve estar limitada pelo tipo particular de associação formada entre o conjugado esfingóide- polialquilamina e a molécula biologicamente ativa. Deste modo, associação 10 significa qualquer interação entre o conjugado e o conjunto formado a partir do mesmo e o material biologicamente ativo, que é capaz de alcançar um efeito terapêutico desejado.
A molécula biologicamente ativa e o conjugado podem ser associados através de qualquer método conhecido na arte. Isto inclui, sem 15 estarmos limitados a isto, a pós ou a co-liofilização do conjugado com a molécula biologicamnete ativa ou a mera misturação do conjugado polialquilamina esfingóide previamente formado com a molécula biológica.
Métodos para a co-liofilização são descritos, inter alia, nas Patentes U.S.
6.156.337 e 6.066.331, enquanto que os métodos para a pós-encapsulação são 20 descritos, inter alia, na WO 03 / 000227, todos incorporados a esta a título
referencial.
Deste modo, de acordo com um primeiro de seus aspectos, a presente invenção refere-se ao uso de um conjugado esfingóide-
• polialquilamina para a preparação de uma composição farmacêutica para 25 modular a resposta imune de um indivíduo, em que o referido conjugado esfingóide-polialquilamina compreende uma espinha dorsal esfingóide, que porta, através de uma ligação carbamoíla, pelo menos uma, e de modo preferido, uma ou duas cadeias polialquilamina.
Como acima indicado, o conjugado esfingóide-polialquilamina
inclui uma ligação entre uma espinha dorsal esfingóide e pelo menos uma cadeia polialquilamina, a ligação sendo efetuada através de ligações carbamaoíla correspondente. De modo mais preferido, o conjugado esfingóide-polialquilamina possui a fórmula geral (I):
OR3
R2-W
NHR1
CF1201:Z4
5 em que:
R1 representa um hidrogênio, alquila linear ou ramificada, arila, alquilamina, ou um grupo -C(0) R5;
R2 e R5 representam, independentemente, uma alquila C10-C24 linear ou ramificada, grupos alquenila ou polienila;
10 R3 e R4 são independentemente um grupo -C(0) -NR6R7, R6 e R7 sendo o mesmo ou diferentes para R3 e R4 e representam, independentemente, um hidrogênio, ou um polialquilamina linear ou ramificada, saturada ou insaturada, em que uma ou mais unidades amina na preferida polialquilamina podem ser um amônio quaternário; ou
15 R3 é um hidrogênio; ou
R3 e R4 formam, junto com os átomos de oxigênio aos quais eles estão ligados um anel heterocíclico, que compreende -C(0)-NR9_[R8- NR9]m-C(0)-, R8 representa uma alquila C1 -C4 saturada ou insaturada e R9 representa um hidrogênio ou uma polialquilamina da fórmula -[R8-NR9]„-, em 20 que o referido R9 ou cada unidade alquilamina R8NR9 pode ser a mesma ou
diferente na referida polialquilamina; e
n e m são independentemente um inteiro de 1 a 10, de modo preferido de 3 a 6;
W representa um grupo selecionado a partir de -CH=CH-, 25 -CH2-CH(OH)- ou -CH2-CH2-.
Exemplos não- limitativos de esfingóides ou de bases esfingóides, que podem ser usados de acordo com uma modalidade mais específica da invenção, incluem, esfingosinas, diidroesfingosinas, fitoesfingosinas, deidrofitoesfingosinas er derivados dos mesmos. Exemplos 5 não limitativos de tais derivados são derivados acila, tais que ceramida (N- acilesfingosina), diidroceramidas, fitoceramidas e diidofitoceramidas, respectiviamente, assim como ceraminas (N-alquilesfingosina) e os derivados correspondentes (por exemplo, diidroceramina, fitoceramina, etc.). Os esfingóides N-substituídos ou as bases esfingóides possuem grupos hidroxila 10 livres, que são ativados e subseqüentemente reagidos com as polialquilaminas para formar a entidade polialquilamina - esfingóide. Exemplos não limitativos de agentes de ativação são N, N'-dissuccinimidilcarbonato, di- ou tri-fosgênio ou derivados imidazol. A reação destes agentes de ativação com os esfingóides ou as bases esfingóides fornece um cloroformato de 15 succinimidiloxicarbonila ou carbamato de imidazol, respectivamente, em uma ou ambas as hidroxilas. A reação dos esfingóides ativados com polialquilaminas pode fornecer os conjugados ramificados, de cadeia reta (não- ramificados) ou cíclicos, tal como apresentado na Fig. 1.
