INSTITUTO FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO CAMPUS PIÚMA
CURSO SUPERIOR EM ENGENHARIA DE PESCA
JULIANE RIBEIRO ROSA
UTILIZAÇÃO DE BACTÉRIAS COM POTENCIAL PROBIÓTICO NO CONTROLE DE Vibrio parahaemolyticus EM CULTIVO EXPERIMENTAL DE Macrobrachium
rosenbergii
PIÚMA 2018
JULIANE RIBEIRO ROSA
UTILIZAÇÃO DE BACTÉRIAS COM POTENCIAL PROBIÓTICO NO CONTROLE DE Vibrio parahaemolyticus EM CULTIVO EXPERIMENTAL DE Macrobrachium
rosenbergii
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Coordenadoria do Curso de Engenharia de Pesca do Instituto Federal do Espírito Santo, Campus Piúma, como requisito parcial para a obtenção do título de Bacharel em Engenharia de Pesca.
Orientadora: Profª. Drª. Flávia Regina Spago de Camargo Gonçalves
PIÚMA 2018
Dados internacionais de catalogação na publicação (CIP) Bibliotecária responsável Ana Muller CRB6/ES 541
R788u Rosa, Juliane Ribeiro. 1991-
Utilização de bactérias com potencial probiótico no controle de Vibrio parahaemolyticus em cultivo experimental de Macrobrachium rosenbergii / Juliane Ribeiro Rosa. -- 2018.
68 f. : il. ; 30 cm.
Orientador: Flávia Regina Spago de Camargo Gonçalves.
Monografia (graduação) - Instituto Federal do Espírito Santo, Campus Piúma, Coordenadoria de Curso Superior de Engenharia de Pesca, 2018.
1. Alimentos - Microbiologia. 2. Bactérias. 3. Camarão - Criação.
4. Camarão - Doenças. I. Gonçalves, Flávia Regina Spago de Camago. II. Instituto Federal do Espírito Santo, Campus Piúma. III. Título.
CDD: 664.001579
JULIANE RIBEIRO ROSA
UTILIZAÇÃO DE BACTÉRIAS COM POTENCIAL PROBIÓTICO NO CONTROLE DE Vibrio parahaemolyticus EM CULTIVO EXPERIMENTAL DE Macrobrachium
rosenbergii
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado à Coordenadoria do Curso de Engenharia de Pesca do Instituto Federal do Espírito Santo, Campus Piúma, como requisito parcial para a obtenção do título de Bacharel em Engenharia de Pesca.
COMISSÃO EXAMINADORA
Profª. Drª. Flávia Regina Spago de Camargo Gonçalves Instituto Federal do Espírito Santo
Orientadora
Prof. Dr. Henrique David Lavander Instituto Federal do Espírito Santo
“Não é sobre chegar no topo do mundo e saber que venceu, é sobre escalar e sentir que o caminho te fortaleceu...”
AGRADECIMENTOS
Antes de tudo, gostaria de agradecer a Deus, pela sua generosidade e por estar comigo em todos os momentos, me sustentando e me dando sabedoria.
Ao Instituto Federal do Espírito Santo, Campus Piúma, por me abrir as portas e ter me dado a oportunidade de fazer parte dessa instituição.
A professora Dr.ª.: Flávia Spago, carinhosamente apelidada como “mamãe”, pela orientação e dedicação na condução deste trabalho, por acreditar no meu potencial, pelos ensinamentos, pelas cobranças, pelos puxões de orelha, sobre tudo, pelos anos em que estive sob sua supervisão, no laboratório de Ecologia Microbiana. Obrigada!
Aos técnicos de laboratório, em especial, à Suzana Bianchini, por estar conosco desde o início, nos apoiando e por seus valiosos ensinamentos, por sua atenção, dedicação, preocupação e amizade. Agradeço também a Daniella, pelos esporros e ajuda, ao André Luís Batista, por seus ensinamentos, a Carolina Rosa e Nathanael, pela colaboração. Aos colegas que fiz no laboratório de ecologia microbiana, Isabela Rovetta, Olga Emília Baungartem, Fillipe Sutil, Victório Baungartem, Ester Garcindo, Alice Bourguignon, Vitória, Mariana Bianchi e Caroline Bindele em especial a Laura Dayrell e Savyo Veloso, por toda a ajuda dada por vocês. Obrigada!
À minha grande e querida amiga, Bruna Morales Paris Rosa, por estar ao meu lado até tantas horas da noite, pelos anos de amizade, pelo carinho, pelas madrugadas fazendo trabalhos e escrevendo nossos TCC’s, pelo seu incentivo e paciência nos meus “maus” momentos! Graças a sua presença, foi mais fácil passar pelos dias de desânimo e cansaço. Essas palavras são pouco para demonstrar toda a gratidão que tenho a você. Te amo amiga!
Ao meu namorado Fábio Harthuique, pela compreensão, agradeço por ter respeitado a importância da realização deste trabalho, por torcer por mim, e por entender sobre todos os dias em que eu não pude estar com ele, devido a dedicação a este trabalho. Amo você!
À minha família, meus pais Nelson Rosa Filho e Maria da Glória Ribeiro Balzana, ao meu padrasto, Renato Machado Balzana, a minha tia Olga Rosa, e irmãos, que mesmo sem entender ao certo o que eu estava fazendo, torceram por mim. Muito obrigada!
nos dias em que tudo estava dando errado no laboratório, em especial, à Denise.
Aos técnicos do LANPOA, Lucas Bassul, pela ajuda e pela preocupação com o meu experimento, sempre buscando saber se tudo estava ocorrendo bem, e Dário, pela ajuda na montagem do sistema de recirculação utilizado em boa parte do experimento.
A todos que, de alguma forma, contribuíram para a realização desse trabalho. Muito obrigada!
Agradeço também à banca examinadora desse trabalho de conclusão de curso, professor Paulo Aride e, em especial, ao professor Henrique Lavander, pela colaboração, pelas dicas e preocupação a respeito do andamento do experimento. Obrigada!
E finalmente, agradeço às instituições financiadoras desta pesquisa: CNPQ e FapES. Dedico este trabalho de conclusão de curso à minha equipe do Laboratório de Ecologia Microbiana.
RESUMO
Diferentemente dos vertebrados, que possuem um sistema imunológico adaptativo e um natural, os crustáceos possuem apenas o sistema imune natural. Dentre as espécies de crustáceos de água doce que são cultivadas, uma das que mais têm se destacado é o camarão Macrobrachium rosenbergii. As doenças são um dos principais fatores limitantes na carcinicultura e têm causado prejuízos ao redor do mundo. A rápida expansão do cultivo de peneídeos está sendo ameaçada por essas doenças provocadas por espécies do gênero Vibrio, que afetam a sua sobrevivência e crescimento. A alta densidade populacional, o manejo inadequado e a má qualidade da água favorecem a proliferação desses micro-organismos patogênicos. Existem várias pesquisas relacionadas às boas práticas de manejo, possibilitando a melhoria no sistema de criação, mas o controle biológico de patógenos é pouco estudado. Diversos autores afirmam que cepas autóctones do tipo Gram positivas veem obtendo resultados satisfatórios como probiótico na aquicultura. Sabendo que os organismos aquáticos possuem, em sua microbiota, maior quantidade de bactérias do tipo Gram negativas, também podemos ressaltar a importância do estudo dessas cepas, assim com as Gram positivas. Além disso, outros autores ressaltam o fato de que cepas exóticas, provenientes de outros ambientes também vem sendo estudadas com a mesma finalidade, por conta do papel que elas atuam no ambiente devido a sua produção de metabólitos secudários no controle de micro-organismos patogênicos. Diante disso, o presente trabalho teve como objetivo isolar e testar o potencial antimicrobiano e probiótico de bactérias autóctones e exóticas no controle de Vibrio parahaemolyticus em cultivo experimental do camarão de água doce (M. rosenbergii), buscando novas propostas para a substituição dos antibióticos utilizados no controle de doenças na carcinicultura. 161 cepas foram isoladas, sendo 56 do trato intestinal de camarões adultos e 105 de solo rizosférico de áreas de mangue. Após triagem a partir de testes in vitro, foram selecionadas três cepas: MB (autóctone - gram negativa), MG (autóctone - gram positiva) e P1A-B (rizobactéria - gram negativa). O experimento externo foi realizado com 15 caixas, divididas em cinco tratamentos, contendo 40 juvenis cada. Além disso, um tratamento denominado controle positivo (cepa probiótica) e controle negativo (meio de cultura) foram utilizados para comparação dos resultados. Os juvenis foram submetidos à biometria e avalização da colonização por cepas probióticas e do gênero Vibrio a cada sete dias. No experimento de infecção com duração de sete dias, 106 ufc/mL do patógeno foram inoculados na água de tratamento. Ao final do experimento, os intestinos dos animais foram plaqueados para contagem de cepas probióticas e bactérias do gênero
Vibrio. Os resultados obtidos neste trabalho, mostram que entre os três tipos de cepas
utilizadas, as autóctones MG e MB se mostraram melhores no controle do patógeno, tanto na água de cultivo como nos intestinos dos camarões, quando comparadas aos demais tratamentos. Com isso, faz-se necessário mais estudos com bactérias desse tipo tendo em vista que a maioria dos probióticos utilizados na atualidade são compostos por cepas que não provém do animal a ser cultivado.
