aula11_Testes Bioquímicos e Atividade Enzimática

Identificação de bactérias

As colorações simples diferenciais ou estruturais

,

mesmo se combinadas com diferentes tipos de

cultivo

e

observação

das

características

das

colônias,

não são suficientes para a identificação

de bactérias isoladas.

Os testes bioquímicos

são amplamente utilizados

em associação com resultados obtidos através da

coloração

e

cultivos,

servindo

como

prova

definitiva na identificação das bactérias isoladas,

visto que as propriedades metabólicas são únicas

para cada espécie.

Identificação de bactérias

Esta classificação das bactérias em relação às

suas características bioquímicas se dá

porque

tipos diferentes os micro-organismos apresentam

tipos diferentes de vias metabólicas para obtenção

de energia

(fermentação, respiração ou ambos),

bem como podem possuir enzimas especificas

utilizadas no processo de metabolização dos

diferentes

substratos

contidos

nos meios

de

cultivo.

Os testes bioquímicos para identificação dos

micro-organismos podem ser divididos:

tipos de

Testes

→

Fermentação de carboidratos;

→

Teste da catalase;

→

Teste da utilização de citrato;

→

Presença de descarboxilases;

→

Teste da uréase;

→

Teste da

β-galactosidade;

→

Liquefação da gelatina;

→

Produção de H

₂

S;

→

Teste do indol;

→

Teste do vermelho de metila;

→

Teste Voges-Proskauer;

→

Redução do nitrato;

→

Teste oxidação/fermentação;

→

Hidrolise do amido;

Identificação de bactérias

Após a análise de todos os testes bioquímicos

,

expressados na maioria das vezes como

positivo

ou negativo

,

os resultados poderão ser agrupados

e a bactéria identificada

de acordo com as

características

já

preestabelecidas

através

de

6

Reações de Caracterização para Coliformes (IMViC)

Esquema de inoculação para as reações de caracterização de Coliformes

Reações IMViC

(I) Indol : Utilizado para caracterizar e/ou identificar bactérias entéricas, que são capazes de produzir indol a partir do aminoácido triptofano, através da enzima triptofanase.

+ +

0 Meio de cultura: caldo triptona ou caldo peptona;

0 Reagente de Kovac (p-dimetillaminobenzaldeido, butanol e ac. clorídrico);

0 Inóculo (micro-organismo) : bactéria do grupo coliforme; 0 Incubação: 24 a 48 horas a 35ºC.

triptofanase

(I) Indol

Interpretação dos resultados: após incubação durante 24 a 48 horas a 35ºC, juntar à cultura crescida 0,2 a 0,3ml do reagente de Kovac’s.

o Teste positivo : aparecimento de um anel sobrenadante vermelho intenso indicando a presença de indol;

(B)Vermelho de Metila:

comprova a capacidade de um organismo de produzir e manter estáveis produtos finais ácidos da fermentação da glicose.

 Meio de cultura: caldo-glicosado-fosfatado (meio de Carky Lubs)  Cultura: bactéria do grupo coliforme.

GLICOSE Ácido pirúvico

Várias Enzimas Ácido lático; Ácido acético; Ácido succínico; Ácido fórmico; Etanol; Dióxido de carbono; Gás hidrogênio

Interpretação: após incubação a 35ºC por 48h, ou 30ºC por 3 a 5 dias, juntar 2 a 3 gotas do indicador vermelho de metila

 Cor vermelha indica teste positivo  Cor amarela indica teste negativo.

(C) Voges Proskauer:

determina a capacidade de um organismo de produzir um produto final neutro da fermentação da glicose, o acetilmetilcarbinol (acetoína).

o Meio de cultura: caldo-glicosado-fosfatado (meio de Carky Lubs)

o Culturas: Eschericha coli (-) e Enterobacter aerogenes, B.subtilis (+)

Glicose Ác. Pirúvico Fermentação

via butilenoglicólica

Acetoína

Reagente de Barrit A (alfa naftol)

Reagente de Barrit B (KOH) Anel Vermelho

MECANISMO DA REAÇÃO

+ +

Interpretação: após 48 horas de incubação, retira-se com pipeta estéril 1ml da cultura crescida para um outro tubo de ensaio; junta-se 0,6ml de solução de -naftol e 0,2 ml de KOH a 40 %. Agita-se vigorosamente e deixa-se em repouso em estufa a 35o_{C. Observa-se a partir de 15 minutos}

até um máximo de 4 horas.

