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BCL 0308-15
Bioquímica: estrutura, propriedade e
funções de biomoléculas
APOSTILA DE LABORATÓRIO
2018.1
Coordenadora: Profa. Dra. Ana Carolina Santos de Souza Galvão Autores: Núcleo Docente da UFABC
2 ÍNDICE
CRONOGRAMA ... 3
SEGURANÇA E NORMAS DE TRABALHO NO LABORATÓRIO ... 4
BIBLIOGRAFIA ... 5
CRITÉRIOS DE AVALIAÇÃO ... 6
PRÁTICA 1: Propriedades da água, solubilidade e uso de micropipetas ... 8
PRÁTICA 2: Aminoácidos: estudo da estrutura e propriedades ácido-base ... 15
PRÁTICA 3: Espectrofotometria e dosagem de proteínas pelo método de Biureto ... 22
PRÁTICA 4: Atividade enzimática e desnaturação de proteínas ... 27
PRÁTICA 5: Extração e caracterização de lipídios ... 31
PRÁTICA 6: Carboidratos: estrutura e propriedades ... 41
PRÁTICA 7: Extração de DNA vegetal ... 48
Coordenadora
Profa. Dra. Ana Carolina Santos de Souza Galvão ana.galvao@ufabc.edu.br
3 CRONOGRAMA
*Somente em caso de falta justificada (Resolução ConsEPE 181). O(A) docente de laboratório reservará o(s) local(is) de aplicação da(s) prova e informará a(s) turma(s) com antecedência.
As aulas práticas não serão repostas em caso de falta.
SEMANA ATIVIDADES
1 (20/2) Apresentação da disciplina, dos critérios e das datas de avaliação e das disposições gerais do curso experimental.
2 (27/2) PRÁTICA 1: Propriedades da água, solubilidade e uso de micropipetas.
3 (06/3) PRÁTICA 2: Aminoácidos: estudo da estrutura e propriedades ácido-base.
4 (13/3) PRÁTICA 3: Espectrofotometria e dosagem de proteínas pelo método de Biureto.
5 (20/3) Discussão dos experimentos e resultados experimentais.
6 (27/3) 1ª Avaliação de laboratório. Poderá ser realizada em sala de aula a ser
reservada pelo(a) docente de laboratório da turma.
7 (03/4) PRÁTICA 4: Atividade enzimática e desnaturação de proteínas.
8 (10/4) PRÁTICA 5: Extração e caracterização de lipídios.
9 (17/4) PRÁTICA 6: Carboidratos: estrutura e propriedades.
10 (24/4) PRÁTICA 7: Extração de DNA vegetal.
11 (01/5) Feriado. Reposição na 6ª feira 18/05.
12 (08/5) 2ª Avaliação de laboratório. Poderá ser realizada em sala de aula a ser
reservada pelo(a) docente de laboratório da turma.
18/5
Reposição do feriado
*Avaliação substitutiva de laboratório (prova escrita)
4 SEGURANÇA E NORMAS DE TRABALHO NO LABORATÓRIO
Leia integralmente o Guia de Segurança, Experimentos e Atividades (3ªed.) da disciplina de Base Experimental das Ciências Naturais. Destacam-se:
Segurança
Conheça a localização dos chuveiros de emergência, extintores e lavadores de olhos. Use sempre avental, mantenha os cabelos presos e use calçados fechados, mesmo na
aula reservada para o preparo da prática seguinte; Os óculos são obrigatórios!
Usar a capela sempre que possível;
Nunca pipete com a boca, não cheire, nem experimente os produtos químicos; Comes e bebes, só fora do laboratório;
Consulte o professor cada vez que notar algo anormal ou imprevisto; Comunique qualquer acidente, por menor que seja ao professor; Se utilizar chama, mantenha longe de qualquer reagente!
Nunca brinque no laboratório;
Evite o contato de qualquer substância com a pele;
Nunca aqueça o tubo de ensaio, apontando a extremidade aberta para um colega ou para si mesmo.
Cuidado ao aquecer vidro em chama: o vidro quente tem exatamente a mesma aparência do frio.
Procedimentos gerais
Siga rigorosamente as instruções fornecidas pelo professor. Pesquise sempre a toxicidade dos reagentes antes das práticas. Nunca abra um recipiente de reagente antes de ler o rótulo.
Evite contaminar reagentes, nunca retorne o excedente aos frascos de origem. Adicione sempre ácidos à água, nunca água a ácidos.
Não coloque nenhum material sólido dentro da pia ou nos ralos.
Não coloque resíduos de solventes na pia ou ralo; há recipientes apropriados para isso. Não atire vidro quebrado no lixo comum. Deve haver um recipiente específico para
fragmentos de vidro.
Verifique se as conexões e ligações estão seguras antes de iniciar uma reação/destilação Ao terminar a prática, lave o material utilizado e deixe-o em ordem.
5 BIBLIOGRAFIA
Básica
LEHNINGER, A.L.; NELSON, D.L.; COX, M.M. Princípios de bioquímica. 4ed. SP: Sarvier, 2006. 1202 p.
VOET, D.; VOET, J.G. Bioquímica. 3 ed. Porto Alegre:Artmed, 2006, 1596 p.
BERG, J. M.; TYMOCZKO, J.L; STRYER, L. Bioquímica, 5 ed., Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2004.
KOOLMAN, J.; ROEHM, K. H. Color Atlas of Biochemistry 2012, 3rd Edition ISBN: 9783131003737
Complementar
BERG, J.M.; TYMOCZKO, J.L.; STRYER, L. Biochemistry. 6.ed. New Jersey: John Wiley, 2006. 1026 p.
MARZZOCO, A.; TORRES, B.B. Bioquímica Básica. 3 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2007. 386 p.
CHAMPE, P.C; Harvey, R.A.; Ferrier, D.R. Bioquimica ilustrada, 3 ed., Porto Alegre: Artmed, 2006. 533 p.
DEVLIN, T.M. Textbook of biochemistry with clinical correlations, 6.ed., New Jersey: WileyLiss, 2006. 1208p.
FERREIRA, C.P.; JARROUGE, M.G.; MARTIN, N.F. Bioquímica Básica. 9 ed. SP: MNP Ltda, 2010. 356 p.
GARRETT, R.H.; GRISHAM, C.M. Biochemistry. 3.ed. Belmont: Thomson, 2005. 1086 p. (International Student edition).
KAMOUN, P.; LAVOINNE, A.; VERNEUIL, H. Bioquímica e biologia molecular. RJ: Guanabara Koogan, 2006. 420 p.
VOET, D.; VOET, J.G. Biochemistry. 3.ed. New Jersey: John Wiley, 2003. 1590 p.
VOET, D.; VOET, J.G.; Pratt, C.W. Fundamentals of biochemistry: life at the molecular level. 3ed., 2008. 1099 p.
Informações técnicas (propriedades físicas, toxicidade, preço, nomenclatura)
1. CRC Handbook of Chemistry and Physics 2. Sigma-Aldrich - www.sigmaaldrich.com 3. IUPAC Gold Book - http://goldbook.iupac.org/ 4. Merck Index
Bases de Dados/Referências
1. The Web os Science (www.isiknowledge.com)
6 CRITÉRIOS DE AVALIAÇÃO
Os conceitos a serem atribuídos ao longo da disciplina estarão de acordo com os critérios contidos no Sistema de Avaliação do Processo de Ensino e Aprendizagem, parte do Projeto Pedagógico do BC&T.
Conceito Desempenho
A Desempenho excepcional, demonstrando excelente compreensão da disciplina e do uso do
conteúdo.
B Bom desempenho, demonstrando boa capacidade de uso dos conceitos da disciplina.
C
Desempenho mínimo satisfatório, demonstrando capacidade de uso adequado dos conceitos da disciplina, habilidade para enfrentar problemas relativamente simples e prosseguir em estudos avançados.
D
Aproveitamento mínimo não satisfatório dos conceitos da disciplina, com familiaridade parcial do assunto e alguma capacidade para resolver problemas simples, mas demonstrando deficiências que exigem trabalho adicional para prosseguir em estudos avançados. Nesse caso, o aluno é aprovado na expectativa de que obtenha um conceito melhor em outra disciplina, para compensar o conceito D no cálculo do CR. Havendo vaga, o aluno poderá cursar esta disciplina novamente.
