RENATA MORO BARONI
PROTEÍNAS PR EM Moniliophthora perniciosa: ANÁLISES GENÔMICAS E FUNCIONAIS DE PROTEÍNAS PR-1 E PR-5 (TAUMATINA - LIKE)
PR PROTEINS IN Moniliophthora perniciosa: GENOMIC AND FUNCTIONAL ANALYSIS OF PR-1 AND PR-5 (THAUMATIN - LIKE) PROTEINS.
CAMPINAS 2016
PROTEÍNAS PR EM Moniliophthora perniciosa: ANÁLISES GENÔMICAS E FUNCIONAIS DE PROTEÍNAS PR-1 E PR-5 (TAUMATINA - LIKE).
PR PROTEINS IN Moniliophthora perniciosa: GENOMIC AND FUNCTIONAL ANALYSIS OF PR-1 AND PR-5 (THAUMATIN - LIKE) PROTEINS.
Tese apresentada à Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do titulo de Doutora em Genética e Biologia Molecular, na Área de Concentração: Genética de Microorganismos.
ESTE ARQUIVO DIGITAL
CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA
RENATA MORO BARONI E
ORIENTADA PELO PROF. DR. GONÇALO AMARANTE GUIMARÃES PEREIRA.
Thesis presented to the Institute of Biology of the University of Campinas in partial fulfillment of the requirements for the degree of Phd in Genetics and Molecular Biology, in the Concentration Area: Genetics Microorganisms.
Orientador: Prof. Dr. Gonçalo Amarante Guimarães Pereira Coorientador: Dr. Jorge Maurício Costa Mondego
CAMPINAS 2016
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Gonçalo Amarante Guimarães Pereira Prof. Dr. Celso Eduardo Benedetti
Prof. Dr. Jorg Kobarg
Prof. Dr. Gonçalo Apolinário de Souza Filho Prof. Dr. Ronaldo Dalio
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico esta tese ao meu filho Dimitri, a pessoa mais importante da minha vida, a pessoa que me dá força para levantar todos os dias com seu sorriso inocente e um olhar apaixonante que nunca imaginei ver ou sentir. Dimitri, você me ensinou a dar valor verdadeiramente às pequenas conquistas da vida. Mamãe te ama!!!
Agradeço aos meus pais e irmão pelo carinho e incentivo ao longo de todos estes anos e pela imensa e fundamental ajuda com nosso Dimitri nestes últimos três anos; especialmente a minha Mãe que dedica horas do seu dia com os cuidados e afazeres do Dimitri.
Agradeço ao Julio Cesar Araujo da Silva, meu grande companheiro, que me possibilitou conhecer o ser mais importante de minha vida. Obrigada pelo apoio nas vezes em que pensei em desistir, obrigada pelo incentivo, dedicação à nossa família e imensa ajuda. Não conseguiria expressar aqui toda aminha gratidão e amor por você.
Agradeço ao pequeno grande Dimitri, meu filho, com seu doce e inocente coração sempre me dando força para buscar mais.
Agradeço aos meus amigos, aqueles que deixei de ver diversas vezes e mesmo assim sempre me apoiaram e incentivaram.
Agradeço a todo o LGE, se fosse citar cada um que passou durante minha estadia no laboratório certamente cometeria o pecado de esquecer alguém, todos vocês foram especiais em algum momento da minha formação.
Agradeço à enorme equipe responsável pala administração do LGE.
Agradeço aos pesquisadores do LNBio André Ambrosio e Sandra Dias por abrirem as portas do laboratório e me orientar durante o desenvolvimento de parte do meu projeto. Agradeço aos amigos e colegas de trabalho do LNBio, em especial à colega de trabalho e hoje amiga Juliana Oliveira que sempre foi muito solicita comigo.
Agradeço a todos os meus colaboradores que de alguma maneira sempre me ajudaram e contribuíram muito para o enriquecimento da minha tese, em especial ao Professor Dr. Roger Schneiter, seu aluno Rabih Darwiche e a pesquisadora Dra. Silvana Rocco.
Agradeço à amiga e colega de trabalho Sulamita Franco. Pela companhia, troca de conhecimentos e coautoria do seu artigo de doutorado.
Agradeço ao amigo Mario Barsottini, mais conhecido como Patrick, pela ótima e produtiva parceria estabelecida. Obrigada pelas longas discussões de trabalho e pelas divertidas conversas.
financiar esta tese (processo 2010/52636-8).
Agradeço, por fim, ao Instituto de Biologia e à Unicamp por me acolherem em uma instituição de reconhecida excelência acadêmica.
doença Vassoura de Bruxa do cacaueiro. M. perniciosa é um fungo hemibiotrófico com uma fase biotrófica longa, uma característica incomum para os fitopatógenos. O sequenciamento do genoma de M. perniciosa, enriquecido por dados de RNA-seq, permitiu a anotação de genes que codificam proteínas relacionadas à patogenicidade (PR). As PRs são um grupo de 17 famílias proteicas heterogêneas em função, dentre as quais podemos destacar as proteínas PR-1 e PR-5 (Taumatina-like). As proteínas PR-5 Taumatina-like são conhecidas como proteínas antifúngicas em plantas, porém estudos em fungos basidiomicetos mostram seu envolvimento no remodelamento celular durante a formação de cogumelos. Nesse trabalho observou-se que o fungo M. perniciosa possui 13 genes codificando proteínas do tipo taumatina (TLP) sendo a espécie com o maior número de TLPs descritas até o momento. Através da anotação de dados de RNA-seq e de experimentos de qPCR, verificamos que 4 MpTLPs são transcritas durante a fase de vassoura seca da doença, situação em que o cacau está susceptível a ação de fungos oportunistas, podendo indicar que estas proteínas estão envolvidas no combate contra esses microrganismos. Sugerimos também que essas proteínas poderiam participar na formação de basidiocarpo e na proteção do fungo contra mecanismos de defesa vegetal incentivada pela degradação de polissacarídeos da parede celular. Dentre as proteínas fúngicas que consideramos importantes para o estabelecimento da doença estão proteínas com domínios conservados SCP/TAPS, conhecidas também como PR-1. Diversos artigos têm mostrado a importância dessas proteínas no sistema de resposta de defesa não só em plantas, mas também nos mais diversos organismos, desde levedura a humanos. Além disso, proteínas SCP/TAPS também têm a capacidade de inibir a ação de moléculas hidrofóbicas vegetais com potencial antifúngico. Identificamos no genoma do M. perniciosa 11 genes (MpPR-1) que codificam proteínas pertencentes a superfamília SCP/TAPS. Esses genes são diferencialmente expressos ao longo do desenvolvimento do fungo e alguns desses são expressos preferencialmente ou exclusivamente in planta durante a progressão da doença Vassoura de Bruxa. Ensaios funcionais envolvendo complementação de leveduras mutantes para os genes PR-1 de levedura (PRY) e de ligação in vitro em proteínas e lipídeos, evidenciaram a capacidade das proteínas
Além de contribuir aos esforços que vêm sendo empreendidos no Projeto Vassoura de Bruxa, transformando os conhecimentos adquiridos em possíveis alvos para o controle da Vassoura de Bruxa.
agent of Witches’ Broom disease (WBD) in cacao (Theobroma cacao). M. perniciosa displays a hemibiotrophic lifestyle with an extended biotrophic stage, an uncommon trait among phytopathogens. The genome of M. perniciosa, enhanced by data originated in RNA-seq, allowed annotation of genes encoding Pathogenicity Related Protein (PRs). The PRs are a group of 17 functionally heterogeneous protein families, among which we can highlight the PR-1 and the PR-5 (Thaumatin-like). Thaumatin-like proteins (TLPs) are considered fungal inhibitors in plants. However, studies in basidiomycete fungal show their involvement in cellular remodeling during mushrooms formation. In this work, we have identified that M. perniciosa fungus is the species with greatest number of Thaumatin-like genes (13). RNA-seq annotation and qPCR experiments revealed that 4 MpTLPs are expressed during the dry broom stage of the disease, at which the cacao is susceptible to opportunistic fungus, indicating that these proteins are involved in the fight against these microrganisms. In addition, we hypothesize the participation of TLPs in basidiocarp formation and in the fungal protection against plant defense mechanisms triggered by cell walls polysaccharides. Among the fungal proteins which may be significant for establish the disease are proteins with conserved domains SCP/TAPS, also known as PR-1. Several articles have shown the importance of these proteins in the immune response system not only in plants but also in various organisms, from yeast to humans. Furthermore, SCP/TAPS proteins also have the ability to inhibit the action of hydrophobic plant molecules with antifungal potential. We identified in the genome of
M. perniciosa 11 genes (MpPR-1a – MpPR1-k) encoding proteins belonging to the
superfamily SCP/TAPS. Those are differentially expressed throughout the development of the fungus and some of them are preferentially or exclusively expressed in plant during the progression of the witch's broom disease. Functional assays using complementation of mutant yeasts depleted of PR-1 genes (PRY) and lipid-protein binding experiments, shown that MpPR-1s are able to export and bind cholesterol and palmitate, and also to help fungal detoxification against the effects of the plant glycosteroid tomatin. We believe that this work can contribute to a better understanding of the mechanisms about the functions of MpPR1s and MpTLPs on WBD. In addition, it can contribute to the efforts being undertaken in the Witches’
material e métodos, resultados e discussão. O capítulo 1 apresenta um artigo publicado na revista Biochemical and Biophysical Research Communications (BBRC) com o título de “Genomic analyses and expression evaluation of thaumatin- like gene family in the cacao fungal pathogen Moniliophthora perniciosa”. Neste artigo foram identificados no genoma do fungo M. perniciosa treze genes pertencentes à família da Taumatina-like, no qual quatro genes são expressos durante a progressão da doença Vassoura de Bruxa. Mais especificamente, esses genes são transcritos durante a fase de vassoura seca da doença, situação em que o cacau está susceptível a ação de fungos oportunistas, podendo indicar que estas proteínas estão envolvidas no combate a esses microrganismos. Neste trabalho, sugerimos ainda que essas proteínas participam na formação de basidiocarpo e na proteção do fungo contra mecanismos de defesa vegetal, incentivados pela degradação de polissacarídeos da parede celular.