O aparecimento de uma coloração cereja que se estende da superfície para o fundo do tubo indica um teste Voges Proskauer positivo.

O aparecimento de uma coloração acobreada ou mesmo vermelha indica teste negativo.

GLICOSE Ácido Pirúvico Acetilmetil carbinol (acetoína) Butilenoglicol Diacetilo ác. lático, ác. acético ác. succínico, ác. fórmico

Complexo vermelho cereja

Fermentação ácida mista

Esquema Bioquímico

KOH + Ar a- naftol Vermelho

Prova VP positiva Prova VM positiva pH < 4,4

vira o indicador para vermelho

D) Teste de citrato: avalia a capacidade de um micro-organismo em utilizar o citrato como única fonte de carbono

 Meio de cultura: meio de citrato (citrato de Koser ou citrato de Simmon)

 Culturas: Eschericha coli e Enterobacter aerogenes

MECANISMO DA REAÇÃO Citrato de sódio +

Fosfato de amônia

Fermentação do Citrato

Hidróxido de amônia, carbonato de sódio + azul de bromotimol (indicador)

Interpretação do teste de citrato: após 24-48 horas de incubação em meio citratado, observa-se:

 Meio líquido de citrato de Koser

Crescimento visível (o meio fica turvo): prova positiva;

Ausência de crescimento (o meio permanece límpido): prova negativa

 Meio solidificado de Simons

+ virada do indicador azul de bromotimol de verde para azul;

DIFERENTES COMBINAÇÕES DE RESULTADOS

DE TESTE DE IMViC

Com os resultados dos quatro testes anteriores pode-se determinar o gênero do coliforme isolado através da Tabela 1, que fornece uma interpretação dos resultados das reações do IMViC.

Microrganismo Indol Vermelho de Metila Voges Proskauer Citrato Eschericha coli Variedade I Variedade II + -+ + -Citrobacter freundii (Intermediário) Variedade I Variedade II -+ + + + -+ -Enterobacter aerogenes Variedade I Variedade II -+ -+ + + + TABELA 1: Interpretação das reações IMViC

Interpretação das reações IMViC

Fermentação de carboidratos

Determina a capacidade de um organismo de fermentar (degradar) um hidrato de carbono específico incorporado a um meio básico, produzindo ácido ou ácido com gás.

Meio de cultura: meio de cultura simples com baixa concentração de

peptona e altas concentrações de açúcares como glicose, lactose etc. O meio contém um indicador (vermelho de fenol), o qual se apresenta na cor amarela em pH abaixo de 6,8 ou na cor vermelha em pH acima de 7,4; e tubo de vidro de Durham.

Interpretação:

0

Prova da Amilase

: determina se o microrganismo possui a enzima amilase que hidroliza o amido

0 Meio: ágar simples contendo aproximadamente 0,2% de amido

0 Culturas: Bacillus subtilis (+); Bacillus megaterium(- ) Proteus vulgaris (-)

Alfa amilase H₂O Alfa-D-glicose Alfa amilase H₂O Alfa-D-glicose

Procedimento: Após inoculação do micro-organismo, a placa é incubada a 35°C por pelo menos 48h. Passado o período de incubação, a superfície da placa é coberta com uma solução de iodo (pode ser lugol da coloração e Gram), para a revelação da prova.

Interpretação:

0 ( + ): a presença de uma zona clara ao redor do crescimento indica a utilização do amido;

0 ( - ): meio azul para amido insolúvel e marron para amido parcialmente solúvel.

TESTE DA CATALASE

 Princípio: Determinar a habilidade de um determinado micro-organismo em degradar enzimaticamente o peróxido de hidrogênio, com formação de água e oxigênio (formação de bolhas). Produzem a enzima catalase.

 Técnica: Gotejar sobre a biomassa microbiana, o reagente peróxido de hidrogênio a 3%. Observar a formação de bolhas.

Provas no Meio de Leite

diferencia micro-organismos sobre a base de suas múltiplas reações metabólicas em meio de leite.

