UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS FACULDADE DE CIÊNCIAS MÉDICAS
INGRIDI RAFAELA DE BRITO
ALGORITMOS MATEMÁTICOS COMO AUXÍLIO EM POTENCIAL NO DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DE NEOPLASIAS DO TÓRAX: CARCINOMA
NEUROENDÓCRINO DE PEQUENAS CÉLULAS, ADENOCARCINOMA DE PULMÃO E CARCINOMA EPIDERMÓIDE.
CAMPINAS 2020
INGRIDI RAFAELA DE BRITO
ALGORITMOS MATEMÁTICOS COMO AUXÍLIO EM POTENCIAL NO DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DE NEOPLASIAS DO TÓRAX: CARCINOMA
NEUROENDÓCRINO DE PEQUENAS CÉLULAS, ADENOCARCINOMA DE PULMÃO E CARCINOMA EPIDERMÓIDE.
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciências.
ORIENTADOR: PROF. DR. KONRADIN METZE
ESTE TRABALHO CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELA ALUNA INGRIDI RAFAELA DE BRITO, E ORIENTADA PELO PROF DR KONRADIN METZE
CAMPINAS 2020
Agência(s) de fomento e n°(s) de processo(s):CNPq 164847/2018-9 ORCID: https://orcid.org/0000-0003-4770-2475
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca da Faculdade de Ciências Médicas
Maristella Soares dos Santos - CRB 8/8402
Brito, Ingridi Rafaela de, 1990-
B777a Algoritmos matemáticos como auxílio em potencial no diagnóstico diferencial e neoplasias do tórax : carcinoma neuroendócrino de pequenas células,
adenocarcinoma de pulmão e carcinoma epidermóide / Ingridi Rafaela de Brito. – Campinas, SP : [s.n.], 2020.
Orientador: Konradin Metze.
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas.
1. Fractais. 2. Análise de textura. 3. Neoplasias. 4. Diagnóstico. I. Metze, Konradin, 1956-. II. Universidade Estadual de Campinas. Faculdade de Ciências Médicas. III. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Mathematical algorithms as a potential aid in the differential diagnoses of thoracic neoplasms: small cell neuroendocrine carcinoma, lung
adenocarcinoma and squamous cell carcinoma Palavras-chave em inglês:
Fractals
Texture analisys Neoplasm Diagnoses
Área de concentração: Fisiopatologia Médica Titulação: Mestra em Ciências
Banca examinadora: Konradin Metze [Orientador] Jose Barreto Campello Carvalheira Alexandre Todorovic Fabro
Data de defesa: 24-07-2020
COMISSÃO EXAMINADORA DA DEFESA DE MESTRADO
INGRIDI RAFAELA DE BRITO
ORIENTADOR: PROF. DR. KONRADIN METZE
MEMBROS TITULARES:
1. PROF. DR. KONRADIN METZE
2. PROF. DR. JOSE BARRETO CAMPELLO CARVALHEIRA
3. PROF. DR. ALEXANDRE TODOROVIC FABRO
Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas.
A ata de defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no SIGA/Sistema de Fluxo de Dissertação/Tese e na Secretaria do Programa da FCM .
Data de Defesa: 24/07/2020
Aos meus pais Paulo e Arlete pelo amor dedicado Amor meu irmão Luiz Paulo por todo amizade, e por ser parte muito importante da minha vida. E ao meu namorado Tales, pelo amor, força e esperança. Dedico esta dissertação
AGRADECIMENTOS
À Deus, por me iluminar e dar forças para chegar até aqui e tornar mais este sonho possível.
Aos meus pais, Paulo e Arlete, e meu irmão Luiz Paulo por serem o pilar da minha vida. Não tenho palavras para agradecer tudo o que fizeram por mim, cada gesto de apoio, incentivo, carinho, compreensão e amor.
Ao meu namorado, Tales, pelo companheirismo durante toda essa trajetória. Por cada conselho nas horas mais difíceis me proporcionando forças para continuar, especialmente por me fazer acreditar que está etapa difícil, porém gratificante terminaria. Por todo amor que me dedica.
Aos meus avós: José Adécio in Memoriam, Alexandrina, José Antônio e Leontina, por sempre estarem dispostos a me ajudar com o que fosse necessário
A meu orientador, Prof. Dr. Konradin Metze, pelos ensinamentos, pela confiança, conselhos, pelo exemplo de amor a ciência. Obrigada por me aceitar como aluna! À Ana Maria e Fernanda pela amizade e pelo apoio, e ajuda primordial na realização deste trabalho.
À Rosana, bióloga do laboratório de Anatomia Patológica Experimental, pela amizade e por toda ajuda durante a tese. Ao Adilson, técnico do laboratório, por me receber no Laboratório de Imagens do Departamento de Anatomia Patológica. Às minhas amigas, Aline Costa, Ana Beatriz e Aline Dalgé e meu amigo Igor, pela amizade, e por todo o apoio que me deram para chegar até esse momento. Os maiores incentivadoras a minha mudança para Campinas, pelos conselhos nos momentos de desespero, pelo apoio por buscar os meus sonhos e nunca desistir e por nunca me deixarem perder a minha fé.
Às minhas companheiras e amigas de República: Vanessa, Juliana, Ana Paula, Débora, Isabela, Raphaela, Bruna, Bárbara e Carol. Obrigada por entenderem e pelo apoio em todos os momentos e renúncia e por vibrarem comigo a cada vitória conquistada.
Aos funcionários do Departamento de Anatomia Patológica da UNICAMP pelo auxílio
Aos pacientes pois sem eles esse trabalho não poderia ser realizado.
À Regina, secretária do programa de pós-graduação em fisiopatologia médica, por toda a ajuda prestada durante todo o curso e em especial na fase final deste trabalho.
À UNICAMP e ao Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica.
O presente trabalho foi realizado com apoio do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), bolsa processo n° 164847/2018-9
Muito Obrigada.