F Reprovado. A disciplina deve ser cursada novamente para obtenção de crédito.
O Reprovado por falta. A disciplina deve ser cursada novamente para obtenção de crédito.
Determinação do conceito final na disciplina
A determinação do conceito final na disciplina envolverá a relação entre os desempenhos obtidos nas partes prática (Lab) e teórica (Teo), conforme tabelas abaixo. Por exemplo,
- caso um aluno obtenha conceito “A” na primeira avaliação no laboratório (coluna: Lab P1) e conceito “C” na primeira avaliação da teoria (linha: Teoria P1), terá conceito parcial 1 (CP1) “B” (tabela 1).
- caso esse mesmo aluno obtenha conceito “A” na segunda avaliação no laboratório (coluna: Lab P1) e conceito “B” na segunda avaliação da teoria (linha: Teoria P1), terá conceito parcial 2 (CP2) “A” (tabela 2). - na tabela 3 serão relacionados os conceitos parciais 1 (CP1) e 2 (CP2) na determinação do conceito final do aluno. Nesse exemplo: CP1 = B e CP2 = A. Logo, conceito final = A (tabela 3).
Tabela 1: Conceito parcial 1 (CP1) – primeira avaliação de teoria e primeira avaliação de laboratório:
Teoria P1 Lab P1 Desempenho A B C D F A A A B C D B A B C C F C B B C D F D B C C D F F C D F F F
Tabela 2: Conceito parcial 2 (CP2) – segunda avaliação de teoria e segunda avaliação de laboratório:
Teoria P2 Lab P2 Desempenho A B C D F A A A B C D B A B C C F C B B C D F D B C C D F F C D F F F
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Tabela 3: Determinação do Conceito Final a partir dos conceitos parciais 1 (CP1) e 2 (CP2):
CP2 CP1 Desempenho A B C D F A A B B C D B A B C C D C B B C D F D B C C D F F C D F F F
Atenção: para cada avaliação não realizada será atribuído conceito “F”. Em caso de falta justificada, o
aluno realizará uma prova escrita substitutiva com o mesmo conteúdo da avaliação não realizada (Resolução ConsEPE UFABC n. 181, de 23/10/14).
4.2 Para ser considerado aprovado na disciplina, o aluno deverá cumprir, simultaneamente, as seguintes condições:
1) ter comparecido, no mínimo, a 75% do total das aulas da disciplina (teoria e laboratório); 2) obter, no mínimo, o conceito final “D” na disciplina.
O(A) docente de teoria e o(a) docente de laboratório da respectiva turma informarão aos alunos na primeira aula quais serão as datas das provas que aplicarão.
4.4 Recuperação
A avaliação de recuperação (exame) será uma prova escrita a ser realizada em data, local e horário a serem combinados com o(a) professor(a) da teoria (Resolução ConsEPE n.182 a qual regulamenta a
aplicação de mecanismos de recuperação nos cursos de graduação da UFABC).
A avaliação de recuperação (exame) poderá envolver todos os conhecimentos explorados na disciplina (aulas teóricas e de laboratório) e é destinado ao discente que for aprovado com Conceito Final D ou reprovado com Conceito Final F. O(A) aluno(a) que obtiver conceito final D e tiver interesse em realizar o exame de
recuperação deverá informar o(a) professor(a) com antecedência.
A determinação do novo conceito final na disciplina envolverá a relação entre os desempenhos obtidos na avaliação de recuperação (exame) e o conceito final obtido na disciplina durante o quadrimestre (CF), conforme tabela abaixo (tabela 4).
Tabela 4: Determinação do Novo Conceito Final a partir do conceito final obtido durante o quadrimestre (CF) e o conceito obtido na avaliação de recuperação (Exame):
Exame
CF Desempenho A B C D F
D B B C D F
8 Prática 1: Propriedades da água, solubilidade e uso de micropipetas.
Atenção:
Não recarregar o celular no laboratório. Não retirar aparelhos da tomada. Há micropipetas que requerem apertar botão para acertar o volume (figura abaixo).
Em caso de dúvidas, consultar o(a) professor(a) e/ou os técnicos no laboratório.
Introdução
A transferência de volume exato de líquidos é fundamental para vasta maioria dos experimentos nas áreas de bioquímica, biologia molecular, química, etc. De uma maneira geral, o conhecimento sobre o pipetamento de líquidos, a compreensão de seus limites de precisão, bem como o estudo de sua importância na execução reprodutível de experimentos justifica a relevância e abordagem deste tema nesta aula.
Fundamentação Teórica
Pipetas automáticas
Micropipetas são aparelhos designados para a transferência de pequenos volumes (entre 0,2 a 5000 µl) com máxima precisão. A construção das micropipetas consiste em um corpo anatômico de polipropileno (autoclavável) equipado com um botão dispensador e um ejetor de ponteiras no topo, um indicador de volume na lateral e uma haste para encaixe de ponteiras descartáveis na parte inferior. Existem vários tipos de micropipetas:
pipetas monocanal ou multicanal
pipetas com volume fixo ou com volume variável
9 Funcionamento de micropipetas com deslocamento de ar
Este tipo de pipetas é o mais utilizado, por ser muito versátil. O botão dispensador é ligado a um pistão dentro da pipeta. Ao pressionar o botão, o pistão se move deslocando o ar que por sua vez desloca um líquido para dentro ou para fora da ponteira. A trajetória de botão dispensador tem dois estágios que podem ser percebidos por diferença da resistência de molas que retornam o botão dispensador para posição de repouso após ele ser liberado. Os dois estágios permitem fazer a pipetagem usando duas técnicas diferentes: a pipetagem direta (esgotamento total) ou a pipetagem
reversa (esgotamento parcial). A escolha da técnica depende das características do líquido a ser
pipetado (viscosidade, volatilidade, hidrofilicidade) e do processo da pipetagem (pipetagem única, titulante ou repetida).
A precisão da pipetagem é influenciada por vários fatores:
- encaixe da ponteira na haste: antes de pipetar, a compatibilidade do tipo de ponteira (fabricante) com o tipo de haste deve ser verificada para evitar passagem de ar no encaixe. A ponteira deve ser encaixada por movimento circular que assegura boa vedação entre a ponteira e a haste, além de maior durabilidade pelo uso correto da haste. Por estas razões, o encaixe da ponteira por batimentos repetidos de haste na ponteira deve ser evitado.
- ajuste de volume (pipetas com volume variável): cada indicador de volume tem uma pequena folga. Assim, para a maior precisão, o volume deve ser ajustado sempre e somente de um lado (de preferência, no sentido horário). Quando o ajuste ultrapassa o volume desejado, recomenda-se voltar <1/3 da rotação e ajustar o volume de novo. Para ajustar corretamente o volume, deve ser considerado o erro paralático; o eixo da visão tem que ser perpendicular à escala do indicador do volume.
Figura 1: A - Pipeta de Deslocamento Positivo; B - Pipeta Deslocamento de Ar (monocanal) e C - Pipeta Deslocamento
de Ar (multicanal). botão dispensador →
botão dispensador →
haste → Indicador do volume →
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- a porção imersa no líquido: por causa da compressibilidade do ar, existe uma medida ideal da imersão da ponta da ponteira que minimiza tais imprecisões (Tabela 1).
- tensão lateral do líquido: os líquidos podem molhar a parede da ponteira, o que pode resultar em perdas de volume ejetado (parte dele fica nas paredes). A minimização dessa imprecisão consiste em aspiração e ejeção de líquido sem efetuar a transferência (no mesmo recipiente). Assim, as paredes já estarão molhadas e o volume da 2a aspiração será transferido por completo.
- volatilidade do líquido: para diminuir gotejamento do líquido durante a transferência e quando a natureza do líquido permite (não corrosivo, não infectante ou não radioativo), o líquido pode ser aspirado/ejetado no mesmo recipiente várias vezes até o ar em cima do líquido ser trocado completamente por vapor do líquido.
Pipetagem direta (esgotamento total)
É a técnica de pipetagem mais conhecida. Utiliza-se para transferir volumes únicos de líquidos aquosos ou de líquidos não voláteis, não viscosos e não espumantes. O princípio de transferência de líquido é mostrado na Figura 2:
Figura 2: Esquema de procedimento usado por a técnica de pipetagem direta. Linhas pontilhadas representam
as posições de botão de esgotamento: Repouso (linha superior), 1o estágio (linha no meio) e 2o estágio (linha
inferior).