0 Meio de cultura: meio de leite (litmus) com indicador de pH (azul de tornassol ou azul de bromocresol).

0 Culturas: Lactobacillus bulgariccus (+) Streptococcus termophyllus (+) Salmonella (-)

Interpretação

0 A) Fermentação da lactose  produção de ácidos: meio amarelo;

0 B) alcalinidade  não ocorre fermentação da lactose mas ocorre atuação nas substâncias nitrogenadas liberando amônia  azul;

0 C) formação de coágulo e digestão: alguns micro-organismos promovem a formação de coágulo devido ao aumento do pH do meio, mas depois o coágulo se desfaz devido à ação de enzimas proteolíticas produzidas pelos micro-organismos.

Teste do Manitol

 Grupo 1- Staphylococcus aureus;

 Grupo 2 - grupo das espécies de Staphylococcus que não são

S. aureus.

 Isso é possível, pois somente os S.aureus fermenta o manitol, acidificando o meio que de rosa passa para amarelo.

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o Meio é o Ágar Hipertônico Manitol, que possui uma concentração muito elevada de sal, o que impede que a grande maioria das bactérias cresça.

o É utilizado na diferenciação de bactérias do

Teste em Meio TSI (Triplice Sugar Iron)

Avalia a capacidade de um organismo atacar um hidrato de carbono específico incorporado em um meio de cultura básico, com produção ou não de gases ou possível produção de ácido sulfídrico (H₂S).

0 Meio de cultura: O meio apresenta a proporção de Glicose :

Lactose : Sacarose 1:10:10 (g/L), há também tiossulfato de sódio, sulfato ferroso e peptona. O indicador de pH é vermelho de fenol (pH ácido indicador fica amarelo; pH alcalino o indicador fica vermelho).

0 Técnica: Inocular a cultura com alça em agulha em meio de cultura distribuído em tubo de ensaio.

0 Culturas: Eschericha coli , Salmonela typhosa, Pseudomonas aeruginosa

Interpretação

0

Teste de Fermentação e liberação de gases

0

Teste para H

₂

S:

Se a bactéria produzir a enzima tiossulfato redutase ela irá catalisar a reação de degradação do tiossulfato de sódio presente no meio produzindo H₂S, este reage com o sulfato ferroso formando um precipitado preto de sulfeto ferroso. Para que esta reação ocorra é necessário que o meio esteja ácido, assim se a base do tubo estiver negra deve ser lida como que a bactéria é fermentadora de glicose.

Prova em meio de Kligler

0 Liquefação da Gelatina: determina a capacidade de um organismo de produzir enzimas do tipo proteolítica (gelatinase) que hidrolizam a

gelatina.

0 Meio: meio de cultura nutritivo, em tubo, suplementado com 12% de

gelatina

0 Culturas: Staphyococcus aureus (patogênico +) e St. Epidermidis (+

tardiamente) , Bacillus (+), e Enterobactérias , Serratia e Proteus ( -) 0 Resultado: Após incubação a 35º C durante 24 a 48 h as culturas são

colocadas no refrigerador a 4º C durante 30 minutos, ou em banho de gelo durante 3 a 5 minutos.

-meio sólido + meio líquido Proteína + H₂O Polipeptídeos + H₂ O Aminoácidos individuais Gelatinase Gelatinase

Métodos rápidos para caracterização:

sistemas

multitestes

0 Enterotube IIR

30 Haste de metal usada

para inocular Compartimentos do Enterotube É um sistema com meios de cultura específicos contidos em compartimentos distintos. É utilizado para a identificação de enterobactérias..

Resultado:

Kits para caracterização de bactérias

0 Tiras API 20E: reações de caracterização de enterobactérias

0 FOOD System Descrição: Food System é um sistema de 24

poços com substratos bioquímicos desidratados e meios de cultura para a pesquisa e presumível identificação de microrganismos em carnes, leite e queijo, peixe e outros produtos alimentares.

O sistema fornece a pesquisa e a presumível identificação de Salmonella spp., Citrobacter spp, Proteus spp./Providencia spp., Pseudomonas spp., Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus cereus, Listeria spp., fungos e leveduras.

O sistema é inoculado com a suspensão da amostra alimentar e incubado a 36ºC ± 1ºC durante 18 a 24 horas.