RESUMO
A análise da textura nuclear se torna cada vez mais importante no auxílio ao diagnóstico de neoplasias malignas. A textura da cromatina dos núcleos das células requer atenção por patologistas, pois a textura revela as alterações que acompanham. diferenciação e carcinogênese. Neste sentido a dimensão fractal e a lacunaridade se apresentam com potenciais descritores matemáticos de textura. Já foi demonstrado que a dimensão fractal da cromatina nuclear de tecido neoplásico pode ser utilizada para o diagnóstico. A lacunaridade atua como descritor complementar pois algumas estruturas celulares podem apresentar o mesmo valor de dimensão fractal. O objetivo deste estudo diagnosticar e diferenciar neoplasias por características de textura por análise de imagens de preparações citológicas de rotina. Foram analisados 5278 núcleos de 132 casos de preparações citológicas provenientes do Hospital das Clínicas da Unicamp HC, dentre eles 29 Adenocarcinomas, 30 Carcinomas Epidermóide e 49 Carcinomas neuroendócrinos de pequenas células e comparados com 24 preparações citológicas de sem evidência de neoplasia. A dimensão fractal foi determinada com imagens transformadas em escala de cinza pelo método Diffrent Box-Counting estendido para pseudo 3D e a Lacunaridade foi determinada a partir de imagens binarizadas. A idade média dos pacientes foi de 61 anos. A análise de variância (ANOVA) seguido por testes post-hoc, demonstrou diferenças significativas entre os subtipos tumorais com uma exceção: não foi possível demonstrar diferenças entre núcleos de carcinomas epidermóide e núcleos de adenocarcinomas. A lacunaridade demonstrou ser um valioso complemento especialmente para o diagnóstico diferencial entre células benignas e malignas
Palavras Chaves: Fractal, Lacunaridade, Neoplasia, Diagnóstico.
ABSTRACT
Nuclear texture analysis is becoming increasingly important in helping to diagnose malignant neoplasms. The chromatin texture of the nuclei of the cells requires attention because it is related to metabolic alterations, cell differentiation, proliferation, and carcinogenesis. In this context the fractal dimensions a lacunarity are presented as mathematical descriptors of texture. It has already been demonstrated that the fractal dimension of nuclear chromatin in neoplasm can be used for diagnosis. Lacunarity acts as a complementary descriptor because different cellular structures may present the same value of fractal dimension, but maybe differentiated their lacunarity values. The objective of this study was diagnosed and differentiate neoplasms by texture characteristics by image analysis of routine cytological preparations. We analyzed 5278 nuclei from 132 cases of cytological preparations from the Hospital das Clinicas - Unicamp HC, among them 29 Adenocarcinomas, 30 Squamous cell Carcinoma and 49 Neuroendocrine Carcinoma of small cells and compared with 24 cytological preparations of no evidence of neoplasm. The fractal dimension was determined with images transformed into grayscale by the Different Box Counting method extended to pseudo 3D and the Lacunarity was determined from binarized images. The mean age of the patients was 61 years. Analysis of variance (ANOVA) followed by post-hoc showed significant differences between nuclei of benign and malignant cells and between the nuclear texture of subtypes with one exception: we could not demonstrate differences between the nuclear texture of adenocarcinomas and squamous cell carcinomas. Lacunarity showed to reveal important complementary information especially for the differentiation of benign and malignant cells
Key words: Fractal Dimension, Lacunarity, Neoplasms, Diagnosis.
Lista de Ilustrações
Figura 1: Imagem de auto semelhança do pulmão, quando examinado
em diferentes aumentos. Adaptado de36. ... 19
Figura 2:Esboço para determinação do Métodos Different box-counting Imagem própria adaptado de 39. ... 20
Figura 3: Esboço para determinação da lacunaridade. Imagem própria adaptado de41. ... 22
Figura 4: A: Imagem original de um núcleo; B: núcleo segmentado ... 25
Figura 5: A: Núcleo segmentado em escala de cinza; B: Núcleo em pseudo 3D; C: Núcleo binarizado. ... 26
Figura 6: Faixa etária dos pacientes do estudo. ... 27
Figura 7:Relação de casos por sexo e raça. ... 28
Figura 8: Comparação dos diferentes grupos de pacientes ... 30
Figura 9: Análise de variância de comparação entre os núcleos dos casos do estudo. ... 31
Lista de Tabelas
Tabela 1: Características nucleares de cada tipo de neoplasia do
estudo. ... 16 Tabela 2: Distribuição do número de imagens e total de núcleos por
casos. ... 29 Tabela 3: Distribuição dos valores médios de dimensão fractal e
Lista de Abreviaturas e Siglas
AC Adenocarcinoma
ANOVA Análise de Variância
BMP Bitmap
Ca Carcinoma
CE Carcinoma Epidermóide
Cél Células
CEBN Células do Epitélio Brônquico Normal
CNPC Carcinoma Neuroendócrino de Pequenas Células DNA Ácido desoxirribonucleico
Ep Epitélio
GLOBOCAN Global Cancer Statistics
HD Hard Disk
H&E Hematoxilina e Eosina INCA Instituto Nacional do Câncer OMS Organização Mundial da Saúde
SPSS Statistical Package for the Social Science
TTF1 Fator de transcrição tireoidiano 1
µm micrômetro
SÚMARIO
1. INTRODUÇÃO ... 14
1.2 Diagnóstico ... 14
1.2.1 Divergências diagnóstica – uma grande problemática ... 15
1.3 Aspectos epidemiológicos e fisiológicos ... 16
1.4 Análise de Textura Nuclear ... 17
1.6 Different Box- Counting (Método Diferencial de Contagem de Caixas) ... 20
1.7 Lacunaridade ... 21
2. OBJETIVOS ... 23
3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 24
3.1 Seleção dos pacientes ... 24
3.2 Aquisição da Imagem ... 24
3.3 Processamento das imagens ... 25
3.4 Análise Estatística... 26
4. RESULTADOS ... 27
4.1 Dimensão Fractal e Lacunaridade ... 29
5. DISCUSSÃO ... 33
5.1 Dados estatísticos e epidemiológicos ... 33
5.2 Análise de Textura ... 33
6. CONCLUSÃO ... 36
7. REFERÊNCIAS ... 37
14 1. INTRODUÇÃO
Recentes o Globocan 1, divulgou dados epidemiológicos alarmantes sobre as neoplasias malignas do pulmão. Estima-se uma incidência de 2,1 milhões de novos casos da doença em todo mundo com previsão de 1,8 milhões de mortes, cerca de 1 em cada 5 mortes por câncer. No Brasil, o Instituto Nacional do Câncer (INCA) realizou a uma estimativa bienal, sendo, entre 2018 e 2019 a incidência de câncer de pulmão, foi 18.740 novos casos de entre homens e 12.530 novos casos entre mulheres.2
Cerca de 80% dos casos diagnosticados estão associados ao hábito de fumar, sendo assim, o consumo do tabaco é o principal fator de risco para o desenvolvimento e a progressão dessa doença 3 e 1. Além disso, outros fatores de risco como exposição à poluição do ar, infecções ou doenças pulmonares crônicas e predisposição genética, também podem contribuir para o desenvolvimento desta neoplasia 3.Contudo, estudos recentes, relatam casos de câncer de pulmão associados a uma série de condições inflamatórias e metabólicas, como o índice de massa corporal, níveis de lipídios e índice dietético de glicemia4.
