Desenvolvimento de suspensões nanoparticuladas com óleo essencial de Tagetes minuta L. e sua aplicação no controle da mastite bovina

Karin Possebon Bolzan

DESENVOLVIMENTO DE SUSPENSÕES

NANOPARTICULADAS COM ÓLEO ESSENCIAL DE Tagetes minuta L. E SUA APLICAÇÃO NO CONTROLE DA MASTITE

BOVINA

Dissertação submetida como requisito parcial final para a obtenção do grau de Mestre em Agroecossistemas pelo Programa de Pós-graduação em Agroecossistemas da Universidade Federal de Santa Catarina.

Orientador: Prof.ª Dra. Shirley Kuhnen Co-orientador: Dra. Letícia Mazzarino

Florianópolis 2018

Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária da

Karin Possebon Bolzan

DESENVOLVIMENTO DE SUSPENSÕES

NANOPARTICULADAS COM ÓLEO ESSENCIAL DE Tagetes minuta L. E SUA APLICAÇÃO NO CONTROLE DA MASTITE

BOVINA

Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre e aprovado em sua forma final pelo Programa de Pós-Graduação

em Ecossistemas.

Florianópolis, 04 de outubro de 2018.

________________________ Prof. Dr. Arcângelo Loss

Coordenador do Curso Banca Examinadora:

________________________ Prof.ª Dr.ª Shirley Khunen

Orientadora

Universidade Federal de Santa Catarina

________________________ Dr.ª Maria Beatriz Veleirinho Universidade Federal de Santa Catarina

________________________ Dr.ª Luciana Aparecida Honorato Universidade Federal de Santa Catarina

AGRADECIMENTOS “Aqueles que passam por nós não vão sós. Deixam um pouco de si, levam um pouco de nós”. Antoine de Saint-Exupéry

Agradeço à minha família pelo constante incentivo e as orientadoras, colegas e amigos, que de alguma forma participaram dessa jornada que

RESUMO

A mastite bovina é a doença mais importante e comum que acomete a bovinocultura de leite. Normalmente é causada por bactérias, principalmente do gênero Staphylococcus aureus. Esta enfermidade representa um grave problema em rebanhos leiteiros, ocasionando perdas econômicas, redução da produção do leite, descarte de animais, além de provocar alterações no comportamento do animal e redução no seu bem-estar. Portanto, este estudo teve como objetivo desenvolver suspensões de nanopartículas contendo 5% do óleo essencial (OE) de Tagetes minuta L. e avaliar, através de testes in vitro, o potencial no controle da mastite bovina causada por S. aureus. O sistema de nanopartículas contendo o OE foi desenvolvido utilizando a técnica de nanoprecipitação. A caracterização da suspensão coloidal foi realizada pela determinação de tamanho de partícula, índice de polidispersão, potencial zeta, pH, morfologia, teor de OE e eficiência de encapsulação. O estudo de estabilidade foi realizado em temperaturas de 4 °C e 25 °C durante 60 dias de armazenamento. A atividade antimicrobiana in vitro do OE de T. minuta nanoencapsulado (NC-OE) foi avaliada pela técnica de microdiluição em caldo. A citotoxicidade em células da glândula mamária bovina da linhagem MAC-T foi determinada utilizando o método do brometo de 3-4,5-dimetiltiazol-2-il-2,5-difeniltetrazolil (MTT). A avaliação do potencial desinfetante e antisséptico in vitro da suspensão coloidal foi realizada conforme a Norma Europeia EN 1040 (2005), utilizando as cepas de S. aureus (ATCC 6538) e Pseudomonas aeruginosa (ATCC 15442), visando o seu uso no pré e pós-dipping. O sistema de NC-OE de T. minuta apresentou formato esférico, distribuição monodispersa de partículas com tamanho de aproximadamente 260 nm, índice de polidispersão abaixo de 0,12, potencial zeta em torno de -42 mV e pH 4. O teor de OE nas nanocápsulas foi cerca de 2,8 %, com eficiência de encapsulação superior a 99 %. A concentração inibitória mínima (CIM) das NC-OE frente a S. aureus foi 1,429 mg/mL de OE. Já o ensaio de citotoxicidade in vitro das NC-OE revelou uma concentração inibitória 50% (IC50) de 0,287 mg/mL, sendo, portanto, inferior a CIM. Foi possível observar o potencial antisséptico das NC-OE de acordo com a Norma Padrão Internacional, tendo havido a redução de, em média, 5 logs nas concentrações e tempos testados. Os resultados encontrados demonstraram que é possível realizar a nanoencapsulação do OE de T.

minuta e o potencial promissor no controle de mastite bovina, especialmente pela sua atividade desinfetante.

Palavras-chave: Tagetes minuta L., óleo essencial, nanotecnologia, nanopartículas, Staphylococcus aureus, MAC-T, desinfetantes e antissépticos

ABSTRACT

Bovine mastitis is a more important and common disease that affects a bovinocultura of milk. Staphylococcus aureus. The biggest problem of dairy herds, causing economic losses, reducing the production of milk, discard of animals, besides other changes. Therefore, this study had the origin of nanoparticles containing 5% of essential oil (OE) of Tagetes

minuta L. and evaluated, through in vitro tests, the potential in the

control of bovine mastitis and the study by S. aureus. The nanoparticle system containing the OE was developed using a nanoprecipitation technique. The characterization of the colloidal suspension was performed by determination of the particle size, polydispersity index, zeta potential, pH, morphology, OE content and encapsulation efficiency. The study was performed at temperatures of 4 ° C and 25 °C for 60 days of storage. The in vitro antimicrobial activity of T. minuta nanoencapsulated OE (NC-OE) was evaluated by broth microdilution technique. Cytotoxicity in bovine mammary gland cells of the MAC-T line was determined by the use of 3-4,5-dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolyl bromide (MTT). The evaluation of the in vitro disinfectant and antiseptic potential of the colloidal suspension was carried out in accordance with the European Standard EN 1040 (2005), using as strains of S. aureus (ATCC 6538) and Pseudomonas

aeruginosa (ATCC 15442), with a view to their non-use Preview.

post-dive. The NC-OE system of T. minuta took the form, monodisperse distribution of approximately 260 nm, emission index below 0.12, zeta potential around -42 mV and pH 4. The OE content in the nanocapsules was about 2.8%, with encapsulation efficiency greater than 99%. The last step of NC-OE against S. aureus was 1,429 mg / mL OE. The in vitro cytotoxicity assay of the NC-OE at an inhibitory concentration was 50% (IC 50) of 0,287 mg / mL, thus being less than a MIC. It was possible to observe the antiseptic potential of the NC-OE according to the International Standard, with a reduction of, on average, 5 logs at the concentrations and times tested. The results obtained are able to perform a nanoencapsulation of T. minuta OE and the promising potential in the control of bovine mastitis, especially for its disinfectant activity.

Keywords: Tagetes minuta L., essential oil, mastitis, nanotechnology, nanoparticles, Staphylococcus aureus, MIC, MAC-T, disinfectants and antiseptics.

LISTADEFIGURAS

Figura 1 - Ilustração esquemática dos diferentes tipos de nanopartículass: a) Micela, cabeça hidrofílica em cauda azul e hidrofóbica em laranja; b) nanopartículas poliméricas, casca hidrofílica em núcleo azul e hidrofóbico em laranja; c) nanoemulsão, cabeça hidrofílica na cauda azul e hidrofóbica laranja; d) ciclodextrinas, carbono α em azul claro, oxigênio em vermelho e hidrogênio em cinza; e) lipossoma, cabeça hidrofílica em cauda azul e hidrofóbica em laranja; f) nanopartícula inorgânica com núcleo de ouro (Au), revestimento polimérico em azul e ligantes em verde. ... 28

Figura 2 - Representação esquemática da preparação de nanopartículas poliméricas (nanocápsulas e nanoesferas) pelo método de precipitação do polímero pré-formado, também conhecido como nanoprecipitação. ... 30

Figura 3 - Estrutura da unidade monomérica da policaprolactona. ... 31

Figura 4 - Parte aérea de T. minuta cultivada no Núcleo de Agroecologia da Fazenda Experimental da Ressacada – UFSC ... 32

Figura 5 - Aspecto macroscópico das suspensões de nanopartículas de OE de T. minuta: A) nanocápsulas de OE de T. minuta (NC-OE) e B) nanocápsulas branca (NC-B). ... 45