11 Pipetagem reversa (esgotamento parcial)
É uma técnica de pipetagem pouco conhecida. Recomenda-se fortemente o uso desta técnica em casos de pipetagem de líquidos viscosos, voláteis e espumantes. Uso da pipetagem reversa em casos de pipetagem repetida de um volume do mesmo líquido (por exemplo, em dosagens de proteína – amostra e curva padrão) pode melhorar a confiabilidade do método até 10 vezes.
A transferência de líquidos por esta técnica resulta em um volume que sobra na ponteira após da transferência que pode ser uma desvantagem caso de líquidos caros ou de volume limitado. Porém, a grande vantagem consiste em ejeção de líquido viscoso ou espumante, onde é praticamente impossível realizar o esgotamento total (da técnica direta). Caso de líquidos voláteis, a transferência do líquido pode ser acompanhada por gotejamento do líquido fora da ponteira (vapor do líquido volátil expande o ar dentro da pipeta). A técnica da pipetagem reversa garante um “volume de reserva” na ponteira que permite a transferência de volume correto até de líquido bastante volátil. O princípio de transferência de líquido é mostrado na Figura 3:
Teste de calibração
Cada micropipeta é calibrada para o valor indicado (valor teórico) corresponder ao valor efetivamente medido (valor real) na faixa da precisão de micropipeta (erro ≤ 2% para pipetas P10, P20, P100, P200, P1000 e ≤ 5% para pipetas P2 e P5000). Porém, com tempo e uso prolongado, os componentes mecânicos são sujeitos ao desgaste ou disfunção resultante de uso inadequado.
A medição de volume é um passo importante em qualquer laboratório porque um pequeno erro de pipetagem pode causar um erro significativo no resultado obtido. Assim, é essencial a verificação
da calibração das micropipetas nas mesmas condições em que são utilizadas no laboratório. Esta
Figura 3: Esquema de procedimento usado por a técnica de pipetagem reversa. Linhas pontilhadas representam
as posições de botão de esgotamento: Repouso (linha superior), 1o estágio (linha no meio) e 2o estágio (linha inferior)
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verificação consiste essencialmente em um conjunto de medições usadas para restabelecer/atualizar a relação entre o valor indicado e o valor efetivamente medido.
Normalmente, a verificação deve ser realizada nas seguintes situações: - após uma manutenção e/ou troca de peças;
- após de um período de uso (~ 1 ano);
- quando a pipeta sofre um dano: queda, contaminação da haste, etc; - de acordo com orientações do fabricante;
Empregam-se geralmente três métodos de calibração de pipetas automáticas:
1. Método gravimétrico: uma série de medições do peso de líquido pipetado (considerando a
temperatura, umidade, pressão atmosférica e coeficiente de expansão) posteriormente convertida em volume. Este método é realizado por laboratórios de
calibração especializados.
2. Método titrimétrico: uma série de medições de quantidades de NaOH com concentração conhecida em volumes pipetados (sem interferência da temperatura, umidade ou pressão atmosférica). Exige uma padronização das soluções envolvidas.
3. Método fotométrico: uma série de medições fotométricas de diferentes diluições de um cromóforo com concentração conhecida. Este método pode ser facilmente implantado no laboratório.
Para a análise dos resultados da calibração, as séries de medições são convertidas para volume (valor efetivamente medido) e comparados com volumes ajustados no indicador da micropipeta (valores indicados). Calcula-se uma média (para mesmos volumes) ou regressão linear (para volumes diferentes) ± desvio padrão.
Parte 1: Uso e calibração de micropipetadores
Objetivos: aprender o modo de pipetagem direta (esgotamento total) no modo positivo, determinar
o limite de precisão de micropipetas e testar a sua calibração (volume real).
Materiais
- Água destilada - Ponteiras
- 1 béquer de 50 mL - Papel absorvente
- Balança de precisão de 1 mg (3 ou 4 casas decimais)
13 Procedimento
Utilizar a micropipeta de volume variável disponível para o seu grupo (P1000).
1. Colocar o béquer seco na balança e zerar (clicar em “tara”). Sem retirar o béquer da balança,
execute o item 2 (abaixo). Evite manusear o béquer durante a pesagem, pois os resíduos das mãos (gorduras, ceras, cosméticos) podem interferir na determinação da massa.
2. Pipetar água com volume máximo, 100%, (nominal) da micropipeta no modo positivo para o
béquer. Em seguida, anotar a massa de água numa tabela escrita no caderno de laboratório. Zerar a balança. Repetir esta etapa três vezes.
3. Repetir os itens 1 e 2 para água com 20%, 40%, 50%, 60% e 80% do volume máximo (nominal)
da micropipeta no modo positivo, ajustando o volume sempre no sentido horário.
Análise dos dados
1. Fazer uma tabela no caderno de laboratório contendo os valores de massa de cada pipetagem. 2. Expressar o valor médio do volume pipetado ± erro padrão. Comparar o volume real (massa da água) com volume ajustado na micropipeta.
Parte 2: Propriedades físico-químicas da água e formação de micelas
Objetivo: estudar as propriedades físico-químicas da água e a formação de micelas aquosas de SDS
(dodecil sulfato de sódio, C12H25SO4Na, representação abaixo) influenciadas pela força iônica do
meio. Estudar as interações intermoleculares e solubilidade.
Dodecil sulfato de sódio, C12H25SO4Na Materiais
- 7 tubos de ensaio de 20ml por grupo - Suporte para tubos
- 1 unidade de micropipeta automática de volume variável por grupo (P20, P200, P1000) - Ponteiras
- Papel absorvente - 2 béquer de 50ml
- NaCl (cloreto de sódio – M.M. 58,5 g/mol)
- Solução de SDS (dodecil sulfato de sódio / C12H25NaO4S , M.M. 288 g/mol ) a 40 mmol/L
- Solução de CaCl2 (cloreto de cálcio – M.M. 110,98 g/mol) 1 mol/L
- Água destilada - Agitador Vórtex
14 Procedimento
Cada grupo deverá preparar 5ml de solução 1M de NaCl (1mol/L). Num béquer de 50mL, adicionar a massa de NaCl calculada. No caderno, anotar a massa de NaCl realmente utilizada (pesada). Adicionar, com o uso de micropipeta, 5ml de água destilada no béquer. Colocar os respectivos volumes nos tubos de ensaio, conforme tabela a seguir, usando uma ponteira para cada solução.
Tubo de Ensaio Reagente Resposta Água Destilada Surfactante SDS Solução NaCl 1M Solução CaCl2 1M 1 2 ml (2000l) - - - ( ) 2 1925l 75l - - ( ) 3 1800l 200l - - ( ) 4 1575l 75l 350l - ( ) 5 1625l 200l 175l - ( ) 6 1575l 75l - 350l ( ) 7 1625l 200l - 175l ( )
Após a adição do detergente em todos os tubos, agitar manualmente e depois no agitador Vórtex. Na tabela, assinalar “0” se não observar a formação de espuma, “+” se observar a formação de pouca espuma ou “++” se observar a formação de bastante espuma após agitação.
Análise dos dados
1. Discutir os resultados obtidos e escrever as reações químicas envolvidas, quando estas ocorrem (considerar que um grupo específico de tensoativos, os aniônicos, reagem com os cátions Ca+2 e Mg+2 presentes na água dura, por exemplo, formando compostos insolúveis).
2. A molécula de SDS é apolar? Justifique.
3. Apresentar possíveis interações intermoleculares que ocorrem na presença dos sais empregados.
Para a próxima aula
Definir pKa e anotar no caderno de laboratório os valores de pK dos grupos ionizáveis dos aminoácidos que serão estudados na próxima prática.
Leituras complementares
FREITAS, M.M.C., SANTOS, F.K.G., LEITE, R.H.L., NÓBREGA, G.AS., NUNES, S.K.S. Avaliação da interferência de salinidade e dureza da água no processo de micelização com sabão base. Revista Verde de Agroecologia e Desenvolvimento Sustentável, v.8, n.4, p.136-146, out-dez, 2013.
15 Prática 2: Aminoácidos: estudo da estrutura e propriedades ácido-base.
Atenção: não recarregar o celular no laboratório. Não retirar aparelhos da tomada.