1.2 Diagnóstico
O diagnóstico de neoplasias do pulmão é inicialmente realizado através do histórico dos pacientes e exames clínicos, além das técnicas de diagnóstico por imagem, como raio X e tomografia computadorizada. Outras técnicas primordiais para o diagnóstico são os exames de citologia e histologia 5. Os exames citológicos são, uma técnica rápida em caso de suspeita de uma neoplasia maligna, a obtenção do material é preferencialmente feita por escovado brônquico, pois esta técnica preserva melhor as células neoplásicas 6. Muitas vezes em um segundo passo, realiza-se uma biópsia da neoplasia, permitindo um diagnóstico histológico ainda mais seguro. Em casos, se ainda houver dúvidas, e especialmente quando o material é muito escasso, o exame de imunohistoquimica, será realizado, como padrão ouro do diagnóstico. Estes exames são responsáveis pela caracterização dos tipos de neoplasia, que é fundamental para a escolha correta dos procedimentos terapêuticos 5 e 7 .
15
1.2.1 Divergências diagnóstica – uma grande problemática
A Organização Mundial da Saúde, classificou o câncer de pulmão em grades grupos histológicos, são estes: Adenocarcinomas (AD), Carcinoma Epidermóide (CE), Carcinoma neuroendócrino de pequenas células (CNPC) e Carcinoma neuroendócrino de grandes células entre outros 8 . Sendo que os três primeiros, que são mais comuns, serão abordados nesse trabalho.
Esta classificação é realizada com base em características histológicas e citológicas, particulares de cada neoplasia. Devido as diferenças no prognóstico e tratamento, entre os diversos tipos de neoplasias é necessário, que os diagnósticos citológicos e histológicos sejam os mais precisos possível, além disso, uma abordagem multidisciplinar poderá melhorar o diagnóstico, auxiliar no tratamento e poderia aumentar a sobrevida dos pacientes 9 e 10.
Entretanto, há uma problemática na eficiência do diagnóstico destas neoplasias. Acarretando um diagnóstico tardio que em alguns casos impossibilitaria um tratamento eficaz 11 . Dependendo do tipo de neoplasia e da quantidade e qualidade do material enviado, a identificação dos subtipos pode ser muito difícil, ou seja, sempre é necessário a realização de mais de uma técnica em conjunto para que se encontre o diagnóstico final mais correto possível. Sendo assim, atualmente é primordial que a análise do material seja realizada por exames complementares. Também pode pedir a avaliação por um outro patologista. Com isso, a análise se torna mais segura quando há concordância na observação das amostras. Esta análises são realizadas com a observação de imagens microscópicas, seguindo as classificações da OMS 11.
Nas classificações detalhes da estrutura nuclear (tabela 1) são consideradas características, porém podem ser confundidas, mesmo quando se trata de observadores experientes. Além disso pode haver variações da textura entre as células da mesma neoplasias, por outro lado, pode haver semelhanças entre células de diferentes neoplasias, pois cada neoplasia poder ser considerada um indivíduo com características únicas 6,8 e 11.
16
Tabela 1: Características nucleares de cada tipo de neoplasia do estudo. Carcinoma Neuroendócrino de pequenas células Carcinoma Epidermóide Adenocarcinoma
Altas taxas nucleares
Hiperqueratose
Macronúcleo
Modelagem nuclear Formação de pérolas/ pontos de tinta Nucléolos múltiplos Núcleos colapsado ou Corpos apoptóticos Cromatina picnótica Membrana nuclear irregular
Cromatina Granular “Sal e Pimenta”
Núcleos lisos Sobreposição nuclear Cromatina vesicular ou
bolhosa
Necrose e Diátese Cromatina granular
Tendo em vista essas possíveis divergências entre os observadores há uma necessidade de novas pesquisas para tornar o diagnóstico mais seguro 12 . 1.3 Aspectos epidemiológicos e fisiológicos
As distintas características morfológicas, requerem uma avaliação extremamente cuidadosa por parte do patologista, principalmente na rotina de hematoxilina e eosina (H&E), pois assim se assegura uma maior precisão no diagnóstico 8.
O Carcinoma neuroendócrino de pequenas células (CNPC) é um tumor neuroendócrino maligno altamente agressivo 8. Durante a tumorigênese do CNPC, algumas características se mostram de maior importância como instabilidade genômica e inibição ou ausência de supressores de crescimento. Os genes supressores tumorais RB1 e TP53 perdem a sua função em quase 90% dos casos de CNPC. Em experimentos com camundongos foi observado que a inativação destes genes induz a proliferação de tumores semelhantes ao CNPC humano 13.
A mediana de sobrevida de pacientes com CNPC é de 14 a 20 meses, em estágio inicial da doença, e de 9 a 11 meses em pacientes em estágio avançado
17
da doença. O prognóstico desta neoplasia é desfavorável e com poucas opções terapêuticas disponíveis na rotina hospitalar 14 . O tratamento e o índice de sobrevida dos pacientes diagnosticados com CNPC, não mudaram consideravelmente em mais de 40 anos, são raras as chances de cura com os tratamentos baseados em quimioterapia, radioterapia convencionais, e eventualmente cirurgia 14.
A segunda neoplasia abordada no nosso trabalho é o carcinoma epidermóide (CE) que é responsável por 40 % de todas as neoplasias de pulmão.15 Geralmente ocorre na porção central do pulmão, ao longo das principais vias aéreas, e pode formar cavidades quando atinge um tamanho grande 10. A distinção desta neoplasia com outras neoplasias pode ser feita como marcadores imunológicos como a presença das proteínas p63 e CK5/6 e ausência de TTF-1 16
A terceira e última neoplasia abordada em nosso trabalho é o Adenocarcinoma de pulmão (AD). É o tipo mais comum de câncer de pulmão, responsável por mais de 40 % dos cânceres de pulmão, 60 % dos casos de carcinoma neuroendócrino de não pequenas células e mais de 70 % dos casos de ressecção cirúrgica. Sua incidência tem aumentado constantemente nas últimas décadas 10 O AD é definido como um tumor epitelial maligno com diferenciação glandular, que pode mostrar a produção de mucina detectável por coloração de mucina como mucicarmina ou expressão de marcadores de pneumócitos como napsina A ou fator de transcrição de tireoide 1 (TTF1), em geral, se localiza na região periférica do pulmão 8.