Figura 6 - Caracterização das NC-OE por meio de imagens obtidas pelo TEM. ... 46

Figura 7 - Distribuição de tamanho de partícula das nanopartículas com o OE de T. minuta obtido em um ângulo de espalhamento de 90º. ... 47

Figura 8 - Diâmetro das partículas (a), índice de polidispersão (b), potencial zeta (c) e pH (d) das NC durante 60 dias de armazenamento à 4 e 25 °C. ... 49

Figura 9 - Espectros de absorbância obtidos para a) solução padrão do OE (3µg/mL) e b) NC-B. ... 52

Figura 10 - Curva de calibração do OE de T. minuta em acetonitrila... 53

Figura 11 - Avaliação do efeito do OE de T. minuta sobre o crescimento de S. aureus após a adição do corante resazurina (100µg/mL). A cor azul representa ausência de crescimento bacteriano e a cor rosa a presença de crescimento bacteriano ... 56

Figura 12 – Percentual de redução do crescimento microbiano (média ± desvio padrão) ocasionado pelo o OE de T. minuta contra S.

aureus ATCC 25923 e isolados de campo. Médias seguidas pela mesma letra minúscula não diferem entre si pelo teste Scott-knott (α= 0,05) ... 57

Figura 13 - Percentual da redução do crescimento microbiano) (média +/- desvio padrão) de OE de T. minuta sobre S. aureus 33592 meticilina resistente e isolados de campo meticilina resistente. Médias seguidas pela mesma letra minúscula não diferem entre si pelo teste Scott-knott (α= 0,05) ... 57

Figura 14 - Efeito das NC-OE de T. minuta sobre o crescimento de S. aureus determinado após adição do corante resazurina (100µg/mL). A presença de cor azul representa ausência de crescimento bacteriano e de cor rosa presença de crescimento bacteriano. ... 58

Figura 15 - Percentual da redução do crescimento microbiano (média +/- desvio padrão) das NC-OE de T. minuta sobre S. aureus ATCC 25923 e isolados de campo. Médias seguidas pela mesma letra minúscula não diferem entre si pelo teste Scott-knott (α= 0,05) ... 59

Figura 16 - Percentual da redução do crescimento microbiano (média +/- desvio padrão) das NC-OE de T. minuta sobre S. aureus 33592 meticilina resistente e isolados de campo meticilina resistente. Médias seguidas pela mesma letra minúscula não diferem entre si pelo teste Scott-knott (α= 0,05) ... 59

Figura 17 - Porcentagem de viabilidade celular (média de três repetições independentes ± DP) das células MAC-T após exposição a diferentes concentrações das NC-OE de T. minuta (P<0,05) ... 61

Figura 18 - Porcentagem de viabilidade celular (média de três repetições independentes ± DP) das células MAC-T após exposição a diferentes concentrações das NC-B (P<0,05) ... 61

Figura 19 - Média da eficácia in vitro do NC-OE de T. minuta (a) e do hipoclorito de sódio (b) como desinfetante e antisséptico frente S. aureus, demonstrado pela diminuição de número de LOGs em diferentes tempos. ... 63

Figura 20 - Média da eficácia in vitro do desinfetante NC-OE de T. minuta (c) e antisséptico hipoclorito de sódio (d) e frente a P. aureginosa, demonstrado pela diminuição de número de LOGs em diferentes tempos. ... 64

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 – Composição das suspensões de nanocápsulas contendo o OE de T. minuta (NC-OE) e das nanocápsulas sem o OE (nanocápsulas branca, NC-B). ... 33

Tabela 2 - Isolados de S. aureus meticilina resistente e não meticilina resistente de campo. ... 39

Tabela 3 - Composição química do OE de T. minuta em estudo coletadas na Fazenda da Ressacada (UFSC). ... 44

Tabela 4 - Propriedades físico-químicas das suspensões de NC-OE desenvolvidas com 5% do OE de T. minuta . ... 48

Tabela 5 - Resultados obtidos na avaliação da precisão do método de espectrofotometria UV – Vis para a quantificação do OE de T. minuta. ... 54

Tabela 6 - Recuperação de OE de T. minuta adicionado à formulação branca analisada pelo método, podendo variar numa porcentagem de 95 a 105%. ... 55

LISTADEABREVIATURASESIGLAS ANOVA - Análise de variância

ATCC- American Type Culture Collection (Coleção Americana de Tipos de Culturas)

BHI- Brain Heart Infusion (Infusão de cérebro e coração) CG - Cromatografia gasosa

CIM- Concentração inibitória mínima

CSLI - Clinical and Laboratory Standards Institute

DMEM- Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium

EUA - Estados Unidos da América IC50- Concentração Inibitória de 50%

i.e. - Do latim id est, traduzida como “isto é” ou ainda “ou seja” IN- Instrução Normativa

LABIMA- Laboratório de Morfofisiologia e Bioquímica Animal

MTT- Brometo de 3-4,5-dimetiltiazol-2-il-2,5-difeniltetrazolil OE- Óleos Essenciais

PCL- Poli-ɛ-caprolactona PDI- Índice de polidispersão pH - Potencial hidrogeniônico SC- Santa Catarina

TVS- Terapia da Vaca Seca

UFC- Unidades Formadoras de Colônia UFSC- Universidade Federal de Santa Catarina

SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 15 2 OBJETIVOS... 18 2.1 Objetivo Geral ... 18 2.2 Objetivos Específicos ... 18 3 HIPÓTESE DO ESTUDO ... 19 4 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 20 4.1 Mastite Bovina ... 20 4.2 Fitoterápicos ... 22

4.3 Potenciais Tratamentos da Mastite Bovina com Fitoterápicos ... 23 4.4 Tagetes minuta L. ... 24 4.5 Nanotecnologia ... 26 4.5.1 Nanopartículas Poliméricas ... 29 4.5.1.1 Poli-ɛ-caprolactona (PCL) ... 30 5 MATERIAL E MÉTODOS ... 31

5.1 Coleta e Extração do OE de T. minuta ... 31

5.1.1 Extração do OE de T. minuta ... 32

5.1.2 Caracterização Química do OE de T. minuta ... 33

5.1.3 Preparação das Suspensões de Nanopartículas contendo o OE de T. minuta ... 33

5.1.4 Caracterização da Suspensão de NC-OE de T. minuta 34 5.1.4.1 Determinação do Tamanho de Partícula e Potencial Zeta 34 5.1.4.2 Determinação do pH ... 34

5.1.4.3 Avaliação Morfológica ... 34

5.1.5 Avaliação da Estabilidade das NC-OE de T. minuta ... 35

5.1.6 Validação do Método Analítico para a Determinação do Teor de OE de T. mimuta nas Suspensões de NC ... 35

5.1.6.1 Método Espectrofotométrico ... 35

5.1.6.3 Linearidade ... 36

5.1.6.4 Limites de Detecção e de Quantificação ... 36

5.1.6.5 Precisão ... 36

5.1.6.6 Exatidão ... 37

5.1.7 Determinação do Teor e Eficiência de Encapsulação de OE de T. minuta nas Suspensões de NC ... 37

5.2 Avaliação da Atividade Antimicrobiana in vitro ... 38

5.2.1 Bactérias ... 38

5.2.2 Atividade Antimicrobiana in vitro ... 39

5.3 Citoxicidade in vitro em Células Epiteliais Mamárias Bovinas da Linhagem MAC-T ... 40

5.4 Ensaio de Desinfetantes e Antissépticos ... 41

6 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 42

7 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 43

7.1 Composição do OE de T. minuta ... 43

7.2 Desenvolvimento e Caracterização das Suspensões de NC-OE de T. minuta ... 45

7.3 Estudo da Estabilidade das NC-OE de T. minuta ... 48

7.3.1 Desenvolvimento e Validação de um Método Espectrofotométrico para Determinação do Teor de OE de T. Minuta em Suspensões de NC ... 52

