Instituto de Biologia
Elisa Ribeiro Miranda Antunes
Variabilidade sazonal da composição química e atividade antioxidante
de extratos de folhas de Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss, Maytenus
aquifolium Mart. (Celastraceae) e seus híbridos.
Seasonal variation of the chemical composition and antioxidant activity of leaf extracts of Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss, Maytenus aquifolium Mart
(Celastraceae) and their hybrids.
Campinas, 2019
Elisa Ribeiro Miranda Antunes
Variabilidade sazonal da composição química e atividade antioxidante
de extratos de folhas de Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss, Maytenus
aquifolium Mart. (Celastraceae) e seus híbridos.
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de mestra em Biologia Vegetal.
ESTE ARQUIVO DIGITAL
CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA TESE DEFENDIDA PELA ALUNA ELISA
RIBEIRO MIRANDA ANTUNES E
ORIENTADA PELA PROF. DRA.
ALEXANDRA CHRISTINE HELENA
FRANKLAND SAWAYA.
Orientadora: Dra. Alexandra Christine Helena Frankland Sawaya
Campinas 2019
Campinas, 04 de Fevereiro de 2019
COMISSÃO EXAMINADORA
Profª. Dra. Alexandra Christine Helena Frankland Sawaya Profª. Dra. Sara Adrián López de Andrade
Profª. Dra. Alessandra Sussulini
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
“Nothing in life is to be feared, it is only to be understood. Now is the time to understand more, so that we may fear less.”
AGRADECIMENTOS
A meus pais que durante toda a minha vida sempre me apoiaram, desde o momento que escolhi prestar Biologia, durante minha Iniciação Científica e Mestrado e inclusive durante às idas ao laboratório nos fins de semana e feriados.
Ao Giovane, por todo o amor, por sempre acreditar em mim e me apoiar. Por me estimular na busca dos meus sonhos e objetivos e por fazer parte da minha vida.
A minha avó Maria, que sempre me incentiva e me pergunta como estão os meus estudos. Aos meus grandes e eternos amigos de graduação Fernanda, Caroline, Giuliana, Pedro, Antônio e Ana Beatriz pela amizade, companheirismo e apoio.
Aos colegas e amigos do laboratório em especial à Bel, Guilherme, Mara, Vanessa, Rodolfo, Mariana e Alexandre pelas conversas, convivências, ajudas em experimentos, ida a congressos e amizade, que durará para sempre.
À professora Dra. Alexandra Sawaya por todas as conversas, orientação, ensinamentos, paciência e dedicação.
À FAPESP/CAPES, Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo, pelo apoio financeiro, sob número de processo 2017/00155-5..
Ao CPQBA, em especial ao Ílio, pelo fornecimento das amostras de Espinheira Santa, por toda ajuda e apoio.
À UNICAMP por toda infraestrutura, em especial ao Instituto de Biologia, onde iniciei meus estudos de Graduação e onde agora, finalizo meu Mestrado.
Ao laboratório do professor Dr. Marcelo Lancellotti pelas análises antimicrobianas e ao professor Dr. Marcelo Menossi e ao Pedro pelas análises antioxidantes.
À Andressa pela grande ajuda durante as análises de ORAC. Sem ela estaríamos perdidas para essa análise.
À CEPAGRI-UNICAMP (Centro de Pesquisas Meteorológicas e Climáticas aplicada à Agricultura) pelo fornecimento dos dados meteorológicos.