1.4 Análise de Textura Nuclear
A textura de uma imagem histológica ou citológica dos tecidos está diretamente ligada as alterações fisiológicas e fisiopatológicas estas alterações influem em nas propriedades da arquitetura da cromatina nuclear.17.Sendo assim, análises de textura podem caracterizar objetivamente e quantificar crescimento fisiológico e patológico dos núcleos18,19,20,21,22 e 23.Portanto, a análise morfológica dos núcleos celulares poderia fornecer dados que contribuem para aperfeiçoar o diagnóstico e melhorar a avaliação do prognóstico dos pacientes. A minuciosa descrição nuclear é uma parte principal do diagnóstico, especialmente em casos
18
de neoplasias 24 e 25. As características de textura nuclear vêm sendo estudadas como fatores de prognóstico em muitas neoplasias 26 e 27 .
Matematicamente, a textura pode ser descrita em termos da ocorrência da regularidade de padrões que o observador humano descreve como aparência homogênea e arenosa, sal e pimenta entre outros 28 . Muitos descritores matemáticos de textura têm sido utilizados em estudos citológicos para a análise da textura da cromatina 29.
A textura pode ser quantificada a partir da textura de uma imagem armazenada no computador, especialmente para a análise de núcleos ou do citoplasma 30 . Considerando que uma imagem digital, por exemplo, de um núcleo é composta de pixels em escala de cinza formando um padrão, a textura depende da relação espacial de cada pixel com os pixels vizinhos, portanto, as medidas de textura são propriedades locais de uma imagem 31 . Sendo assim a textura é uma propriedade que expressa a distribuição e a interrelação espacial entre os vários graus de cinza que compõem um objeto 32.
O conceito de dimensão fractal foi definido por Mandelbrot na década de 60 e desde então tem sido amplamente difundido no campo da biologia 33 e 34. Fractais em termos matemáticos são objetos com similaridade ou auto-afinidade, cuja estrutura complexa detalhadas contém os mesmos padrões em diferentes escalas e, portanto, neste caso a geometria euclidiana clássica não é aplicável, como por exemplo a estrutura anatômica do sistema pulmonar 35 e 33 .
19
A fractalidade pode ser observada em uma grande gama de processos fisiológicos como por exemplo a regulação da pressão arterial. A organização fractal contribui positivamente para o processo evolutivo, aumentando a capacidade de adaptação às mudanças no ambiente 33.
O estudo da dimensão fractal nos núcleos, parte do princípio da organização do DNA. Modificações e alterações no genoma ( mutações) alteram a estrutura da cromatina nas neoplasias 37. As características de alterações na organização da cromatina quantificadas pela análise da textura nuclear têm sido amplamente utilizadas como auxílio no diagnóstico e prognóstico de várias neoplasias 38 .
Atualmente existem vários métodos que são empregados na análise de textura. Em relação a dimensão fractal o método estimativa mais empregado é o Box-counting. No nosso estudo utilizamos o método do different box-counting
Figura 1: Imagem de auto semelhança do pulmão, quando examinado em diferentes aumentos. Adaptado de 36.
20
1.6 Different Box- Counting (Método Diferencial de Contagem de Caixas)
O método foi proposto por Sarkar et al em 1994 39 e 40. O método utiliza uma imagem em escala de cinza bidimensional 2D convertida em um objeto virtual tridimensional 3D. Esta imagem pseudo 3D adquire as seguintes coordenadas x e
y, comprimento e largura, respectivamente. E uma terceira coordenada z,
responsável por indicar os valores da luminescência dos pixels da imagem 37, 39 e 40.
Figura 2:Esboço para determinação do Métodos Different box-counting Imagem própria adaptado de 39.
A seguir, conta-se o número 𝑁 (𝑟) de cubos que contêm partes do revelo do objeto pseudo 3D os cubos centrais não são computados. O número de cubos contendo o relevo é contado para cada escala de aumento ( com cubos de diferentes tamanhos). Então, num próximo passo um gráfico log-log é criado com 𝑥 = 𝑙𝑜𝑔 (número de caixas por comprimento da grade) e 𝑦 = 𝑙𝑜𝑔 (número de caixas
21
contendo uma parte da estrutura pseudo 3D). A inclinação da curva de regressão linear é equivalente à dimensão fractal 26 e 37.
1.7 Lacunaridade
A lacunaridade é definida como o expoente de uma mensuração em diferentes escalas, assim sendo o quociente entre o segundo momento da distribuição de pontos e o primeiro momento ao quadrado da mesma distribuição37. A análise da Lacunaridade descreve o tamanho e a distribuição das lacunas, a heterogeneidade espacial e o grau de desvio da imagem da invariância translacional. Ou seja, ela é utilizada para estimar a variedade geométrica ou a ausência de homogeneidade de uma estrutura anatômica causada pela presença de lacunas em uma imagem binarizadas, deste modo pode ser utilizada para identificar diferenças entre imagens com a mesma dimensão fractal 37 e 34
Lacunaridade com altos valores faz referência a heterogeneidade acentuada da distribuição de lacunas e presença de lacunas maiores e uma maior sensibilidade à rotação, (a imagem muda mais após a rotação do que uma imagem com baixa lacunaridade) 37.
O método mais empregado no cálculo deste recurso, é o método da caixa deslizante, em uma imagem binarizada. Este método consiste numa caixa do tamanho r × r , que desliza primeiro pela imagem. O número de pontos de massa (pixels pretos) dentro da caixa em cada posição é calculado. Assim, um histograma, chamado como XBr (n), é construído sobre a coleção de valores de todas as caixas. Onde n indica o número de pontos de massa que estão dentro da caixa e XBr (n) é o número de caixas que contém n pontos de massa 41.
22
Figura 3: Esboço para determinação da lacunaridade. Imagem própria adaptado de 41.
A abordagem de contagem diferencial de caixas substitui o número de pontos na medida de lacunaridade pela variação (diferença entre o valor mínimo e máximo dentro de uma caixa). O método de variação de quadrante local de três termos divide a janela deslizante em três blocos e usa a variação entre o número de pontos em cada bloco para compor a medida de lacunaridade 37 e41. Em síntese a dimensão fractal estima quantos objetos ocupam o espaço métrico subjacente, já a lacunaridade calcula o tamanho e os arranjos das lacunas que ocupam esse espaço 37 e 41.
23
2. OBJETIVOS
Diagnosticar neoplasias por características de textura por análise computadorizada de imagens de preparações citológicas de rotina, aplicando geometria não euclidiana.
Objetivos específicos
Diferenciar os núcleos em preparações citológicas de três tipos de neoplasias pulmonares e de células de mucosa normal com base na geometria fractal.