7.3.1.1 Especificidade ... 52

7.3.1.1.1 Linearidade ... 53

7.3.1.1.1.1 Limites de Detecção e de Quantificação ... 53

7.3.1.1.1.2 Precisão ... 53

7.3.1.1.1.3 Exatidão ... 54

7.3.2 Determinação do Teor e Eficiência de Encapsulação de OE de T. minuta nas Suspensões de NC ... 55

7.4 Avaliação da Atividade Antimicrobiana ... 55

7.5 Avaliação da Citotoxicidade ... 60

7.6 Atividade Desinfetante e Antisséptica ... 62

8 CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 65

1 INTRODUÇÃO

O leite é um importante alimento da dieta humana, consumido na atualidade por pessoas de diferentes idades. Devido a sua importância como alimento consumido in natura ou para a produção de derivados, a presença de resíduos, tais como o de fármacos utilizados durante o manejo sanitário dos animais tem sido uma preocupação crescente. Apesar dos padrões mínimos de qualidade estabelecidos na Legislação Brasileira, os quais incluem entre outras coisas, os limites máximos de resíduo (LMR) (BRASIL, 2014), isto não tem sido suficiente para garantir um alimento livre de resíduos. Alguns estudos têm mostrado que amostras de leite cru de quatro áreas produtoras de leite no Brasil tinham resíduos de antimicrobianos acima do permitido (NERO et al., 2007). O uso indiscriminado, sem controle técnico e veterinário de antimicrobianos no Brasil, no controle de doenças infecciosas dos rebanhos leiteiros, tem sido a principal causa desse cenário (PORTUGAL et al., 2001). Em contrapartida, esta é uma preocupação crescente por parte da população que tem buscado, cada vez mais, alimentos “limpos” e “saudáveis”, como o leite orgânico e/ou agroecológico.

Dentre os principais problemas sanitários do rebanho leiteiro que requerem o uso de antimicrobianos destaca-se a mastite. Esta doença causada principalmente por bactérias, afeta negativamente o setor leiteiro, ocasionando a redução da produção de leite, o descarte precoce de matrizes, a redução do valor comercial dos animais e elevados gastos com medicamentos. Além disso, as alterações provocadas na composição físico-química do leite também causam prejuízos à indústria de laticínios (COSTA et al., 2013).

As principais espécies de bactérias causadoras de mastite em rebanhos bovinos são S. aureus e Escherichia coli, havendo o predomínio da primeira em casos de mastite subclínica. Neste caso, há uma maior facilidade de penetração de S. aureus na glândula mamária por existir sobre a pele do animal. Ao colonizar o órgão, as bactérias podem induzir a formação de um tecido fibroso, originando “bolsões” de bactérias que limitam a ação dos antimicrobianos, qualificando a infecção como de longa duração, crônica, com baixo índice de cura espontânea ou por antimicrobianos. Não há sinais visíveis da manifestação da doença, a não ser que haja uma redução na produção de leite, o que muitas vezes passa despercebido. A mastite subclínica é diagnosticada pelo aumento na contagem de células somáticas (CCS) no

leite, podendo ser esta mensurada direta ou indiretamente por meio dos testes California Mastitis Test (CMT) ou pela contagem eletrônica de células somáticas (CCS) em laboratório (FERNANDES, 2013; MARTINS FILHO et al., 2007; FONSECA & SANTOS, 2001; DÜRR, 2005).

Por outro lado, na mastite clínica os sinais visíveis da doença acarretam em elevadas perdas por descarte do leite, gastos com medicamentos, perda funcional da glândula e até mesmo a morte do animal. Em casos agudos, é possível observar na glândula mamária os sinais de inflamação, tais como inchaço, coloração avermelhada, aumento na temperatura local e rigidez no úbere. Tais infecções são também de difícil resolução terapêutica (AMARANTE, 2011). No entanto, os maiores prejuízos são causados pela mastite subclínica, pelo fato desta se alastrar de maneira silenciosa, sem a manifestação de sinais externos no rebanho leiteiro (BOGNI et al., 2011).

O controle da mastite é ainda um desafio para os sistemas de produção de leite. No sistema orgânico ou agroecológico este problema é ainda maior, uma vez que o uso de antimicrobianos é restrito, havendo ainda pouco conhecimento sobre tratamentos alternativos, conforme indicado pela Instrução Normativa 17 (IN17) (BRASIL, 2014). Desse modo, a busca por alternativas terapêuticas, como através da fitoterapia, poderá permitir a implantação de soluções menos impactantes para o meio ambiente, para a saúde humana e animal e que não representem entraves econômicos para o setor leiteiro em geral.

Neste sentido, a planta Tagetes minuta, objeto de pesquisa deste trabalho, popularmente conhecida como calêndula selvagem, tem uma longa história de uso humano através de alimentos, perfumes, medicamentos, entre outros. Embora originária do México, nos dias de hoje é naturalizada a uma ampla gama de condições climáticas em todo o mundo (CORNELIUS & WYCLIFFE, 2016). É conhecida principalmente pela produção de óleo essencial, utilizado, predominantemente como agente aromatizante e tempero, conferindo aroma a diversos produtos alimentares e bebidas. As infusões e os extratos das folhas estão relatados na medicina popular para o tratamento de alguns problemas, como doenças intestinais e estomacais (CORNELIUS & WYCLIFFE, 2016; SENATORE et al., 2004; SINGH et al.,1992).

Estudos com o óleo essencial (OE) de T. minuta mostraram que este contém compostos e/ou misturas associadas a várias propriedades bioativas e terapêuticas, tais como anti-helmíntica, sedativa, antisséptica, germicida, estomacal, bactericida, nematicida,

inseticida, fungicida, antiviral, larvicida, entre outras (CORNELIUS & WYCLIFFE, 2016; SENATORE et al., 2004; SINGH et al.,1992).

A atividade antimicrobiana do óleo de T. minuta contra bactérias causadoras de mastite foi previamente demonstrada por um trabalho realizado pelo grupo de pesquisa do LABIMA (UFSC) (SPERANDIO, 2016). No entanto, neste mesmo estudo, o uso intramamário não foi recomendado, devido a elevada toxicidade às células epiteliais mamárias bovinas, havendo, portanto, o interesse de se desenvolver uma formulação com potencial de redução da sua toxicidade.

Neste sentido, o desenvolvimento de nanopartículas para o encapsulamento do OE de T. minuta foi o tema proposto no presente estudo. A utilização de um sistema de nanopartículas contendo o óleo de T. minuta no controle da mastite é um tema inovador, podendo apresentar grande eficiência terapêutica, de saúde pública e econômica. Além disso, o uso de sistemas nanocarreadores para a liberação de ativos apresenta vantagens em relação às formulações tradicionais, incluindo a liberação controlada de ativos, possibilidade de solubilizar ativos lipofílicos em meio aquoso, aumento da estabilidade físico-química, redução de efeitos colaterais e toxicidade (RIBEIRO et al., 2009; VINTOV. et al., 2003).

Desse modo, o presente estudo teve como objetivo desenvolver um sistema de nanopartículas contendo o OE de T. minuta visando o controle da mastite bovina. Para isso, diferentes métodos de preparação e caracterização das nanopartículas do OE de T. minuta foram avaliados. O potencial antimicrobiano, a citotoxicidade em células epiteliais mamárias bovinas da linhagem MAC-T e o potencial antisséptico in vitro dos sistemas desenvolvidos foram estudados visando o potencial uso intramamário e externo no pré e pós dipping. Através do desenvolvimento de uma nanoformulação espera-se, ainda, assegurar uma melhor absorção dos princípios ativos da planta, intensificando o potencial terapêutico no combate à mastite com menores danos à glândula mamária do animal.

2OBJETIVOS 2.1Objetivo Geral

Desenvolver suspensões de nanopartículas contendo o óleo de T. minuta, com potencial de aplicação no controle da mastite bovina. 2.2Objetivos Específicos

-Desenvolver uma suspensão de nanocápsulas contendo o OE de T. minuta pela técnica de nanoprecipitação;

-Caracterizar a suspensão coloidal quanto ao tamanho de partícula, índice de polidispersão, potencial zeta, pH, morfologia, teor e eficiência de encapsulação;

-Desenvolver e validar uma metodologia analítica para o doseamento do OE de T. minuta na suspensão de nanopartículas;

-Avaliar a estabilidade da suspensão de nanopartículas contendo o OE durante armazenamento a 4 °C e 25 °C pelo período de 60 dias;

-Avaliar a atividade antimicrobiana in vitro da suspensão de nanopartículas contra a cepa padrão de S. aureus (ATCC 25953) e isolados de leite de vacas diagnosticadas com mastite, além de S. aureus ATCC 33592 meticilina resistente e isolados meticilina resistente de vacas com mastite;

-Avaliar o efeito citotóxico in vitro da formulação em células epiteliais mamárias bovina da linhagem MAC-T;

-Avaliar o efeito desinfetante e antisséptico in vitro da formulação frente às cepas P. aeruginosa (ATCC 15442) e S. aureus (ATCC 6538).