O capítulo 2, denominado “Caracterização funcional e estrutural de proteínas PR-1 expressas por Moniliophthora perniciosa, fungo causador da Vassoura de Bruxa do cacaueiro”, detalha a expressão diferencial ao longo do desenvolvimento do fungo e alguns desses genes expressos preferencialmente ou exclusivamente in planta durante a progressão da doença Vassoura de Bruxa. Ensaios funcionais envolvendo complementação de leveduras mutantes para os genes PR-1 de levedura e de ligação in vitro em proteínas e lipídeos evidenciaram a capacidade das proteínas do M. perniciosa em exportar e se ligarem a colesterol e a palmitato, além de ajudarem na detoxificação do fungo contra os efeitos do glicoesteróide vegetal tomatina.
Antes dos capítulos, iniciamos com uma introdução geral no qual são apresentados o sistema de estudo, a problemática e o estado da arte no que se refere à doença Vassoura de Bruxa. Por fim, é apresentada uma conclusão geral baseada nas discussões feitas nos dois capítulos envolvendo a doença, tema que une toda a tese.
Em anexo consta o artigo, do qual sou coautora, publicado na revista PLOS One com o título de “The fungal pathogen Moniliophthora perniciosa has genes similar to plant PR-1 that are highly expressed during its interaction with
INTRODUÇÃO GERAL ... 16
Cacaueiro ... 16
Moniliophthora perniciosa e a Vassoura de Bruxa ... 17
Mecanismos de Interação Planta-Patógeno ... 22
CAPÍTULO 1 ... 25
Genomic analyses and expression evaluation of thaumatin-like gene family in the cacao fungal pathogen Moniliophthora perniciosa ... 25
CAPÍTULO 2 ... 34
Caracterização funcional e estrutural de proteínas PR-1 expressas por Moniliophthora perniciosa, fungo causador da Vassoura de Bruxa do cacaueiro ... 34
Introdução ... 35
Proteínas PR-1 e a família SCP/TAPS ... 35
Proteínas do tipo PR-1 em Moniliophthora perniciosa ... 38
Objetivos ... 39
Material e Métodos ... 39
Material Biológico ... 39
Extração de RNA... 40
Análise da expressão gênica dos genes MpPR-1 ... 40
Clonagem dos genes MpPR-1 ... 41
Expressão das proteínas MpPR-1 ... 42
Purificação das proteínas MpPR-1 ... 43
Caracterização estrutural das MpPR1... 44
Cristalografia de raio-X ... 44
Dicroísmo Circular - CD ... 45
Espalhamento de Luz Dinâmico - DLS ... 45
Caracterização funcional das MpPR1 ... 45
Teste de crescimento de M. perniciosa na presença de eugenol ... 45
Ensaios de fluorescência ... 46
Linhagens de levedura e condições de crescimento ... 46
Complementação nos mutante Pry e análise de secreção de lipídeos ... 47
Ligação a esterol e palmitato in vitro ... 47
Cromatografia de camada delgada (TLC)... 48
Toxicidade a alfa-tomatina in vivo em S. cerevisiae ... 48
Resultados ... 49
Análise de expressão gênica dos genes MpPR-1 ... 49
Amplificação e clonagem dos genes MpPR-1 ... 51
Expressão e purificação das MpPR-1 ... 52
Caracterização estrutural das MpPR-1s ... 57
Caracterização funcional das MpPR-1s ... 65
Teste de crescimento na presença de eugenol ... 65
Ensaios de fluorescência ... 66
ANEXO I ... 84 The Fungal Pathogen Moniliophthora perniciosa Has Genes Similar to Plant PR-1 That Are Highly Expressed during Its Interaction with Cacao ... 84 ANEXO II – Termo de Autorização ... 95 ANEXO III - Declaração referente a Bioética e Biossegurança ... 96
INTRODUÇÃO GERAL
Cacaueiro
O cacaueiro (Theobroma cacao) pertence à família Malvaceae e é originário da região amazônica. Sua principal importância econômica está na utilização das sementes como matéria prima para a produção de chocolate (MOTAMAYOR et al., 2002). Seus frutos também são utilizados pelas indústrias de cosméticos, de bebidas finas, de geleias, sorvetes e sucos (PURDY; SCHMIDT, 1996). Estima-se que a indústria do chocolate movimente anualmente cerca de 60 bilhões de dólares no mercado mundial, o que faz do cacaueiro uma das culturas mais importantes do mundo e uma das principais lavouras permanentes no Brasil.
No Brasil, o cultivo acontece nos estados do Pará, Rondônia, Espírito Santo e principalmente no sul da Bahia, que responde por 75% do total nacional. Uma característica importante do cacaueiro é a necessidade de sombra para o seu desenvolvimento. Um dos sistemas de cultivo do cacaueiro mais utilizado é a cabruca, que utiliza as árvores nativas para o sombreamento do cacaueiro. Este tipo de cultura tem papel importante na preservação de trechos de Mata Atlântica nas áreas de produção (LOBÃO et al., 2007).
A maior preocupação das indústrias chocolateiras mundiais é a manutenção dos suprimentos de cacau. Fatores como alterações climáticas e principalmente a ação de pragas e patógenos acarretam no declínio da produção de cacau no Brasil. Até o início da década de 90, o Brasil era o principal produtor de amêndoas de cacau do mundo, chegando a produzir 406,4 mil toneladas no período de 1984/85. Entretanto, a partir de 1989, a produção do país foi drasticamente reduzida, caindo para 105,4 mil toneladas no período de 1999/2000 (ICCO 2016).
O principal fator dessa queda produtiva foi o aparecimento no sul da Bahia da doença conhecida como Vassoura de Bruxa, causada pelo fungo Moniliophthora perniciosa. Até começo da década de 90, a produção já era concentrada no sul da Bahia, devido ao clima úmido bastante favorável a cacauicultura, e, principalmente, por ser essa uma região livre de Vassoura-de-bruxa até então, a qual foi sempre considerada um limitador de produção para o cacau na Amazônia. O principal fator dessa queda produtiva foi o aparecimento no sul da Bahia da doença conhecida como Vassoura de Bruxa, causada pelo fungo
invés de exportar cacau por não ser capaz de suprir a demanda nacional da indústria chocolateira (ICCO, 2016).
Com o aumento da demanda mundial existem previsões que o ritmo atual de produção não atenderá a procura por chocolate. Logo, iniciativas visando a melhorias para a produtividade do cacaueiro tais como manejo agrícola, melhoria na qualidade do fruto, resistência a doenças do cacau e até o melhor entendimento das pragas da cacauicultura são importantes para o aumento da produtividade de sementes de cacau.
A fim de aprofundar o conhecimento sobre esse vegetal foram publicados dois genomas de T. cacao. O consórcio coordenado pelo centro de pesquisa francês CIRAD, sequenciou o genótipo Criollo de Belize (B97-61/B2). Um genótipo altamente homozigoto resultante de muitas gerações de autofertilização durante o processo de domesticação, o que reduz bastante a complexidade do processo de montagem do genoma, esta variedade é muito utilizada na fabricação de chocolate fino (ARGOUT et al., 2011). Outro consórcio liderado pela chocolateira Mars sequenciou o genótipo Forasteiro (Matina 1-6), representativo do background genético mais cultivado no mundo (aproximadamente 80%) e também altamente homozigoto (MOTAMAYOR et al., 2013). Os dados de ambos os projetos do genoma estão disponíveis através dos sítios da internet http://cocoagendb.cirad.fr e http://www.cacaogenomedb.org, respectivamente.