Palavras – chave: Micro-organismos, Gigante da Malásia, Carcinicultura, Metabólitos secundários, Crustáceos, Patógeno.
ABSTRACT
Unlike vertebrates, which have an adaptive and natural immune system, crustaceans have only the natural immune system. Among the species of freshwater crustaceans that can be cultivated, the shrimp Macrobrachium rosenbergii is one of the most prominent. Diseases are one of the main limiting factors in shrimp farming and have caused damage around the world. The rapid expansion of shrimp culture is being threatened by these diseases, especially those caused by bacterial species of the genus Vibrio, which affect its survival and growth. High shrimp population density, lack of management and poor water quality, favor the proliferation of these pathogenic microorganisms. There are several researches related to good management practices, making possible the improvement in the breeding system, but the biological control of pathogens is little studied. Several authors affirm that gram-positive autochthonous strains see satisfactory results as probiotics in aquaculture. Knowing that aquatic organisms have a greater amount of gram-negative bacteria in their microbiota, we can also emphasize the importance of studying these strains, as well as Gram-positive strains. In addition, other authors emphasize the fact that exotic strains from other environments have also been studied for the same purpose, due to the role they play in the environment, once they are capable of produce secondary metabolites, for the control of pathogenic microorganisms. The objective of this work was to isolate and to test the antimicrobial and probiotic potential of native and exotic bacteria in the control of Vibrio parahaemolyticus in experimental culture of freshwater prawn (M. rosenbergii), searching for new proposals for the substitution of antibiotics used in the control of diseases in shrimp farming. 161 strains were isolated, being 56 from the intestinal tract of adult shrimp and 105 of rhizospheric soil from mangrove areas. After screening from in vitro tests, three strains were selected: MB (autochthonous - gram negative), MG (autochthonous - gram positive) and P1A-B (rhizobacteria - gram negative). The external experiment was carried out with 15 boxes, divided in five treatments, containing 40 juveniles each. Two treatments, called positive control (probiotic strain) and negative control (culture medium), were used to compare the results with the three treatments using bacteria. The juveniles were submitted to biometry and tests to verify the colonization by probiotic and Vibrio strains every seven days. Na infection experiment were carried out with seven days, where 106 cfu/ml of the pathogen were inoculated into the water of shrimp cultivation of each treatment. At the end of the experiment, the intestines of the animals were plated for counting probiotic strains and the bacteria of the genus Vibrio. The results obtained in this work showed that, among the three types of strains used, the autochthonous MG and MB have the best results in the control of the pathogen in both culture water and intestines of shrimp, when compared to the other treatments. Thus, more studies are needed with these bacteria, since most of the probiotics used today are composed of strains that do not come from the animal to be cultivated.
Key words: Microorganisms, Malaysian Giant, Carcinogenesis, Secondary metabolites, Crustaceans, Pathogen
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1: Camarão da Malásia (Macrobrachium rosenbergii) ... 22
Figura 2: Raízes contendo solo rizosférico ... 27
Figura 3: Ração ofertada no cultivo experimental dos camarões ... 32
Figura 4: Bactérias viáveis na ração suplementada com bactéria MB ... 32
Figura 5: Sistema de recirculação utilizado no experimento ... 33
Figura 6: Remoção de intestino para análise de colonização bacteriana ... 34
Figura 7: Sistema de cultivo para infecção experimental ... 35
Figura 8: Atividade antimicrobiana in vitro ... 38
Figura 9: Teste de hemólise em Ágar Sangue (A) Alfa-hemolícia, (B) Beta-hemolítica e (C) Gama-Beta-hemolítica ... 39
Figura 10: Taxa de agregação das cepas com potencial probiótico ... 40
Figura 11: Variação no peso dos camarões durante o experimento de colonização probiótica ... 43
Figura 12: Variação no comprimento dos camarões durante o experimento de colonização probiótica ... 44
Figura 13: Quantidade de bactérias presente nos camarões ... 47
Figura 14: Quantidade de bactérias totais na água dos tratamentos ... 49
Figura 15: Taxa de sobrevivência no período de trinta e cinco dias ... 50
Figura 16: Relação do peso dos camarões com o tempo durante o ensaio de infecção com Vibrio parahaemolyticus ... 52
Figura 17: : Variação do comprimento dos camarões em relação ao tempo durante o experimento de infecção por Vibrio parahaemolyticus ... 53
Figura 18: Bactérias totais (probióticas, Vibrio sp. e demais) ... 54
Figura 19: Diferenciação na opacidade do abdômen de camarões submetidos a infecção com V. parahaemolyticus, comparados com camarão sadio ... 54
Figura 20: Quantidade de bactérias presentes em cada tratamento durante a infecção experimental ... 58
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Atividade antimicrobiana de bactérias rizosféricas e autóctones contra o patógeno V. parahaemolyticus ... 37 Tabela 2: Descrição dos testes bioquímicos realizados ... 41 Tabela 3: Caracterização visual das colônias com potencial probiótico ... 42 Tabela 4: Peso dos camarões (g) durante o experimento de colonização probiótica ... 42
Tabela 5: Comprimento dos camarões (cm) durante o experimento de colonização probiótica ... 43 Tabela 6: Análise bacteriana nos camarões a cada sete dias ... 46 Tabela 7: Análise bacteriana na água a cada sete dias ... 48 Tabela 8: Peso dos camarões (g) durante o ensaio de infecção com Víbrio
parahaemolyticus ... 51 Tabela 9: Comprimento (cm) dos camarões infectados com Víbrio
parahaemolyticus ... 52 Tabela 10: Quantidade de bactérias totais (ufc/mL) nos camarões ... 53 Tabela 11: Quantidade de bactérias na água durante sete dias de experimento ... 56 Tabela 12: Quantidade de bactérias na ração ... 60
LISTA DE ABREVIATURAS
Abs Absorbância
AN Ágar Nutriente
ANS Ágar Nutriente acrescido de 3 % de Cloreto de Sódio
cm Centímetro
CN Caldo nutriente
CN3 Caldo nutriente acrescido de 3 % de Cloreto de Sódio
ºC Graus Celsius
D.O Densidade óptica
FAO Organização das Nações Unidas para a Alimentação e a
Agricultura
g Grama
λ Comprimento de onda
L Litro
LANPOA Laboratório de Nutrição e Propagação de Organismos Aquáticos
LP Leite Peptonizado
mL Mililitro
µL Microlitro
μm Micrometro
MRS Caldo De Man, Rogosa e Sharpe
nm Nanômetro
N2 Nitrogênio
NaCl Cloreto de sódio
pH Potencial Hidrogeniônico
RAS Sistema de recirculação
RPCP Rizobactérias promotoras do crescimento das plantas
SSE Solução salina estéril
TCBS Ágar Tiossulfato Citrato Sais de Bile
TSA Ágar Triptona de Soja
TSB Caldo Soja Tripticaseína
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 15 2 OBJETIVO GERAL ... 17 2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 17 3 REVISÃO DE LITERATURA ... 18 3.1 AQUICULTURA ... 18 3.1.1 Carcinicultura ... 18 3.1.1.1 Patógenos na carcinicultura ... 19 3.2 VÍBRIO sp. ... 19 3.2.1 Vibrio parahaemolyticus ... 20
3.2.1.1 Síndrome Aguda da Necrose Hepatopancreática (AHPNS) ... 21
3.3 CAMARÃO DE ÁGUA DOCE, Macrobrachium rosenbergii (DE MAN, 1879) ... 21
3.3.1 Cultivo de M. rosenbergii ... 22
3.4 PROBIÓTICOS ... 23
3.4.1 Probióticos na aquicultura ... 23
3.5 PROSPECÇÃO DE BACTÉRIAS COM POTENCIAL PROBIÓTICO .. 24
3.5.1 Bactérias da microbiota intestinal do camarão ... 25
3.5.2 Áreas de manguezal e seu potencial antimicrobiano ... 25
4 METODOLOGIA ... 27