3 HIPÓTESE DO ESTUDO

O OE de T. minuta nanoencapsulado terá melhor efeito antimicrobiano e menor citotoxicidade às células da glândula mamária comparado ao óleo não encapsulado, em testes in vitro, visando a sua aplicação no controle da mastite bovina causada por S. aureus ou como antisséptico em práticas do manejo tais como no pré e pós dipping.

4REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 4.1Mastite Bovina

A mastite bovina é a doença mais importante e comum que acomete a bovinocultura de leite, sendo causada, normalmente, por bactérias. Esta enfermidade representa um grave problema em rebanhos leiteiros, ocasionando perdas econômicas, redução da produção do leite, descarte de animais, além de provocar alterações no comportamento do animal e redução no seu bem-estar (GUIMARÃES et al., 2017; FOGSGAARD et al., 2015). É responsável por 38% de toda morbidade em vacas leiteiras adultas. Anualmente, três em cada dez vacas leiteiras apresentam inflamação clínica aparente da glândula mamária. Dessas, 7% são descartadas e 1% morre. Ao todo, 25% das perdas econômicas totais de bovinos leiteiros, são atribuídas à mastite (PERES NETO & ZAPPA, 2011).

As formas de transmissão dos microrganismos causadores de mastite podem ser classificadas como ambiental ou contagiosa. Esta última ocorre quando os microrganismos são transmitidos entre as vacas que tiveram contato com o leite infectado. Neste caso, os patógenos causam principalmente as formas subclínicas da doença, sendo de difícil detecção, pois os animais não apresentam sinais clínicos (MEDEIROS & SOUZA, 2009; MDEGELA et al., 2009 ATAKISI et al., 2010). Em contrapartida, a forma de transmissão ambiental é dada por meio de agentes patogênicos, que inclui uma gama de microrganismos que ocorrem no ambiente e, apesar de causarem a doença em sua manifestação clínica com frequência, é difícil que um grande número de vacas em um mesmo rebanho seja infectado pela mesma estirpe. Ademais, vacas com mastite clínica são de fácil identificação no rebanho, pois apresentam sinais visíveis como febre, perda de apetite, função do rúmen reduzida, fraqueza, prostração, inchaço, calor e vermelhidão no úbere, além de alterações no aspecto do leite, tais como flocos, coágulos e uma aparência aquosa (BOGNI et al., 2011).

Os casos de mastite clínica diferem de acordo com a intensidade da enfermidade, sendo classificados conforme as manifestações dos sinais da doença. A mastite é considerada branda quando ocorrem apenas alterações macroscópicas no aspecto do leite, é considerada moderada, quando além de alterações no aspecto normal da glândula mamária, como vermelhidão, edema, calor e dor, e é considerada severa quando além das alterações no aspecto do leite, há um comprometimento sistêmico como febre elevada, alteração da

frequência cardíaca e respiratória, ausência de movimentos ruminais e alterações externas do úbere (ROBERSON, 2003).

A ocorrência de mastite depende de alguns fatores, tais como, a interação com o hospedeiro, o agente microbiano e as condições ambientais. O grau de inflamação depende do patógeno causal, idade, raça, estado de saúde e grau de lactação do animal. A defesa da glândula mamária abrange um complexo sistema de tecidos, células e moléculas que funcionam somados contra os organismos causadores de mastite. Tanto nos casos clínicos, como nos subclínicos, as infecções têm início assim que os microrganismos penetram internamente o teto, causando a multiplicação nos tecidos que produzem o leite. Logo após a ordenha, devido ao esfíncter permanecer dilatado por um tempo, o canal do teto fica desprotegido e propenso a infecções, assim os microrganismos que naturalmente estão do lado de fora da glândula, entram em contato com o canal e como essa exposição é reincidente, a infecção pode tornar-se crônica (LAM et al., 2013; BOGNI et al., 2011; CUNNINGHAM & KLEIN, 2008).

A principal bactéria causadora de mastite subclínica e clínica é Staphylococcus aureus. Essa bactéria é capaz de originar infecções de longa duração, graves que podem tornar-se crônicas. Isso causa uma baixa taxa de cura e uma alta perda da produção de leite, especialmente quando afetadas por S. aureus (SABOUR et al., 2004). No tratamento convencional da mastite recomenda-se o uso da penicilina e seus derivados. Contudo, o aumento mundial de cepas de S. aureus resistentes a estes antimicrobianos tem crescido consideravelmente. Devido a esse aumento, cresce o interesse por novos agentes antimicrobianos para o controle das infecções de origem animal e humana (RIBEIRO et al., 2009; RIBEIRO et al., 2006).

No Brasil, um estudo sobre a ocorrência de infecções intramamárias, no período pós-parto, em primíparas, revelou uma alta incidência de mastite (FONSECA & SANTOS, 2007). A aquisição de animais infectados e ordenhadores que carregam a bactéria ou o próprio manejo da ordenha são focos de contaminação do rebanho. A prevenção e o controle dessas infecções são feitas com a utilização de antimicrobianos, porém o uso excessivo e indiscriminado no rebanho bovino leiteiro tem sido uma das causas do aparecimento de resistência bacteriana progressiva a esses fármacos (SPINOSA et al., 2011; MANTILLA et al., 2008).

O uso contínuo de antimicrobianos de uso restrito e com períodos de carência no tratamento da mastite causa alguns riscos à

saúde humana e animal, entre eles a carga residual de antimicrobianos no leite consumido pela população, além da resistência antibacteriana nos animais. Este cenário tem sido relatado por diversos autores como grave problema de saúde pública, que causa prejuízos à indústria de laticínios, fatos que justificam a busca por alternativas ambientalmente mais sustentáveis (FONSECA et al., 2009; MARTINS et al., 2011; MALUF DIAS et al., 2012; VIEIRA et al., 2012).

4.2Fitoterápicos

A busca por novos antimicrobianos nas plantas medicinais surge como uma alternativa promissora. O Brasil tem um grande potencial para o desenvolvimento de fitoterápicos considerando a grande e extensa diversidade de sua flora, que representa aproximadamente um terço da flora mundial (YUNES; PEDROSA; CECHINEL FILHO, 2001; BRASIL, 2008). O produto fitoterápico pela legislação sanitária brasileira é o medicamento obtido exclusivamente a partir de matérias-primas vegetais, devendo ser reconhecido pela sua eficácia e pelos riscos de seu uso, sua qualidade e ainda sua reprodutibilidade (CARVALHO et al., 2008).

A utilização de fitoterápicos no controle da mastite bovina, em alternativa aos antimicrobianos convencionais, tem apresentado resultados promissores. Trabalhos recentes revelaram o potencial de produtos naturais como antimicrobianos frente a cepas causadoras desta doença, e em alguns casos a resistência bacteriana não foi encontrada (SANTANA et al., 2012; SPEROTTO et al., 2012; FIORDALISI et al., 2016).

Os fitoterápicos à base de óleos essenciais (OE) apresentam em sua composição alguns metabólicos que possuem atividade antimicrobiana similares aos tradicionais antimicrobianos sintéticos. Os OEs têm se mostrado eficazes no combate aos microrganismos devido aos seus constituintes apresentarem interações fito-sinérgicas (BASSOLÉ & JULIANI, 2012; VAN VUUREN & VILJOEN, 2011). É importante evidenciar que a busca por produtos naturais no controle da mastite deve abranger compostos com ações distintas, tais como, antimicrobiana, antioxidante, anti-inflamatória e cicatrizante. Produtos que apresentem todas essas características exigem o sinergismo de uma matriz complexa, o que possivelmente só poderá ser encontrado na natureza.

Apesar do potencial de T. minuta como planta medicinal ainda há poucos estudos sobre ela. Entre as atividades encontradas para essa

espécie, destaca-se a atividade antimicrobiana do seu OE. No entanto, sua alta toxicidade dificulta seu uso em aplicações com dosagem controlada e segura para o animal (VIEIRA et al., 2011; SCHUCH et al., 2008; WIEST et al., 2009; SENATORE et al., 2004; SOUZA et al., 2000).