De acordo com uma modalidade preferida, a espinha dorsal 20 esfingóide é uma ceramida ligada a uma (Fig. 1A) ou duas (Fig. 1B ou 1 C)
polialquilaminas, ou ligadas através de duas porções hidroxila para formar uma porção polialquilamina cíclica (Fig. 1D).
Os conjugados esfingóide-polialquilamina formados podem ser adicionalmente reagidos com agentes de metilação de modo a formar 25 aminas quaternárias. Os compostos resultantes são positivamente carregados em um grau diferente, dependendo da razão entre as aminas quaternárias, primárias e/ ou secundárias dentro dos conjugados formados. Como tal, o conjugado esfingóide-polialquilamina existe como sal de nitrogênio quaternizado incluindo, mas não limitado a, cloreto de amônio quaternário,
iodeto de amônio quaternário, fluoreto de amônio quaternário, brometo de amônio quaternário, um oxiânions de amônio quaternário e uma combinação dos mesmos.
O conjugado esfingóide-polialquilamina é preferivelmente 5 usado em combinação com uma molécula biologicamente ativa. O material biologicamente ativo é qualquer molécula, que quando administrada com o conjugado esfingóide-polialquilamina, tenha um efeito sobre o sistema imune de um indivíduo, de acordo com uma modalidade, ou que estimule ou melhore o efeito. O efeito é, de modo preferido, de um fator de dois os mais 10 com relação ao efeito, se houver da molécula biologicamente ativa, quando
provido a um indivíduo sem o referido conjugado.
De acordo com uma modalidade, o material biologicamente ativo é uma proteína, polipeptídeo, peptídeo, ou carboidrato. De modo específico, a molécula biologicamente ativa pode ser um modulador imune, 15 incluindo proteína antigênica ou peptídeo antigênico, imunoestimulantes e/ ou
imunossupressores. Proteínas e peptídeos antigênicos, imunoestimulantes e imunossupressores são bem conhecidos na arte. De modo preferido, a proteína biologicamente ativa ou peptídeo ou carboidrato possui um pH fisiológico, ou um momento dipolo negativo líquido, uma carga negativa líquida ou contém 20 pelo menos uma região tendo uma carga negativa líquida negativamente
carregada.
De acordo ainda com outra modalidade, o material biologicamente ativo é uma molécula de ácido nucleico, tal que oligodeoxinucleotídeos (ODN).
25 Uma razão, em peso, preferida entre o conjugado esfingóide- polialquilamina e o material biologicamente ativo é uma razão, em peso, de 1000:1 a 1:1.
O conjugado esfmgóide-polialquilamina pode ser também combinado com outras substâncias ativas conhecidas, a serem usadas em
combinação com moléculas antigênicas. Tais substâncias incluem, por exemplo, agentes imunoestimulantes (também conhecidos pelo termo
"imunoestimulante" ou "adjuvante"). Isto inclui qualquer substância que, quando adicionada a uma vacina, aperfeiçoa a resposta imune, de tal modo 5 que menos vacina seja requerida para produzir uma resposta maior. O agente imunoestimulante pode ser provido junto com o conjugado/ material biologicamente ativo, ou dentro de um intervalo de tempo especificado (por exemplo, várias horas ou dias antes ou após a administração do conjugado / molécula biologicamente ativa).
10 Agentes imunoestimulantes preferidos incluem, sem que estejamos limitados a estes, citoquinas, tais que interleucinas (IL-2, IL-10, IL- 12, IL-15, IL-18), interferonas (IFN alfa, beta, gama), oligodeoxinucleotídeos (ODN), toxinas (por exemplo, toxina da Meta (CT), enterotoxina estafilocócica B (SEB), enerotoxina E. Coli rotulada termicamente (HLT) 15 assim como outros adjuvantes conhecidos daqueles versados na arte para
aumentar ou estimular a resposta imune a uma molécula antigênica.
Os conjuntos podem incluir o conjugado esfingóide- polialquilamina (metilado ou não metilado) como o único ingrediente tipo lipídeo, ou ser combinados com outros substâncias lipídicas auxiliadoras. Tais 20 substâncias lipídicas auxiliadoras podem incluir lipídeos não- catiônicos, tais que DOPE, DOPC, DMPC, Colesterol, ácido oléico ou outros em diferentes razões molares para o composto tipo lipídeo. Colesterol é uma substância adicionada preferida para a aplicação in vivo, enquanto que DOPE pode ser um lipídeo auxiliador preferido para aplicações in vitro. Nesta modalidade 25 particular, a razão molar de colesterol para o lipídeo catiônico está dentro da
faixa de 0,01 - 1,0 e preferivelmente de 0,1 - 0,4.