4.1 ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS COM POTENCIAL PROBIÓTICO ... 27
4.1.1 Isolamento de rizobactérias ... 27
4.1.2 Isolamento de bactérias autóctones com potencial probiótico ... 27
4.2 TESTES IN VITRO ... 28
4.2.1 Teste de atividade antibacteriana ... 28
4.2.2 Teste de atividade hemolítica ... 28
4.2.3 Teste de tolerância à sais biliares ... 28
4.2.4 Teste de tolerância ao ph ácido ... 29
4.2.5 Teste de autoagregação ... 29
4.3 CARACTERIZAÇÃO DAS BACTÉRIAS COM POTENCIAL
PROBIÓTICO ... 30
4.3.1 Morfologia ... 30
4.3.2 Testes bioquímicos ... 30
4.3.3 Coloração de Gram ... 31
4.4 ESTOCAGEM E REATIVAÇÃO DAS BACTÉRIAS COM POTENCIAL PROBIÓTICO ... 31
4.5 PREPARO DAS RAÇÕES ... 31
4.6 ENSAIOS IN VIVO ... 32
4.7 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE COLONIZAÇÃO DAS CEPAS PROBIÓTICAS ... 34
4.8 INOCULAÇÃO DO PATÓGENO NA ÁGUA DE CULTIVO ... 35
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA ... 35
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 36
5.1 ISOLAMENTO DE CEPAS COM POTENCIAL PROBIÓTICO ... 36
5.2 TESTES DE INIBIÇÃO CONTRA Vibrio parahaemolyticus ... 36
5.3 ATIVIDADE HEMOLÍTICA DAS CEPAS COM POTENCIAL PROBIÓTICO ... 38
5.4 TOLERÂNCIA À SAIS BILIARES E pH ÁCIDO ... 39
5.5 AUTOAGREGAÇÃO ... 39
5.6 TESTES BIOQUÍMICOS ... 40
5.7 COLORAÇÃO DE GRAM ... 41
5.8 PADRONIZAÇÃO DO MEIO DE CULTURA PARA ASPERSÃO DA RAÇÃO ... 41
5.9 CARACTERIZAÇÃO DAS BACTÉRIAS UTILIZADAS NOS TRATAMENTOS ... 41
5.10 ENSAIOS IN VIVO ... 42
5.10.1 Biometria ... 42
5.10.2 Ensaios, in vivo, ao ar livre ... 45
5.10.2.1 Bactérias totais nos camarões ... 45
5.10.3 Ensaios, in vivo, a partir da inoculação do Víbrio
parahaemolyticus, no LEM ... 50
5.10.3.1 Biometria dos camarões durante os ensaios de infecção com Vibrio parahaemolyticus ... 51
5.10.3.2 Quantidade de bactérias totais no camarão ... 53
5.10.3.3 Quantidade de bactérias totais na água ... 55
5.10.3.6 Quantidade de bactérias na ração ... 59
6 CONCLUSÃO ... 61
1 INTRODUÇÃO
O ambiente aquático possui, naturalmente, uma microbiota equilibrada contendo bactérias neutras, benéficas e patogênicas (obrigatórias e oportunistas) aos animais (VIEIRA, 2010).
Alguns fatores ambientais podem ocasionar a diminuição da imunidade dos organismos aquáticos (DOURADO, 2009), fazendo com que o sistema de defesa dos animais fique debilitado por conta do gasto energético necessário para readaptação ao meio. Sendo assim, uma porta de entrada para a ação dos micro-organismos patogênicos já presentes no meio, afetando a saúde desses animais (VIDAL, 2015). Dentre esses fatores estão os extremos de temperatura (estresse físico) o pH, a baixa concentração de oxigênio dissolvido, presença de substâncias tóxicas (estresse químico) e altas densidades de organismos vivos (estresse biológico) (ORTIZ, 2017).
A incidência de doenças na carcinicultura, contribui para a diminuição da produção do camarão (DOURADO, 2009). As doenças causadas por bactérias do gênero Vibrio estão entre as que mais prejudicam o cultivo de camarões (NEGREIRO; SANTOS, 2015). A utilização de probióticos constitui um método alternativo no controle de patógenos e vem ganhando destaque na carcinicultura (GASTÉLUM, 2011), principalmente quando comparado ao uso de antibióticos, que colabora para o surgimento de cepas bacterianas resistentes e podem deixar resíduos na carne do camarão (VIEIRA, 2014).
Atualmente, os compostos mais utilizados no controle de infecções bacterianas, na aquicultura são os antibióticos. A oxitetraciclina e o florfenicol são os que possuem registro para o uso na aquicultura brasileira. (PÁDUA; MENEZES-FILHO, 2014). Quando a dose ofertada aos organismos de cultivo é muito alta, por um longo período, os animais podem sofrer danos em seus órgãos. Os efeitos tóxicos dos resíduos acumulados no músculo dos animais cultivados podem trazer riscos à saúde do consumidor (GASTALHO et al., 2014). Além disso, quando mal administrados, os antibióticos podem matar as bactérias benéficas do intestino dos animais, desequilibrando seu trato intestinal (VIEIRA; PEREIRA, 2016).
Na aquicultura, a utilização de cepas probióticas não estão associadas apenas aos benéficas do trato intestinal dos animais, melhorando também a água do cultivo, inibindo a presença de bactérias patogênicas (FROZZA, 2013).
Na piscicultura, malacocultura e na carcinicultura, os principais gêneros de bactérias utilizados como probióticos são Pseudomonas, Bacillus e alguns Lactobacillus (GASTÉLUM, 2011).
Segundo Franco (2009) as cepas com melhores resultados como probióticas, devem ser isoladas dos organismos de origem, ou seja, do próprio animal, e serem gram positivas, pois essas já fazem parte da micronbiota autóctone e estão mais familiarizadas com as condições intrínsecas dos mesmos. Entretanto, estudos revelam que bactérias isoladas de outros meios ou organismos e do tipo gram negativas, também vêm sendo utilizadas, porém com resultados pouco satisfatórios (VIEIRA, 2010).
O trato intestinal de humanos e animais domésticos possuem, em sua maioria, bactérias gram positivas, já os animais aquáticos, possuem uma maior quantidade de bactérias do tipo gram negativas. A importância dessa especificidade implica no fato de que os probióticos eficazes na criação de suínos e aves, dentre outros animais terrestres, não possui efeitos positivos no cultivo dos organismos aquáticos (RIBEIRO et al., 2008). O solo do manguezal possui uma diversidade microbiana abundante, onde existe a interação simbiótica entre esses organismos e as plantas sadias, que se encontram nesse habitat. Tais interações contribuem na produção de compostos metabólicos que beneficiam as plantas, fazendo com que essas adquiram resistência contra patógenos (HOLANDA, 2016). Além da produção destes compostos, a utilização desses micro-organismos, como probiótico, também apresenta-se como uma possibilidade no controle de espécies do gênero Vibrio, a exemplo do V. parahaemolyticus, causador da Síndrome Aguda da Necrose Hepatopancreática (AHPNS) e vibriose (FROZZA, 2013).
A busca por novas cepas probióticas vem como uma alternativa ao uso de antibióticos, visto que o uso indiscriminado dessas substâncias vem colaborando para que agentes bacterianos desenvolvam estratégias para alcançar a resistência a eles, tornando possível o surgimento de cepas multirresistentes sendo assim, difícil de serem combatidas pelos antibióticos tradicionais.
2 OBJETIVO GERAL
Isolar micro-organismos com potencial probiótico que possam ser utilizados no controle de Vibrio parahaemolyticus no cultivo de camarões de água doce, Macrobrachium
rosenbergii.
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Isolar diferentes bactérias capazes de produzir compostos antimicrobianos em condições de laboratório;
Avaliar as cepas bacterianas e compostos antimicrobianos dos micro-organismos isolados, no controle de Vibrio parahaemolyticus, in vitro; Padronizar as condições físicas necessárias para uma maior produção
desses compostos;
Avaliar a colonização das cepas com potencial probiótico nos intestinos de camarões.
Avaliar o potencial de infecção do V. parahaemolyticus nos intestinos de camarão Macrobrachium rosenbergii;
Verificar a capacidade das cepas probióticas diminuírem a infecção por V.
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 AQUICULTURA
A aquicultura é definida como o cultivo de animais aquáticos e/ou semiaquáticos de água salgada e doce, em cativeiro, fazendo com que seja possível controlar o meio de cultivo, com a utilização de fertilizantes, oferta de ração aos organismos, utilização de mão de obra, dentre outros (CEZIMBRA, 2016).
O rápido crescimento na atividade aquícola está relacionado a pequenos produtores, que vem se dedicando cada vez mais ao aumento desse meio de produção de alimentos de alto valor nutricional (FERREIRA, 2018).