À todos que direta e indiretamente me ajudaram ao longo do meu mestrado,
RESUMO
As espécies, Maytenus ilicifolia e Maytenus aquifolium, popularmente conhecidas como “Espinheira Santa”, são largamente utilizadas na medicina tradicional brasileira para tratar gastrites e dispepsias. Vários estudos comprovaram que tais espécies possuem atividade gastroprotetora e antiulcerogênica, cuja ação pode estar relacionada à suas propriedades antioxidantes. De acordo com alguns estudos, a elevada produção de espécies reativas de oxigênio e nitrogênio ocasiona alterações celulares graves caracterizando um quadro de estresse oxidativo. Portanto, o comprometimento do sistema de defesa antioxidante, tem sido associado à patogênese da lesão da mucosa gástrica relacionada ao estresse. Porém, para obter um fitoterápico de alta qualidade e propor critérios de padronização é imprescindível conhecer a variabilidade química da espécie vegetal utilizada como matéria prima. Com relação às flutuações sazonais na composição química do gênero Maytenus, há apenas um estudo na literatura no qual se observou que na primavera a planta apresentou maior teor de flavónoides e fenóis totais enquanto que no inverno apresentou maior teor de triterpenos. O presente trabalho visou identificar possíveis variações sazonais da composição química dos extratos destas espécies e seus híbridos. Para isso, foram realizadas coletas de folhas de 5 indivíduos de M. ilicifolia, de M. aquifolium e híbridos resultantes do cruzamento de ambas, mensalmente ao longo de um ano. Seus extratos foram analisados via cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (UHPLC-MS) e foram submetidos à testes de atividade antioxidante por DPPH e ORAC. Através dos resultados obtidos foi possível concluir que a diferença química entre as espécies foi mais acentuada que eventuais diferenças sazonais. Os indivíduos híbridos analisados, por sua vez, apresentaram maior semelhança morfológica, química e biológica com a espécie M. aquifolium. Além disso, foram observadas mudanças na intensidade de 4 features, que apresentaram maiores intensidades nos meses de outubro e maio. Tais variações podem ser resultado de variações climáticas nos meses em questão ou resposta ao dano sofrido por alguns indivíduos e a consequente sinalização entre plantas, capaz, inclusive, de alterar a composição química de indivíduos não submetidos à poda. Todas as amostras demonstraram acentuada atividade antioxidante, sendo M. ilicifolia mais eficiente nos ensaios de DPPH e M. aquifolium nos ensaios de ORACFL mostrando que diferenças na composição interferem na eficiência
antioxidante, dependendo do mecanismo em questão.
Palavras–chave: Maytenus ilicifolia, Maytenus aquifolium, espinheira santa, UHPLC-MS,
ABSTRACT
The species Maytenus ilicifolia and Maytenus aquifolium, commonly known as “Espinheira Santa” are widely used in Brazilian traditional medicine for treatment of gastritis and dyspepsia. Several studies have confirmed that both species have gastroprotective and antiulcerogenic activities, whose action may be related to their antioxidant properties. According to some studies, the high production of reactive oxygen and nitrogen species, cause severe cellular alterations, characterizing a state of oxidative stress. Therefore, the impairment of the antioxidant defense system has been associated with the pathogenesis of stress-related lesion of the gastric mucosa. However, to obtain a high quality phytotherapic and to propose a standardization criteria, it is essential to know the chemical variability of the species used as raw material. Regarding the seasonal variations in the chemical composition of the Maytenus genus, there is only one study in the literature in which it was observed that during the spring the plants presented higher levels of flavonoids and total phenols, while in winter, they presented higher levels of triterpenes. The present work aimed to identify possible seasonal variations on the chemical composition of the leaf extracts of these species and their hybrid. For this, leaf samples were collected from 5 individual of of M. ilicifolia, M. aquifolium and their hybrid, monthly over a year. The leaf extracts were analyzed by ultra-high performance liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UHPLC-MS) and submitted to antioxidant tests of DPPH and ORACFL. Through the results obtained it was possible to
conclude that the chemical difference between the species were more pronounced that possible seasonal variations. The hybrid, however, presented more chemical, biological and morphological similarities with the species M. aquifolium. Furthermore, differences in 4
features were observed, which demonstrated higher intensities in the months of October and
May. Such variations may be the result of climate variations in the months in question or the response to damage and the signaling between plants, capable of altering the chemical composition of the individuals not pruned. All the samples demonstrated accentuated antioxidant activity, with M. ilicifolia as the most efficient on the DPPH assays and M.
aquifolium on the ORACFL assays, showing that differences in composition interfere on the
antioxidant efficiency, depending on the assay´s mechanism.