4.3Potenciais Tratamentos da Mastite Bovina com Fitoterápicos

A utilização de fitoterápicos, no controle da mastite bovina, é praticada por agricultores e veterinários, tanto na prevenção quanto no tratamento em si. São usadas soluções ou pomadas medicinais de uso local à base de ervas, ou ainda, o uso de plantas verdes ou secas administradas via oral (SCHUCH et al., 2008; MUSHTAQ et al., 2015). Há diversos estudos sobre o potencial antimicrobiano de diversas espécies de plantas contra os patógenos causadores de mastite bovina. A parte residual da colheita, i.e., galhos descartados que não são aproveitados pela indústria da erva mate, Ilex paraguarienses A.st.-(Hil.), por exemplo, apresentou efeito antimicrobiano contra S. aureus (GIROLOMETTO et al., 2009). Da mesma forma, o potencial antimicrobiano de Baccharis trimera (Less.) D.C. – Compositae, conhecida como carqueja, contra S. aureus foi demonstrado por AVANCINI et al. (2000), com possibilidades de uso como desinfetante e antisséptico biológico. O decocto de Hypericum caprifoliatum Cham. Shclecht. – Guttiferae (“escadinha/sinapismo”) também mostrou atividade desinfetante frente a diferentes concentrações de inóculo de S. aureus (AVANCINI; WIEST, 2008).

A erva Thalictrum minus L., uma erva usada tradicionalmente no controle de mastite em regiões da Ásia e Europa, contra bactérias gram-positivas e gram-negativas causadoras de mastite bovina, teve sua eficiência confirmada (MUSHTAQ et al., 2015). Efeitos similares foram encontrados por SPEROTTO et al. (2012), com infusões de macela (Achyrocline saturioides) de conhecimento popular na América do Sul contra bactérias S. aureus e E. coli isoladas de leite mastítico. A Baccharis trimera, Bidens pilosa, Eucalyptus sp., Polygonun hydropiper e Tagetes minuta também demonstraram atividade antimicrobiana frente a cepas de diferentes bactérias causadoras da mastite (SCHUCH et al., 2008). O OE de Minthostachys verticillata e do limoneno isolado foi eficaz contra Streptococcus uberis, um importante patógeno causador de mastite bovina (MONTIORINI et al. 2016). Produtos naturais já demonstraram atividades biológicas in vivo, com resultados positivos no

tratamento de cabras com mastite experimental após a aplicação de formulações à base de Hymenaea martiana, espécie de uso popular, tal como o jatobá (PEIXOTO et al., 2015). Outra planta que teve sua ação antimicrobiana demonstrada é a Vaccinium oxycoccus (oxicoco/cranberry) que atua em sinergia com antimicrobianos β-lactâmicos frente a cepas de S. aureus (DIARRA et al., 2013).

Para que os fitoterápicos sejam uma alternativa ao uso de tratamentos convencionais no controle da mastite via glândula mamária bovina, os mesmos devem ser utilizados de forma segura. Para isso, resultados de pesquisas que comprovem sua eficácia devem ser consultados. O uso indiscriminado de fitoterápicos deve ser evitado, pois acredita-se que eles não apresentam toxicidade e efeitos prejudiciais no tratamento de doenças, mas quando a dosagem de fitoterápicos é administrada adequadamente os riscos de intoxicações são diminuídos e o tratamento se torna eficaz (ARNOUS et al., 2005; MARQUES, 2000; SCHENKEL,1995;).

De acordo com os resultados descritos na literatura e estudos que vem sendo feitos no LABIMA incluindo os do OE de T. minuta, tal como o trabalho desenvolvido por Sperandio (2016), onde testes in vitro foram feitos e a ação antimicrobiana do OE da planta foi confirmada. Devido os resultados promissores, optou-se por continuar a investigação do seu potencial como agente antimicrobiano no controle de mastite bovina.

4.4Tagetes minuta L.

A planta Tagetes pertence a família Asteraceae ou Compositae, introduzida no Brasil há muitos anos é originária da América do Norte e do Sul. É de fácil adaptação aos diferentes climas, se tornando uma planta subespontânea (CORNELIUS & WYCLIFFE, 2016; KISSMANN & GROTH, 1992). T. minuta, popularmente conhecida como rabo-de-foguete, chinchilho, rabo-de-rojão, cravo-do-mato, possui folhas compostas imparipinadas, com 3-9 folíolos glandulosos e flores em pequenos capítulos amarelos, reunidos em panículas axilares e terminais (CORNELIUS & WYCLIFFE, 2016; LORENZI, 2008; KISSMANN & GROTH, 1992).

A planta é um subarbusto, ereto e pouco ramificado, podendo alcançar dois metros de altura, se reproduzindo facilmente por sementes, com germinação na primavera, desaparecendo no início do inverno, na Região Sul do Brasil. Seu ciclo é de 120-150 dias até a formação de sementes. Cresce espontaneamente em lavouras agrícolas anuais e

perenes e é considerada uma “planta daninha”. Desenvolve-se bem em terrenos secos e em solos cultivados e férteis (LORENZI, 2008; KISSMANN & GROTH, 1992).

O uso popular de T. minuta inclui propriedades anti-inflamatória, bronco dilatadora, larvicida, bactericida, antiespasmódica, antiparasitária, antisséptica, inseticida e sedativa, também é usada em infecções pulmonares e da pele. Ainda tem efeito curativo em feridas e cortes (NIKKON F et al., 2011; SCHUCH et al., 2008; WANG M et al., 2006). Em termos de composição química, foram encontrados nas suas partes aéreas, saponinas, terpenóides, taninos, alcalóides e flavonoides (RODRIGUEZ & MABRY, 1997). No OE, extraído das flores de plantas do noroeste do Himalaia, foram identificados como compostos majoritários P—ocimeno (39,44%), dihidrotagetona (15,43%), (2)-tagetona (8,78%), (E)- ocimenona (14,83%) e (Z)-ocimenona (9,15%). Os mesmos autores encontraram atividade larvicida da ocimenona contra mosquitos (MOREIRA, F., 1996; KISSMANN & GROTH, 1992; SINGH et al.,1992; SCHIAVON, D. B. A., 2011).

O estudo da atividade antimicrobiana de T. minuta contra bactérias positivas (S. aureus e Enterococcus. faecium) e Gram-negativas (Salmonella gallinarum e Escherichia coli), mostrou seu potencial como antisséptico/desinfetante (SOUZA et. al, 2000). A atividade antimicrobiana dos extratos hidroalcoólicos e decocto de T. minuta foi também demonstrada contra Streptococcus spp. (SCHUCH et al., 2008).

A grande maioria das atividades de T. minuta parecem estar associadas aos princípios ativos do OE produzido nas partes aéreas das plantas. De maneira geral, o OE é uma mistura complexa de substâncias voláteis, lipofílicas, de baixo peso molecular, geralmente odoríferas e líquidas, constituídas principalmente por moléculas de natureza terpênica. Em temperatura ambiente, tais compostos apresentam aspecto oleoso e alta volatilidade, além de serem pouco solúveis em água (ARAÚJO et al., 2015; BILIA et al., 2014; MILLEZI et al., 2012; SIMÕES; SPITZER, 2004), características que podem limitar o uso de T. minuta como fitoterápico. Essas qualificações derivam das características físico-químicas, como a denominação de “óleo”, por geralmente serem líquidos de aspecto oleoso à temperatura ambiente. Todavia, tem como característica principal a volatilidade, no que se diferenciam dos óleos fixos, que são constituídos por substâncias lipídicas normalmente provindas de sementes. Os OEs têm sua solubilidade limitada em água, são solúveis em solventes orgânicos

apolares, por esse motivo são nomeados de óleos etéreos (BILIA et al., 2014; SIMÕES; SPITZER, 2004). Os óleos essenciais podem ser sintetizados por todas as partes das plantas e são armazenados em células secretoras, cavidades, canais, células epidérmicas ou tricomas glandulares (ARAÚJO et al., 2015; SÃO PEDRO et al., 2013; BIZZO; HOVELL; REZEN, DE, 2009; SIMÕES; SPITZER, 2004).