Moniliophthora perniciosa e a Vassoura de Bruxa
O fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime & Phillips- Mora pertence à família Tricholomataceae da ordem Agaricales (AIME; PHILLIPS- MORA, 2005). O primeiro relato da doença Vassoura de Bruxa no estado da Bahia ocorreu em 1989 (PEREIRA et al., 1989). A partir desse ano, a produção brasileira foi reduzida drasticamente. Levando em consideração o potencial destrutivo dessa doença, caso ocorresse uma infecção nos países africanos, outra importante região produtora, poderia gerar uma enorme crise no mercado de cacau e seus derivados.
M. perniciosa é um fungo homotálico com ciclo de vida hemibiotrófico (Figura 1). No início da doença, basidiósporos infectam tecidos meristemáticos vivos do cacaueiro penetrando na planta através dos estômatos ou por fendas abertas por
ferimentos. Os basidiósporos germinam e os micélios resultantes se alojam no apoplasto vegetal. Nesse estágio da infecção, tido como estágio biotrófico ou parasítico, os micélios são relativamente espessos, monocarióticos e sem grampos de conexão. Nessa fase da doença ocorre hiperplasia e hipertrofia do ramo do cacaueiro, perda de dominância apical e ramos deformados conhecidos como “vassouras verdes”. Após um período de 4 a 8 semanas, as vassouras verdes iniciam um processo de necrose e morrem, sendo, então, denominadas “vassouras secas”. A morte do tecido infectado é acompanhada da transição para a fase necrotrófica do fungo, porém, ainda não se sabe se esta mudança de fase é causa ou consequência da morte do ramo infectado (EVANS, 1980; MEINHARDT et al., 2008). Ao contrário da fase biotrófica, a fase necrotrófica do patógeno apresenta micélio binucleado com grampos de conexão e cresce intensamente, podendo ser encontrada no interior das células do hospedeiro (KILARU; HASENSTEIN, 2005; SILVA; MATSUOKA, 1999). Após períodos intermitentes de chuva e seca, o fungo necrotrófico inicia a produção de basidiomas. Em seguida, estes basidiomas liberam basidiósporos que, levados por água ou vento, podem infectar outras plantas reiniciando o ciclo de vida do patógeno. Muitos métodos de controle da doença vêm sendo utilizados, porém sem muito sucesso. Dentre as tentativas realizadas destacam-se a poda fitossanitária, o uso de fungicidas, o controle biológico e o desenvolvimento de variedades de cacau resistentes. No entanto, um plano viável e efetivo para o controle da Vassoura de Bruxa ainda não foi implantado nas regiões afetadas (PURDY; SCHMIDT, 1996).
Figura 1. Ciclo de vida do fungo Moniliophthora perniciosa. Basidiósporos germinam no meristema do cacaueiro formando o micélio biotrófico dando inicio ao ciclo e gerando a vassoura verde. A morte do tecido infectado indica a mudança para a fase necrotrófica do fungo, chamada de vassoura seca. Neste estagio da doença são produzidos os basidiomas, que liberam os basidiósporos, recomeçando o ciclo de vida do patógeno (TEIXEIRA; THOMAZELLA; PEREIRA, 2015).
Com objetivo de contribuir para a solução desta problemática, no ano de 2000 foi lançado o Projeto Genoma Vassoura de Bruxa, sob coordenação do
Professor Dr. Gonçalo A. G. Pereira da UNICAMP. Desde então, o projeto vem acumulando dados preciosos quanto aos diferentes aspectos da Vassoura de Bruxa, como a avaliação do tamanho do genoma de M. perniciosa (RINCONES et al., 2003), as alterações bioquímicas em cacaueiros infectados (SCARPARI et al., 2005), a diversidade genética do fungo (RINCONES et al., 2006), os mecanismos de ação do fungo durante a doença e a produção de oxalato de cálcio (RIO et al., 2008). Estudos paralelos desenvolveram o método de cultivo do fungo em seu estágio biotrófico, permitindo assim a análise da expressão de diversos genes durante essa etapa de desenvolvimento do fungo (MEINHARDT et al., 2006); forneceram dados importantes sobre as diferenças de expressão gênica entre os micélios biotróficos e necrotróficos de M. perniciosa (MEINHARDT et al., 2008), sobre a constituição do genoma mitocondrial (FORMIGHIERI et al., 2008) e um panorama geral sobre o genoma deste patógeno (MONDEGO et al., 2008).
Genes expressos ao longo do desenvolvimento dos basidiomas também foram identificados (PIRES et al., 2009). Com relação aos mecanismos de defesa do cacaueiro, Gesteira et al.(2007) e Leal et al. (2007) geraram dados importantes sobre a expressão gênica do cacaueiro durante a infecção por M. perniciosa. Oliveira e colaboradores (2012) sugerem um modelo onde o fungo metaboliza metanol derivado da pectina propondo um modelo de peroxissomo independente.
Proteínas fúngicas conhecidas por estarem envolvidas na interação planta-patógeno também foram vistas no M. perniciosa, tais como as proteínas indutoras de necrose NEPs (Necrosis and Ethylene-inducing Proteins) e ceratoplataninas (BAILEY, 1995; BARSOTTINI et al., 2013; CABRERA, 2007; QUTOB; KAMOUN; GIJZEN, 2002; ZAPAROLI et al., 2009, 2011). Em especial, as NEPs que são uma classe de proteínas muito interessantes, uma vez que essa proteína induz necrose no tecido da planta e parece ser a maior responsável pela morte celular do tecido do cacaueiro durante o desenvolvimento da Vassoura de Bruxa (GARCIA et al., 2007; ZAPAROLI et al., 2011). Interessantemente, verificou- se que os genes NEP de M. perniciosa foram adquiridos através de transferência horizontal do oomiceto do gênero Phytophthora (TIBURCIO et al., 2010). De fato, muitas espécies de Phytophthora colonizam o cacaueiro, o que corrobora a ideia de que esses dois oomicetos coexistiram com um ancestral do gênero Moniliophthora. Mostrando que a incorporação do gene NEP foi um evento importante para o estilo de vida do fungo patogênico hemibiotrófico do gênero Moniliophthora (TEIXEIRA;
Um outro gene muito interessante é o MpAOX, que codifica a proteína mitocondrial oxidase alternativa (AOX). AOX faz parte da via respiratoria alternativa que é resistente a várias moléculas utilizadas como defensores agrícolas que inibem a cadeia respiratória principal, dentre eles as moléculas óxido nítrico e o fungicida estrobilurina. Curiosamente, o fungo M. perniciosa parece utilizar vias respiratórias diferentes em sua fase biotrófica (via respiratória alternativa) e necrotrófica (cadeia respiratória principal). Essa característica abre portas para o desenvolvimento de novos agrodefensivos que possam inibir tanto a cadeia respiratória principal como também a alternativa, representando uma nova perspectiva de controle da Vassoura de Bruxa (TEIXEIRA; THOMAZELLA; PEREIRA, 2015; THOMAZELLA et al., 2012).
Teixeira (2013) em sua tese de doutorado apresentou o atlas transcriptômico da Vassoura de Bruxa com aproximadamente 60 bibliotecas de RNA-seq contendo a representação dos vários estágios e condições de desenvolvimento e resposta a estresse do fungo in vitro e in planta. Com base no atlas foi possível compreender e traçar um modelo molecular de eventos da fase biotrófica do fungo, assim como ter ideias sobre o processo metabólico da planta durante a transição para o estágio necrotrófico do M. perniciosa (TEIXEIRA et al., 2014). Esses dados podem ser considerados como um grande avanço no melhor entendimento da doença, ajudando e corroborando com os demais trabalhos do grupo.
Recentemente, Barau et. al. mostrou a importância dos açúcares da planta na sinalização molecular da doença Vassoura de Bruxa e também avanços significativos na transformação do fungo. Neste trabalho, os autores transformaram o protoplasto do fungo com um cassete contendo o gene de resistência a higromicina e Green Flourescent Protein (GFP), contribuindo com o avanço da manipulação genética, uma vez que até hoje não foi possível obter o fungo M. perniciosa geneticamente modificado em sua fase infectiva (BARAU et al., 2015; CARIBÉ DOS SANTOS et al., 2009).