keywords: Maytenus ilicifolia, Maytenus aquifolium, espinheira santa, UHPLC-MS,
Lista de ilustrações
Figura 1. Workflow de Metabolômica ... 21 Figura 2. Cromatogramas UHPLC-MS típicos dos extratos das duas espécies e do híbrido analisados, com ionização em modo positivo (ESI+). ... 28 Figura 3. Cromatogramas UHPLC-MS típicos dos extratos das das duas espécies e do híbrido analisadosm com ionização em modo negativo (ESI-). ... 29 Figura 4. PCA com os agrupamentos das amostras analisadas por UHPLC-MS dos extratos das espécies M. ilicifolia, M. aquifolium, híbridas e QCs ... 32 Figura 5. Biplot do PCA indicando as features responsáveis pelas separações observadas. ... 33 Figura 6. Intensidades médias de cada feature por cada as duas espécies de Espinheira Santa e seu híbrido. Letras diferentes dentro do mesmo gráfico indicam diferença significativa pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Barras representam o erro padrão (n=120). (p ≤ 0,05). ... 35 Figura 7. Intensidades médias de cada feature por cada as duas espécies de Espinheira Santa e seu híbrido. Letras diferentes dentro do mesmo gráfico indicam diferença significativa pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Barras representam o erro padrão (n=120). (p ≤ 0,05). ... 36 Figura 8. PCA com amostras analisadas por UHPLC-MS dos extratos da espécies M. ilicifolia. Biplot em Anexo 2 ... 38 Figura 9. PCA com amostras analisadas por UHPLC-MS dos extratos da espécies M. aquifolium. Biplot em Anexo 3 ... 39 Figura 10. PCA com amostras analisadas por UHPLC-MS dos extratos dos indivíduos híbridos. Biplot em Anexo 4 ... 40 Figura 11. Variação de intensidade média e erro padrão das features válidas por mês nos indivíduos da espécie M. ilicifolia. Os asteriscos indicam diferença significativa peloteste de Tukey a 5% de probabilidade. Barras representam o erro padrão (n=10) (p ≤ 0,05). ... 42 Figura 12. Variação de intensidade média e erro padrão das features válidas com valor p≤ 0,05 por mês nos indivíduos da espécie M. aquifolium. Os asteriscos indicam diferença significativa pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Barras representam o erro padrão (n=10). (p ≤ 0,05). ... 43
Figura 13. Variação de intensidade média e erro padrão das features válidas com valor p≤ 0,05 por mês nos indivíduos Híbridos. Os asteriscos indicam diferença significativa pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Barras representam o erro padrão (n=10). (p ≤ 0,05). ... 44 Figura 14. Variação de intensidade da feature M289T2, mês a mês nos cinco indivíduos de M. ilicifolia. Os asteriscos indicam diferença significativa pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Barras representam o desvio padrão (n=2). (p ≤ 0,05). ... 45 Figura 15. Médias mensais da Radiação Incidente, Pluviosidade e Temperatura durante o ano de coleta ... 51 Figura 16. Reação de oxirredução do DPPH na presença de quercetina ... 60
Lista de tabelas e quadros
Tabela 1. Datas das coletas realizadas... 24 Tabela 2. Features observadas nas análises de LC-MS dos extratos das duas espécies de Maytenus e suas híbridas. Rt (tempo de retenção), m/z ( relaçao massa/carga do composto). ... 30 Tabela 3. Valores de massa de alta resolução, identificações propostas e referências das features detectadas em extratos de folhas de Espinheira Santa. Afz→afzelequina ou epiafzelequina; Cat→catequina ou epicatequina; Gall→gallocatequina or epigallocatequina; Rha→rhamnose; Ara→arabinose; Kaemp→kaempferol; Hex→glucose ou galactose ... 47 Tabela 4. EC50 dos extratos das folhas das três espécies de Espinheira Santa e do padrão Quercetina. Menores valores de EC50 indicam maior atividade antioxidante. ... 63 Tabela 5. EC50 dos extratos do caule das três espécies de Espinheira Santa e do padrão Quercetina. Menores valores de EC50 indicam maior atividade antioxidante. ... 64 Tabela 6. Equivalência de Trolox dos extratos de ... 66 Tabela 7. Equivalência de Trolox dos extratos dos caules das espécies de Espinheira Santa pelo ensaio ORAC. Maiores valores de equivalência indicam maior atividade antioxidante. ... 66
Lista de abreviaturas e siglas
AAPH – cloreto de (2,2‟-azobis (2-amidiopropano) ABTS – 2,2'-azino-bis
ANOVA – Analise de Variância
CEPAGRI – Centro de Pesquisas Meteorológicas e Climáticas Aplicadas à Agricultura CPQBA – Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas DPPH – 2,2-difenil-1-picril-hidrazila
EC50 – Concentração efetiva 50% ESI – Ionização por eletrospray ET – Transferência de elétrons GC – cromatografia gasosa
GC-MS – cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas HAT – Tranferência de átomos de hidrogênio
HPLC-MS – Cromatografia líquida de alta eficiência acoplada à espectrometria de massas KW/m2 – kilowats/metro quadrado
LC – cromatografia líquida
LC-MS – cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massas
m/z – relação massa/carga
MS – espectrometria de massas
NAPRALERT® – base de dados de produtos naturais, incluindo informações etnomédicas, farmacológicas e bioquímicas.