Introdução
Este experimento didático tem como proposta fazer com que os estudantes tenham contato com os aspectos estruturais dos aminoácidos, estudem suas propriedades e diferenças estruturais e aprendam, por meio de titulação, as propriedades ácido-base das unidades monoméricas que constituem as proteínas. Do ponto de vista experimental, serão utilizadas técnicas simples de titulação ácido-base, porém, permitirá que o estudante correlacione diversas características estruturais destes compostos com seu comportamento químico compreendendo conceitos teóricos.
Em química, um aminoácido é qualquer molécula que contém simultaneamente grupos funcionais amina e ácido carboxílico. Em bioquímica, este termo é usado como termo curto e geral para referir os -aminoácidos, ou seja, ácidos carboxílicos em que as funções amino estão ligadas às posições (ou posição 2 em relação à carboxila). Na natureza existem cerca de 200-300 aminoácidos, entretanto, somente 21 podem ser metabolizados pelo organismo humano, sendo 20 aqueles que geralmente constituem as proteínas. Dentre estes, 8 são chamados aminoácidos essenciais, isto é, não podem ser sintetizados pelo organismo humano, e precisam ser obtidos através de alimentos de origem animal ou vegetal. Os outros 12 aminoácidos que geralmente constituem as proteínas são produzidos por grande parte dos organismos superiores e são chamados não essenciais.
O aminoácido mais simples é a glicina (Figura 1), e possui apenas um átomo de hidrogênio em sua cadeia lateral. A alanina vem a seguir, com um grupamento metila. Cadeias laterais hidrocarbônicas maiores são encontradas na valina, leucina e isoleucina. A prolina também tem uma cadeia lateral alifática, mas difere dos outros membros do “conjunto dos vinte” por sua cadeia lateral ser ligada tanto ao nitrogênio quanto ao átomo de carbono . Esta resultante estrutura cíclica influencia fortemente a arquitetura das proteínas. Três aminoácidos com cadeias laterais aromáticas fazem parte do “conjunto dos vinte”. A fenilalanina contém um substituinte fenila ligado a um grupamento metileno. O anel aromático da tirosina contém uma hidroxila, o que torna a tirosina menos hidrofóbica do que a fenilalanina. O triptofano tem um anel indólico ligado a um grupamento metileno. Dois aminoácidos, serina e treonina, contêm hidroxilas alifáticas, o que as tornam muito mais hidrofílicas e reativas. Vamos agora aos aminoácidos com cadeias laterais muito polares, sendo altamente hidrofílicos. A lisina e a arginina têm cargas positivas em pH neutro. A histidina pode não ter carga ou tê-la positiva, dependendo de seu ambiente local. As cadeias laterais da arginina e da lisina são as mais longas no “conjunto dos vinte”.
16 O OH NH2 L-isoleucina O OH NH2 L-leucina O OH H2N NH2 L-lisina O OH S NH2 L-metionina OH O NH2 L-fenilalanina O OH NH2 OH L-treonina O OH HN NH2 L-triptof ano O OH NH2 L-valina O OH NH2 L-alanina O OH H2N O NH2 L-aspargina O OH O HO NH2 ácido L-aspártico O OH HS NH2 L-cisteína O OH O HO NH2 ácido L-glutâmico O OH H2N O NH2 L-glutamina O OH NH2 glicina H N O OH L-prolina O OH HO NH2 L-serina O OH HO NH2 L-tirosina O OH NH2 N H NH H2N L-arginina O OH N HN NH2 L-histidina Figura 1. Estrutura dos 20 L-aminoácidos encontrados em proteínas.
Existem dois aminoácidos com cadeias laterais ácidas, o ácido aspártico e o ácido glutâmico. Esses aminoácidos são geralmente chamados de aspartato e glutamato para salientar que suas cadeias laterais têm, quase sempre, cargas negativas no pH fisiológico. A glutamina e a asparagina são derivados não carregados de glutamato e aspartato que contêm uma amida terminal em vez de um carboxilato. Sete dos vinte aminoácidos têm cadeias laterais facilmente ionizáveis. Um átomo de enxofre está presente nas cadeias laterais de dois aminoácidos. A cicteína contém uma sulfidrila (-SH) e a metionina possui um átomo de enxofre em uma ligação tioéter (-S-CH3). Ambas as
cadeias laterais que contêm enxofre são hidrofóbicas. Deve-se destacar que a maioria destes aminoácidos presentes em proteínas possui pelo menos um centro quiral definido com estereoquímica (S) com exceção da cisteína que é (R) e da glicina que não possui centro quiral (Figura 1); ainda, todos os aminoácidos comuns em proteínas são freqüentemente denominados L-aminoácidos, baseados na nomenclatura do gliceraldeído (configurações de Fisher). Estas características conferem a estes compostos uma grande diversidade química e estrutural, permitindo que estes possam constituir uma gama enorme de diferentes proteínas com diferentes arranjos espaciais e as mais diversas funções (Figura 2). Alguns autores relatam que para formar uma proteína é necessária uma cadeia com mais de 70 aminoácidos. Já os peptídeos (“fragmentos de proteínas”) podem ser formados por dois ou mais aminoácidos.
17 Figura 2. Esquema representativo dos diferentes níveis de estrutura protéica da hemoglobina
(LEHNINGER, NELSON & COX, 2006).
Propriedades ácido-base dos aminoácidos
No organismo, os aminoácidos existem na forma de “zwitterion”, ou seja, compostos com cargas positivas e negativas totalizando uma carga nula (Figura 3).
Figura 3. Estrutura de um aminoácido na forma de “zwitterion”.
Quimicamente, os aminoácidos podem ser considerados como compostos anfotéricos uma vez que podem atuar como ácidos na presença de bases (Equação 1) ou como bases na presença de ácidos (Equação 2), seguindo a definição de Brönsted.
Equação 1. Aminoácido atuando como ácido.
Equação 2. Aminoácido atuando como base. R O O NH3 (aq) R OH O NH2 OH(aq) + R O (aq) O NH2 + H2O(l)
Ácido Base Base Ácido
(aq) R OH O NH2 H3O(aq) + R OH(aq) O NH3 + H2O(l) Ácido
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Um estudo destas propriedades ácido-base pode ser realizado utilizando-se titulações partindo-se de aminoácidos contidos em soluções ácidas (completamente protonados na função amina). Nestes casos, quando se adiciona base (OH) na solução, o pH aumenta gradativamente, sendo possível monitorar o seu valor em função das quantidades adicionadas pelo o uso de pHmetros ou papel de indicador universal (0-14 unidades). Se forem lançados em gráfico o volume ou numero de mols de base (OH) em função do pH da mistura resultante, é possível obter algumas das propriedades intrínsecas dos aminoácidos como o pKa (logaritmo negativo da constante de ionização) e pI (ponto
isoelétrico – logaritmo negativo do pH em que os aminoácidos estão completamente na forma de “zwitterion”) (Figura 4).
Figura 4. Curva de Titulação da Alanina.
De uma maneira geral, quando consideramos um ácido do tipo HA ionizado em solução aquosa (Equação 3), podemos escrever a seguinte equação para descrever o pH do meio (Equação 4 – Equação de Henderson-Hasselbach):
Equação 3. Ácido de Brönsted em equilíbrio aquoso.
Equação 4. Equação de Henderson-Hasselbach. HA(aq) + H2O(l) H3O(aq) + A(aq)
pH = pKa+ log [A ] [HA] Titulação da ALANINA
-19
Uma análise simples da equação de Henderson–Hasselbach pode fornecer o pKa de um
determinado ácido de Brönsted. Se o termo logarítmico da Equação 4 da for igual a 0 (zero), ou seja, quando as [HA] e [A] são idênticas no equilíbrio, teremos que o pH do meio é igual ao pKa
(pH = pKa).
Tomando como exemplo o aminoácido alanina (Figura 4), pode-se verificar experimentalmente que durante sua titulação com base surge um primeiro ponto de inflexão na curva (ponto (I), pKa1)
onde as variações de pH do meio são muito pequenas em função das adições de base. Assim, pode-se dizer que as concentrações relativas das espécies em equilíbrio [A]/[HA] (no caso, considere as duas espécies de aminoácidos da Equação 5) não variam significativamente nas imediações deste ponto porque o sistema está tamponado. O ponto de inflexão (II) é obtido numa faixa muito pequena da variação da quantidade de base adicionada, caracterizando o ponto de viragem na titulação da função ácido carboxílico (função mais acídica) e neste caso o pI (ponto isoelétrico). No ponto (III), de maneira similar ao que ocorre para o ponto (I), obtêm-se o pKa2 da função amina
protonada. As Equações 5 e 6 descrevem os equilíbrios das espécies químicas durante as titulações.