A partir de todo o conhecimento acumulado com o projeto Genoma Vassoura de Bruxa, poderemos então criar estratégias de combate efetiva ao fungo, seja através de síntese de drogas inibitórias de proteínas patogênicas ou pela manipulação genética do patógeno e da planta.
Mecanismos de Interação Planta-Patógeno
O mecanismo inicial de defesa vegetal contra patógenos se dá por barreiras físicas (cutícula e tricomas) ou por metabólitos secundários presentes no vegetal mesmo antes da infecção, geralmente chamados de fitoanticipinas (GONZÁLEZ-LAMOTHE et al., 2009). A partir da superação dessas barreiras pelos fitopatógenos, os vegetais ativam um sistema de defesa de amplo espectro que percebe os invasores. A percepção se dá pela detecção de moléculas conservadas conhecidas como MAMPs ou PAMPs (do inglês ‘microbe- or pathogen-associated molecular patterns’) que são secretadas ou estão presentes na superfície do fitopatógeno. O mecanismo de imunidade disparado pelas PAMPs (PTI, ‘PAMP- triggered immunity’) é uma defesa primária que deve ser superada pelo microrganismo para efetuar a colonização nos tecidos vegetais (JONES; DANGL, 2006; ZIPFEL, 2008).
A superação da PTI se dá pela secreção de fatores de virulência conhecidos como efetores que podem atuar no apoplasto ou no interior celular pela manipulação ou bloqueio de fatores de hospedeiro em benefício da sobrevivência do patógeno. A suscetibilidade vegetal ocasionada por efetores patogênicos (ETS, Effector-triggered susceptibility) é a primeira linha de coevolução molecular na interação planta-patógeno, sendo extensivamente documentada, já que vários efetores de patógenos têm a capacidade de suprimir a imunidade vegetal através de interações com proteínas e outros compostos do hospedeiro associadas à defesa (BLOCK et al., 2008; CHISHOLM et al., 2006; DE JONGE et al., 2010; GRANT et al., 2006; HEIN et al., 2009; JONES; DANGL, 2006; STERGIOPOULOS; WIT, 2009).
Algumas das proteínas efetoras podem ser detectadas pela segunda linha de defesa molecular vegetal. Proteínas de resistência vegetal (R) interagem de modo direto ou indireto com efetores protéicos que nesse contexto são conhecidos como proteínas de avirulência (Avr). Esse mecanismo (ETI, ‘Effector-triggered immunity’) confere defesa contra os patógenos que suprimem a PTI. A ETI é o segundo nível de coevolução molecular entre planta e patógeno, já que os efetores podem evoluir a fim de evadir o mecanismo de detecção de defesa e as proteínas R também evoluem a fim de manter ou expandir os níveis de detecção dos efetores (JONES; DANGL, 2006).
hipersensitiva vegetal conhecida como HR (‘Hypersensitive Response’), que é caracterizada por necrose de células próximas ao local de infecção do patógeno, restringindo a proliferação do mesmo (HAMMOND-KOSACK; JONES, 1996). O mecanismo de interação direta entre Avr e R é conhecido como interação gene-a- gene (FLOR, 1971). Outra teoria relacionada à interação planta-patógeno é denominada “teoria do guarda”. Nesse caso, as proteínas sintetizadas por genes avr interagem com “proteínas-guarda”, que a partir dessa interação são reconhecidas pelas proteínas R, que então induzem a resposta de defesa (DANGL; JONES, 2001; MARATHE; DINESH-KUMAR, 2003). Durante este processo de interação há produção de espécies reativas de oxigênio, óxido nítrico (NO) e ácido salicílico (SA). Estes compostos participam dos processos de indução de morte celular e da ativação de cascatas de sinalização para expressão de proteínas de defesa (DURRANT; DONG, 2004; THATCHER; ANDERSON; SINGH, 2005).
A HR antecede uma resposta sistêmica secundária, denominada Resistência Sistêmica Adquirida (SAR), que é caracterizada pela ativação de processos defensivos em áreas não infectadas da planta (RYALS et al., 1996). Assim como na HR, ocorre ativação da expressão de várias proteínas de defesa que agem na suposta ETI, em especial, as proteínas conhecidas como proteínas relacionadas à patogênese (Pathogenesis Related Proteins, PRs). Essas proteínas são bastante estudadas, tendo seu papel comprovado no combate direto aos patógenos ou na homeostase vegetal pós-infecção (VAN LOON; REP; PIETERSE, 2006).
As PRs compõem um grupo de 17 famílias, dentre as quais podemos destacar a PR-1, PR-2 (β-glucanases), PR-3 (quitinases classe l) e PR-5 (Taumatina-like). Inicialmente as PRs foram descobertas em Nicotiana tabacum infectado pelo Vírus do Mosaico do Tabaco (TMV). Posteriormente, foi demonstrada a ocorrência em outras espécies de plantas infectadas por fungos, bactérias, oomicetos e vírus ou sujeitas ao ataque de insetos ou nematódeos. Muitas destas proteínas são induzidas por sinalização de compostos como ácido salicílico, ácido jasmônico ou etileno e apresentam atividade antimicrobiana in vitro (VAN LOON; REP; PIETERSE, 2006). A maneira pela qual as PRs estão relacionadas com a inibição da atividade do patógeno varia de acordo com a atividade enzimática da proteína.
Interessantemente, a análise no genoma do fungo M. perniciosa enriquecida por dados originados por RNA-seq evidenciaram genes que codificam proteínas similares a proteínas das famílias PR-1 e PR-5. Encontramos ao todo 11 e 13 genes que codificam proteínas PR-1 e PR-5, respectivamente. Nem todas as famílias de PR tiveram seus mecanismos de ação totalmente elucidados, como é o caso da PR-1. Entretanto, dados recentes vêm contribuindo para desvendar a função dessas proteínas.
CAPÍTULO 1:
Genomic analyses and expression evaluation of thaumatin-like gene family in the cacao fungal pathogen Moniliophthora perniciosa
Sulamita de Freitas Franco, Renata Moro Baroni, Marcelo Falsarella Carazzolle, Paulo José Pereira Lima Teixeira, Osvaldo Reis, Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, Jorge Maurício Costa Mondego
Trabalho publicado na revista Biochemical and Biophysical Research Communications (BBRC), Outubro 2015, Vol. 466, Issue 4, Pag 629–636.
CAPÍTULO 2:
Caracterização funcional e estrutural de proteínas PR-1 expressas por Moniliophthora perniciosa, fungo causador da Vassoura de Bruxa do cacaueiro.
Proteínas PR-1 e a família SCP/TAPS
As proteínas PR-1 são consideradas proteínas marcadoras de defesa em plantas correspondendo a 10% do total de proteínas expressas durante a HR nas folhas infectadas (CORNELISSEN et al., 1986). A expressão das PR-1 também ocorre em regiões não infectadas da planta, provavelmente incentivada pela SAR. Todavia, alguns estudos demonstram que proteínas PR-1 possuem capacidade de inibição de oomicetos e fungos (KIBA et al., 2007; NIDERMAN et al., 1995; RAUSCHER et al., 1999).
Genes que codificam proteínas similares a PR-1 foram identificados em fungos (BRAUN et al., 2000; SCHUREN et al., 1993), insetos (LU et al., 1993; SCHREIBER; KARLO; KOVALICK, 1997), moluscos (MILNE et al., 2003), nematódeos (ASOJO et al., 2005b) e vertebrados, incluindo humanos (MURPHY et al., 1995; RICH et al., 1996). Todas estas proteínas, apesar da distância evolutiva significativa entre os organismos, possuem um domínio comum conservado, formando a família SCP/TAPS (‘Sperm-coating protein - Tpx- 1/Ag5/PR-1/Sc7’). Em sua grande maioria essas proteínas possuem um peptídeo sinal para secreção para o meio extracelular e contêm em torno de seis cisteínas. A formação das pontes de dissulfeto geradas por estas cisteínas torna as proteínas PR-1 mais compactas e resistentes, fator importante para proteínas secretadas e que devem superar a ação de proteases do meio extracelular. As proteínas SCP/TAPS de mamíferos e répteis venenosos possuem um domínio C-terminal rico em cisteína denominado CRISP (‘Cysteine rich secreted protein’).
Além de serem relacionadas com a defesa vegetal (como a PR-1), membros da família SCP/TAPS foram identificados em proteínas específicas de testículos (Tpx-1; (KASAHARA et al., 1989), proteínas de glioma (MURPHY et al., 1995), no veneno de vespas e formigas e na saliva de insetos que se alimentam de sangue (CALVO et al., 2006; HOFFMAN, 2006; LU et al., 1993; VALENZUELA et al., 2004). Proteínas SCP/TAPS são também componentes significantes do veneno de cobras, podendo afetar a contração de músculos lisos e/ou atuando em canais iônicos do tipo CNG (YAMAZAKI; MORITA, 2004). Um dos dados mais relevantes sobre essas proteínas é sua abundante expressão e secreção por helmintos patogênicos como Schistosoma mansoni (CHALMERS et al., 2008) e Necator americanus (CANTACESSI et al., 2009). Especula-se que essas proteínas sejam imunomoduladoras favorecendo a infecção pelo verme patogênico.