ORACFL – Oxygen Radical Absorbance Capacity
PAL – fenilalanina amonia liase PC – Componente principal
PCA – Análise de componentes principais QC – Controle de Qualidade
ROS – Espécie reativa de Oxigênio Rt – Tempo de retenção
TE – Trolox equivalente TQD – Triplo Quadrupolo
UHPLC-MS – cromatografia líquida de ultra alta eficiência acoplada à espectrometria de massas
UV – ultra violeta
SUMÁRIO
Introdução Geral ... 15 1. Parte 1 – Metabolômica ... 17 1.1. INTRODUÇÃO ... 19 1.2. OBJETIVO ... 23 1.3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 241.3.1. Material vegetal e Sazonalidade ... 24
1.3.2. Preparação dos extratos... 25
1.3.3. Análise por UHPLC-MS de baixa resolução ... 25
1.3.4. Análise por UHPLC-MS de alta resolução ... 26
1.3.5. Estatística... 26
1.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 27
1.4.1. Material Vegetal e Sazonalidade ... 27
1.4.2. Preparação dos Extratos ... 27
1.4.3. Análise por LC-MS ... 27
1.4.4. Análise metabolômica e estatística de todas as amostras. ... 29
1.4.5. Análise metabolômica e estatística das amostras por espécie ... 37
1.5. CONCLUSÃO ... 54
2. Parte 2 – Atividade Biológica ... 55
3.1. INTRODUÇÃO ... 56
3.2. OBJETIVO ... 59
3.3. MATERIAIS E METODOS ... 60
3.3.1. Preparação dos extratos ... 60
3.3.2. Atividade antixidante por DPPH ... 60
3.3.3. Atividade antioxidante por ORACFL ... 61
3.3.4. Estatística... 62
3.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 63
3.4.1. Atividade Antioxidante por DPPH ... 63
3.4.2. Atividade Antioxidante por ORACFL ... 65
3.5. CONCLUSÃO ... 68 Conclusão Geral ... 69 Perspectivas Futuras...70 Referências Bibliográficas ... 71 Anexo...81
1.
2.
Introdução Geral
Tradicionalmente, a principal estratégia do homem no tratamento de doenças foi o uso de plantas, cujos registros possivelmente datam de 60.000 anos atrás 1. Apenas recentemente, com a evolução da química e da tecnologia, o homem conseguiu reduzir sua dependência do reino vegetal, que, entretanto, continua sendo uma importante fonte de ingredientes ativos para a produção de medicamentos e permanece sendo largamente utilizada pela população 2.
Uma planta muito empregada na medicina popular brasileira é a “Espinheira Santa”, cujo nome abrange predominantemente, espécies do gênero Maytenus, destacando-se a
Maytenus ilicifolia Mart. ex Reiss e Maytenus aquifolium Mart. Este gênero, o principal
dentro da Família Celastraceae, conta com 200 espécies e é considerado um gênero pantropical, concentrado na América do Sul 3. As espécies M. aquifolium e M. ilicifolia são nativas da região sul e sudeste do Brasil, sendo a primeira mais adaptada a climas mais quentes 4.