4.5Nanotecnologia

A fim de contornar as limitações decorrentes da baixa solubilidade em meio aquoso e a alta volatilidade dos OE, tais como o OE de T. minuta, técnicas de nanoencapsulamento vem sendo investigadas (DHEEBIKA et. al., 2015). A nanotecnologia é uma ciência multidisciplinar que estuda a caracterização, fabricação, manipulação e aplicação de materiais biológicos e não biológicos em escala nanométrica. Possui aplicação em setores distintos que vão desde a indústria farmacêutica até energia e eletrônica. O termo nanotecnologia vem da palavra nanômetro, medida que equivale a bilionésima parte do metro. Nesta escala de tamanho, as estruturas apresentam propriedades funcionais únicas que não são apresentadas em escala de maior dimensão (ASSIS et al., 2012). Esta ciência baseia-se no fato de que os materiais nanométricos apresentam uma grande área superficial, apresentando propriedades físico-químicas, reatividade, solubilidade e estabilidade distintos quando comparados aos agentes ativos originais (TRONCARELLI et al., 2013).

Entre as principais vantagens apresentadas pelo uso de sistemas nanocarreadores para liberação de OE, pode-se citar:

proteção das moléculas lábeis frente degradação enzimática, oxidação ou volatilização, garantindo a integridade do produto natural encapsulado (SAVARDEKAR; BAJAJ, 2016; MANGALE et al., 2015);

maior estabilidade física e uma prolongada vida útil do ativo e do produto final (JAISWL; DUDHE; SHARMA, 2015; MANGALE et al., 2015; BILIA et al., 2014; SÃO PEDRO et al., 2013);

atividade antimicrobiana potencializada, devido à dimensão nanométrica das partículas que possuem propriedade de difusão através das membranas biológicas (MANGALE et al., 2015; BILIA et al., 2014; SÃO PEDRO et al., 2013);

liberação prolongada da molécula ativa no sítio de ação (BILIA et al., 2014; SÃO PEDRO et al., 2013);

maior eficácia terapêutica (BILIA et al., 2014; SÃO PEDRO et al., 2013);

menor toxicidade às células saudáveis (JAISWL; DUDHE; SHARMA, 2015; BILIA et al., 2014; SÃO PEDRO et al., 2013);

maior solubilidade em água, o que possibilita a aplicação em diferentes formas, como por exemplo, solução, gel, creme, spray e espuma (JAISWL; DUDHE; SHARMA, 2015; MANGALE et al., 2015; SÃO PEDRO et al., 2013);

Na medicina veterinária, a nanotecnologia também é utilizada, por exemplo, no nanobioprocessamento enzimático e na prevenção e tratamento de doenças (SCOTT, 2007). Espera-se que neste setor, a nanotecnologia possa contribuir com a inovação de produtos e medicamentos, tais como, vacinas de uso animal e de métodos de aplicação desses produtos que aumentem a sua eficácia. Também poderá reduzir possíveis efeitos tóxicos aos animais, reduzindo uma possível contaminação ambiental que o uso continuado destes produtos possa causar (EMBRAPA, 2013).

A utilização de sistemas coloidais nanométricos para a encapsulação de compostos bioativos naturais que apresentam uma atividade antimicrobiana é uma estratégia promissora para contornar as limitações da utilização dos OEs in natura (SÃO PEDRO et al., 2013). Dentre as estratégias utilizadas, os OEs podem ser associados a diferentes sistemas nanocarreadores, tais como sistemas coloidais poliméricos e lipídicos (SÃO PEDRO et al., 2013).

Os sistemas coloidais que apresentam nanopartículas com tamanho de partícula entre 50 e 1000 nm. O tamanho médio das partículas normalmente é de 100 a 500 nm. (LOVELYN & ATTAMA, 2011; SHAH et al., 2010). As nanopartículas que são utilizadas para a encapsulação de OEs podem ser de vários tipos, incluindo micelas, nanopartículas poliméricas, nanoemulsões, lipossomas, como mostrado na Figura 1.

Figura 1 - Ilustração esquemática dos diferentes tipos de nanopartículass: a) Micela, cabeça hidrofílica em cauda azul e hidrofóbica em laranja; b) nanopartículas poliméricas, casca hidrofílica em núcleo azul e hidrofóbico em laranja; c) nanoemulsão, cabeça hidrofílica na cauda azul e hidrofóbica laranja; d) ciclodextrinas, carbono α em azul claro, oxigênio em vermelho e hidrogênio em cinza; e) lipossoma, cabeça hidrofílica em cauda azul e hidrofóbica em laranja; f) nanopartícula inorgânica com núcleo de ouro (Au), revestimento polimérico em azul e ligantes em verde.

Fonte: adaptado de ALBERTI et al., 2017.

As micelas são estruturas formadas por um núcleo e um invólucro obtidas espontaneamente pela mistura de copolímeros e solventes, normalmente possui um núcleo hidrofóbico e uma parede externa hidrofílica em solução aquosa (NISHIYAMA, N.; TAKEMOTO, 2014; MIYATA, K. et al, 2011).

As nanopartículas poliméricas são formadas por uma parede polimérica e um núcleo, geralmente, oleoso. Estes sistemas podem ser desenvolvidos utilizando polímeros naturais, semi-sintéticos ou sintéticos (SÃO PEDRO et al., 2013; KUMARI; YADAV, 2010).

As nanoemulsões são misturas homogêneas de dois líquidos imiscíveis que originam um sistema coloidal, com tamanho de gota de aproximadamente 500 nm. Esses sistemas exigem pouca energia para formar emulsões, pois elas se formam espontaneamente quando componentes aquosos, oleosos e anfifílicos são trazidos contato, além de ter um custo de produção menor em relação às nanoemulsões (SÃO PEDRO et al., 2013; ANTON; VANDAMME, 2011; ANTON et al., 2008). Ainda podem ser denominadas como miniemulsões, emulsões finamente dispersas, ou emulsões submicrométricas.

Os lipossomas, vesículas lipídicas esféricas, são associações coloidais de lipídios anfifílicos que se organizam espontaneamente em vesículas de bicamada e que são adequadas com compostos hidrofílicos e hidrofóbicos. De acordo com o tamanho e número de bicamadas, seu tamanho pode variar entre 100-5000 nm (ZHANG et al., 2016; SÃO PEDRO et al., 2013; CAO; ZIENER, 2013; KHUWIJITJARU, 2004).

4.5.1Nanopartículas Poliméricas

Nanopartículas poliméricas podem se apresentar na forma de nanocápsulas ou nanoesferas, diferindo entre si em sua composição e organização estrutural. As nanocápsulas possuem um núcleo oleoso revestido por uma parede polimérica, o ativo pode estar dissolvido no interior do núcleo oleoso e/ou retido à parede polimérica. As nanoesferas, por sua vez, são partículas constituídas de uma matriz polimérica densa e sua massa interna é sólida. Dessa forma, a adsorção de moléculas ativas pode ocorrer na superfície ou interior da partícula (BILIA et al., 2014; SÃO PEDRO et al, 2013).

As nanopartículas poliméricas podem ser preparadas por diferentes técnicas, como por exemplo, nanoprecipitação do polímero pré-formado ou deslocamento de solvente, polimerização de monômeros, dispersão de polímeros pré-formados (SCHAFFAZICK et al., 2003). Os polímeros pré-formados mais utilizados incluem poli(ácido lático) (PLA), poli(ácido lático-co-ácido glicólico) (PLGA), poli(-caprolactona) (PCL) e copolímeros do ácido acrílico ou metacrílico (IQBAL et al., 2015a).

A técnica mais utilizada (Figura 2 na obtenção de sistemas nanoparticulados é o método de formação de nanocápsulas por deposição de polímero pré-formado, ou nanoprecipitação. Nessa técnica, é possível que as propriedades das nanopartículas sejam controladas por modificações nas condições de preparação e dos materiais empregados (SCHAFFAZICK et al., 2003). Além disso, o método de nanoprecipitação é considerado um método de baixa energia que usa uma pequena quantidade de energia para formação do sistema coloidal, sem a necessidade de elevada energia mecânica proveniente de equipamentos específicos. Tendo em vista a simplicidade e baixo custo do método, a técnica de nanoprecipitação foi escolhida para desenvolvimento das nanopartículas poliméricas no presente trabalho.

Figura 2 - Representação esquemática da preparação de nanopartículas poliméricas (nanocápsulas e nanoesferas) pelo método de precipitação do polímero pré-formado, também conhecido como nanoprecipitação.

Fonte: Adaptado de Schaffazick & Guterres, 2003.