Asojo et al. (2005) determinaram a estrutura da Na-ASP-2, uma proteína similar a PR-1 presente no nematódeo causador da ancilostomose (Necator americanus). Os autores observaram que, apesar da presença da tríade catalítica descrita para Tex-31, esta proteína não possui atividade de serino proteinase ou que esta atividade é exercida sobre um substrato altamente específico. Não obstante, estes autores relataram a semelhança entre a Na-ASP-2 e a PR-1 like protein de Ancilostoma caninum, denominada NIF (Neutrophil Inhibitory Factor), uma proteína secretada que se liga aos receptores CR3 de células de defesa do hospedeiro. Isso afeta a migração dos mesmos e promove o bloqueio do sistema imune (MOYLE et al., 1994). Curiosamente, Na-ASP-2 também possui similaridade estrutural às quimiocinas, havendo a possibilidade de essa proteína ser um ligante antagonista dos receptores que ativam o sistema imune do hospedeiro (ASOJO et al., 2005b). Portanto, em vermes parasitas, proteínas contendo o domínio SCP/TAPS parecem estar envolvidas em mecanismos de inibição das defesas do hospedeiro, garantindo o sucesso da infecção (CANTACESSI et al., 2009; CHALMERS et al., 2008).
Diversos artigos vêm confirmando a importância dessas proteínas no combate ao sistema imune do hospedeiro, não só em vermes patogênicos, mas também em fungos como é o caso do Fusarium oxysporum. Prados-Rosales et al. (2012) verificaram que o gene Fpr1 que codifica uma proteína SCP/TAPS de F. oxysporum quando nocauteado levou a uma diminuição dos indíces de mortalidade em ratos imunodeprimidos quando comparado a ratos infectados com o fungo selvagem. Curiosamente, apesar de F. oxysporum ser também capaz de infectar plantas, não foi observada diferença de infectividade entre F. oxysporum mutante e o selvagem. Lozano-Torres (2012) demonstrou que a proteína SCP/TAPS do nematódeo Globodera rostochiensis GrVap-1 interage com a protease cisteínica Rcr3 de tomate, proteína esta que está envolvida na resistência mediada pelo receptor Cf-2, sugerindo um papel importante das proteínas SCP/TAPS em mecanismos de supressão de defesa vegetal.
Outros trabalhos têm mostrado a importância de fitoesterois na imunidade inata de vegetais contra patógenos, podendo ser os responsáveis na indução de resposta de defesa da planta através da regulação de nutrientes no apoplasto (SIMONS et al., 2006; WANG et al., 2012). Choudhary e Schneiter (2012) mostraram que as proteínas Pry1 e Pry2 de Saccharomyces cerevisiae, também pertencentes à superfamília SCP/TAPS, são proteínas que secretam acetato de colesterol e são capazes de se ligar a colesterol e a acetato de colesterol. Através do uso de mutantes de S. cerevisae nos quais esses genes foram depletados, foi possível demonstrar que sem esses genes a exportação de acetato de colesterol era praticamente abolida. Além disso, foi possível testar se outras proteínas do tipo
(esterol fúngico) e o sitosterol (esterol vegetal) competiram eficientemente com colesterol pela ligação a Pry1, indicando que as proteínas Pry tem uma afinidade comparável à de outras proteínas que se ligam a esterol (CHOUDHARY; SCHNEITER, 2012). Também foram produzidas proteínas mutantes apenas para o domínio conservado SCP/TAPS, mais especificamente para aminoácidos localizados numa região análoga ao motivo de ligação de caveolina (caveolin-binding motif – CBM). Os resultados mostraram que esse domínio é necessário e suficiente para a ligação do esterol e/ou pequenas moléculas hidrofóbicas (CHOUDHARY; SCHNEITER, 2012; CHOUDHARY et al., 2014).
Outro dado deveras interessante foi o aumento de sensibilidade dos mutantes depletados dos genes Pry ao eugenol, molécula hidrofóbica vegetal capaz de afetar a integridade das membranas celulares de fungos. A complementação desses mutantes pelos genes SCP/TAPS recuperou a resistência ao eugenol. Além disso, as proteínas Pry são capazes de se ligar ao eugenol, o que sugere fortemente que essas proteínas além de serem responsáveis pela exportação de esteróis também participariam da detoxificação de moléculas hidrofóbicas nocivas aos fungos (CHOUDHARY; SCHNEITER, 2012; CHOUDHARY et al., 2014).
Recentemente, Kelleher, et al.(2014) mostraram que a proteína SmVAL4 (venom allergen – like protein 4), mais uma pertencente a superfamília SCP/TAPS, de Schistosoma mansoni, tem a capacidade de exportar esterol. Porém a SmVAL4 tem o loop CBM diferente das demais Pry e sua estrutura não possui esterol próximo ao loop CBM. Visto isso, o autor buscou proteínas que pertencessem à superfamília SCP/TAPS com a capacidade de se ligarem a lipídeos. A caracterização estrutural da Tablilisina-15 de artrópodes hematófagos revelou um canal hidrofóbico que se liga a leucotrienos com afinidades submicromolar. A SmVAL4 quando comparada com a Tablilisina -15 apresenta um espaço entre as α-hélices 1 e 4 suficiente para facilitar a ligação do palmitato, apesar de não possuirem os resíduos conservados entre elas. Indicando a habilidade dessas proteínas de se ligar a ácidos graxos, porém em um sítio diferente da interação com esteróis, sugerindo pelo menos duas regiões diferentes de ligação a lipídios (KELLEHER et al., 2015; XU et al., 2012). Desse modo, vem se confirmando que SCP/TAPS teriam papel importante na interação com compostos de características hidrofóbicas como esteroides e ácidos graxos.
Proteínas do tipo PR-1 em Moniliophthora perniciosa
Com o sequenciamento do genoma do fungo M. perniciosa observou-se a presença de genes similares à PR-1 denominados MpPR-1. Onze genes foram encontrados, denominados de MpPR-1a à MpPR-1k. Esses onze genes foram identificados através da combinação de diversas técnicas de identificação de genes, como predição gênica ab initio por bioinformática utilizando o programa AUGUSTUS (STANKE; WAACK, 2003), bibliotecas de ESTs, microarranjos de DNA e RNA-seq. Rincones et al. (2008) compararam a expressão gênica dos estágios miceliares biotrófico e necrotrófico de M. perniciosa. A partir de uma anotação de bibliotecas de ESTs e mais especificamente de microrranjos de DNA foi possível verificar que os genes MpPR-1a, MpPR-1c e MpPR-1d são mais expressos na fase biotrófica em relação a fase necrotrófica, o que seria um primeiro indício que genes MpPR1 possam ser importantes no desenvolvimento biotrófico e também nos mecanismos de infecção desse fungo. Outro gene MpPR-1, denominado MpPR-1b, foi identificado em bibliotecas de ESTs derivadas de basidiomas em desenvolvimento (PIRES et al., 2009).
Também foram feitos ensaios de indução de expressão para o gene MpPR-1a, utilizando diferentes fontes de carbono e nitrogênio aplicadas ao meio de crescimento do fungo na fase de vida necrotrófica. Observou-se que quando a fonte de carbono foi substituída pelo extrato de cacau, o gene MpPR-1a foi consideravelmente induzido. Outro dado interessante é que o gene MpPR-1a foi induzido pela adição de ácido salicílico, sugerindo que a produção de proteínas MpPR-1 possa ser induzida pelos mesmos fatores que as proteínas PR-1 vegetais e que as proteínas do fungo possam exercer um papel importante na interação planta-patógeno.
A partir do aumento da cobertura do sequenciamento de M. perniciosa pelo uso de novas tecnologias, como pirosequenciamento e Illumina/Solexa, outros sete genes MpPR-1 foram identificados. Estes foram nomeados MpPR-1e a MpPR-1k. Teixeira et al. (2014) executaram uma análise comparativa da expressão gênica global do fungo M. perniciosa por meio de novas tecnologias de sequenciamento, processo denominado RNA-seq (TEIXEIRA et al., 2014). A partir da análise dos dados de RNA-seq somados aos experimentos de qPCR realizados previamente por Teixeira et al., (2014) vários estágios do fungo crescido in vitro foram testados, além de material vegetal infectado. Desse modo podemos avaliar e comparar a expressão dos genes do fungo in vitro e in planta. Dados indicam que os genes MpPR-1c, MpPR-1f, MpPR-1g, MpPR-1h e MpPR-1k são expressos quase que exclusivamente in planta durante a interação M. perniciosa-cacaueiro, mais especificamente durante o desenvolvimento das ‘vassouras’ (TEIXEIRA et al., 2012). Outro dado interessante é que os
(TEIXEIRA et al., 2012). Esse resultado se assemelha à expressão elevada das proteínas da família SCP/TAPS em venenos de vespas (HENRIKSEN et al., 2001) e de cobras (YAMAZAKI; MORITA, 2004) e na alta secreção de antígenos dessa família em nematódeos durante infecção (CHALMERS et al., 2008).