Equação 5. Equilíbrio envolvido na primeira ionização.
Equação 6. Equilíbrio envolvido na segunda ionização.
Parte experimental
Objetivo: determinar os valores de pKa de aminoácidos por titulações ácido-base. Construir os gráficos e comparar os perfis das curvas, correlacionando os valores de pKa. Estudos da estrutura de
aminoácidos, equilíbrios químicos, solução tampão e reação ácido-base.
(aq) H3C OH O NH3 H2O(l) + H3C O (aq) O NH3 + H3O(aq) Ka1 (aq) H3C O O NH3 H2O(l) + (aq) H3C O O NH2 + H3O(aq) Ka2
20 Materiais
- pHmetro - Soluções 0,05 mol/L de glicina, arginina e ácido glutâmico.
- 1 pipetas de Pasteur - Solução 4 mol/L de HCl
- 1 bureta de 25ml - Solução 0,125 mol/L de NaOH
- 1 pipetas volumétricas de 20 mL - 1 tubo Falcon de 50 mL
Procedimento
Para as titulações, poderão ser utilizados vários aminoácidos, sendo recomendado didaticamente o uso de glicina, arginina e ácido glutâmico. Cada grupo deverá titular um aminoácido sugerido pelo(a) professor(a) e os resultados deverão ser compartilhados entre os grupos de modo que cada grupo possua resultados referentes às três titulações.
1. Pipete 20 mL de uma solução 0,05 mol/L da solução de aminoácido e adicione em um tubo
Falcon de 50 mL. Insira o eletrodo do pHmetro (devidamente calibrado) no tubo e faça a medida do pH e anote o valor. Em seguida, acidifique a solução do aminoácido com HCl 4 mol/L até que o pH do meio seja igual a 1,0. Seja cuidadoso na adição de ácido e utilize conta-gotas nesta etapa.
2. Complete uma bureta de 25 mL com solução de NaOH 0,125 mol/L e inicie a titulação
adicionando porções de 0,5 mL da base, medindo o pH após cada adição. Lembre-se de agitar com cuidado a mistura titulada e então aferir o pH.
3. Efetue adições sucessivas até que o pH do meio apresente valor entre 12,7 a 13,0. Após isso, lave
o eletrodo com água destilada e coloque-o imerso na solução tampão de armazenamento do eletrodo.
Análise dos dados
1. Construir uma tabela contendo os valores de pH juntamente com os respectivos volumes de
NaOH adicionados para cada aminoácido titulado.
2. Lance em gráfico os valores de pH (eixo y) em função dos volumes da solução titulante de NaOH
(eixo x). Faça isso para cada aminoácido (três gráficos separados) e depois faça um gráfico contendo as três curvas superpostas.
3. Indique nos gráficos lançados individualmente os valores dos pKa (pKa1, pKa2 e pKaR se houver)
e indique o ponto isoelétrico (pI). Obtenha os valores de pKa determinados experimentalmente
(localizando os pontos de inflexão na curvas) e compare-os com os valores da literatura.
21 5. Faça uma análise do perfil das curvas obtidas correlacionando com os valores de pKa obtidos e as funções orgânicas presentes. Você acha que se fossem realizadas adições sucessivas de 0,25 mL de solução de NaOH seria possível calcular o valor de pKa com maior precisão? E se fosse utilizada
uma solução 0,1 mol/L de NaOH?
6. Após construir todas as curvas aponte qual a espécie predominante nas soluções iniciais de
aminoácidos utilizadas (medida inicial do pH antes da adição do HCl). Explique suas respostas.
7. a. Utilizando a equação de Henderson-Hasselbalch, justifique qual seria a representação (A ou B)
predominante da estrutura geral de um aminoácido em solução aquosa com pH = 7. Considerar pK1(-COO-) = 2 e pK2(-NH3+) = 10.
Equação de Henderson-Hasselbalch: pH = pKa + log [base conjugada (A-)] [ácido conjugado (HA)]
(A) (B)
b. Desconsiderando a cadeia lateral, seria possível encontrar aminoácidos com a estrutura A
(representada no item acima) em pH = 14? ( ) Sim ( ) Não
8. Sabendo que o cloreto de sódio, NaCl, é um sólido iônico que apresenta alta solubilidade em
água; que o ácido clorídrico, HCl, é um ácido forte; e que o hidróxido de sódio, NaOH, é uma base forte, um aluno afirmou que caso fossem misturados num mesmo recipiente volumes iguais de soluções, de baixas e iguais concentrações, de ácido clorídrico e hidróxido de sódio, haveria apenas a formação de água. Além disso, afirmou que após a mistura os íons cloreto e sódio permaneceram solubilizados da mesma forma que estavam na solução de origem e, por isso, os nomeou íons
expectadores. Com isso, concluiu que nesse experimento, o qual envolveu a mistura de ácido com
base, formou-se apenas água. Você concorda com esse aluno? Justifique sua resposta com o uso de reação química.
Para a próxima aula
No caderno de laboratório, preencher a tabela do experimento 3 com os volumes a serem adicionados em cada tubo de ensaio.
Leitura complementar
MARCONATO, J.C., FRANCHETTI, S.M.M., PEDRO, R.J. Solução tampão: uma proposta experimental usando materiais de baixo custo. Química Nova na Escola, n.20, p.59-62, Nov./2004.
22 Prática 3: Espectrofotometria e dosagem de proteínas pelo método de Biureto.
Atenção: não recarregar o celular em nenhuma tomada do laboratório. Em hipótese alguma, retirar aparelhos da tomada.
O fenômeno de absorção de luz diretamente por macromoléculas ou cromóforos formados por reações secundárias é usado para caracterização espectral e/ou quantificação dessas substâncias por espectrofotometria. Este experimento didático tem como proposta apresentar a técnica de espectrometria de absorção eletrônica no UV-vis aplicada à Bioquímica, explorando a Lei de Lambert-Beer. Para esta aula, será usado o método do Biureto para quantificação de proteínas, primeiramente determinando o comprimento de onda de máxima absorção do cromóforo para se construir uma curva-padrão (curva de calibração). Esta curva será usada para a determinação da concentração de proteínas de uma amostra desconhecida.
O termo medida fotométrica foi definido originalmente como o ato de medir a intensidade da luz, independente do comprimento de onda (energia). A maioria dos instrumentos tem, contudo, mecanismos para isolar uma faixa estreita de comprimentos de onda do espectro. Os instrumentos que usam filtros para esse propósito são referidos como fotômetros de filtro ou colorímetros e os que utilizam prismas ou grades de difreção são chamados de espectrofotômetros.
Comprimento de onda refere-se a distância entre dois picos da propagação da luz que ocorre na forma de onda, e essa distância normente é dada em nanômetros (nm). A radiação eletromagnética inclui desde a energia radiante dos comprimentos de onda curtos dos raios aos comprimentos de onda longos das ondas de rádio. O termo luz é usado para descrever a energia dos comprimentos de onda visíveis ao olho humano e àqueles limítrofes. O olho humano é capaz de detectar comprimentos de onda entre 380 e 750 nm, entretanto espectrofotômetros são capazes de medir também comprimentos de onda mais curtos (ultra-violeta, UV) ou mais longos (infra-vermelho, IV) (Fig. 1). Fig. 1. Espectro eletromagnético evidenciando a faixa dos comprimentos de onda visíveis.
(Fonte: http://www.arq.ufsc.br/labcon/arq5656/Curso_Iluminacao/07_cores/luz_01.htm e
23
A espectrofotometria é um dos métodos ópticos de análises mais usados nas investigações bioquímicas (Fig. 2). O espectrofotômetro é um instrumento que permite comparar a intensidade de luz absorvida ou transmitida por uma solução que contém uma quantidade desconhecida de soluto, e uma quantidade conhecida da mesma substância. Todas as substâncias podem absorver energia radiante, como por exemplo, a água que absorve fortemente na região do IV. A absorção das radiações ultravioletas, visíveis e infravermelhas dependem da estrutura molecular e é característica para cada substância química. Quando a luz atravessa uma solução de determinada substância, parte da energia é absorvida (absorbância). A cor das substâncias se deve a não absorção (transmitância) de certos comprimentos de ondas da luz branca que incide sobre elas, deixando transmitir aos nossos olhos apenas aqueles comprimentos de ondas não absorvidos. Esse fenômeno pode ser usado para quantificação de substâncias por meio da intensidade de absorbância em um comprimento de onda específico, com base em uma curva-padrão, utilizando-se da Lei de Lambert-Beer (PUNGOR, 1995).