Segundo a Organização das Nações Unidas para Alimentação e Agricultura (FAO, 2016), até 2025, a produção mundial da pesca, somando a aquicultura e a pesca extrativa, alcançará o patamar de 196 milhões de toneladas, um aumento de 17% em comparação a produção de 2013-15. Ferreira (2018) acrescenta que o consumo de pescado, oriundo da aquicultura, também poderá aumentar paralelamente, saindo de 50% para 57%, em 2025. Para a América Latina e Caribe, o novo relatório da FAO, o Estado Mundial da Pesca e Aquicultura 2016 (SOFIA), estima uma expansão importante na produção aquícola que pode chegar as 3,7 milhões de toneladas em 2025, um crescimento de 39.9%. Ainda segundo o relatório da FAO, o Brasil deve registrar o maior crescimento na região, de 104% na produção da pesca e aquicultura em 2025, devido aos investimentos feitos no setor nos últimos anos.
3.1.1 Carcinicultura
A carcinicultura é um dos setores da aquicultura que mais se desenvolve na Ásia, África e América Latina (DOURADO, 2013). A carcinicultura de água doce, apresenta vantagens que têm despertado o interesse de produtores rurais, com maior estabilidade produtiva, não sofrendo oscilações bruscas de produção e causando baixo impacto ambiental em relação à carcinicultura marinha (REBOUÇAS, et al., 2017).
Dentre as espécies de camarões de água doce atualmente cultivadas, destaca-se a espécie Macrobrachium rosenbergii (CEZIMBRA, 2016).
3.1.1.1 Patógenos na carcinicultura
A carcinicultura vem sofrendo problemas relacionados às questões ambientais, resultando em um aumento de estresse para os animais e, com isso, o aumento da incidência de doenças, contribuindo para a queda dos índices de desenvolvimento na produção de camarões (DOURADO, 2009). Práticas voltadas para a manutenção da qualidade de água e também, a redução do estresse dos animais, fazem com que as enfermidades causadas por patógenos oportunistas diminuam (SILVA, 2007). A incidência desses patógenos têm um impacto negativo na indústria de criação de camarões, causando consideráveis perdas econômicas (RAO et al., 2015).
Dentre as doenças causadas por agentes biológicos, as mais comuns são ocasionadas por micro-organismos oportunistas, sp. e, principalmente, as do gênero Vibrio (MENDES et al., 2009). Esses micro-organismos atacam quando existe uma combinação de manejo inadequado com o aumento de densidade de estocagem, promovendo a diminuição na qualidade de água e levando a alterações ambientais, comprometendo o sistema imunológico dos animais, o que poderá ocasionar o surgimento de doenças (NEGREIRO; SANTOS, 2015). Os micro-organismos oportunistas podem ser encontrados na água e nos sedimentos, podendo fazer parte, também, da microbiota intestinal de diversas espécies aquáticas, inclusive a do próprio camarão (REBOUÇAS et al., 2017).
Os micro-organismos patogênicos aderem na superfície das células epiteliais intestinais do animal, ou seja, na superfície onde é feita a absorção dos nutrientes. Após a colonização, essas bactérias patogênicas se reproduzem enviando suas proteínas ao interior da célula epitelial, liberando algumas toxinas que prejudicam o hospedeiro (REDONDO, 2008). Segundo Mendes et al., (2009), o M. rosenbergii é considerado a espécie menos resistente a doenças entre os camarões peneídeos.
3.2 VIBRIO sp.
De acordo com Dourado (2009), o número de espécies aceitas para a família Vibrionaceae é de 105, essas, distribuídas em oito gêneros: Aliivibrio, Catenococcus, Enterovibrio, Grimontia, Listonella, Photobacterium e Vibrio. Os membros do gênero
Vibrio são bacilos curvos ou retos, mesófilos, gram negativos que medem em torno de
com um único flagelo polar, aeróbias ou anaeróbias facultativas, tendo em sua maioria, espécies que produzem enzimas catalase e oxidase (REBOUÇAS et al., 2017), e fermentam a sacarose quando inoculados em Ágar Tiossulfato Citrato Sais de Bile (TCBS), o fato dessas espécies possuírem capacidade de fermentar ou não a sacarose, não está relacionada com a patogenicidade da bactéria e, portanto, a presença de um tipo ou de outro, não indica a gravidade da situação (DOURADO, 2009).
Bactérias do gênero Vibrio são encontradas em ambientes de água salgada, bem como salobra e doce, por todo o mundo (SANTIAGO et al., 2013), sendo a água doce um reservatório crítico para espécies desse gênero (LIMA, 2007). Por se tratarem de bactérias que são capazes de afetar todos os estádios de vida do camarão, as doenças causadas por Vibrio spp. possuem muita importância para a carcinicultura, sendo classificadas como infecções secundárias e oportunistas, podendo ser entéricas (intestinal) ou sistemáticas (envolvendo vários órgãos) (REBOUÇAS et al., 2017).
Além disso, essas doenças podem significar 100% de perda dos animais afetados (MENDES et al., 2009). As principais espécies do gênero Vibrio que representam risco para o cultivo dos peneídeos são Vibrio alginolyticus, V. anguillarum, V. campbellii, V.
carchariae, V. damsela, V. harveyi, V. ordalii, V. parahaemolyticus. V. salmonicida, V. splendidus e V. vulnificus (DOURADO, 2009). Nos últimos anos, a espécie V. parahaemolyticus vem apresentando um papel importante na etiologia das toxinfecções
alimentares (COSTA, 2006).
3.2.1 Vibrio parahaemolyticus
Para o M. rosenbergi, a espécie V. parahaemolyticus, isolado pela primeira vez em 1951 no Japão, emergiu como seu principal agente patogênico (RAO et al., 2015). A patogenicidade do V. parahaemolyticus está associada a três compostos produzidos pela bactéria, sendo eles: a hemolisina termoestável direta (TDH), que é uma enterotoxina que atua tanto dentro quanto fora das células do hospedeiro, levando à sua morte; a hemolisina termoestável relacionada com TDH (TRH), que possui o gene imunologicamente igual ao TDH, possuindo algumas diferenças químicas e atuando em eritrócitos diferentes; sendo que o TDH está interligado geneticamente ao terceiro composto produzido pelo patógeno, a urease (ureR), que é um composto produzido para
que a síntese de muco, na parede intestinal do hospedeiro, seja inibido, facilitando a colonização pelo patógeno (SILVEIRA et al. 2016; COSTA, 2006).
Nos humanos, a ingestão de organismos mal cozidos, que estejam contaminados por bactérias do gênero Vibrio, tem sido responsável por causar gastroenterites, onde os sintomas são: diarréia, vômito, dores na região do abdômen, febre e calafrios. Quando o caso se agrava, pode causar disenteria com fezes sanguinolentas (SILVEIRA et al., 2016). A intoxicação causada pelo V. parahaemolyticus é o que causa as infecções masis graves (ORTIZ, 2017).
3.2.1.1 Síndrome Aguda da Necrose Hepatopancreática (AHPNS)
Essa síndrome é causada pelo Vibrio parahaemolyticus e os primeiros casos dessa doença bacteriana em camarões foram descritos no continente Asiático (REBOUÇAS et al., 2017), e inicialmente era chamada de síndrome da mortalidade precoce (EMS) antes da identificação do seu agente etiológico (MEDEIROS, 2016). Essa doença provocou um colapso na carcinicultura, tanto da Ásia quanto do México (VIDAL, 2015), causando danos aos camarões através da produção de uma toxina que causa a destruição dos tecidos nos seus órgãos digestivos (GEREMIAS, 2014; FERREIRA, 2018). Letargia, opacidade corporal e pontos de necrose, são algumas características observadas nos animais infectados por essa doença (FERREIRA, 2018).
3.3 CAMARÃO DE ÁGUA DOCE, Macrobrachium rosenbergii (DE MAN, 1879)
A espécie Macrobrachium rosenbergii (Figura 1), conhecida como camarão gigante da Malásia, pertence ao maior gênero da família Palaemonidae (RAO, et al., 2015), e a maior espécie do gênero Macrobrachium (COSTA, 2014). Essa espécie é oriunda de regiões tropicais e sub-tropicais do Indo-Pacífico e são considerados animais bentônicos, caminhando com o auxílio de seus pereiópodos e utilizando os pleópodos para nadarem curtas distâncias (RAMIRO, 2017). São encontrados em águas interiores como rios, lagos, pântanos, áreas estuarinas, canais, bem como em dutos de irrigação (RAO et al., 2015), podendo chegar a 32 cm, pesando cerca de 500 g, passando sua vida na água doce quando adultos, porém, durante os estágios iniciais de sua vida, requerem água salobra (CEZIMBRA, 2016).