A fim de buscarmos inferências sobre as possíveis atividades enzimáticas das MpPR-1, estas foram alinhadas com a proteína de molusco Tex-31, cuja atividade proteolítica foi demonstrada (MILNE et al., 2003). O alinhamento mostrou que MpPR-1b, MpPR-1c, MpPR-1d, MpPR-1e, MpPR-1h e MpPR-1j possuem duas histidinas e dois glutamatos/glutaminas que determinam um sítio catalítico hipotético que pode conter um cátion divalente. No entanto, a proteína MpPR-1a não apresenta uma das histidinas e nem um dos glutamatos/glutaminas que realizaria a ligação com um íon metálico e a MpPR1-f possui apenas um dos glutamatos/glutaminas e nenhuma das histidinas. Nas proteínas MpPR1-g, MpPR-1i e MpPR1-k, ambas histidinas e ambos glutamatos estão ausentes. Curiosamente, os genes que codificam para essas três proteínas são expressos durante as fases de germinação de esporos, na vassoura verde e em necrose, fases estas cruciais na progressão da Vassoura de Bruxa.
Objetivos
Os objetivos desse trabalho foram a caracterização estrutural e funcional das MpPR-1s. Sendo que os objetivos específicos foram:
- Avaliação da expressão gênica in planta dos genes MpPR-1s; - Clonagem, expressão e purificação das proteínas MpPR-1s; - Caracterização estrutural das MpPR-1s;
- Caracterização funcional das MpPR-1s;
Material e Métodos
Material Biológico
O isolado de M. perniciosa utilizado foi FA553, coletado no município de Ilhéus (BA), o mesmo utilizado no sequenciamento do genoma. A variedade de Theobroma cacao utilizado foi ‘cacau comum’, suscetível à M. perniciosa.
Extração de RNA
Foi feita extração de RNA do fungo em diferentes fases do seu ciclo de vida (biotrófico, necrotrófico e esporos), utilizando RNeasy Plant Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) de acordo com as instruções do manual do fabricante. Também foram feitas extrações de RNA do tecido de cacau infectado mostrando sintomas de vassoura verde e de vassoura seca. O método de extração de RNA total utilizado está descrito em Barau et al. (2015). As infecções de plântulas foram realizadas segundo Frias et al. (1995). As plântulas foram inicialmente submetidas a uma câmara úmida, sendo cobertas por sacos plásticos previamente umedecidos para induzir a abertura dos estômatos. Este tratamento foi realizado 24 horas antes da inoculação dos basidiósporos. Posteriormente, gotas de aproximadamente 60 μL de suspensão de esporos (concentração aproximada de 105 esporos/mL) foram aplicadas sobre o meristema apical em atividade das plântulas. Após 48 horas a câmara úmida foi retirada. Um micrograma de RNA foi utilizado para a síntese de cDNA. A síntese de cDNA foi feita segundo o protocolo da enzima SuperScript II (Invitrogen, EUA) modificado. Análise da expressão gênica dos genes MpPR-1
A fim de comprovarmos os dados preliminares derivados do RNA-seq sobre as MpPR-1 a presença de transcritos fúngicos in planta foi avaliada através de qPCR. Os pares de oligonucleotídeos de cada gene foram desenhados para posterior análise de expressão gênica (Tabela 1). Os experimentos de qPCR foram executados no sistema StepOne (Applied biosystems, EUA) utilizando SYBR® GreenER™ (Promega, EUA).
Genes Primer Forward - 5’ → 3’ Primer Reverse - 5’ → 3’ β-actin CCCTTCTATCGTCGGTCGT AGGATACCACGCTTGGATTG MpPR-1a AGTTGAAAGGCTCAGATGGAT AGTGATTATAGGCGGGATTGG MpPR-1b TAGCGACAGTTATTCCATTTCC GACTTGAGTTGTGGCTTTCC MpPR1-c CAAACACACAGAACCGACT GTGGGTTACTGTGTTCATACA MpPR-1d CACTCAAGTTGTCTGGAAGAG CTGGTAACTTTGCTGGACG MpPR-1e CCGAGCCTTTGACCTGGA CCCAAGTTCTGTAGTGGATTTCC
MpPR-1f ACCAGTGCAACTTCCAGACTTC CACACGATTTGGGTCCAGC MpPR-1g CTAAGCAATGTCAACTCGAGGC CCCAACACTTCTGGTTGACTTG
MpPR-1h CCGCGGTTCAGCTATGGC CACGTGGAGCGTAGTGGG
MpPR-1i CGCAGCTTTGGGGCGATA GGTAGCTTCACCACATCCAAC MpPR-1j GCCAGTTTGAGCACAGTGACC AGTTGGAAAAATGTGGGTCGTCA MpPR-1k CGATAGGTCTACAGGGTGATTTC AGAACTATCCCCGCTTGAATAC
Clonagem dos genes MpPR-1
Os genes MpPR-1 foram amplificados através de técnicas de RT-PCR (Reverse Transcriptase Polymerase Chain Reaction). Foram utilizados oligonucleotídeos específicos contendo sequências de sítios de enzimas de restrição em suas bordas. Os oligonucleotídeos forward foram desenhados para aninharem na região logo em seguida ao peptídeo sinal que, portanto, não foi amplificado (Tabela 2). Os genes amplificados foram clonados no plasmídeo pGEM T-Easy (Promega, EUA). Após a clonagem e replicação do plasmídeo em E. coli DH10B ou TOP 10, os plasmídeos recombinantes foram selecionados por α-complementação (SAMBROOK; FRITSCH; MANIATIS, 1989). Os vetores contendo os insertos foram purificados através de isolamento de DNA plasmidial e digeridos com as enzimas de restrição presentes nos oligonucleotídeos. Os fragmentos digeridos foram purificados de gel de agarose 1% com o Kit Wizard Genomic DNA Purification (Promega) e clonados em vetores de expressão de proteínas.
Tabela 2: Oligonucleotídeos desenhados para a amplificação das MpPR-1. Em negrito as enzimas de restrições Bam HI = GGATCC; Bgl II = AGATCT; Sal I = GTCGAC; Eco RI = GAATTC; Sac I = GAGCTC.
Genes Primer Forward - 5’ → 3’ Primer Reverse - 5’ → 3’
MpPR-1a GGATCCCCCCGTCACCTCGCTTCTA GTCGACTCATGGTTGAACATTATCCAAAGC
MpPR-1b AGATCTCCAGCCTGTGCGAAGAAATAC GAATTCTCAAGCTTGGACGTTGACAGC
MpPR-1c GGATCCCGACTTGACAACTCCATCTCG GAGCTCTCACTCAAACTCCCCGTCATAAT
MpPR-1d GGATCCCCCTCGCAATGGGTTTTC GTCGACTCAGTCAAGATCAGCCTGGAGA
MpPR-1e GGATCCATTCTCCCTCGCCAATCTGATA GTCGACCTACACCTCAACATTCTCGGGG
MpPR-1f GGATCCCCCACGCCTAGAGCAGATG GTCGACTCACTTGTACTGCCCAGACACAT
MpPR-1g GGATCCCCTCACGACCCTAGGGACA GTCGACCTACATCTGCCCGATATCACG
MpPR-1h GAGCTCCAAGCTAGACGACACTCGAAC GTCGACTTAAAGGTTAACGTTTTGACGG
MpPR-1i GGATCCCCCGCTGCTGAACTCGAGGC GAGCTCCTATTCGCGAATGTCCAGATC
MpPR-1j GGATCCCCCAGCCGACTTGATAACTCCAT GAGCTCCTATTGAAGCATCCCAACGTTCTTC
MpPR-1k GGATCCCCTATACCCGAAAAACCAAAGGAC GAGCTCTCAATTGTATGAACAAGCAAGAACTATCC
O plasmídeo de expressão utilizado foi o pETSUMO (Small ubiquitin-like modifier), acrescido de um de 6 histidinas (6 His). As cepas de E. coli utilizadas foram Origami 2 (EMD4 Biosciences) e Shuffle (New England Biolabs), mais adequadas para proteínas que formam pontes de dissulfeto, como é o caso das MpPR1. A expressão de proteínas em fusão com SUMO aumenta a solubilidade de várias proteínas produzidas em E. coli, além de ter sua remoção facilitada pelo da protease, ULP-1, que possui ação específica sobre seu sítio de clivagem e é dependente do correto enovelamento do sítio.