24
3. MATERIAIS E MÉTODOS
Este é um estudo retrospectivo utilizando esfregaços citológicos de carcinomas neuroendócrino de pequenas células do pulmão, adenocarcinomas do pulmão e carcinomas epidermóides do pulmão e células do epitélio brônquico normal. Foram levantados exames citológicos de escovados brônquicos corados com hematoxilina e eosina de rotina do Hospital das Clínicas da Unicamp, entre 1993 e 2008..O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Unicamp (CAAE: 89409118.7.0000.5404) e isento do Termo de Esclarecimento Livre por se tratar de um estudo retrospectivo
3.1 Seleção dos pacientes
Os pacientes foram selecionados com base nas informações registradas nos arquivos eletrônico do Departamento de Anatomia Patológica do HC-UNICAMP. Também foi utilizado a base de dados do departamento.de informática do HC- UNICAMP.
Foram incluídos na pesquisa pacientes cujos exames citológicos de escovados brônquicos foram possíveis estabelecer:
• Diagnóstico confirmatório de neoplasia pulmonar.
• Pacientes com laudos de biópsia e, eventualmente, imunohistoquimica confirmatórias.
• Pacientes com lâminas de esfregaço com boa qualidade sem artefatos de secagem ou perda da intensidade da coloração.
• Pacientes sem diagnóstico de neoplasia, mas que foram submetidos ao procedimento de escovado brônquico devido a algum processo inflamatório. Os critérios de exclusão para este estudo foram:
• Pacientes sem biopsia e eventualmente imunohistoquimica confirmatórias. • Ausência de células neoplásicas em pacientes com neoplasia confirmada por
biópsia.
3.2 Aquisição da Imagem
As imagens foram analisadas de forma aleatória através de um microscópio Zeiss, com a objetiva de 100 x aumento, Achroplan em imersão a óleo, com abertura numérica de 1,25.
25
Utilizou-se o sistema KS-300 para aquisição das imagens com resolução espacial de 0,1 µm/pixel, dado obtido através da digitalização de uma régua micrométrica de 1 mm. As imagens foram salvas em HD externo no formato bitmap (BMP) colorido de 24 bits, com tamanho 480x480 pixels, possibilitando a aquisição de mais de um núcleo por imagem.
Foram adquiridas imagens no melhor foco, onde é possível visualizar todos os contornos no núcleo e pelo mesmo operador. Prezando pelas aquisição de células neoplásicas ou células do epitélio traqueobrônquico de pacientes sem neoplasia. Núcleos com alguma deformidade ou artefatos causados durante o preparo técnico não foram fotografadas
3.3 Processamento das imagens
As imagens adquiridas foram submetidas a segmentação dos núcleos pelo software Limiar, com a colaboração entre dois observadores. Deixando o fundo de cor branca, e salva isoladamente como imagem quadrada com 256 pixels de lado (cerca de 25,6 µm, na escala real) (figura 4 ).
A imagem de cada núcleo foi convertida em escala de cinza ( figura 5) com luminescência de entre 0 a 255. Onde 255 é o pixels mais claro da imagem de cada núcleo convertido e pseudo 3D.
26
Após o processo de conversão, foram calculados a dimensão fractal, por different box-counting por núcleo, e média, percentil 25% e percentil 75% e média de cada caso. Também foi realizado o processo de binarização dos núcleos (figura 5) pelo Algoritmo de Otsu para a estimativa da lacunaridade. Este processo transforma a imagem em duas cores: preto e branco. Todas as imagens digitalizadas foram segmentações e nomeadas automaticamente pelo programa, diminuindo a possibilidade de erro durante o processo.
3.4 Análise Estatística
Para cada paciente foi calculado, a média, percentil 25% e percentil 75% de dimensão fractal e lacunaridade, utilizamos a análise de variância para dados pareados (ANOVA). Seguindo pelo teste post-hoc LSD.(“mínima diferença significante”). A diferenciação de casos malignos e benignos foram realizadas por Análise discriminante linear, seleção stepwise. Todas as análises foram realizadas utilizando os programas WinSTAT Statistics for Windows version 3.1 e SPSS 20.
Figura 5:A: Núcleo segmentado em escala de cinza; B: Núcleo em pseudo 3D; C: Núcleo binarizado.
27
4. RESULTADOS
. A idade média dos pacientes é de 61 anos, com mínima de 18 anos e máxima de 84 anos (figura 6).
Figura 6: Faixa etária dos pacientes do estudo.
Foi observado o predomínio da ocorrência de pacientes do sexo masculino, com 90 casos, contra 43 casos do sexo feminino. Do total de pacientes, 120 declararam brancos, e apenas 12 declararam não brancos (negro, pardo, índio, asiático) (figura 7).
28
Os pacientes foram classificados em 4 categorias, sendo 3 para diagnóstico confirmado de neoplasia do pulmão, e um grupo com diagnóstico negativo para neoplasia. Foram adquiridas e segmentadas o total de 5278 núcleos dos 132 casos selecionados.
29
Tabela 2: Distribuição do número de imagens e total de núcleos por casos. Grupos Pacientes Número de Imagens Total Média Mínimo Máximo
Adenocarcinoma 29 18,24 3 31 529 Ca. Epidermóide 30 16,13 8 30 484 Ca. Neuroendócrino 49 72,92 2 220 3573 Cél. Ep. Brônquico Normal 24 28,83 8 73 692 Total 132 45,37 2 220 5278
4.1 Dimensão Fractal e Lacunaridade
Para cada paciente foi realizado o cálculo da média, percentil 25% e percentil 75% de dimensão fractal e lacunaridade. Posteriormente, efetuou-se o teste post-hoc para análise de variância (ANOVA), onde foi observado o p = 0.0217 para os valores médios de DF, e um p <0.00001 para os valores médios de lacunaridade.
Tabela 3: Distribuição dos valores médios de dimensão fractal e lacunaridade. Grupos Médias de Dimensão Fractal Médias de Lacunaridade Adenocarcinoma 2.2211 0.10752 Ca. epidermóide 2.2208 0.09995 Ca. neuroendócrino de pequenas células 2.242 0.12593 Células do epitélio brônquico normal 2.1875 0.1615
30
31
Figura 9: Análise de variância de comparação entre os núcleos dos casos do estudo.
As análises de variação da média, percentil 75% e percentil 25% de dimensão fractal revelaram uma diferença entre as núcleos das células do epitélio normal contra os núcleos das células de Carcinoma neuroendócrino de pequenas células. Entretanto nas análises de média de lacunaridade, tanto para média, quanto para percentil 75% e percentil 25% pode se observar uma diferença entre todos os núcleos exceto um; não houve diferença detectável entre Adenocarcinoma e Carcinoma Epidermóide.