Figura 1: Camarão da Malásia (Macrobrachium rosenbergii)
Fonte: Autora
3.3.1 Cultivo de M. rosenbergii
Na carcinicultura de água doce, destacam-se duas espécies do gênero Macrobrachium, o M. amazonicum e M. rosenbergii, porém, a única cultivada comercialmente no Brasil é a M. rosenbergii (RAMIRO, 2017). Conforme Costa (2014), essa espécie de camarão apresenta algumas características básicas para que seja cultivada: a boa aceitação no mercado consumidor, alta fecundidade, fácil reprodução em cativeiro, rápido crescimento e alimentação de baixo custo.
A criação de camarões de água doce é relativamente mais simples que a de camarões marinhos, podendo ser realizada em propriedades de pequeno, médio e grande porte, próximas, ou não, do litoral (RAJU et al., 2014).
Mundialmente, o cultivo de M. rosenbergii, teve início na década de 60 (COSTA, 2014). Conforme Rao et al. (2015), a alta demanda na indústria da aquicultura, fez com que houvesse um cultivo em alta escala do camarão dessa espécie, em diversos países. Os principais produtores são Bangladesh, Brasil, China, Equador, Índia, Tailândia, Malásia (RAO et al., 2015), Estados Unidos da América, Irã e Peru (RAJU et al., 2014).
No Brasil, a introdução do M. rosenbergii ocorreu no final da década de 70, como forma de estudo sobre a adaptação das técnicas de cultivo à realidade brasileira. Com isso, já na década de 80, o país se tornou o 4º maior produtor mundial dessa espécie, devido à
implantação de empreendimentos comerciais, afirma Santos (2013). Contudo, a forma de trabalhar esse produto no mercado consumidor, foi inadequada, fazendo com que houvesse um declínio a partir da década seguinte (RAMIRO, 2017).
3.4 PROBIÓTICOS
A primeira definição aceita para o termo probiótico foi proposta por Fuller, em 1989, onde ele propõe que probióticos são produtos constituídos por micro-organismos vivos que, quando administrados em quantidades adequadas, trazem benefícios ao hospedeiro a partir do equilíbrio intestinal (KOTZENT, 2017). Além disso, Vieira (2010) acrescenta que as bactérias que são adicionadas ao cultivo, com o objetivo de inibir o crescimento de bactérias patogênicas na água, também são consideradas bactérias probióticas.
As cepas com potencial probiótico estão sendo muito estudadas devido ao aumento da variedade de espécies que estão sendo utilizadas para estes fins (RABELLO, 2017). Alguns critérios devem ser levados em conta a respeito do potencial probiótico das culturas microbianas, sendo o principal deles a não patogenicidade da cultura, seguido dos resultados obtidos através dos testes sobre a atividade antimicrobiana, que deve ser positivo, e também, deve-se levar em consideração sobre sua capacidade de adesão e colonização do trato intestinal (MATOS, 2010).
Quanto aos aspectos tecnológicos, essas culturas precisam conter propriedades sensoriais agradáveis, apresentar viabilidade das características desejáveis durante o processamento e a capacidade de serem produzidas em larga escala (COELHO, 2013). Os probióticos geram benefícios a partir de três mecanismos diferentes: melhoramento na qualidade da água, devido a sua metabolização, exclusão competitiva de bactérias patogênicas (GÜNTHER, 2004), devido a competição por recursos como nutrientes e espaço (VIDAL, 2015) e benefícios sobre o processo digestivo do hospedeiro (ROSELET, 2008).
3.4.1 Probióticos na aquicultura
Na aquicultura, os probióticos são definidos como células microbianas que entram no trato digestivo dos animais de forma que, vivas, melhorem a sua saúde, produzindo enzimas digestivas suplementares, estimulando o sistema imunológico e diminuindo a
carga bacteriana (JATOBÁ; STECKERT, 2013), além de permitir a diminuição no uso de antibióticos no cultivo (ROSELET, 2008).
Os probióticos não se restringem apenas a região intestinal, podendo ser adicionados à água de cultivo desses organismos, mantendo o ambiente saudável e livre de patógenos através da produção de compostos inibitórios (FROZZA, 2013). Entre os probióticos que são mais utilizados na atualidade, se destacam os que possuem bactérias ácido-láticas como base. A utilização desses micro-organismos no controle de enfermidades, tem sido colocado em pauta como uma alternativa viável na prevenção da disseminação de organismos patogênicos (VIDAL, 2015). Probióticos são utilizados tanto na carcinicultura marinha como na de água doce, onde colonizam o trato digestório de seu hospedeiro, ajudando na redução do desenvolvimento de micro-organismos patogênicos possuindo um efeito positivo na aquicultura como um todo (GUZMAN, 2013).
Segundo Buglione (2008), o fornecimento de substâncias imunoestimulantes aos camarões durante o seu cultivo, mostram que existem melhorias nos índices imunológicos e um aumento da resistência a infecções por patógenos.
Guzman (2005; 2013), descreve que no continente Asiático, uma medida profilática bastante utilizada no cultivo, é a aplicação de hidróxido de cálcio [Ca(OH)2] nos viveiros para combater doenças e melhorar a qualidade da água. Vidal (2015), afirma que vários estudos estão encaminhando para a descoberta de novas técnicas terapêuticas e preventivas para que as incidências de enfermidades no cultivo, sejam reduzidas.
Segundo Kotzent (2017), os probióticos estão entre os alimentos funcionais mais utilizados na aquicultura, assim como os prebióticos.
Tanto as bactérias gram-positivas, quanto as gram-negativas, têm sido utilizadas e testadas como probióticas na aquicultura. As bactérias gram-negativas estão obtendo sucesso nas pesquisas e estudos continuam sendo realizados sobre o uso dessas cepas na carcinicultura marinha (VIDAL, 2015). Além disso, as bactérias não autóctones também vêm sendo estudadas como probióticas, mas sem muito sucesso (COSTA, 2006).
3.5.1 Bactérias da microbiota intestinal do camarão
Segundo Vieira (2010), para se obter novas cepas probióticas é importante que a bactéria seja isolada do trato intestinal do animal de interesse. Conforme Franco (2009), atualmente, o uso de probióticos na aquicultura pode ser realizado com a utilização de micro-organismos de origem do próprio animal (autóctone), ou não. Estudos sobre o uso de cepas probiótica isolada de outros animais ou ambientes vem sendo realizados, acrescenta o autor.
A introdução de probióticos comerciais produzidos com cepas exóticas ao ambiente de cultivo devem ser mais discutidos (VIDAL, 2015).
3.5.2 Áreas de manguezal e seu potencial antimicrobiano
O manguezal funciona como berçário e fonte de alimentos para peixes e outros animais, desenvolvendo um papel essencial na manutenção da biodiversidade estuarina. Formam-se em áreas que possuem águas ricas em material em suspensão, constituindo ecossistemas de baixa energia (CURY, 2002).
No Brasil, as áreas de manguezal encontram-se desde o Amapá até Santa Catarina. Bactérias, fungos (DIAS, 2008), vírus, protozoárias, arqueas e nematoides (FIROOZMAND, 2008), correspondem a 91% da biomassa microbiana total em manguezais tropicais (DIAS, 2008).
Conforme Holanda (2016), o solo do mangue possui a diversidade microbiana mais abundante e diversificada do planeta. Esse ecossistema possui uma importância na fixação da vegetação no solo, evitando erosões, as raízes das plantas funcionam como filtros, retendo sedimentos e contribuindo para recuperação de áreas degradadas devido ao seu banco genético. Segundo Sottero et al. (2006), o interesse por micro-organismos rizosféricos está relacionado as suas funções no ambiente.
As rizobactérias promotoras do crescimento das plantas (RPCPs), formam um grupo vasto de micro-organismos que incluem qualquer bactéria que viva na rizosfera e que beneficie o crescimento de vegetais (HOLANDA, 2016). Esse crescimento ocorre devido aos resultados de diversos mecanismos, sendo eles a produção de fitormônios, o controle biológico, devido a competição por nutrientes com o patógeno, produção de antibióticos, resistência a doenças e disponibilidade de nutrientes devido a fixação de N2 (SOTTERO
et al., 2006). Frozza (2013) destaca que a utilização desses micro-organismos como potencial probiótico é apresentado como uma possibilidade viável.
As bactérias rizosféricas colaboram no controle biológico de fitopatógenos por diversos mecanismos, incluindo a produção de antimicrobianos (FREITAS; VELDOSO, 2004).