Fig. 2. Esquema óptico simplificado de um espectrofotômetro. (fonte:
http://www.ufpa.br/ccen/quimica/espect2.jpg) Fundamentação Teórica
Considere um feixe de luz incidente com intensidade Io passando por uma cubeta contendo uma
solução de uma determinada substância que absorve luz de certo comprimento de onda (Fig. 3). A intensidade do feixe de luz transmitido (I) será sempre menor que Io, sendo que a transmitância (T)
é definida como uma relação entre a intensidade da luz transmitida e a intensidade da luz incidente (Lei de Beer).
T = I/Io
Fig. 3. Esquema demonstrando a incidência de um feixe de luz em uma cubeta e sua transmitância.
(fonte:http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/thumb/0/04/Beer_la mbert.png/300px-Beer_lambert.png)
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À medida que aumentamos a concentração da substância em solução, a transmitância varia em relação inversa ao logaritmo da concentração. Em conseqüência disso, pode-se definir um novo termo, absorbância (A), que será diretamente proporcional à concentração. Portanto,
A = log I/Io = log T
A = log 1/T
Dessa forma, a absorbância é direta e linearmente proporcional à concentração. Esta varia também de forma direta com o caminho óptico (diâmetro interno) da cubeta, ou seja, se dobrarmos o caminho óptico mantendo a concentração constante, teremos um valor de absorbância duas vezes maior. Essa relação é frequentemente referida como Lei de Lambert-Beer:
A = a.b.c
Onde A = abosrbância, a = constante de proporcionalidade (absortividade ou coeficiente de extinção), b = caminho óptico (em centímetros) e c = concentração. Como os valores de A são adimensionais, a unidade de a são as recíprocas daquelas para b e c. Quando b = 1 cm (geralmente é) e c é expresso em mol/L, a constante a pode ser chamada de absortividade ou coeficiente de extinção molar (, epsilon) e é constante para dado comprimento de onda, temperatura, pH, solvente, etc. Assim, a proporcionalidade direta entre absorbância e concentração pode ser usada para a determinação da absortividade de uma determinada substância em determinada condição experimental por meio de realização de uma curva-padrão. Para a construção dessa curva, soluções de concentrações conhecidas da substância devem ser preparadas e as absorbâncias determinadas em determinado comprimento de onda. Posteriormente, essa absortividade pode ser utilizada para quantificação dessa substância em uma solução, cuja concentração é desconhecida (VOET & VOET, 2006).
Parte experimental
Objetivos: determinar o espectro de absorção UV-visível do complexo formado entre os íons Cu2+
presentes no reagente de Biureto e proteínas. Utilizar o comprimento de onda de absorbância máxima para a elaboração de uma curva-padrão e determinação da absortividade. Calcular a concentração de proteína em uma solução de albumina bovina. Estudo da estrutura de proteínas.
25 Materiais
- reagente de Biureto - papel absorvente macio para limpeza das cubetas
- água destilada - 2 pipetas volumétricas de 2 mL
- espectrofotômetros - cubetas
- pera - estante
- 9 tubos de ensaio - agitador tipo vórtex
- soluções-padrão de Albumina de Soro Bovino (BSA) com as seguintes concentrações em % (m/v): 0,125; 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,25 e 1,75.
- amostra de concentração de proteína desconhecida
Procedimentos
Como fazer a reação de Biureto: Adicionar 0,5 mL da amostra de concentração de proteína
desconhecida num tubo de ensaio; 0,5 ml de branco (água destilada) em outro tubo de ensaio e 0,5 ml de cada solução padrão de albumina em cada um dos outros tubos. Adicionar água destilada a cada um dos tubos de ensaio, de forma que cada um apresente o volume igual a 1,5 mL. Agitar. Adicionar 1,5 mL do reagente de Biureto e tornar a agitar. O volume total de cada tubo de ensaio ficou igual a 3 ml. Considerando essas informações, preencha a tabela a seguir com os volumes a serem adicionados em cada tubo de ensaio. Após 5 minutos a absorbância pode ser determinada.
Preencher a tabela abaixo com os volumes a serem adicionados em cada tubo de ensaio.
Reagentes
Tubos Amostra Água Biureto Solução padrão de albumina % (m/v) 0,125 0,25 0,5 0,75 1,0 1,25 1,75 1 2 3 4 5 6 7 8 9
1. Para a determinação do comprimento de onda, inicialmente, deve-se fazer a reação com o padrão
26
aquisição do espectro de varredura (em espectrofotômetro) da reação obtida com a solução padrão de concentração 0,25 % de 400 a 800 nm, de 10 em 10 nm, zerando sempre com o branco a cada mudança de comprimento de onda.
2. Para a elaboração da curva padrão, numerar nove tubos de ensaio, sendo um branco, sete com
padrões e um com a amostra desconhecida. Realizar a reação de Biureto e determinar a absorbância no comprimento de onda onde a absorção é máxima, conforme dados obtidos no item acima. Usar os padrões para o cálculo da absortividade e, após isso, usar a absortividade para calcular a concentração da amostra desconhecida.
Análise dos dados
1. Plotar a absorbância da amostra do item 1 em função do comprimento de onda, determinando o
comprimento de onda de máxima absorbância.
2. Plotar as absorbâncias das soluções padrão em função da concentração e calcular a absortividade. 3. Determinar a concentração da amostra desconhecida.
4. Descrever o princípio do método de Biureto para a dosagem de proteínas, relacionando suas
vantagens e desvantagens em relação a outros métodos para dosagem de proteínas.
Leituras complementares
ALMEIDA, V.V., CANESIN, E.A., SUZUKI, R.M., PALIOTO, G.F. Análise qualitativa de proteínas em alimentos por meio de reação de complexação do íon cúprico. Química Nova na Escola, v.35, n.1, p.34-40, Fev/2013.
ZAIA, D.A.M.; ZAIA, C.T.B.V.; LICHTIG, J. Determinação de proteínas totais via espectrofotometria: vantagens e desvantagens dos métodos existentes. Química Nova, v.21, n.6, p.787-793, 1998.
27 Prática 4: Atividade enzimática e desnaturação de proteínas.
Atenção: há micropipetas que requerem apertar botão para acertar o volume.
Introdução
Enzimas proteolíticas ou proteases catalisam o rompimento das ligações peptídicas em proteínas. São enzimas da classe 3, as hidrolases, e subclasse 3.4, as peptídeo-hidrolases ou peptidases. Estas enzimas constituem uma grande família (EC 3.4), dividida em endopeptidases ou proteinases (EC 3.4. 21-99) e exopetidases (EC 3.4.11-19), de acordo com a posição da ligação peptídica a ser clivada na cadeia peptídica. Estas endopeptidases podem ser ainda subdivididas de acordo com o grupo reativo no sítio ativo envolvido com a catálise em serina- (EC 3.4.21), cisteína- (EC 3.4.22), aspártico-proteinases ou endopeptidases (EC 3.4.23) e metalloproteinases ou metalloendopeptidases (EC 3.4.24). As enzimas cujo mecanismo de ação não está completamente elucidado são classificadas no subgrupo EC. 3.4.99.
Exopeptidases
As exopeptidases atuam somente nos finais das cadeias polipeptídicas na região N ou C terminal. Aquelas que atuam na região amino terminal livre liberam um único resíduo de aminoácido (aminopeptidases), um dipeptídeo (dipeptidil-peptidases) ou um tripeptídeo (tripeptidil-peptidases).
As exopeptidases que atuam na região carboxi terminal livre liberam um único aminoácido (carboxipeptidases) ou um dipeptídeo (peptidil-dipeptidases).
Endopeptidases
Endopeptidases atuam preferencialmente nas regiões internas da cadeia polipeptídica, entre as regiões N e C terminal.