Em realização da análise discriminante para diferenciação entre comparando os núcleos do epitélio normal e os núcleos de neoplasias maligna,
32
selecionou-se as variáveis do percentil 75% de dimensão fractal onde a melhor discriminação obteve 60,6% de classificação correta dos casos. O mesmo procedimento foi realizado com as variáveis do percentil 25% de lacunaridade, onde este por sua vez demonstrou acurácia de 78,79 na classificação correta dos casos. Ambos os procedimentos se observaram estabilização dos valores.
Posteriormente, foi realizada uma análise discriminante com percentil 75% de dimensão fractal e o percentil 25% de lacunaridade juntos, ambas as variáveis permaneceram independentes, porém o percentual de classificação correta aumentou para 79,5%, contudo após a validação cruzada este percentual voltou a cair para 78,79%.
33
5. DISCUSSÃO
5.1 Dados estatísticos e epidemiológicos
Nosso grupo de estudo se concentrou em pacientes com carcinoma do pulmão. Após a distribuição dos pacientes por idade, observamos que a idade média (61 anos) do nosso grupo de estudo foi menor em comparação a média de idade em pacientes do Estados Unidos ( 70 anos) 42 e 12.
O câncer de pulmão é a segunda maior causa de morte por neoplasias malignas no mundo em ambos os sexos 4 e 1. Em 2018 uma estimativa da porcentagem de novos casos nos Estado Unidos era de 14 % para homens e 13% para as mulheres. No Brasil, recentemente, foi divulgado pelo INCA, a estimativa trienal (2020-2022) do número de novos casos de câncer de pulmão no país. Estima-se que o número de novos casos para homens será maior que o número de novos casos para mulheres, respectivamente, cerca de 17.760 novos casos para homens (16,99 por 100 mil homens) e 12.440 novos casos para mulheres ( 11,56 por 100 mil mulheres) 43.
Estas informações corroboram com a distribuição dos pacientes do nosso grupo de estudo por sexo, onde foi constado um maior frequência de homens diagnosticados com câncer de pulmão em comparação com as mulheres.
Os dados epidemiológicos tendem a variar, pois estão sujeitas a características de cada país, como, por exemplo, o índice de desenvolvimento, poluição do ar, até mesmo a alimentação. No Brasil, estamos mais expostos a agentes cancerígenos como benzopireno, benzeno e os seus derivados, amianto e, sílica entre muitos outros agentes químicos e físicos em comparação ao habitantes do hemisfério norte onde as políticas de supressão desses agentes cancerígenos são mais rigorosas, e até mesmo proibidos. 3, 43, 44 .
5.2 Análise de Textura
Frequentemente utilizada na patológica computacional, a análise de textura nuclear permite a diferenciação de tecidos neoplásicos e normais, além de auxiliar na elaboração de uma classificação morfológica e de um prognóstico mais preciso 9,23,28,33,37,45,46 e 47. Mello et al, 48 utilizaram a análise de textura para avaliar
34
as mudanças na cromatina nuclear em cultura de células 17- B- estradiol pode ocasionar modificação da cromatina.
Nishihira et al.,49 compararam a área nuclear de células tumorais de pacientes com carcinoma de epidermóide do pulmão com células do epitélio brônquico em casos de inflamação. O estudo demonstrou que a área nuclear das células tumorais era significativamente maior que a das células epiteliais brônquicas, respectivamente 102,4 ± 26,2 μm2 - 64,1 ± 16,9 μm2. Além disso, o estudo mostrou sensibilidade de 75% e especificidade de 88% na detecção de malignidade.
Namazi et al.,50 observaram que a fractalidade da sequência de DNA de células neoplásicas do pulmão era maior que em comparação com as sequências normais de DNA. Assim, concluíram que a utilização da dimensão fractal é útil para a análise do crescimento neoplásico.
Em 2004, Adam et al 51 estudaram as características granulométricas dos eritoblastos como uma ferramenta de diagnóstico em doenças hematológicas. No mesmo ano, 2004, em outro estudo, Adam et al 52 observaram que o tamanho dos resíduos de partículas pode ser utilizado como uma técnica complementar de diagnóstico em citologia.
Metze et al., 53 analisaram a textura das regiões organizadoras nucleolares do câncer de pulmão. Em outro estudo, Metze et al., 54 compararam a textura da cromatina em adenomas foliculares e nódulos tireoidianos hiperplásicos.
A morfologia clássica com base na geometria euclidiana não permite descrever estruturas complexas de maneira satisfatória da cromatina nuclear. Complexidade, porém, pode ser satisfatoriamente avaliada com o conceito da fractalidade 38 e 55.
A fractalidade de núcleos de células tumorais analisada em preparações citológicas ou lâminas histológicas já foi estimada em vários estudos e mostrou ter relevância prognóstica 37 ,como, por exemplo, em leucemia 55, melanomas malignos 46, carcinomas de laringe 56 e do pulmão 57.
Uma padronização da preparação das lâminas é necessária. Foi demonstrado que na citologia a fractalidade pode sofrer variações causadas pelo
35
preparo técnico. Mesmo assim, Metze et al., 23 estudando as variações técnicas, como a intensidade da coloração na análise citológica, demonstraram, dimensão fractal foi relativamente robusta em comparação com outras variáveis morfológicas, que descrevem textura nuclear. O uso da fractalidade como descritor da textura tem ainda outras vantagens, como a robustez contra variações da segmentação. Porém, o uso rotineiro em laboratórios necessita ainda de estudos de validação entre laboratórios. 37.
Além da dimensão fractal, outro descritor matemático complementar, criado por Mandelbrod ainda nos anos setenta, é a lacunaridade 37, 34 e 41. A lacunaridade foi utilizada em poucos e diferentes estudos como método complementar a dimensão fractal. Pantic et al.,58 observaram um aumento da lacunaridade em análise do envelhecimento em hepatócitos de camundongos. Em dois estudos em 2013, Pantic et al.59 e 60, observaram a diferença entre as alterações da lacunaridade e da dimensão fractal. O primeiro estudo analisou a incorporação de nanopartículas de prata em núcleos epiteliais bucais. E o segundo estudo observou as alterações em núcleos celulares da mácula densa no período pós-natal. Recentemente, em 2017, Pantic et al.61, analisaram alterações nos núcleos das células foliculares do baço também no período pós natal.
Em nosso estudo, a lacunaridade não revelou diferença detectável entre os núcleos de Adenocarcinomas e Carcinomas Epidermóide. Mesmo assim a lacunaridade demonstrou ser um exame complementar valioso no auxílio da diferenciação entre células normais e neoplásicas
36
6. CONCLUSÃO
A análise de textura de cromatina nuclear em imagens digitalizadas pode ser uma ferramenta útil para o diagnóstico diferencial de neoplasias do tórax.