4 METODOLOGIA
4.1 ISOLAMENTO DE BACTÉRIAS COM POTENCIAL PROBIÓTICO
4.1.1 Isolamento de rizobactérias
As bactérias foram isoladas da rizosfera de plantas de áreas de manguezal, no município de Piúma, Espírito Santo, Brasil (20º50’09,2” S 40º43’38,9” W). As raízes contendo solo rizosférico (Figura 2) foram acondicionadas em sacos plásticos, colocadas em caixas térmicas com gelo e transportados até o Laboratório de Ecologia Microbiana do Instituto Federal do Espírito Santo – Campus Piúma. Um grama do solo rizosférico foi adicionado a 9 mL de solução salina estéril (SSE) e foi realizada uma diluição seriada decimal até 10-7. Foram inoculados 50 µL das diluições 10-4 a 10-7 em meio de cultura Ágar Triptona de Soja (TSA). As placas foram incubadas durante 48 horas à 28 ºC.
Figura 2: Raízes contendo solo rizosférico
Fonte: Autora
As colônias obtidas foram diferenciadas morfologicamente, semeadas em novas placas de Petri com meio de cultura TSA para a obtenção de culturas puras e selecionadas para posterior avaliação da atividade antimicrobiana.
4.1.2 Isolamento de bactérias autóctones com potencial probiótico
Foram extraídas porções dos intestinos de alguns exemplares de camarões da Malásia (M. rosenbergii), sob condições assépticas. Os órgãos foram macerados e adicionados a 100 µL de SSE e o mesmo procedimento descrito para, plaqueamento e incubação do
solo (item 4.1.1) foram realizados com os intestinos, com a diluição 10-1. As colônias obtidas foram diferenciadas morfologicamente, semeadas em novas placas de Petri com meio de cultura TSA para a obtenção das culturas puras.
4.2 TESTES IN VITRO
4.2.1 Teste de atividade antibacteriana
O primeiro teste de inibição in vitro foi realizado contra a bactéria patogênica Vibrio
parahaemolyticus. Foi realizada uma suspensão 108 ufc/mL do patógeno, com leitura em
espectrofotômetro (λ 590 nm, 0,040 Abs) (Marte – modelo UV/VIS Spectrophotometer), que foi inoculada em meio de cultura Ágar nutriente (AN) acrescido de 3 % de NaCl (ANS), com o auxílio de um swab estéril. Uma pequena quantidade da bactéria antagonista foi inoculada no centro da placa contendo o patógeno e as placas foram incubadas a 28 ºC por 24 horas. Após o período de incubação, a inibição foi observada pelo halo produzido ao redor da colônia bacteriana antagonista. As cepas que apresentaram os maiores halos de inibição in vitro foram isoladas em placas contendo meio AN para a realizações dos demais testes.
4.2.2 Teste de atividade hemolítica
As cepas com potencial antimicrobiano selecionadas foram semeadas, em meio de cultura Ágar sangue de carneiro, e incubadas durante 24 horas a 35 ºC. A reação hemolítica foi observada a partir das zonas de hidrólise ao redor das colônias.
4.2.3 Teste de tolerância à sais biliares
Foram transfeidos 100 µL contendo 108 ufc/mL de cada bactéria com potencial antimicrobiano para tubos de ensaio contendo 900 µL de caldo nutriente, acrescido de 0,3 % de extrato de bile bovina. Os tubos foram incubados à 30 ºC por 24 horas. Posteriormente, 50 µL da solução foram plaqueados em meio de cultura AN e incubadas a 30 ºC por 24 horas. Após a incubação foi realizada a avaliação de crescimento bacteriano.
4.2.4 Teste de tolerância ao pH ácido
Foram cultivadas 108 ufc/mL das cepas testes em meio de cultura caldo nutriente à 28 ºC, por 24 horas. Após o tempo de incubação, 100 µL da cultura inicial foram transferidos para 900 µL de salina tampão fosfato (pH=2,0) e incubados a 30 ºC, por 3 horas. Posteriormente, transferiu-se 100 µL da solução para 900 µL de salina tampão fosfato (pH=2,0) novamente e 50 µL de cada cultura foram plaqueados em meio de cultura AN. As placas foram incubadas a 30 ºC durante 24 horas. Após a incubação foi realizada a avaliação de crescimento bacteriano.
4.2.5 Teste de autoagregação
Cultivou-se cada bactéria por 18 horas à 28°C em CN, após o período de incubação, 2 mL de cada cultura foram transferídos para Eperdorf’s e submetidos ao processo de centrifugação a 7000 rpm por 30 minutos. Após as culturas serem centrifugadas, uma alíquota foi trasferida para solução de Tampão Fosfato, até acertar a D.O.600nm à concentração de 108 ufc/mL. Dividiu-se a solução em quantidades iguais em dois tubos de ensaio, um dos tubos foi denominado de “controle” e foi levado à estufa a 70°C por 30 minutos para inativação das bactérias, o outro tubo permaneceu em temperatura ambiente.
Após o período estipulado, foram realizadas novas leituras de ambos os tubos e foram incubados a 25°C realizando leituras após 5 horas. Este procedimento foi realizado com as 3 cepas com potencial probiótico selecionadas e também com a cepa isolada de um Probiótico comercial (Controle positivo).
O resultado foi obtido através da fórmula proposta por Grzeskowiak et al. (2012).
AT = 1- (Tf ⁄ Ti ) x 100
Onde AT é a autoagregação, Tf é a leitura da D.O.600nm após 1 hora de incubação eTi é a leitura da D.O.600nm anterior à incubação.
4.2.6 Teste de padronização de meio de cultura
cultura, para a padronização do crescimento bacteriano. Foi transferido1 mL de cada antagonista (108 células) para 3 Erlenmeyer de 250 mL, um contendo 100 mL de meio de cultura Caldo Soja Tripticaseína (TSB), outro contendo 100 mL Caldo Leite Peptonizado (LP) e o último, contendo 100 mL caldo MRS, todos em triplicata, com variação no pH (6,5; 7; 7,5), para enriquecimento durante 4 dias à 28 ºC.
Para verificar qual meio de cultura possuía, em sua composição, os nutrientes que favoreciam o crescimento das 3 cepas selecionadas, testes de difusão em poços foram realizados a cada 24 horas (24, 48, 72, 96). Cerca de 2000 μL do sobrenadante foram filtrados em membranas de nitrocelulose (0,22 µm). Posteriormente, 108 células do patógeno V. parahaemolyticus foram inoculados com um swab em placas de ANS e 150 μL dos caldos filtrados foram adicionados aos poços (triplicata) em placas de Petri e foram incubadas à 32 ºC durante 24 horas. Após o período de incubação, as zonas de inibição foram mensuradas.
4.3 CARACTERIZAÇÃO DAS BACTÉRIAS COM POTENCIAL PROBIÓTICO
4.3.1 Morfologia
As cepas que obtiveram melhores resultados no controle do patógeno, in vitro, foram caracterizadas morfologicamente, de acordo com sua coloração, formato da borda, tamanho e textura das colônias, com o auxílio da lupa (Phoenix Luferco, modelo CP 600 Plus), para que pudessem ser comparadas posteriormente com as cepas bacterianas encontradas nos camarões e em seus intestinos, além das encontradas na água do cultivo.
4.3.2 Testes bioquímicos
Os testes bioquímicos foram realizados a partir da inoculação das cepas com potencial probiótico em meios de cultura: Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI), para verificar se há utilização de glicose, sacarose, produção de gás e produção de sulfeto de hidrogênio; Ágar Citrato de Simmons (CIT), para verificar a utilização de citrato como fonte de carbono; Ágar Lisina Ferro (LIA), descarboxilação ou desaminação da lisina, com formação de ácido sulfídric; Ágar Fenilalanina (FENIL) para verificar a presença da
enzima fenilalanina desaminase; e Ágar Manitol, para verificar a degradação de Manitol com formação de ácido. Além disso, foi realizado o teste de catalase, adicionando peróxido de oxigênio sobre as cepas, após esfregaço em lâmina, com a observação da atividade enzimática a partir da formação, ou não, de gás.
4.3.3 Coloração de Gram
Do crescimento das cepas antagonistas com melhores resultados in vitro, foram feitos esfregaços em lâminas, seguindo-se sua fixação por calor, com o auxílio de uma lamparina, e coloração de Gram, que consistiu nas seguintes etapas: adição de cristal violeta por 2 minutos; adição de lugol por 2 minutos; lavagem com uma mistura de álcool+ acetona; lavagem com água destilada corrente; adição de safranina por 1 minuto; lavagem com água destilada corrente; e secagem. As lâminas adicionadas de uma gota de óleo de imersão foram examinadas em microscópio óptico (Leica – modelo DM500) no aumento de 1000 x.