Tipos catalíticos
Segundo Barret, 1994 as proteases são classificadas em carboxipeptidases e as endopeptidases e são divididas em subclasses, tendo como base o seu mecanismo catalítico. As carboxipeptidases foram subdivididas em serino-, metalo- e cisteíno- carboxipeptidases e as endopeptidases em serino-, cisteino-, aspártico- e metaloendopeptidases. Serino peptidases possuem um resíduo de serina em seu centro ativo, enquanto as aspártico-peptidases têm duas unidades de ácido aspártico no seu centro catalítico. Cisteíno-proteases apresentam um aminoácido cisteína e as metalo-proteases usam um íon metal no seu mecanismo catalítico.
28 Proteases: função e aplicação
Proteases representam uma classe de enzimas com importantes papéis em processos fisiológicos. Além disto, elas possuem aplicação comercial, estando entre os três maiores grupos de enzimas industriais, sendo responsáveis por 60% da venda internacional de enzimas. Estas enzimas estão envolvidas em processos biológicos essenciais, como a coagulação sanguínea, morte celular e diferenciação de tecidos. Várias etapas proteolíticas importantes ocorrem no mecanismo invasivo de tumores, assim como no ciclo de infecção de um grande número de vírus e microrganismos patogênicos. Estes fatos tornam as proteases um alvo quimioterápico valioso para o desenvolvimento de novos compostos farmacêuticos. As enzimas proteolíticas também participam no catabolismo de proteínas, tanto nas vias degradativas como nas biossintéticas, e na liberação de hormônios peptídeos farmaceuticamente ativos a partir de proteínas precursoras. Certas modificações específicas e seletivas de proteínas durante a ativação de enzimas ocorrem via proteólise, que também colabora no transporte de proteínas secretórias na membrana. As proteases têm também uma variedade de aplicações principalmente na indústria de detergentes e de alimentos. Tendo em vista os recentes acordos mundiais para uso de tecnologias não poluentes, as proteases começaram a ser usadas em larga escala no tratamento do couro, em substituição aos compostos tóxicos e poluentes até então usados. Na indústria farmacêutica, as proteases são usadas em pomadas cicatrizantes e têm um uso potencial para outros medicamentos. Proteases hidrolisam as proteínas em peptídeos e aminoácidos, facilitando a sua absorção pelas células; devido a seu papel despolimerizante, as enzimas extracelulares têm um papel importante na nutrição.
Parte experimental
Objetivo: demonstrar a atividade proteolítica presente no suco de abacaxi, o efeito da desnaturação
protéica por temperatura e o efeito da alteração de solubilidade protéica, e conseqüente precipitação, provocados pela adição de álcool ou sal de amônio em solução de gelatina (colágeno).
Reagentes
- Solução de sulfato de amônio 3 mol/L - Etanol absoluto ou comercial 99,3º INPM - Abacaxi maduro (1 fatia média)
- Gelatina incolor e sem sabor - Água destilada
29 Materiais
- 8 tubos de ensaio de 20 mL - 1 tubo de ensaio de 30 mL - Estante para tubos de ensaio
- Béquer de vidro de 100 mL (para aquecer água)
- Béquer de 25 ou 50 mL (para água destilada) - Funil de vidro pequeno e gaze, tesoura para cortar o papel de filtro
- Recipiente com gelo - Almofariz e pistilo
- Pipetadores automáticos de 1 mL e ponteiras, ou pipetas de vidro de 5 mL
- Faca ou estilete - Luvas de látex
- Bastão de vidro (para dissolver a gelatina) - Placa aquecida ou banho-maria 100ºC - Banho-maria 60ºC
- Banho-maria 30ºC - Balança
-papel alumínio para pesagem da gelatina
Procedimento
Parte 1: Atividade enzimática do suco de abacaxi e desnaturação protéica por aquecimento.
Extração do suco de abacaxi
Uma fatia de abacaxi deve ser cortada em pequenos pedaços. A extração do suco será feita macerando-se os pedaços utilizando almofariz e pistilo. O suco deve em seguida ser filtrado utilizando funil de vidro, fixo numa argola presa a um suporte universal, e gaze em um tubo de ensaio de 20 mL. O tubo deverá ser armazenado no gelo.
Preparo da gelatina
Pesar 2 g de gelatina incolor e sem sabor de qualquer marca comercialmente disponível num papel alumínio. Adicionar a gelatina a um béquer de 50ml contendo 20 mL de água destilada aquecida a 60ºC. Mexer com bastão de vidro até a total solubilização. Após solubilização transferir para um tubo de ensaio. Manter esse tubo em banho de 60oC até a sua utilização.
Ensaio
Primeiramente, deve-se preparar as amostras de abacaxi. Para isso, utilizando tubos de ensaio de 20 mL, deve-se pipetar 2,0 mL de água no tubo 1 e 2,0 mL do extrato de abacaxi nos tubos 2, 3 e 4. O tubo 2 deve ser mantido à temperatura ambiente, o tubo 3 aquecido à 60ºC (banho de aquecimento) e o tubo 4 fervido por 5 minutos. Após este tempo de tratamento de cada uma das amostras, resfriar no gelo imediatamente por 1 minuto. Após o resfriamento das amostras fervidas adicionar em todos os tubos a solução de gelatina. Homogeneizar. Incubar as amostras por 10 minutos a 37oC e em seguida resfriar todas as amostras no gelo por 7 minutos, observar e anotar o resultado.
30 Tabela 1. Resumo do procedimento experimental.
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4
Água 2,0 mL - - -
Amostra Abacaxi - 2,0 mL - -
Amostra Abacaxi 60ºC - - 2,0 mL -
Amostra Abacaxi Fervida - - - 2,0 mL
Gelatina 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL
Parte 2: Precipitação de proteínas.
Pipetar nos tubos de ensaio de 20 mL os reagentes conforme a tabela 2, realizar o experimento em temperatura ambiente (~ 25ºC). Observar e anotar o resultado para posterior discussão.
Tabela 2. Resumo do procedimento experimental.
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3
Água 2,0 mL - -
Sulfato de amônio - 2,0 mL -
Etanol Absoluto - - 2,0 mL
Gelatina 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL
Análise dos dados
1. Prepara uma tabela indicando os resultados observados de cada experimento.
2. Tirar uma fotografia dos resultados para anexar ao caderno de laboratório como figura. 3. Discutir o efeito do suco de abacaxi sobre o colágeno (gelatina).
4. Discutir o efeito da temperatura sobre as enzimas (proteases) presentes no suco do abacaxi. 5. Discutir o efeito do etanol e do sulfato de amônio sobre as proteínas em solução. Qual o princípio
de cada efeito?
6. Pesquisar qual(is) protease(s) está(ão) presente(s) no suco de abacaxi.
6.1 Como poderia ser realizada a purificação dessa(s) proteína(s)? 6.2 A atividade das proteases pode ser otimizada? Como?
7. Discuta o efeito da temperatura sobre a desnaturação de proteínas no processo de cozimento dos
alimentos. Qual a importância disso?
8. Por que se pode utilizar abacaxi para amaciar carnes? Qual a relação entre o suco do abacaxi e os
amaciantes de carnes comerciais.
Leitura complementar
FRANCISCO JR., W.E., FRANCISCO, W. Proteínas: hidrólise, precipitação e um tema para o ensino de química. Química Nova na Escola, n.24, p.12-16, Nov./2006.
31 Prática 5: Extração e caracterização de lipídios.
Atenção: há micropipetas que requerem apertar botão para acertar o volume.
Introdução
Os lipídios são representados por um grupo de biomoléculas baixa massa molecular que apresentam estruturas químicas bastante variadas e são praticamente insolúveis em água. A diversidade de estruturas apresentadas pelos lipídios faz com que esses compostos tenham a capacidade de exercer diversas funções biológicas atuando desde componentes de membranas celulares, isolantes térmicos, sinalizadores celulares, pigmentos e reservas de energia (óleos e gorduras). Adicionalmente, os próprios lipídios ou seus derivados, podem também exercer funções de vitaminas e hormônios. As principais classes de compostos pertencentes ao grupo dos lipídios são os triacilgliceróis, glicerofosfolipídeos, esfingolipídios, glicolipídios e esteróides (Figura 1).
Figura 1. As principais classes de lipídios biológicos. Em (A) todos os lipídios mostrados apresentam glicerol ou esfingosina, estrutura central, ligados a ácidos graxos. (B) Estrutura de três hormônios esteróides.