Os conjuntos podem também incluir agentes de melhoramento (como conhecido na arte, tais que CaC12 e polialquilaminas solúveis.
Outros componentes que podem ser incluídos no conjunto de
lipídeo, e que são conhecidos para serem usados em estruturas dos similares, são estabilizadores estéricos. Um exemplo de um estabilizador estérico comumente usado é a família dos lipopolímeros, por exemplo, lipídeos derivados de polietileno glicol (conjugado PEG-lipídeo). Esta família de 5 compostos é conhecida, inter alia, como sendo capaz de aumentar (estender)
o período de tempo de circulação dos lipídeos.
De acordo com uma modalidade, os lipossomas formados podem ser moldados como vesículas heterogêneas não classificadas e vesículas heterolamelares (UHV) tendo um diâmetro de cerca de 50-5000 nm.
10 O UHV formado pode ser reduzido a um tamanho menor e convertido a vesículas unilamelares grandes (mais homogêneas (LUV) tendo um diâmetro de cerca de 50-100 nm através de processamento adicional. A estrutura e as dimensões das vesículas, por exemplo, a sua configuração e tamanho podem apresentar implicações importantes sobre a sua eficiência como veículos para 15 a distribuição das entidades biológicas ativas ao alvo, isto é, estas determinam
as suas propriedades de distribuição.
Um grupo preferido de cadeias polialquilamina, que fazem parte do conjugado esfingóide - polialquilamina foram estruturalmente definidas acima em conexão com a fórmula (I). De acordo com esta 20 modalidade, as cadeias polialquilamina, que podem ser as mesmas ou diferentes no conjugado da fórmula (I), são selecionadas a partir de espermina, espermidina, um análogo polialquilamina ou uma combinação dos mesmos. O termo análogo de polialquilamina é usado para denotar qualquer cadeia polialquilamina, e, de acordo com uma modalidade, denota uma 25 polialquilamina compreendendo de 1 a 10 grupos amina, preferivelmente de 3 a 6 e, de modo preferido, 3 ou 4 grupos amina. Cada alquilamina dentro da cadeia polialquilamina pode ser a mesma ou diferente e pode ser uma amina primária, secundária, terciária ou quaternária.
A porção alquila, que pode ser a mesma ou diferente dentro da
cadeia polialquilamina é, de modo preferido, uma unidade de repetição alifática C1-6. Alguns exemplos não - limitativos de polialquilaminas incluem espermidina, N-(2-aminoetil)-1,3-propano-diamina, 3,3'- irninobispropilamina, espermina e derivados bis (etil) de espermina, 5 polietilenoimina.
O conjugado esfingóide-polialquilamina mais preferido de acordo com a invenção é N-palmitoil D-eritro esfingosil carbamoil- espermina (CCS). Este conjugado inclui uma ceramida ligada através de uma ligação carbamoíla à espermina.
10 O conjugado esfingóide-polialquilamina de acordo com a invenção é usado, de modo preferido, para a preparação de uma vacina.
De acordo com uma modalidade, o conjugado esfingóide- polialquilamina e preferivelmente o CCS, é usado para a preparação de uma vacina de influenza. Em uma modalidade particular, o material 15 biologicamente ativo é derivado do vírus influenza ou de um análogo biologicamente ativo de uma molécula derivada a partir do vírus influenza.
Tais análogos incluem qualquer substância, que inclui um fragmento antigênico derivado de influenza, que produz uma resposta imune.
Um material antigênico derivado de influenza específico são 20 as moléculas hemaglutinina (HA) e neuramidase (NA), a combinação sendo
referida como HN.
A presente invenção também refere-se a um método para modular a resposta imune de um indivíduo, o método compreendendo tratar o referido indivíduo com o conjugado esfingóide-polialquilamina junto com um 25 material biologicamente ativo.
O tratamento combinado inclui a administração do conjugado esfingóide-polialquilamina e do material biologicamente ativo seja conjuntamente, ou dentro de um intervalo de tempo previamente definido, assim como durante várias horas ou vários dias (opcionalmente em
combinação com um imunoestimulante). No entanto, de acordo com uma modalidade preferida, o conjugado e o material biologicamente ativo são misturados, de um modo conjunto, antes da administração ao paciente.