4.4 ESTOCAGEM E REATIVAÇÃO DAS BACTÉRIAS COM POTENCIAL PROBIÓTICO
As bactérias que obtiveram resultados positivos no controle de V. parahaemolyticus foram mantidas em glicerol (20 %), a -80 ºC (Ultrafreezer ColdLab – CL580-86V). A reativação das antagonistas foi realizada em placas de Petri contendo meio de cultura AN e incubadas a 28 ºC por 24 horas. As culturas reativadas foram mantidas a 4 ºC com repiques periódicos.
4.5 PREPARO DAS RAÇÕES
A ração comercial (INVE O.range) foi suplementada a partir da aspersão de 200 mL/Kg com 108 ufc/mL das culturas bacterianas com potencial probiótico, diluídas em meio de cultura LP (pH= 7,5). A dieta denominada controle negativo foi aspergida apenas com o meio de cultura LP (pH=7,5) estéril, sem a adição de bactérias. Uma dieta comparativa foi aspergida com probiótico industrial diluída em meio de cultura LP (pH=7,5) apenas.
Todas as dietas foram hermeticamente fechadas e incubadas em estufa 28 ºC durante 24 horas para que ocorresse o crescimento bacteriano.
Após esse período, a ração foi transferida para 35 ºC, para secagem, durante 24 ºC e conservada sob refrigeração a 4 ºC durante todo o experimento. A ração foi produzida semanalmente (Figura 3).
Figura 3: Ração ofertada no cultivo experimental dos camarões
Fonte: Autora
A concentração de bactérias com potencial probiótico viáveis na dieta, foi estimada a cada 7 dias, até o final do experimento. Para isso, foram pesados e triturados 1 grama de cada dieta em SSE, diluída serialmente, e 50 μL das diluições 10-3 e 10-5 de cada dieta foram plaqueados em meio de cultura AN e incubadas por 24 horas a 28 °C, para contagem de bactérias totais e probióticas (Figura 4).
Figura 4: Bactérias viáveis na ração suplementada com a bactéria MB
Fonte: Autora
4.6 ENSAIOS IN VIVO
Os juvenis de camarão-da-Malásia, foram mantidos em tanques contendo 60 L de água previamente desclorada. Utilizou-se o sistema RAS (Sistema de Recirculação),
individual para cada caixa, composto por um filtro mecânico, com a função de reter partículas sólidas, tais como, restos de ração e fezes e um filtro biológico, que foi confeccionado com garrafas pet, contendo cascalho com o objetivo de eliminar a amônia do sistema (Figura 5).
Figura 5: Sistema de recirculação utilizado no experimento
Fonte: Autora
A água do tratamento foi mantida sob aeração constante e diariamente foram medidos: temperatura, utilizando um termômetro eletrônico; pH, utilizando um pHmetro (Tecnopon – Mpa 210); e amônia total e tóxica, utilizando o kit colorimétrico, ambos da marca LabconTest. Os resíduos do fundo dos tanques foram sifonados diariamente, durante o período manhã, antes da primeira alimentação. Após a realização da biometria, os camarões foram distribuídos em 15 caixas, com volume total de 60 L cada, e aclimatados por 3 dias. O experimento consistiu em 5 tratamentos, onde cada tratamento foi formado por 3 réplicas delineadas ao acaso e cada caixa acomodava 40 camarões juvenis. Durante o período experimental, foram observados a ocorrência de mortalidade e os valores de qualidade de água. Foram arraçoados 3% do peso total dos camarões de cada caixa duas vezes ao dia, sendo que 1,5 % de ração foi administrado no período da manhã (09:00 horas) e os outros 1,5% ao final do dia (17:00 horas). A fase de alimentação com a dieta experimental teve duração de 55 dias nas imediações do LANPOA (Laboratório de Nutrição e Propagação de Organismos
Aquáticos), em área externa, para verificar a colonização intestinal pelas bactérias com potencial probiótico.
4.7 AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DE COLONIZAÇÃO DAS CEPAS PROBIÓTICAS A cada 7 dias, 5 camarões de cada caixa foram submetidos à biometria e remoção de seus intestinos (Figura 6). Os camarões foram macerados em SSE (1:9) e diluídos até 10-3. 50 µL dessa diluição foram plaqueados em placas de Petri contendo meio de cultura AN, para contagem de bactérias totais e com potencial probiótico, e 50 µL da diluição 10-1 foram plaqueados em placas de Petri contendo meio de cultura TCBS, para contagem de Vibrio sp.
Para os intestinos, os mesmos foram macerados em 100 µL de SSE e 50 µL da solução foram plaqueados em meio de cultura AN, para verificar a quantidade de colônias totais e probióticas e 50 µL foram plaqueados em meio de cultura TCBS, para a contagem de
Vibrio sp.
Figura 6: Remoção de intestino de camarão da Malásia para análise de colonização bacteriana
Fonte: Autora
Além disso, a água do cultivo também foi plaqueada em meios de cultura AN e TCBS com a mesma finalidade que os procedimentos anteriores. As placas contendo meio de cultura AN foram incubadas a 28 ºC ee as placas contendo meio de cultua TCBS, a 35 ºC, ambas durante 24 horas. Após o tempo de incubação, as colônias obtidas foram contadas e isoladas para os testes bioquímicos de conrfirmação.
4.8 INOCULAÇÃO DO PATÓGENO NA ÁGUA DE CULTIVO
Um sistema experimental de cultivo, contendo 5 caixas de polietileno com volume total de 70 L, foi montado no Laboratório de Ecologia Microbiana (LEM) (Figura 7). Foram acondicionados 15 indivíduos em cada caixa. Aproximadamente 106 ufc/mL do patógeno foram adicionados na água dos tratamentos. O sistema foi mantido durante sete dias, sob aeração constante e monitoramento diário da qualidade de água e mortalidade.
Figura 7: Sistema de cultivo para infecção experimental
Fonte: Autora
Ao final dos sete dias, os camarões foram submetidos a retirada dos tratos intestinais, maceração em SSE e diluição e plaqueamento como descrito no item 4.1.1. O plaquemanto foi realizado em Placas de Petri contendo meio de cultura AN, para o plaqueamento dos camarões macerados e dos intestinos (contagem de bactérias totais e probióticas), e meio TCBS para plaqueamento dos intestinos e da água do sistema (contagem de bactérias do gênero Vibrio). O experimento, in vivo, teve duração total de 65 dias.
4.9 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados foram analisados utilizando-se o programa de análises estatísticas Sisvar 5.3 (Ferreira, 2010), desenvolvido pela Universidade Federal de Lavras—UFLA. Foram analisadas a normalidade dos dados e os resultados foram submetidos à análise de variância, seguido de teste de Tukey em nível de 5% de significância.
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 ISOLAMENTO DE CEPAS COM POTENCIAL PROBIÓTICO
Vários estudos citam bactérias autóctones como sendo as de melhor potencial probiótico, mas alguns trabalhos justificam a necessidade de buscar esse potencial em outros ecossistemas. Neste trabalho, a prospecção de bactérias com potencial para serem utilizadas como probióticos no cultivo de camarões foi realizada em intestinos de camarões da Malásia e na rizosfera de plantas típicas de Manguezal. A partir do solo rizosférico foram isoladas 105 cepas morfologicamente distintas. Dos intestinos de camarões foram obtidas 56 bactérias.
Carvalho (2016) isolou 6 cepas, com potencial probiótico, dos intestinos de camarões selvagens da espécie Farfantepenaeus subtilis, e as identificou como pertencentes ao gênero Bacillus, para utilizá-las no controle de Vibrio parahaemolyticus.
O estudo de Villaseñor et al (2011) isolaram cepas de Bacillus spp. do intestino de camarões da espécie Litopenaeus vannamei para sua avaliação no controle de bactérias do gênero Vibrio.
O estudo de Jatobá et al (2008), isolaram seis cepas do trato intestinal, da tilápia do nilo (Oreochromis niloticus) para serem utilizadas como probiótico, a partir da suplementação de ração, para ser utilizada no cultivo da própria espécie.
5.2 TESTES DE INIBIÇÃO CONTRA Vibrio parahaemolyticus
No total, 161 cepas foram submetidas ao teste de produção de antimicrobianos por inibição in vitro, realizado frente ao patógeno Vibrio parahaemolyticus. Para as cepas rizosféricas, quatro obtiveram resultados positivos e para as bactérias autóctones do camarão, seis obtiveram resultados satisfatórios no controle do patógeno (Tabela 1). Das cepas que apresentaram resultados positivos no controle do patógeno in vitro, a cepa P1A-B, isolada do solo e duas bactérias autóctones (MG e MB) foram selecionadas para serem utilizadas no experimento in vivo.