(A)
32
Tipicamente, os lipídios apresentam em suas estruturas longas cadeias carbônicas, como os ácidos
graxos e isoprenos, ou múltiplos anéis interligados, como no caso dos esteróides. Várias classes de
lipídios apresentam ácidos graxos como componentes estruturais. Ácidos graxos são ácidos monocarboxílicos, moléculas anfipáticas que apresentam uma região polar, representada pelo grupo carboxila (ionizado em pH neutro), e uma região apolar, representada por uma cadeia carbônica com comprimento variando entre 4 a 36 átomos de carbono (Figura 2). Estruturalmente, a cadeia carbônica dos ácidos graxos é caracterizada pela presença de número par de carbonos formando uma estrutura não ramificada que pode ser saturada ou conter uma, duas ou mais insaturações.
Figura 2. Estrutura de ácidos graxos. Os ácidos graxos são compostos anfipáticos formados por uma longa cadeia carbônica apolar e um grupo carboxila polar. As cadeias carbônicas dos ácidos graxos não possuem ramificações e podem ser saturadas, como no caso do ácido esteárico, (A) ou insaturadas, como no caso do ácido oleico (B).
Lipídios como triacilgliceróis, fosfolipídios, glicolipídios e esfingolipídios apresentam ácidos graxos esterificados em suas estruturas. Uma das funções mais importantes dos ácidos graxos nas células é a participação na construção das membranas celulares, finas camadas lipídicas que circundam todas as células e suas organelas internas. As membranas celulares são compostas em grande parte por fosfolipídios, pequenas moléculas constituídas principalmente por ácidos graxos e glicerol. Outra importante função desempenhada pelos ácidos graxos está associada á manutenção de uma reserva energética celular. De fato, os ácidos graxos podem ser estocados no citoplasma celular na forma de gotículas lipídicas constituídas por moléculas de triacilgliceróis. Os triacilgliceróis, também conhecidos como triglicerídeos, triglicérides ou gorduras neutras, representam os lipídios mais abundantes na natureza sendo formados pela esterificação de três
Grupo carboxila Cadeia carbônica Insaturação (A) (B)
33
ácidos graxos a uma molécula de glicerol. É este estabelecimento de ligações éster entre os precursores polares dos triacilgliceróis (hidroxilas do glicerol e carboxilas dos ácidos graxos) que confere ao composto caráter essencialmente apolar, permitindo com que seja armazenado nas células de forma praticamente anidra (Figura 3).
Figura 3. Triacilglicerois são compostos apolares resultantes da formação de ligações éster entre as hidroxilas livres de uma molécula de glicerol e os grupos carboxila dos ácidos graxos.
As gorduras animais e óleos vegetais são misturas de triacilgliceróis, que diferem na sua composição em ácidos graxos e, conseqüentemente, no seu ponto de fusão. Os triacilgliceróis das gorduras animais são ricos em ácidos graxos saturados, o que atribui a esses lipídeos uma consistência sólida à temperatura ambiente. Já os triacilgliceróis origem vegetal são ricos em ácidos graxos poliinsaturados sendo, portanto, líquidos à temperatura ambiente. Os óleos vegetais são utilizados para a fabricação de margarinas através de um processo de hidrogenação que reduz parte de suas duplas ligações e os torna sólidos à temperatura ambiente.
Ácidos graxos saturados → Cadeia carbônica não apresentam ligações duplas entre os
átomos de carbono e, assim, contem o número máximo possível de hidrogênios.
Ácidos graxos insaturados → Cadeia carbônica possui uma ou mais ligações duplas entre
átomos de carbono contendo o número máximo possível de hidrogênios.
Os lipídios anfipáticos, tais como os ácidos graxos, quando são adicionados a um meio aquoso, tendem a agregar-se, organizando-se espontaneamente em estruturas plurimoleculares. Essas estruturas permitem maximizar as interações hidrofóbicas entre as cadeias carbônicas, isolando-as da água, e deixar os grupos polares em contato com o solvente, com o qual podem interagir. Tais
Glicerol
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arranjos moleculares constituem o estado de menor energia livre para esses lipídios em água e resultam da presença de duas regiões com solubilidades diferentes na mesma molécula.
O tipo de estrutura formada é determinado pela geometria da molécula do lipídio anfipático (Figura 4). Lipídios com uma única cadeia carbônica, como sabões de detergentes, devido a forma cônica e afilada de suas moléculas, formam, preferencialmente, micelas. Nesta estrutura esférica, as cadeias carbônicas organizam-se no interior, isolando-se da água, e os grupos polares posicionam-se na superfície externa, interagindo com o solvente. A formação de micelas é uma etapa importante na digestão dos lipídios da dieta. A maioria dos fosfolipídios e glicolipídios associam-se em uma camada dupla de moléculas, chamada bicamada lipídica. Esta estrutura permite uma agregação mais estável das moléculas desses lipídios, que têm forma cilíndrica pela presença de duas cadeias apolares.
As moléculas de lipídios alinham-se lado a lado, compondo duas monocamadas e as cadeias carbônicas das monocamadas agrupam-se frente a frente de modo a criar um domínio hidrofóbico no meio da bicamada; os grupos hidrofílicos dispõem-se na superfície das duas faces da bicamada, interagindo com a água. Bicamadas lipídicas tendem a se converter em estruturas fechadas, chamadas lipossomos, que são mais estáveis porque não apresentam caudas hidrofóbicas expostas ao solvente, como acontece na periferia das bicamadas planas. Lipossomos são, portanto, vesículas sintéticas esféricas formadas por uma bicamada lipídica contínua, que delimita uma cavidade interna preenchida por solvente.
Figura 4. Estruturas formadas por lipídios anfipáticos em meio aquoso. (A) Micelas são formadas por
moléculas de lipídios com uma única cadeia carbônica, cadeias estas que se localizam no interior dessas estruturas. (B) Bicamada lipídica é uma estrutura bidimensional na qual as cadeias carbônicas formam um domínio central hidrofóbico, isolando-se da água, exceto nas extremidades da bicamada; é a estrutura comumente formada por lipídios anfipáticos com duas cadeias de hidrocarbonetos. (C) Liposssomo é uma vesícula oca, resultante do fechamento de uma bicamada lipídica, dotada de uma cavidade central preenchida por solvente.
(A) Micela (B) Bicamada Lipídica (C) Lipossomo
35 Fundamentação Teórica
Os lipídios representam um grupo de compostos com estrutura bastante variada. Várias classes de lipídios apresentam ácidos graxos como componentes estruturais entre eles, os fosfolipídeos, glicolipídeos e os triacilgliceróis. Os lipídios podem ser caracterizados por suas propriedades físico-químicas. Em geral, são praticamente insolúveis em água enquanto apresentam alta solubilidade em solventes orgânicos como clorofórmio, éter, benzeno, mistura de Folch (clorofórmio:metanol), entre outros.
Os triacilgliceróis, que constituem o principal grupo de lipídios, podem ser hidrolisados liberando ácidos graxos e glicerol. Se esta hidrólise é feita mediante aquecimento em meio alcalino (hidrólise alcalina), formam-se sais de ácidos graxos (sabões) e o processo é chamado saponificação (Figura 5). Este é o princípio da fabricação dos sabões a partir de gordura animal fervida em presença de NaOH ou KOH.
Figura 5. Hidrólise alcalina de triacilgliceróis. Triacilgliceróis, mediante aquecimento em presença de bases fortes, como hidróxido de sódio (NaOH) ou hidróxido de potássio (KOH), sofrem hidrólise produzindo sais de ácidos graxos (sabões). No esquema acima é mostrada a hidrólise do triestearina na presença de NaOH dando origem a glicerol e sal sódico (estereato de sódio).
Assim como os ácidos graxos, os sabões são moléculas anfipáticas apresentando em sua estrutura uma longa cadeia carbônica (cauda apolar, lipofílica) e um grupo carboxilato (cabeça polar, hidrofílica). Dessa maneira, os sabões, quando em solução aquosa, associam-se por interações hidrofóbicas entre as caudas apolares formando um uma película lipídica na superfície do liquido ou dando origem a estruturas como as micelas (Figura 6).
Figura 6. Formação de micelas a partir das interações entre sabões dispersos em solução aquosa.
Triestearina Glicerol Estearato de Sódio
Sabão Grupo carboxilato Cadeia carbônica
Micela Película lip ídica