A administração do conjugado esfingóide-polialquilamina 5 junto com o material biologicamente ativo refere-se a outro aspecto da invenção. Deste modo, é provida uma composição farmacêutica, que compreende um veículo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade eficaz do conjugado esfingóide-polialquilamina, junto com o material biologicamente ativo. A composição farmacêutica compreende opcionalmente 10 um imunoestimulante.
O conjugado esfingóide-polialquilamina em combinação com o material biologicamente ativo pode ser administrado e dosado de acordo com a boa prática médica, levando em consideração a condição clínica do paciente individual, o sítio e o método de administração, a programação de 15 administração, a idade do paciente, sexo, peso corpóreo e outros fatores
conhecidos daqueles versados na arte médica.
A "quantidade eficaz", para os propósitos nesta, denota uma quantidade, que é eficaz para modular (melhorar ou estimular, tal como acima definido) a resposta do paciente em relação ao efeito obtido quando o material 20 biologicamente ativo é provido ao paciente sem o conjugado esfingóide - polialquilamina. De modo preferido, a quantidade é eficaz para alcançar a imunização eficaz de um indivíduo contra uma doença ou distúrbio específico.
Não obstante o acima, a quantidade pode ser eficaz para 25 alcançar a supressão ou a inibição da resposta imune, por exemplo, para o
propósito de tratar alergia ou respostas autoimunes.
A composição da invenção, que compreende o conjugado esfingóide-polialquilamina associado com o material biologicamente ativo pode ser administrada de vários modos: exemplos não- limitativos de vias de
administração incluem a administração por via oral, subcutânea (s.c.), parenteral incluindo intravenosa (i.v.), intraarterial (i.a), intramuscular (i. m.), intraperitonial (i.p.), intrarretal (i.r.), intranasal (i.n.), assim como através de técnicas de infusão ao olho intraocular. Preferivelmente, os modos de 5 administração são as administrações intranasal ou intramuscular.
• O veículo fisiologicamente aceitável de acordo com a invenção refere-se, de modo genérico, a substâncias inertes, não- tóxicas ou líquidas, de modo preferido que não reajam com o material biologicamente ativo ou com o conjugado, e que é requerido para a distribuição eficaz do 10 conjugado com a molécula biologicamente ativa.
Exemplos não limitativos do veículo fisiologicamente aceitável incluem água, solução salina, 5% de dextrose (glicose), 10% de sacarose, etc., seja isoladamente ou com quantidades menores (de até 10%) de um álcool, tal que etanol.
15 De modo preferido, a composição da invenção é uma formulação líquida, que inclui suspensões, soluções aquosas ou sob a forma de um aerossol, todas as quais são conhecidas daqueles versados na arte. As formulações de aerossol podem ser colocadas no interior de propelentes pressurizados aceitáveis, tais que propano, nitrogênio, e os similares. Elas 20 podem ser também formuladas como substâncias farmacêuticas para preparações não- pressurizadas, tais que em veículos adequados para um aparelho de nebulização ou de atomização.
DESCRIÇÃO DOS EXEMPLOS ESPECÍFICOS INFLUENZA
25 Caracterização de lipossomas catiônicos carregados com antígeno HN
A eficiência de encapsulação de HN (uma preparação comercial de hemaglutinina e neuramidase derivada de vírus de influenza) carregada sobre várias formulações lipossômicas catiônicas, em diferentes
razões p/p de lipídeo/ proteína diferentes (3/1 - 300/1), e com ou sem colesterol (Col) foi testada. A tabela 1 apresenta os resultados de um tal experimento, usando os lipídeos catiônicos DOTAP e CCS.
Tabela 1-O efeito da razão do lipídeo (DOTAP, CCS)/ proteína e 5 colesterol (Col) sobre a eficiência de encapsulação de HN
DOTAP/
HN, razão P P/
DOTAP / Col, razão molar
% encapsulação
de HN
CCS/
HN, razão p/p
CCS/ Col, razão molar
% encapsulação
HN
300/1 1/1 93 300/1 1/0 73
100/1 1/1 90 100/1 1/0 64
50/1 1/1 90 30/1 1/0 38
30/1 1/1 88 10/1 1/0 1
10/1 1/1 79
3/1 1/1 35
100/1 1/0 90 300/1 3/2 71
100/1 1/1 92 100/1 3/2 64
100/1 2/1 89 30/1 3/2 41
100/1 4/1 80 10/1 3/2 O
Uma vacina monovalente foi usada para DOTAP e uma vacina trivalente para CCS.