A determinação da lacunaridade é um método complementar a análise da dimensão fractal, e diferencia melhor as células neoplásicas e não neoplásicas que a dimensão fractal
Os descritores usados em nosso estudo, dimensão fractal e lacunaridade podem ajudar na discriminação entre as neoplasias, porém não mostram diferenças de textura entre os núcleos de adenocarcinomas e carcinomas epidermóides.
37 7. REFERÊNCIAS
1. Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre L A, Jemal A. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a cancer journal for clinicians. 2018; 68(6): 394-424.
2. Ministério da Saúde, Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva, Coordenação de Prevenção e Vigilância. Estimativa 2018: Incidência de câncer no Brasil - Rio de Janeiro: INCA; 2017.
3. Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva, Organização Mario Jorge Sobreira da Silva. ABC do câncer: abordagens básicas para o controle do câncer. Rio de Janeiro: INCA; 2017.
4. Blandin K S., Crosbie PA. Balata H. Progress and prospects of early detection in lung cancer. Open biology. 2017; 7. (9):170-70.
5. Araújo LH, Baldotto C, Castro Jr G, Katz A, Ferreira CG, Mathias C, et al. Câncer de pulmão no Brasil. Jornal Brasileiro de Pneumologia. 2018; 44(1): 55-64.
6. Sturgis CD, Nassar DL, D’Antonio JA, Raab, SS. Cytologic features useful for distinguishing small cell from non-small cell carcinoma in bronchial brush and wash specimens. American journal of clinical pathology. 2000.114(2):197-202. 7. Van Meerbeeck J P, Fennell DA, De Ruysscher DK. Small-cell lung cancer. The
Lancet. 2011; 378(9804): 1741-1755.
8. Travis, WD, Brambilla E. Müller-Hermelink HK. Harris CC. World Health Organization classification of tumours. Pathology and genetics of tumours of the lung, pleura, thymus, and heart. 2004;10: 179-84.
9. Schmid K, Angerstein N, Geleff S. Gschwendtner, A. Quantitative nuclear texture features analysis confirms WHO classification 2004 for lung carcinomas. Modern pathology. 2006; 19(3): 453-459.
38
10. Zheng M. Classification and pathology of lung cancer. Surgical Oncology Clinics. 2016; 25(3): 447-468.
11. Bedin V. Parâmetros de textura da cromatina como fator prognóstico em carcinoma basocelular.[Dissertação]. Campinas: Universidade Estadual de Campinas- UNICAMP. 2004.
12. Basumallik N, Agarwal M. Cancer, Lung Small Cell (Oat Cell). StatPearls Publishing. 2019.
13. Thomas A, Pommier Y. Small cell lung cancer: Time to revisit DNA-damaging chemotherapy. Sci Transl Med. 2016, 8(12): 346 346.
14. Rudin CM, Pietanza MC, Bauer TM, Ready N, Morgensztern D, Bonnie SG, et al. Rovalpituzumab tesirine, a DLL3-targeted antibody-drug conjugate, in recurrent small-cell lung cancer: a first-in-human, first-in-class, open-label, phase 1 study. The Lancet Oncology. 2017;18(1):42-51.
15. Li Y, Gu J, Xu F, Zhu Q, Ge D, Lu C. Transcriptomic and functional network features of lung squamous cell carcinoma through integrative analysis of GEO and TCGA data. Scientific reports. 2018; 8(1): 1-12.
16. Kalhor N, Zander DS, Liu J. TTF-1 and p63 for distinguishing pulmonary small-cell carcinoma from poorly differentiated squamous small-cell carcinoma in previously pap-stained cytologic material. Modern Pathology. 2006;19(8):1117-23.
17. Diaz G, Zucca A, Setzu MD, Cappai C. Chromatin pattern by variogram analysis, Microscopy. Research and Technique.1997; 39 (3):305-11.
18. Gilberti MFP, Metze K, Lorand-Metze I. Changes of nucleolar organizer regions in granulopoietic precirsors during chronic myeloid leukemia. Annals of Hematology. 1995; 71(6):275-9.
19. Grotto HZW, Lorand- Metze I, Metze K. Nucleolar organizer regions in normal hematopoiesis relationship to cellular proliferation and maturation. Nouvelle Revue Francaise D Hematologie. 1991; 33(1):1-4.
39
20. Irazusta SP, Vassallo J, Magna LA, Metze K, Trevisan M. The value of agnor and pcna staining in endoscopic cardiac muscle cells. Acta anatomica.1980;194:33-9.
21. Metze K, Lorand-Metze I. Age related decrease of agnor activity in acute and chronic lymphocytic leukemias. Journal of Clinical Pathology: Molecular Pathology. 1999; 52(1):52.
22. Metze K, Trevisan M. The use epithelial membrane antigen and silver stained nucleolar organizer regions testing in the differential diagnosis of mesothelioma form benign reactive mesothelioses. Cancer. 1999, 85:250.
23. Metze K, Adam RL, Vido JR, Lorand-Metze I. Influence of staining characteristics on nuclear texture features in cytology. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 2009,31:241–246.
24. Gimenez- Mas JA, Sanz-Moncasi MO, Remón L, Gambó P, Gallego-Calvo MP. Automated Textural analysis of nuclear chromatin, Analytical and Quantitative Cytology and Histology.1995,17:39-47.
25. Canzonieri V, Monfardini S, Cabone A. Defining prognostic factors in malignancies though image analysis. American Journal of Clinical Pathology. 1995, 103:195-8.
26. Metze K. Fractal dimension of chromatin: potential molecular diagnostic applications for cancer prognosis. Expert review of molecular diagnostics. 2013;13(7): 719-35.
27. De Mello NMR, Albuquerque DM, Pereira-Cunha FG, Albanez KB, Pagnano KB, Costa FF, et al. Molecular characteristics and chromatin texture features in acute promyelocytic leukemia. Diagn Pathol. 2012; 7(1):1-8.
28. Haralick RM, Shanmugan K, Dinstein I. Textural features for image classification, IEEE Transactions on Systems Man and Cybernetics. 1973, 6:610-21.
29. Marchevsky AM, Bartels PH. Image Analysis: A Primer for Pathologists. Raven Press.1994.
40
30. Spina D, Disanto A, Luzi P, Tosi P, Gallorini M, Mouthon A, Kraft R, Cottier H. Novel contrast gradient oriented, automated chromation texture analysis. Virchows Archives B Cellular Pathology. 1992, 62:119-124.
31. Thunnissen FBJM, Diegenbach PC. Classication of lung carcinoma by means of digital nuclear image analysis. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 1986; 8(4):301.