Expressão das proteínas MpPR-1
Para os ensaios de superexpressão das MpPR-1 inicialmente foram feitos testes em pequena escala, os quais serão detalhados individualmente para cada proteína nos Resultados. Os testes de indução de expressão foram realizados em 100 mL de meio LB inoculados com 6% de pré-cultura e os devidos antibióticos para cada cepa bacteriana utilizada. A cultura foi crescida a 37°C para a cepa de E. coli Origami 2 ou a 30°C para a cepa Shuffle sob agitação até atingir densidade ótica a 600 nm entre 0,8 e 1,0. A expressão da proteína de interesse foi iniciada com a adição de 0,2 mM de IPTG. Para verificar possíveis diferenças na expressão das proteínas, foram testadas duas temperaturas de indução, uma a 37°C ou 30°C de acordo com a bactéria e a 18°C para ambas as cepas. A indução foi realizada por 16 horas para as diferentes temperaturas, a 200 rpm de agitação. As células foram sedimentadas por centrifugação a 5000 rpm de velocidade na temperatura de 4°C por
As cepas Origami 2 e Shuffle foram escolhidas devido a sua capacidade de facilitar a formação de ligações de dissulfeto. A cepa Shuffle expressa a proteína DsbC isomerase no citoplasma que facilita a formação correta das proteínas com pontes de dissulfeto, possibilitando uma expressão maior da proteína no seu enovelamento correto. Já a cepa Origami 2 possui mutações nos genes tiorredoxina redutase (trxB) e glutationa redutase (gor), o que ajuda na formação dessas ligações no citoplasma.
Purificação das proteínas MpPR-1
As células do teste de expressão foram ressuspendidas em tampão de lise contendo 50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 150 mM NaCl e 10% Glicerol. A lise celular foi feita com a adição de lisozima (150 mg/L), combinada com o ácido deoxicólico (40 mg/L) e DNAse I (1,25 mg/L) todos adquiridos da Sigma-Aldrich (EUA). As células ressuspendidas foram incubadas por 1 hora no gelo, centrifugadas a 15000 rpm por 50 minutos a 4°C. A fração solúvel resultante desse processo foi recuperada para posterior avaliação. Espera-se que MpPR-1 recombinantes estejam na fração solúvel e prontas para o processo de separação dos contaminantes também solúveis nessas condições.
O protocolo de purificação foi então desenhado de maneira a explorar e combinar as características físico-químicas inerentes à proteína de interesse com relação a esses contaminantes. O primeiro passo aplicado foi a cromatografia por afinidade a metais imobilizados (IMAC - Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography). A escolha por esse passo inicial foi feita baseada na presença de uma cauda contendo seis histidinas (6xHis), adicionado ao vetor pETSUMO, localizada na região N-terminal da proteína de interesse. A expressão de proteínas em fusão com SUMO aumenta a solubilidade de várias proteínas produzidas em E. coli, além de ter sua remoção facilitada pelo uso da SUMO protease, a ULP-1, que possui ação específica sobre seu sítio de clivagem. O grupo imidazol presente nas histidinas interage com metais divalentes do tipo zinco, cobalto ou cobre. A fração solúvel do lisado é passada através de uma resina cuja fase estacionária é composta por uma matriz contendo esses metais imobilizados. Desta maneira, espera-se que as histidinas da cauda interajam através de suas cadeias laterais com os metais. A resina TALON (Clontech) foi escolhida pelo fato de o centro reativo do íon de cobalto, resultante da coordenação com a matriz, favorecer especificamente a interação com resíduos de histidina adjacentes ou espacialmente mais próximos, resultando na prática em interações mais fortes e em uma
amostra final mais pura. A clivagem da cauda foi feita enquanto a proteína ainda estava ligada na resina. A SUMO protease, ULP-1, foi então adicionada e toda a mistura foi mantida durante a noite em temperatura ambiente, sob leve agitação. Na manhã seguinte, a fração sem afinidade pela resina de cobalto (nesse caso a MpPR-1 clivada) foi eluída pela adição de tampão de lavagem. A proteína coletada foi então concentrada por ultrafiltração (Amicon Millipore, corte nominal e 10kDa) e aplicada em coluna de filtração em gel para exclusão por tamanho molecular, já que para ensaios de cristalização o ideal é ter uma amostra o mais pura possível, além de homogênea em termos de espécies moleculares (sem agregados). Foi utilizada coluna do tipo Superdex 75 16/60 (GE Healthcare), previamente equilibrada com tampão 50 mM Tris-HCl, pH 8,5 e 150 mM NaCl. A cromatografia foi realizada com o auxilio do equipamento Äkta FPLC (GE Healthcare), com eluição de 1 mL por minuto no mesmo tampão. Para obter maior grau de pureza da MpPR-1d uma etapa de purificação intermediaria foi adicionada antes da gel filtração, a cromatografia por troca iônica. A coluna escolhida foi a Mono Q 5/50 GL (GE). Para fazer a troca iônica são utilizados dois tampões, um com baixa concentração de NaCl (tampão A) e outro com alta concentração de NaCl (tampão B). Para o tampão A foi utilizado 50 mM de Tris HCl, pH 8,5 e 10 mM de NaCl, já para o tampão B 50 mM de Tris HCl, pH 8,5 e 1 M de NaCl. A cromatografia foi realizada com fluxo de 0,5 mL/minuto e eluição com gradiente de 0 a 100% de tampão B em 20 vezes o volume da coluna.
Caracterização estrutural das MpPR1 Cristalografia de raio-X
De posse das proteínas puras, iniciamos as tentativas de cristalização. As varreduras iniciais foram feitas no Robolab, junto ao Laboratório Nacional de Biociências do Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais (LNBio/CNPEM Campinas) utilizando o sistema robotizado HoneyBee (Genomic Solutions). Esse sistema faz uso do método de difusão de vapor por gotas sentadas e é capaz de varrer 96 condições únicas em menos de 5 minutos. Foram realizadas triagens iniciais de pelo menos 600 condições únicas, com as mais diversas combinações entre agentes precipitantes, soluções tampão e aditivos baseados nos kits comerciais Crystal Screen I e II, Index I e II, SaltRX, Peg/Ion (Hampton), Precipitant Sinergy (Jena Bioscience), entre outros. Os ensaios foram mantidos inicialmente a temperaturas de 18 e 4°C para o alcance do equilíbrio de vapor ao longo dos dias. O aparecimento de possíveis cristais foi monitorado através de um robô documentador de
produziu (pH e concentração de agente precipitante) e/ou acrescentando aditivos e detergentes (detalhados ao longo do texto), visando à obtenção de monocristais com maior difração e resolução. Os cristais obtidos foram submetidos à coleta de dados em condições criogênicas nas linhas de luz MX1 e MX2 do Laboratório Nacional de Luz Síncrotron. Os cristais também foram enviados para o Síncrotron de terceira geração Deutsches Elektronen- Synchrotron (DESY, Petra III, Hamburgo, Alemanha) e os dados de difração foram coletados na linha P14. Todo o processo de expressão, purificação em larga escala e cristalização foi realizado no LNBio, conforme proposta da SMOLBNET 2.0 (Processo 2010/51884-8) com o suporte cientifico dos pesquisadores André L. B. Ambrósio e Sandra Martha G. Dias e da assistente de pesquisa Juliana F. de Oliveira.
Dicroísmo Circular - CD
Para realizar o experimento de dicroísmo circular, a proteína foi diluída na concentração final de 10 μM em tampão contendo 50 mM Tris HCl, pH 8,5 e 150 mM NaCl, em seguida foi feito a medida por espectroscopia UV próximo de CD (190-260 nm) usando o equipamento J810 spectropolarimeter (JASCO). Os espectros de CD foram medidos a 20°C com cubeta de quartzo retangular com 1 cm de caminho óptico. As medições foram feitas com uma velocidade de varredura de 20 nm/min de 198 a 260 nm até atingir a voltagem máxima de 700 V na fotomultiplicadora. Para a deconvolução dos dados, foi utilizado o programa DichroWeb (WHITMORE; WALLACE, 2004, 2008).
Espalhamento de Luz Dinâmico - DLS
As medidas de DLS foram feitas em cubetas de quartzo no equipamento DLS- Wyat DynaPRO 99-E (Wyatt Technology Corporation), com as proteínas em diferentes concentrações, a temperatura de 25°C. Foram feitas cerca de 50 medidas para cada amostra, com tempo de coleta de 10 segundos.