As espécies da família Celastraceae geralmente se apresentam como árvores, arbustos ou lianas 5. No caso de M. ilicifolia e M. aquifolium, ambas as espécies ocorrem na forma de arbusto ou árvore, com folhas glabras de textura coriácea ou cartácea cuja margem serreada apresenta espinhos que podem variar de tamanho. As flores se dispõem em fascículos multifloros e os frutos são bivalvares e orbiculares.
As principais diferenças entre os indivíduos de M. ilicifolia e M. aquifolium é que a primeira geralmente apresenta uma altura menor, cujo máximo é em torno de 5 m, frutos monospérmicos e espinhos marginais maiores, enquanto a segunda possui tamanho máximo de 12 m, frutos dispérmicos e espinhos marginais ligeiramente menores 2.
Popularmente, a Espinheira Santa é utilizada principalmente para o tratamento gastrites e dispepsias. A atividade gastroprotetora e antiulcerogênica de M. ilicifolia e M.
aquifolium foi comprovada inúmeras vezes na literatura e tais efeitos medicinais têm sido
relacionados com suas propriedades antioxidantes 6–13.
De acordo alguns estudos, o sistema de defesa antioxidante nas plantas e animais tem a finalidade de evitar que o acúmulo excessivo de espécies reativas de oxigênio (ROS) ocasione danos celulares no organismo. O comprometimento deste sistema de defesa no reino animal tem sido correlacionado com inúmeras afecções gástricas como gastrites, úlceras e
carcinomas que podem ser prevenidas e tratadas com subtstâncias antioxidantes 11–13.
Tais efeitos na mucosa gástrica não são causados por um único princípio ativo presente na planta e sim por grupo de compostos, provavelmente agindo sinergicamente. Sabe-se que as plantas do gênero Maytenus possuem inúmeras substâncias, dentre elas: terpenos e triterpenos, óleos essenciais, taninos (principalmente condensados), glicolipídios, flavonóis e alcalóides 14–21.
De acordo com Pereira et al. (1993) e Ming et al. (1998) 22,23, tanto os taninos, principalmente a epigalocatequina, quanto os terpenoides – destacando-se o fridenelol – são responsáveis, parcialmente, por seus efeitos gastroprotetores. Por outro lado, no estudo de Leite et al. (2010) 24, os glicosídeos de canferol, isolados dos extratos etanólicos e aquosos de
M. ilicifolia demonstraram atividade sobre o volume e o pH da secreção gástrica, sendo de
grande importância para o efeito gastroprotetor.
Porém, infelizmente, apesar das plantas medicinais constituírem uma importante fonte de novos medicamentos não há preocupação com a conservação das espécies. Em 1976, uma missão financiada pelo US National Cancer Institute coletou 27.215 kg de Maytenus no Quênia – toda a população adulta da espécie no país – para uso em seu programa de desenvolvimento de medicamentos contra o câncer 2,25. No Brasil, por exemplo, a espécie M.
ilicifolia está atualmente em risco de extinção devido ao seu uso indiscriminado 26.
Assim, com a finalidade de poupar os indivíduos selvagens e potencializar a produção do fitoterápico, é necessário o desenvolvimento de técnicas agrícolas específicas para o cultivo de cada espécie medicinal. Entretanto, uma vez que a alta qualidade do medicamento não é atingida apenas na etapa final, a identificação, cultivo, colheita e armazenamento corretos da espécie vegetal são essenciais para uma boa produção e necessitam de um estudo detalhado 27.
Neste aspecto, as etapas que merecem bastante atenção, além da correta identificação da espécie, são as condições de cultivo e a época de colheita, uma vez que a concentração dos princípios ativos se modifica dependendo das condições naturais como temperatura, umidade e luminosidade28 e das condições de coleta, como danos físicos gerados na poda29–33 . Com relação à essas diferenças químicas, já foram relatadas na literatura alterações na quantidade de taninos presentes nas folhas de diversas espécies dependendo da luminosidade recebida, do ano em que o material foi coletado ou das condições do ambiente em geral 28.