O percentual de carga para DOTAP foi de 75-90% usando uma razão p/p de lipídeo /proteína de 50/1 a 300/1, com e sem Col. Em razões 10 p/p de lipídeo/proteína de 30/ 1 a 300/ 1, foi alcançada carga de antígeno de
—90%, diminuindo para 79% e 35% em razões p/p de 10/ 1 e 3/1, respectivamente. A adição de Col à formulação não afetou a carga em razões molares de DOTAP/ Col de 1/1 e 2/1, com encapsulação ligeiramente mais baixa (80%) em uma razão de 4/ 1. Para CCS, com ou sem Col, a eficiência 15 da carga foi menor (64-73% em razão p/p de 100/1 - 300/1).
A associação de HN com os lipossomas mediante simples misturação do antígeno solúvel com lipossomas vazios previamente formados foi também determinada. Em tais casos, 40-60% do antígeno foi associada com os lipossomas usando uma razão p/p de proteína/ lipídeo de 100/ a 300/1, 20 independentemente da formulação.
Estas descobertas, coletivamente, indicam uma eficiência de carga muito alta (> 60%) usando um procedimento simples e ligeiro (5
minutos) em todas as formulações. Além disso, mesmo os lipossomas previamente formados em suspensões aquosas foram capazes de serem eficazmente associados com antígenos superficiais do vírus influenza.
A imunogenicidade das várias razões p/p de lipídeo /antígeno 5 (com ou sem a adição de colesterol) foram também avaliadas.
Em um primeiro experimento, os níveis de soro dos anticorpos HI, IgG1 e IgG2 seguindo-se à vacinação i. n de camundongos BALB/c jovens (2 meses de idade) com lipossomas neutros, aniônicos ou catiônicos carregados com HN foram determinadas (Tabela 2A). O antígeno HN era uma 10 vacina de subunidade monovalente derivada da cepa A/ New Caledonia (H1N1). No mesmo experimento, os níveis pulmonares e nasais dos anticorpos HI, IgGl. IgG2a e IgA, e os níveis de INFy produzidos pelas células do baço, foram também testados (Tabelas 2B e 2 C).
Tabela 2A- Níveis de soro dos anticorpos HI, IgC1 e IgG2a
Grupo (n=5)
Vacina Soro
HI (média ± desvio IgG1 IgG2a padrão)
1 PBS O O O
2 F-HN O 55 O
3 Lip (DMPC)-HN (Neutral) 3±7 (0) 150 O
4 Lip (DMPC/DMPG)-HN 6±13 (20) 500 O
(Anionic)
5 Lip (DC-Chol:DOPE)-HN 18±7 (0) O O
6 Lip (DSTAP:Chol)-HN 28±29 (40) 20 O
7 Lip (DDAB: Chol)-HN 136±32 (100) 100 O 8 Lip (DOTAP: Chol)-HN 576±128 (100) 15000 730 9 Lip (DMTAP: Chol)-HN 672±212 (100) 30000 470 10 Lip (CCS: Chol)-HN 2368±1805 (100) 30000 9000 1 1 F-HN+CT (1µg) 1664±572 (100) 55000 7000 F- HN, antígeno livre; Col, colesterol; CT, toxina da cólera. Os grupos 5-10 são lipossomas catiônicos. Em parênteses, % de soroconversão - % de camundongos com titulação de HI 40.
15 Em particular, foi efetuada uma comparação entre os conjuntos (Lip) neutros (DMPC), aniônicos (DMPC/ DMPG, razão molar 9/1) e catiônicos (6 formulações), que encapsulam os antígenos HN para induzir as respostas locais e sistêmicas seguindo-se a duas administrações i. n. Para todas as formulações a razão p/p de lipídeo /Hn foi de 300/ 1 e a razão molar
de lipídeo catiônico /Col ou lipídeo catiônico / DOPE foi de 1/1. O antígeno livre (F-HN) F-HN co-administrados com a toxina da cólera (CT, 1 µg(como um adjuvante foram testados em paralelo. A vacina foi administrada nos dias 0, e 7,3 µg/ dose (10 µ1 por narina), e as respostas foram determinadas 4-6 5 semanas após a segunda dose da vacina.
Tabela 2B- Níveis de lavagem pulmonar e nasal dos anticorpos IgG1, IgG2a e IgA.