O método de nanoprecipitação consiste na dissolução do ativo ou óleo e do polímero em solvente orgânico polar com baixa toxicidade (acetona, etanol). A fase orgânica é vertida lentamente e de forma gradativa sobre uma fase aquosa contendo o tensoativo. A formação das nanopartículas é instantânea adquirindo um aspecto leitoso, na sequência o solvente utilizado é evaporado sob pressão reduzida (RAO; GECKELER, 2011; PINTO REIS et al., 2006; FESSI, 1989).

4.5.1.1Poli-ɛ-caprolactona (PCL)

O polímero utilizado para a preparação das nanocápsulas contendo o OE de T. minuta foi a policaprolactona (PCL) (Figura 3). Este polímero é um poliéster biodegradável, hidrofóbico, atóxico e possui uma baixa temperatura de fusão (60 °C). Pode ter seu tamanho aumentado devido a elevação de temperatura e a sua cristalinidade diminuir com o aumento do peso molecular (NAIR & LAURENCIN, 2007; AMASS; AMASS; TIGHE, 1998). O PCL é sintetizado, principalmente, pelo processo de polimerização por abertura do anel dos monômeros da ε-caprolactona (WEI et al., 2009). Além de ser bioreabsorvível, sua degradação mais lenta que outros polímeros. Essa característica pode beneficiar o nanoencapsulamento dos óleos essenciais, pois sua volatilidade tende a prejudicar a estabilidade e a eficiência dos sistemas de liberação prolongada (KUMARI; YADAV, 2010; RASEKH et al., 2011).

Figura 3 - Estrutura da unidade monomérica da policaprolactona.

Neste contexto, o desenvolvimento de nanopartículas contendo o OE de T. minuta para a avaliação da sua atividade antimicrobiana, desinfetante e antisséptica in vitro pode vir a ser uma estratégia promissora com potencial no controle da mastite bovina.

5MATERIAL E MÉTODOS

5.1Coleta e Extração do OE de T. minuta

As plantas da espécie T. minuta foram cultivadas no Núcleo de Agroecologia da Fazenda Experimental da Ressacada – UFSC (Florianópolis-SC) e identificadas pela equipe herbário Flor da Universidade Federal de Santa Catarina (FLOR 64100). As plantas foram introduzidas inicialmente no local em 2015, através de sementes adquiridas comercialmente.

As mudas foram obtidas em casa de vegetação e posteriormente transferidas para o campo. Desde então, as plantas ocorrem naturalmente naquela área, a qual é destinada ao plantio de espécies medicinais. As plantas coletadas para a realização desse estudo foram monitoradas a partir do início da floração, tendo sido coletadas antes que as flores estivessem secas. Os indivíduos tinham em média seis a nove meses. Toda a parte aérea foi coletada, incluindo inflorescência, ramos e folhas.

Após a coleta, as plantas foram pesadas e secas em estufa de ventilação forçada à 50 °C por 48 h. Posteriormente foram armazenadas a -80 °C para a extração do OE.

Figura 4 - Parte aérea de T. minuta cultivada no Núcleo de Agroecologia da Fazenda Experimental da Ressacada – UFSC

5.1.1Extração do OE de T. minuta

A extração do óleo de T. minuta foi feita através de arraste por vapor de água, utilizando o aparato Clevenger conforme a metodologia descrita por Mechkovski & Akerele (1992). Cerca de 70 g de matéria seca da parte aérea da planta e 1000 mL de água destilada foram adicionadas em um balão volumétrico. O processo de extração foi realizado por cerca de 2 h. O rendimento do óleo extraído foi determinado através da graduação da bureta que o aparelho Clevenger possui, considerando o peso da planta adicionado ao balão e a quantidade obtida de óleo ao final da mesma. O óleo extraído foi aliquotado e acondicionado à -20 °C.

5.1.2Caracterização Química do OE de T. minuta

A determinação da composição química do óleo extraído de T. minuta foi realizada por cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massas (Shimadzu – Japão modelo GCMS-QP2010) de acordo com a metodologia descrita por El-Deeb et al. (2004). Para isso, foi utilizada uma coluna capilar de sílica RTX®-5MS (Restek – Japão; 30 m x 0.25 mm) e hélio como gás de arraste em um fluxo de 25 mL/min. A temperatura utilizada variou de 60 a 200 °C, com um aumento de 10 °C/min. A injeção foi realizada em modo split: 1:50, contendo 200 µL da amostra (200 µL + 400 µL de hexano). A identificação dos compostos foi realizada considerando os resultados obtidos em bibliotecas de massa (software GCMSSolution) do Centro de Análises do Departamento de Engenharia Química da UFSC.

5.1.3Preparação das Suspensões de Nanopartículas contendo o OE de T. minuta

No presente estudo, a formulação contendo o óleo de T. minuta foi preparada utilizando o polímero PCL e identificada como NC-OE. Para fins de comparação do comportamento estrutural e de estabilidade foi, também, desenvolvida uma formulação branca, sem o OE (NC-B). A composição destas formulações está mostrada na

Tabela 1.

Tabela 1 – Composição das suspensões de nanocápsulas contendo o OE de T. minuta (NC-OE) e das nanocápsulas sem o OE (nanocápsulas branca, NC-B).

Parâmetros NC-OE NC-B

Composição

Lecitina (mg) 25 25

Solução aquosa Poloxamer 1% (g/mL) 10 10

PCL (mg) 50 50

OE de T minuta (g) 0,5 -

Acetona (mL) 2,5 2,5

Etanol (mL) 2,5 2,5

As NC-OE foram preparadas pelo método de nanoprecipitação-evaporação do solvente, conforme descrito por Fessi et al. (1989). O sistema coloidal foi constituído por duas fases, a primeira aquosa composta por 10 mL de solução contendo 1% (m/v) de surfactante hidrofílico poloxamer 188 (Kolliphor P188 micro, BASF, EUA) em água. A fase orgânica continha 0,5 g de OE de T. minuta, 50 mg do polímero poli-ɛ-caprolactona (PCL) e 25 mg de surfactante lipofílico lecitina (Lecitina - LIPOID S 75-3N, Alemanha) solubilizados em 5 mL de uma mistura de acetona e etanol (1:1). A fase orgânica foi adicionada lentamente sobre a fase aquosa por meio de gotejamento, sob agitação magnética. A suspensão coloidal ficou sob agitação por aproximadamente 4 h para a evaporação do solvente orgânico. Ao término desse período, obteve-se 10 mL da suspensão coloidal. Posteriormente, as NC foram filtradas em papel filtro (0,16 mm), sob vácuo, e armazenadas em vidro âmbar. As NC foram preparadas em triplicata.

5.1.4Caracterização da Suspensão de NC-OE de T. minuta 5.1.4.1Determinação do Tamanho de Partícula e Potencial Zeta

O tamanho médio de partículas e potencial zeta foram determinados por espalhamento de luz dinâmico e anemometria laser Doppler, respectivamente, utilizando um Zetasizer Nano ZS® (Malvern Instruments, UK). As amostras foram diluídas (1:50) em água destilada e as medidas foram feitas à 25 °C. O tamanho de partícula foi determinado em ângulo de espalhamento de 90°. Para a determinação do potencial zeta, as amostras foram transferidas às células eletroforéticas, onde um potencial de ± 150 mV foi aplicado.

5.1.4.2Determinação do pH

O pH das NC-OE foi determinado sem a diluição das amostras, com o uso de um potenciômetro Kasvi (modelo K39-2014B), equipado com eletrodo de vidro universal. Antes das análises o equipamento foi calibrado com soluções tampão pH 4,0 e 7,0.

5.1.4.3Avaliação Morfológica

A morfologia das NC-OE foi avaliada com o uso de um microscópio eletrônico de transmissão (JEM-1011 MET, Peabody,

Estados Unidos), no Laboratório Central de Microscopia Eletrônica (LCME) da UFSC. Duas diluições (10 e 20 x) da amostra foram preparadas em água MILLI-Q® e, posteriormente, depositadas sobre grids de cobre revestidos com carbono (CF300-Cu, TED PELLA INC., EUA, 300 mesh). Após 25 min, as amostras foram coradas com acetato de uranila 2% (m/v), permanecendo em contato com o corante por pelo menos 24 h.

5.1.5Avaliação da Estabilidade das NC-OE de T. minuta Para a realização do estudo de estabilidade, a suspensão de NC foi armazenada em vidro âmbar, sob refrigeração (4 °C) e temperatura ambiente (25 °C), por 60 dias. A estabilidade físico-química das NC foi avaliada pelo monitoramento do aspecto macroscópico, tamanho médio de partícula, índice de polidispersão, potencial zeta e pH após 0, 7, 15, 30 e 60 dias de armazenamento, conforme metodologias previamente descritas.