Na Figura 8 podemos observar a diferença entre uma cepa com potencial antimicrobiano (B) e uma que obteve resultado negativo no controle do patógeno (A).
Tabela 1: Atividade antimicrobiana de bactérias rizosféricas e autóctones contra o patógeno V. parahaemolyticus
Bactérias rizosféricas
Raio dos halos de inibição (cm) V. parahaemolyticus P1A-B 0,4 P4D 0,2 3D 0,2 P3E 0,4 Bactérias autóctones MB 0,6 MI 0,6 1I 0,2 7A 0,4 7D 0,2 MG 0,4 Fonte: Autora
Nos estudos de Jatobá et al. (2008), das seis cepas isoladas, duas apresentaram resultados positivos no controle de Vibrio sp. Enterococcus e E. coli, no cultivo de Tilápia do Nilo.
Figura 8: Atividade antimicrobiana in vitro
Fonte: Autora
Onde: (A) Bactéria não produtora de antimicrobiano e (B) bactéria com atividade antimicrobiana contra V. parahaemolyticus
5.3 ATIVIDADE HEMOLÍTICA DAS CEPAS COM POTENCIAL PROBIÓTICO
Para o teste de atividade hemolítica, observou-se que, após crescimento das cepas, algumas apresentaram resultado positivo, sendo consideradas hemolíticas: as cepas MI e 7A causaram o rompimento das membranas plasmáticas das hemoglobinas presentes no meio de cultura, pela mudança de coloração. As demais cepas foram caracterizadas como Gama-hemolíticas, pois não apresentaram modificações no meio, como apresentado na Figura 9.
As cepas caracterizadas como Beta-hemolíticas possuem colônias no tom de marrom acompanhadas de halos de hemólise, as cepas Alfa-hemolíticas, colônias em tom de verde e as cepas Gama-hemolíticas, não demonstram nenhuma reação no meio de culltura, apenas crescimento. A partir do resultado do teste de inibição apresentado na Tabela 1, do item 5.2, nota-se que apesar das bactérias MI e 7A apresentarem halos de inibiçao relativamente maiores que as demais cepas, frente ao patógeno V.
parahaemolyticus, não foi possível utilizá-las devido ao resultado obtido no teste de
hemólise, por serem classificadas como Alfa e Beta hemolíticas, respectivamente.
Figura 9: Teste de hemólise em Ágar Sangue (A) Alfa-hemolícia, (B) Beta-hemolítica e (C) Gama- hemolítica
Fonte: Autora
5.4 TOLERÂNCIA À SAIS BILIARES E pH ÁCIDO
Tanto o teste de resistência à bile, quanto o da resitência a acidez, tem como objetivo, a verificação da capacidade da bactéria sobreviver no trato gastrointestinal do indivíduo. Todas as bactérias apresentaram ótimo crescimento em pH ácido, formando biofilme em toda a placa, não permitindo a contagem. Frente aos sais biliares, os resultados mostraram-se igualmente positivos, todas as bactérias apresentaram taxa de sobrevivência acima de 50%. Com isso, afirmamos que as bactérias resistem à passagem pelo trato digestório dos camarões e podem chegar até o intestino.
5.5 AUTOAGREGAÇÃO
Esse teste é utilizado para estimar a capacidade de adesão da bactéria ao trato intestinal do hospedeiro. Bactérias agregadas podem formar um biofilme na parede intestinal do indivíduo fazendo com que as chances de serem expulsas do trato seja menor e, assim, podendo realizar suas atividades metabólicas, impedindo, também, que patógenos colonizem o trato intestinal dos camarões. Ao se alojarem nas paredes do intestino, as bactérias probióticas competem com os patógenos por espaço e também inibem seu desenvolvimento por meio da produção de metabólitos secundários com atividade antimicrobiana.
Figura 10: Taxa de agregação das cepas com potencial probiótico
Fonte: Autora
Conforme a figura 10, todas as cepas bacterianas apresentaram capacidade de autoagregação, quando comparadas às formas não viáveis. A capacidade de autoagregação da cepa P1A-B foi maior que das demais cepas, mas todas se assemelham ao controle positivo, que foi realizado utilizando uma cepa probiótica comercial.
Estudos realizados por outros autores demonstram uma capacidade de agregação de cepas com potencial probiótico próximos aos encontrados nesse trabalho. Luz (2017) registrou valores de agregação próximos a 5% para a maioria das bactérias isoladas. Grześkowiak et al. (2012) apresentaram resultados variando de 5,4% a 15%.
5.6 TESTES BIOQUÍMICOS
Após a realização dos testes bioquímicos, obteve-se o resultado descrito na Tabela 2. Esse teste tem como objetivo, colaborar na identificação de grupos e espécies de micro-organismos, a partir das transformações ocorridas nos meios utilizados como substratos, sendo observados a modificação da coloração do meio de cultura, turvação e tipo de crescimento, evedenciando a ação das enzimas produzidas por cada bactéria (EMBRAPA, 1999).
Tabela 2: Descrição dos testes bioquímicos realizados
Bactéria Testes bioquímicos
Citrato LIA TSI Fenil Catalase
P1A-B + Rampa Não - +
e fundo alterou a alcalino, coloração sem H2S do meio MG + Rampa Base - + e fundo ácida e alcalino, rampa sem alcalina, H2S sem gás e com H2S MB - Rampa Rampa e - + e fundo fundo alcalino, alcalino, sem com gás e H2S sem H2S Fonte: Autora
Para o teste bioquímico em meio de cultura manitol, nenhuma das cepas obtiveram crescimento, mostrando que as cepas não utilizam os nutrientes do meio de cultura para seu desenvolvimento.
5.7 COLORAÇÃO DE GRAM
Após submissão aos procedimentos para coloração de Gram, onde as cepas MB e P1A-B foram classificadas com cepas do tipo Gram-negativas e as cepas MG e Controle positivo (C+) do tipo Gram-positivas.
5.8 PADRONIZAÇÃO DO MEIO DE CULTURA PARA ASPERSÃO DA RAÇÃO
As bactérias selecionadas após o teste de inibição por inoculação central, foram utilizadas para a seleção do meio de cultura utilizado para aspersão da ração nos 5 tratamentos. Após 96 horas de testes, o meio de cultura escolhido foi o LP com Ph=7,5. Esse meio, nessas condições, foi escolhido devido a seus nutrientes e por colaborar na produção de compostos antimicrobianos fazendo com que o crescimento do patógeno fosse inibido.
5.9 CARACTERIZAÇÃO DAS BACTÉRIAS UTILIZADAS NOS TRATAMENTOS Foi realizada a caracterização, somente das cepas que foram selecionadas e utilizadas ao longo do experimento, sendo aspergidas nas rações (Tabela 3).
Tabela 3: Caracterização visual das colônias com potencial probiótico
Bactérias Características morfológicas
Coloração Borda Formato da colônia Textura
MB Branca Transparente Irregular Lisa
MG Bege claro Bege claro Irregular Lisa
P1A-B Branca Branca Arredondada Lisa
Fonte: Autora
5.10 ENSAIOS, IN VIVO
5.10.1 Biometria (Teste de colonização pelo probiótico)
A biometria total foi realizada no início do experimento in vivo, e a cada 7 dias foram realizadas biometrias parciais, com 5 camarões de cada tratamento.
Tabela 4: Peso dos camarões (g) durante o experimento de colonização probiótica.
t (dias) Tratamentos C- C+ P1A-B MB MG 0 0,1350,08 a 0,1520,13ab 0,1500,08ab 0,1700,09b 0,1470,07 ab 7 0,1430,07 a 0,1330,05 a 0,1240,04 a 0,2030,12 b 0,1780,11 b 14 0,1510,08 a 0,1810,11ab 0,1700,08ab 0,2460,13 b 0,1490,06 c 21 0,2340,11 a 0,2180,06ab 0,2320,10abc 0,2670,13bc 0,2780,21 c 28 0,2610,10 a 0,2890,10ab 0,3230,17 b 0,3350,21 b 0,3220,12 b 35 0,2500,08 a 0,2870,11 b 0,1600,13 b 0,2650,14bc 0,3090,15 c Fonte: Autora
O peso dos camarões está descrito na tabela 4, através da média seguida do desvio padrão. As letras diferentes em cada linha mostram resultado significativo pelo teste de Tukey a 5%. De acordo com a tabela 4, observamos que no início do experimento, o peso dos indivíduos submetidos ao tratamento com a cepa MB já eram maiores que os demais, demontrando que esse difere do controle negativo, mas não difere dos demais tratamentos. No sétimo dia, podemos observar que os tratamentos MG e MB diferem dos demais, mas não diferem entre eles.