Caracterização funcional das MpPR1
Teste de crescimento de M. perniciosa na presença de eugenol
Inicialmente foi feito um teste funcional de crescimento do fungo em placa de petri com a presença de eugenol. O teste foi feito em triplicata, com o fungo necrotrófico em meio Malte (composto por 17 g de extrato de malte, 5 g extrato de levedura e 20 g de ágar,
dissolvido em 1 L de agua destilada). As concentrações usadas foram de 100 µg, 200 µg, 300 µg e 400 µg. O eugenol foi diluído em metanol 100% (DARVISHI et al., 2013; ZABKA;
PAVELA, 2013).
Os controles de inibição de crescimento fúngico foram feitos com a combinação dos fungicidas azoxistrobina 2.5 µM (inibidor da cadeia respiratória principal de fungos) e SHAM 5 mM (inibidor da enzima oxidase alternativa). Foi necessário fazer mais dois controles, um com metanol 100% (solvente do eugenol) e outro com etanol 50% (solvente do SHAM). A priori sabemos que o M. perniciosa cresce bem em meio com metanol segundo estudos do Oliveira e colaboradores (2012).
Ensaios de fluorescência
A partir do conhecimento da afinidade das proteínas SCP/TAPS por pequenos compostos hidrofóbicos (CHOUDHARY; SCHNEITER, 2012; CHOUDHARY et al., 2014) foram feitos ensaios de fluorescência com dois ligantes fluorescentes com capacidade de ligação a cavidades hidrofóbicas (BOTHRA et al., 1998; PASTUKHOV; ROPSON, 2003). Para avaliar a afinidade da proteína MpPR-1i aos ligantes 1,8 ANS (1-Anilinonaphthalene-8- Sulfonic Acid; SIGMA) e Bis-ANS (4,4'-Dianilino-1,1'-Binaphthyl-5,5'-Disulfonic Acid; SIGMA), foi utilizada a proteína na concentração de 25 μM e foram acrescentadas alíquotas do ligante a 1 mM em metanol nas concentrações finais de 2 μM a 16 μM. A sonda ANS e Bis-ANS foi excitada a 380 nm e 400 nm, respectivamente. E o espectro de sonda foi medido de 380 a 600 nm para o composto ANS e de 420 a 600 nm para o Bis-ANS. O equipamento utilizado foi o espectrofluorímetro de placa En Vision (Perkin Elmer) e as placas usadas foram OptiPlate 96F (Perkin Elmer). A afinidade ao eugenol foi medida por meio de competição com o Bis- ANS na concentração de 4 μM. A concentração do competidor (eugenol) variou de 5-100 μM. Linhagens de levedura e condições de crescimento
Linhagens de leveduras mutantes ∆hem1 foram cultivadas em meio rico YPD (extrato de levedura, 2% peptona, e 2% glicose; US Biological, Swampscott, MA) ou em meio mínimo definido (contendo 0,67% meio nitrogenado sem aminoácidos, 0,73 g/L aminoácidos e 2% glicose; US Biological). Meio suplementado com esterol e ácidos graxos continha 0.05 mg/mL Tween 80 e 20 µg/mL colesterol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Para superar a heme deficiência derivada da deleção do gene hem1, as leveduras foram cultivadas em meio suplementado com 10 µg/mL ácido delta-aminolevulínico. A heme deficiência é necessária para que as células capturem esteróis exógenos em condições aeróbicas (LEWIS et al.,
Complementação nos mutante Pry e análise de secreção de lipídeos
Os plasmídeos pGEM T-easy contendo os genes MpPR-1 sem a região codante para o peptídeo sinal foram usados como moldes para clonagem em vetores desenvolvidos pelo laboratório do Professor Dr. Roger Schneiter da Universidade de Freiburg, Suiça, utilizando a estratégia conhecida como marker rescue strategy (CHOUDHARY; SCHNEITER, 2012; GUELDENER et al., 2002; LONGTINE et al., 1998; TIWARI; KÖFFEL; SCHNEITER, 2007). Esses plasmídeos possuem o fator pre-pro-alpha característico para rota secretória de leveduras. As clonagens foram confirmadas por digestão com enzimas de restrição e PCR.
A acetilação e exportação de esteróis para o sobrenadante da cultura foram analisadas como descrito anteriormente (CHOUDHARY; SCHNEITER, 2012; TIWARI; KÖFFEL; SCHNEITER, 2007). Resumidamente, após transformação com os genes MpPR-1, as leveduras mutantes em biossíntese de grupos heme (hem1∆) foram cultivadas na presença de colesterol/Tween-80 contendo meio marcado com 0.025 µCi/mL [14C] de
colesterol (American Radiolabeled Chemicals, Inc., St. Louis, MO). As células foram centrifugadas e lavadas duas vezes com meio sintético completo (SC), diluídas para ficar na OD600 1.0 com meio fresco contendo colesterol não marcado radioativamente e crescido
durante a noite. As células foram centrifugadas e os lipídeos foram extraídos do sedimento celular e dos sobrenadantes usando clorofórmio/metanol (v/v, 1:1). As amostras foram secas e separadas por TLC usando placas de sílica gel 60 (Merck). O sistema de solvente éter de petróleo/éter dietílico/ácido acético (70:30:2; por volume) foi utilizado. Os lipídeos radiomarcados no TLC foram quantificados por escaneamento com o equipamento “Berthold Tracemaster 40 automatic TLC-linear analyzer” (Berthold Technologies). Placas de TLC e os lipídeos radiomarcados foram expostos em um phosphorimager (Bio-Rad Laboratories).
Ligação a esterol e palmitato in vitro
O ensaio de ligação com o ligante marcado radioativamente está descrito detalhadamente em Im et. al. (2005) e Choudhary & Schneiter (2012). Proteína purificada (0 – 300 pmol) foi adicionada ao tampão de ligação (20 mM Tris, pH 6,5, 30 mM NaCl, 0,05% Triton X-100) e incubada com [3H]-colesterol e/ou [3H]-palmitato (50 ou 200 pmol) por 1 h a
30°C. A proteína foi separada do ligante não aderido através de beads de Q Sepharose (GE Healthcare, USA), os beads foram lavados e o ligante marcado radioativamente foi quantificado por contagem de cintilação.
Cromatografia de camada delgada (TLC)
Para realizar a cromatografia inicialmente foi feita a extração do possível lipídeo que estaria ligado a proteína MpPR-1i. A extração de lipídeo foi feita a partir de 400 µL de proteína purificada (~1.5 mg/mL) usando 1 mL da mistura MTBE:metanol:água 3:1:1 (v:v:v) previamente resfriada (-15°C) com agitação por 30 minutos a 4°C, seguido de mais 10 minutos incubado no gelo em um banho de ultrassonicação. Na sequência foi adicionado 650 µL de metanol:água 1:3 (v:v), homogeneizado por vôrtex e centrifugado em velocidade máxima por 5 minutos a 4°C. A fase superior, na qual se encontra os lipídeos, foi transferida para um tubo limpo, que foi secada através do speed-vac. Quatro amostras foram secadas juntas em apenas um tubo.
As separações cromatográficas foram realizadas em uma placa de alumínio de 4 x 2 cm TLC Silica gel 60 F254 (Merck). O complexo de mistura de lipídeos foi aplicado na extremidade das placas utilizando um capilar de vidro. As amostras correram por 4 cm em uma câmara de vidro de 8 x 4 cm, previamente saturada com a fase móvel. Três fases móveis distintas foram usadas: (i) ciclohexano:acetato de etila (4:1), separa lipídeos neutros insaturados; (ii) clorofórmio:metanol:água (75:25:2,5), separa lipídeos neutros saturados; (iii)
clorofórmio:metanol:água (75:25:2,5) revelado com o reagente dittmer-lester, identifica
fosfolipídios. As placas foram, em seguida, deixadas expostas ao ar para permitir a
evaporação da fase móvel residual. As placas contendo a primeira e segunda fase móvel foram reveladas com acido sulfúrico 5% e queimadas com um secador. As placas foram imediatamente fotografadas.
Toxicidade a alfa-tomatina in vivo em S. cerevisiae
Leveduras mutantes para os genes Pry e complementadas com os genes MpPR-1 foram inoculadas em meio SC sem uracila (garantindo assim o crescimento apenas da leveduras com o gene de interesse) até atingirem OD 600nm de 1. As soluções das leveduras foram pingadas em meio YPD sólido contendo alfa-tomatina (0.005 mM diluída em DMSO), fazendo diluições seriadas. As placas foram incubadas a 30°C e o crescimento das leveduras foi acompanhado durante 4 dias.