5.1.6Validação do Método Analítico para a Determinação do Teor de OE de T. mimuta nas Suspensões de NC

A validação do método analítico foi avaliada utilizando os parâmetros: especificidade, linearidade, limites de detecção e de quantificação, precisão e exatidão conforme diretrizes do ICH (ICH, 2005) e ANVISA (BRASIL, 2003).

5.1.6.1Método Espectrofotométrico

As análises foram realizadas por espectrofotometria (Bel UV-M51) UV-vis. As amostras foram colocadas em cubeta de quartzo de 1 cm. O comprimento de onda foi ajustado para 280 nm, conforme o estudo de varredura feito previamente.

5.1.6.2Especificidade

A especificidade foi avaliada analisando a suspensão NCB, sem o OE. O objetivo foi verificar se os componentes utilizados na formulação NC-OE de T. minuta não causaram absorção/interferência na quantificação do OE de T. minuta, em um mesmo comprimento de

onda. As soluções foram analisadas por espectrofotometria conforme metodologia descrita no item 5.1.6.1. em triplicata.

5.1.6.3Linearidade

Para avaliar a linearidade do método, uma solução estoque foi preparada a partir de 1 μL de OE de T. minuta em 990 μL de acetonitrila. Essa solução foi diluída em acetonitrila para a obtenção de concentrações que variaram de 3,0 a 15,0 μg / mL. As soluções foram preparadas em triplicata e analisadas por espectrofotometria a 280 nm. O gráfico da curva de calibração foi obtido plotando-se as absorbâncias versus as concentrações teóricas das soluções padrão. A linearidade foi avaliada por meio de análise de regressão linear pelo método dos mínimos quadrados.

5.1.6.4Limites de Detecção e de Quantificação

O limite de detecção (LD) é definido como a menor concentração da curva de calibração que pode ser detectada, mas não necessariamente quantificada como um valor exato. O valor do LD foi calculado diretamente a partir da curva de calibração, usando a seguinte equação:

LD = 3,3 σ / S (1) Onde, σ é o desvio padrão dos interceptos das curvas com o eixo Y e S é a inclinação da curva de calibração. O limite de quantificação (LQ), por sua vez, é definido como a menor concentração da curva de calibração que pode ser medida com precisão e exatidão adequadas. O valor do LQ foi calculado diretamente a partir da curva de calibração, usando a seguinte equação:

LQ = 10 σ / S (2) Onde, σ é o desvio padrão dos interceptos das curvas com o eixo Y e S é a inclinação da curva de calibração.

5.1.6.5Precisão

A precisão do método foi determinada pela medida da repetibilidade (precisão intra-dia) e da precisão intermediária (precisão

inter-dia), ambos expressos como desvio padrão relativo (DPR). A precisão foi avaliada pela análise de soluções padrão contendo diferentes concentrações de OE em acetonitrila (3, 7 e 11 μg/mL). A repetibilidade foi avaliada pela medida de cada solução padrão em triplicata, no mesmo dia, sob as mesmas condições experimentais. A precisão intermediária foi avaliada pela análise de cada solução padrão em três dias diferentes.

5.1.6.6Exatidão

A exatidão do método foi avaliada através da determinação da recuperação de OE de T. minuta. Quantidades conhecidas de NCB (50µL) foram adicionadas em três soluções padrão de diferentes concentrações finais de OE (baixa, média e alta) de OE, que correspondem aos valores de 3, 7 e 11 µg/mL. Todas as análises foram realizadas em triplicata.

A porcentagem de recuperação (R) do OE foi calculada após a análise de absorbância no UV-vis, assim como no item 5.1.6.1. , a partir da seguinte equação:

R= (C1-C2/C3) x 100 (3) Onde,

C1 = concentração de OE nas NC;

C2 = concentração de OE adicionada as NCB; C3 = concentração de OE na solução padrão.

5.1.7Determinação do Teor e Eficiência de Encapsulação de OE de T. minuta nas Suspensões de NC

A eficiência de encapsulação (EE%) do óleo de T. minuta foi realizada de acordo pelo método descrito por Mazzarino et al. (2010). A EE foi estimada pela diferença entre a concentração total do óleo de T. minuta encontrada nas NC após dissolução em acetonitrila (Vetec, Brasil) e a concentração de óleo presente no sobrenadante obtido pelo procedimento de ultrafiltração/centrifugação usando dispositivos filtrantes Amicon com membrana Ultracel YM-100 (100kDa, Millipore Corp., EUA). A EE% das NC-OE foi calculada através da equação:

Eficiência de encapsulação (%) = [(Quantidade total de óleo - Óleo livre) / Quantidade total de óleo] x 100] (4)

O teor de óleo foi apresentado em µg/mL de OE presente na suspensão. A recuperação do óleo (%) foi ponderada comparando a quantidade total de óleo determinada nas NC com a quantidade inicialmente adicionada à formulação. O conteúdo de OE foi determinado de acordo com o método previamente validado (4.1.6Validação do Método Analítico para a Determinação do teor de OE de T. mimuta nas suspensões de NC), utilizando espectrofotômetro (Bel UV-M51) UV-vis no comprimento de onda 280 nm. As soluções foram preparadas em triplicata após dissolução em acetonitrila (Vetec, Brasil) e analisadas por espectrofotometria. O gráfico da curva de calibração foi obtido plotando as intensidades de absorbância versus as concentrações teóricas das soluções padrão.

5.2Avaliação da Atividade Antimicrobiana in vitro 5.2.1Bactérias

Para a determinação da atividade antimicrobiana in vitro foram utilizadas a cepa padrão de S. aureus ATCC 25923 e sete isolados da mesma espécie oriundos de vacas com mastite. O teste de sensibilidade in vitro por difusão em ágar em disco (Antibiograma) dos isolados aos principais antimicrobianos comerciais foi testada e está mostrada na Tabela 2. Além desses isolados, utilizou-se também a cepa de S. aureus ATCC 33592 meticilina resistente e 3 isolados meticilina resistente de vacas com mastite. Os isolados de S. aureus foram obtidos de amostras de leite coletadas no oeste de Santa Catarina e pertencem ao Laboratório de Morfofisiologia e Bioquímica Animal (CCA/UFSC).

Tabela 2 - Isolados de S. aureus meticilina resistente e não meticilina resistente de campo.

Isolado de campo meticina

resistente

Antimicrobianos que os isolados apresentam resistência

534 AMP CFE CFL CLI ENE ERI OXA PEN SUL

646 AMP CLI ERI OXA PEN

4 Ø 6 OXA SUL Isolado de campo não meticina resistente

19A4 GEN NEO

19A2 AMP PEN

23A1 SUL

11B3 -

22D3 -

10D -

4D -

Legenda: AMP = Ampicilina, CFE= Cefalexina, CFL= Cefalotina, CLI= Ticarcilina, EN= Enrofloxaxina, ERI=Eritromicina, GEN= Gentamicina , NEO= Neomicina , OXA= Oxacilina, PEN= Penicilina, SUL= Sulfametozona.

5.2.2Atividade Antimicrobiana in vitro

A Concentração Inibitória Mínima (CIM) do OE de T. minuta e da formulação nanoencapsulada foi determinada de acordo com o método de microdiluição em caldo conforme a norma M7-A6 do National Committee for Clinical Laboratory Standards (CSLI, 2003). O óleo foi preparado em Tween® 80 (Synth, Brasil), (0,5 g do óleo de T. minuta, Tween 2% (m/v), para uma melhor homogeneização do ativo com o meio de cultivo bacteriano (caldo BHI - Brain Heart Infusion - Merk®, EUA). Já as NC-OE de T. minuta foram adicionadas diretamente ao caldo BHI. Para as NC, as concentrações testadas variaram de 1,429 a 0,011 mg/mL e para as da emulsão do OE variaram de 100 a 0,781 mg/mL, ambas preparadas em diluição seriada. Inicialmente, uma alíquota (100 μL) de meio caldo BHI foi adicionada a cada um dos poços da placa de 96 poços, seguido da adição de 100 µL dos tratamentos (óleo em Tween e NC-OE). Após a adição dos tratamentos às microplacas, 10 µL da suspensão do inóculo com