32. Castleman KR. Digital Image Analysis. Prentice Hall. Englewood Cliffs, New Jersey. 1979.
33. Metze K. Fractal dimension of chromatin and cancer prognosis. Epigenomics. 2010; 2(5): 601-4.
34. Popovic N. Radunovic M, Badnjar J, Popovic T. Fractal dimension and lacunarity analysis of retinal microvascular morphology in hypertension and diabetes. Microvascular research. 2018, 118: 36-43.
35. Florindo JB, Bruno OM. Local fractal dimension and binary patterns in texture recognition. Pattern Recognition Letters. 2016, 78: 22-27.
36. Glenny RW. Emergence of matched airway and vascular trees from fractal rules. Journal of Applied Physiology. 2011;110(4): 1119-1129.
37. Metze K, Adam RL, Florindo JB. The fractal dimension of chromatin-a potential molecular marker for carcinogenesis, tumor progression and prognosis. Expert review of molecular diagnostics. 2019; 19(4): 299-312.
38. Ferro DP, Falconi MA, Adam RL, Ortega MM, Lima CP, De Souza CA, et al. Fractal characteristics of May-Grünwald-Giemsa stained chromatin are independent prognostic factors for survival in multiple myeloma. PloS one.2011;6(6):20706-11.
39. Panigrahy C, Seal A, Mahato NK, Bhattacharjee D. Differential box counting methods for estimating fractal dimension of gray-scale images: A survey. Chaos, Solitons & Fractals. 2019; (126):178-02.
41
40. Panigrahy C, Seal A, Mahato NK. Quantitative texture measurement of gray-scale images: Fractal dimension using an improved differential box counting method. Measurement, 2019, 147: 106859.
41. Quan Y, Xu Y, Sun Y, Luo Y. Lacunarity analysis on image patterns for texture classification. In: Proceedings of the IEEE conference on computer vision and pattern recognition. 2014,160-167.
42. De Groot PM, Wu CC, Carter BW, Munden RF. The epidemiology of lung cancer. Translational lung cancer research. 2018; 7(3): 220.
43. Ministério da Saúde. Instituto Nacional de Câncer José Alencar Gomes da Silva. Estimativa 2020: Incidência de Câncer no Brasil. Rio de Janeiro. 2019.
44. Lorand-Metze I, Pereira FG, Costa F, Metze K. Proliferation in non-Hodgkin’s lymphomas and its prognostic value related to staging parameters. Cell Oncology. 2004, 26: 63-71.
45. Sabo E, Beck AH, Montgomery EA. Bhattacharya B, Meitner P, Wang JY, Resnick MB. Computerized morphometry as an aid in determining the grade of dysplasia and progression to adenocarcinoma in Barrett’s esophagus. Lab Invest. 2006, 86:1261-71.
46. Bedin V, Adam, RL, Sá BCS, Landman G, Metze K. Fractal dimension is an independent prognostic factor for survival in melanoma. BMC Cancer. 2010, 10:260.
47. Mello MRB, Metze K, Adam RA, Pereira FG, Magalhaes MG, Machado CG, Lorand-Metze, I. Phenotypic subtypes of acute lymphoblastic leukemia associated with different nuclear chromatin texture. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 2008, 30:175-84.
48. Mello MLS, Vidal BC, Russo IH, Lareef MH, Russo J. DNA content and chromatin texture of human breast epithelial cells transformed with 17-beta-estradiol and the estrogen antagonist ICI 182,780 as assessed by image analysis. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis 2007, 617:1-7.
42
49. Nishihira M, Nakazato Y, Tsuchida S, Kuroda H, Imai Y, Chida M. Nuclear Morphometry of Lung Squamous Cell Carcinomas in Cytologic Study. Annals of Thoracic and Cardiovascular Surgery.2018; 24(6): 303-7.
50. Namazi H, Kiminezhadmalaie M. Diagnosis of lung cancer by fractal analysis of damaged DNA. Computational and mathematical methods in medicine. 2015. 51. Adam RL, Ribeiro E, Metze K, Leite NJ, Lorand-Metze I. Morphometric and
granulometric Features of erythroblasts as a diagnostic tool of hematologic diseases. Cytometry. 2004; 59(1): 46.
52. Adam RL, Leite NJ, Carvalho RB, Silva PV, Metze K. Granulometric residues as a diagnostic tool in cytology. Cytometry, 2004; 59(1): 63.
53. Metze K, Bedin V, Adam RL, Cintra ML, Souza EM, Leite NJ. Parameters derived from the Fast fourier transform are predicitive for the recurrence of basal cell carcinoma. Cellular Oncology. 2005; 27:137.
54. Metze K, Ferreira RC, Adam RL., Leite NJ, Ward LS, Matos PS. Chromatin texture is size dependent in follicular adenomas but not in hyperplastic nodules of the thyroid. World Journal of Surgery. 2008; 32(12):2744-46.
55. Adam RL, Silva RC, Pereira FG, Leite NJ, Lorand-Metze I, Metze K. The fractal dimension of nuclear chromatin as a prognostic factor in acute precursor B lymphoblastic leukemia. Analytical Cellular Pathology. 2006; 28(1,2):55–59. 56. Delides A, Panayiotides I, Alegakis A, Kyroudi A, Banis C, Pavlaki A. Fractal
dimension as a prognostic factor for laryngeal carcinoma. Anticancer Research. 2005; 25(3B):2141-44.
57. Lennon FE, Cianci GC, Cipriani NA, Hensing TA, Zhang HJ, Chen CT, et al. Lung cancer-a fractal viewpoint. Nature Reviews Clinical Oncology. 2015;12(11):664-75.
58. Pantic I, Nesic D, Basailovic M, Basailovic M, Cetkovic M, Mazic S, et al. Chromatin fractal organization, textural patterns, and circularity of nuclear
43
envelope in adrenal zona fasciculata cells. Microscopy and Microanalysis. 2016; 22(6):1120-27.
59. Pantic I, Paunovic J, Basta-Jovanovic G, Perovic M, Pantic S, Milosevic NT. Age-related reduction of structural complexity in spleen hematopoietic tissue architecture in mice. Experimental Gerontology. 2013; 48(9):926–932.
60. Pantic I, Paunovic J, Perovic M, Cattani C, Pantic S, Suzic S. Time-dependent reduction of structural complexity of the buccal epithelial cell nuclei after treatment with silver nanoparticles. Journal of Microscopy. 2013; 252(3): 286– 94.
61. Pantic I, Paunovic J, Vucevic D, Radosavljevic T, Dugalic S, Petkovic A, et al. Postnatal developmental changes in fractal complexity of Giemsa-stained chromatin in mice spleen follicular cells. Microscopy and Microanalysis.2017; 23(5):1024–29.
44 8.ANEXOS
45
46
47
48