Assim, para propor critérios de padronização de medicamentos fitoterápicos é essencial conhecer a variabilidade na composição química da espécie vegetal utilizada como matéria prima 34. Neste aspecto, técnicas de metabolômica untargeted utilizando estratégias baseadas em análises por LC-MS, por exemplo, são particularmente importantes para pesquisas com plantas, por possuírem uma grande riqueza de metabólitos, na sua maioria semi-polares, que podem ser detectados e separados por esta técnica 35,36.
Com relação às flutuações sazonais na composição química do gênero Maytenus há apenas um estudo na literatura realizado com a espécie M. aquifolium, no qual Yariwake et al. (2005) 34 observaram mudanças na concentração de fenóis totais, triterpenos totais e flavonóides totais. Neste trabalho, observou-se que as plantas apresentaram maior teor de flavonóides e fenóis totais durante a primavera, enquanto que no inverno apresentaram maior teor de triterpenos 34. Porém, tal estudo acompanhou a variação sazonal apenas por análises genéricas de absorbância, que não distinguem componentes individuais dos extratos.
Portanto, o presente trabalho teve como objetivo analisar a composição química dos extratos de exemplares de M. ilicifolia, M. aquifolium e de indivíduos híbridos resultantes do cruzamento de ambas as espécies, ao longo de um ano, via cromatografia líquida de ultra-alta eficiência acoplada à espectrometria de massas (UHPLC-MS). A atividade antioxidante foi avaliada através de ensaios antioxidantes de DPPH e ORACFL, visando futuramente obter
fitoterápicos mais padronizados para o tratamento de distúrbios gástricos.
Parte 1
–
1.1. INTRODUÇÃO
Os metabólitos são compostos orgânicos de baixa massa molecular, que podem ser caracterizados como reagentes, intermediários ou produtos do metabolismo de diversos organismos 37,38. Diferentemente dos genes, transcritos e proteínas, os metabólitos não são codificados diretamente no genoma, mas servem como marcadores da atividade bioquímica. Por esta razão, o estudo dos metabólitos tem se mostrado uma ferramenta útil para caracterizar amostras biológicas e relacionar atividade molecular com fenótipo 39,40.
Estima-se que o reino vegetal possua aproximadamente 200.000 metabólitos diferentes, muitos dos quais são responsáveis pela sobrevivência das espécies em diferentes nichos ecológicos e condições ambientais, além de proporcionar matéria prima para a indústria alimentícia ou farmacêutica 41,42. Tais compostos são conhecidos como metabólitos secundários e são produzidos a partir de vias bioquímicas derivadas do metabolismo primário, sendo largamente distribuídos no reino vegetal, especialmente nas plantas vasculares 43.
Os metabólitos secundários são frequentemente referidos como responsáveis pela manutenção dos processos biológicos nas plantas e diversos estudos demonstraram que estes possuem um importante papel na defesa contra patógenos e herbívoros44, conferem proteção contra estresse ambiental43 e contribuem para os odores e colorações específicos das plantas
45
. A acumulação de compostos fenólicos e fenilpropanóides, por exemplo, é altamente influenciada por estresse nutricional, ataques de patógenos, radiação UV, temperatura e presença de herbicidas 46,47.
Apesar dos metabólitos serem alvo de pesquisa desde meados de 1980, somente em 2001, o termo “metabolômica” foi criado e utilizado para descrever tais estudos 44. A metabolômica tem como finalidade identificar e quantificar os metabólitos dentro de um sistema biológico (metaboloma) e tem se mostrado uma técnica versátil, amplamente utilizada pela indústria e pela ciência, em diversas áreas biológicas, como medicina, toxicologia, nutrição, dentre outras 43,48. A área passou por progressos notáveis dentro da última década e implementou novas ferramentas que possibilitam correlacionar mudanças bioquímicas e fenótipo, sendo aplicada com sucesso, por exemplo, na análise do fenótipo químico de plantas em resposta a condições ambientais 49–52.