Grupo (n=5)
Vacina Pulmão Nasal
IgG1 IgG2a IgA IgG1 IgG2a IgA
1 PBS O O O O O O
2 F-HN O O O O O O
3 Lip (DMPC)-HN (Neutral) 30 O O O O O
4 Lip (DMPC/DMPG)-HN 40 O O O O O
(Anionic)
5 Lip (DC-Chol:DOPE)-HN O O O O O O
6 Lip (DSTAP:Chol)-HN O 20 O O 80 O
7 Lip (DDAB: Chol)-HN O 80 30 O 30 O
8 Lip (DOTAP: Chol)-HN 730 1050 170 40 180 30 9 Lip (DMTAP: Chol)-HN 470 3000 30 15 80 70 10 Lip (CCS: Chol)-HN 9000 30000 1900 15000 30 300 1 1 F-1{N+CT (1µg) 7000 10000 1800 40 120 30
Tabela 2C- Níveis de INFy do Baço (pg/ml)
Grupo Vacina Baço
(n=5)
IFNy (pg/ml)
1 PBS 1800
2 F-HN 1400
3 Lip (DMPC)-HN (Neutral) 4200 4 Lip (DMPC/DMPG)-HN (Anionic) 4000 5 Lip (DC-Chol:DOPE)-HN 4900
6 Lip (DSTAP:Chol)-HN 2300
7 Lip (DDAB: Chol)-HN 3100
8 Lip (DOTAP: Chol)-HN 8000
9 Lip (DMTAP: Chol)-HN 7800
10 Lip (CCS: Chol)-HN 10200
1 1 F-HN+CT (1µg) 5200
Como mostrado nas Tabelas 2A- 2C, o antígeno livre, assim 10 como o Lip-HN neutro e aniônico foram vacinas de mucosa virtualmente ineficazes. Em contraste, o Lip-HN catiônico, em particular aqueles designados por DOTAP- HN, DMTAP- HN e CCS-HN evocaram uma resposta humoral da mucosa e sistêmica robusta, com altos níveis de
anticorpos IgGl, IgG2 e IgA, ou seja uma resposta Thl + Th2 mista. Não haviam anticorpos IgE defeituosos. As vacinas lipossômicas catiônicas, que compreendem DOTAP- HN, DMTAP-HN e CCS- HN também induziram altos níveis de IFNy (mas nenhum IL-4) em células do baço estimuladas com 5 antígeno. As respostas produzidas por CCS-HN foram ainda mais fortes do que aquelas induzidas por F-HN com adição de CT. Com base nestas verificações, apenas as formulações lipossômicas catiônicas: DOTAP- HN, DMTAP -HN e CCS-HN foram ainda usadas.
Em um segundo experimento, o efeito da razão p/p de lipídeo 10 /HN sobre a imunogenicidade de lipossomas catiônicos carregados com HN e lipossomas previamente formados simplesmente misturados com o antígeno solúvel, foi determinada. Os dados apresentados nas Tabelas 3A-3C indicam que todas as três formulações induziram uma resposta sistêmica forte (soro) e local (pulmão), e que a redução da razão p/p de lipídeo /HN a abaixo de 100/
15 1 reduziu significativamente a resposta.
Tabela 3A - Níveis de soro dos anticorpos HI, IgG1, IgG2a e IgA
No. Vacina (n=5) Razão p/p de Lipídeo/
HN
III do soro IgG1 IgG2a IgA
1 F-HN O O O O
2 Lip (DOTAP)-HN 300/1 496±295 (100) 15000 450 O
3 100/1 196±119 (100) 5000 280 O
4 30/1 36±50 (80) 1000 200 O
5 10/1 28±18 (60) 600 30 O
6 3/1 O 20 O O
7 Lip (DMTAP)-HN 300/1 3 88±260 (100) 2500 250 O
8 100/1 208±107 (100) 2200 600 O
9 50/1 130±118 (80) 850 150 O
10 30/1 48±71 (40) 450 O O
1 1 10/1 24±35 (40) 120 O O
12 Lip (CCS)-HN 300/1 560±480 (100) 2000 1800 200
13 100/1 752±504 (100) 6500 6000 O
14 50/1 272±156 (100) 1900 700 O
15 30/1 112±125 (80) 650 400 O
16 10/1 52±68 (40) 275 440 O
17 F-HN+CT (1µg) 896±350 (100) 30000 8000 120 18 F-HN+Lip (DOTAP) 300/1 864±446 (100) 5000 1500 O 19 F-HN+Lip (DMTAP) 300/1 320±226 (100) 1900 400 O 20 F-HN+Lip (CCS) 300/1 704±525 (100) 30000 5000 500