O metaboloma pode ser analisado através de duas estratégias: targeted e untargeted. A metabolômica do tipo targeted se refere ao método no qual uma lista específica de metabólitos é mensurada e analisada, tipicamente focando em uma ou mais rotas metabólicas previamente definidas. A metabolômica do tipo untargeted, por sua vez, aplica métodos de análise global da composição química e tem o objetivo de mensurar, simultaneamente, a maior quantidade de metabólitos possíveis, dentro de uma amostra biológica 50.
Os estudos na área de metabolômica tipicamente seguem uma sequência de passos ou processos, denominada de workflow. A Figura 1 representa graficamente os passos envolvidos nas pesquisas metabolômicas: iniciando com a pergunta biológica, em seguida o desenho experimental, a aquisição e préprocessamento dos dados, finalizando com as análises estatísticas; para permitir possíveis identificações químicas e obter uma interpretação biológica dos resultados obtidos.
Uma vez que o desenho experimental tenha sido propriamente definido, o passo seguinte envolve aquisição dos dados. A plataforma analítica e a forma de extração dos compostos de interesse deve ser escolhida em de acordo com as exigências da amostra. Entretanto, devido à grande diversidade de metabólitos presentes no reino vegetal, em diferentes concentrações, não há, atualmente, um método analítico capaz de extrair e detectar todos os compostos em uma dada amostra vegetal 53. Dos 200.000 metabólitos diferentes presentes nas plantas, menos de um quarto tiveram suas estruturas moleculares elucidadas 54. Felizmente, novos avanços na área de metabolomica, como técnicas hifenadas e de alta resolução de espectometria de massas têm contribuido para o estudo destes componentes 55–57. Uma das principais técnicas para geração de dados em metabolômica de plantas é a espectrometria de massas (MS), utilizada no presente trabalho. A espectrometria de massas é amplamente empregada devido à sua sensibilidade, rapidez e ampla aplicação e tem a finalidade de determinar a razão massa/carga (m/z) e a abundância dos íons dos compostos das amostras 36.
Para isso, três componentes são fundamentais no equipamento: fonte de ionização, analisador de massas e detector 58. Para que a análise ocorra, a amostra é inicialmente introduzida ao espectrômetro de massas por infusão direta ou cromatografia. Dependendo do tipo de extrato utilizado, a Cromatografia Gasosa (GC) ou a Cromatografia Líquida (LC) são mais comumente aplicadas para separações dos metabólitos de interesse, antes destes serem detectados pelo espectrometro de massas 36. Estratégias baseadas em análises por LC-MS, por exemplo, são particularmente importantes para pesquisas com plantas, uma vez que o reino vegetal possui uma grande riqueza de compostos metabólitos, na sua maioria semi-polares, que podem ser detectados e separados pela técnica de LC-MS 35,36. Após a separação por LC, os compostos são direcionados à ionização por eletrospray, no qual ocorre a transferência de íons de uma solução para fase gasosa, formando um “spray” eletrostático. Para isso, é necessária uma fonte de alta tensão (1000 a 7000V) em contato com a solução, que será bombeada através de um capilar, sendo ionizada. Os íons formados serão então selecionados, de acordo com o potencial de ionização utilizado.
Para os estudos de metabolômica untargeted, após a aquisição dos dados, o préprocessamento tem se tornado um prérequisito essencial devido à complexidade dos dados gerados. O préprocessamento tem como objetivo identificar, com precisão, os íons detectados e converter os dados brutos em tabelas de picos, sendo realizado através de vários passos, que incluem filtragem, detecção de features, alinhamento e normalização 59.
Pergunta Biológica
Desenho
Experimental Aquisição de dados
Préprocessamento de dados Análise Estatística Identificação Química Interpretação Biológica
Os métodos de filtragem processam os dados brutos a fim de remover ruídos e determinar a linha de base. A detecção de features tem a finalidade de identificar os sinais gerados por íons reais, evitando detecção de falsos positivos como adutos e moléculas duplicadas. O alinhamento dos picos, por sua vez, corrige os tempos de retenção entre as corridas cromatográficas agrupando os dados de diversas amostras. A normalização tem como objetivo remover viés indesejado nas medições de sinais dos íons mantendo as variações biológicas de interesse 59.
Uma vez préprocessados, os dados obtidos devem ser, a seguir, analisados por métodos estatísticos apropriados, sendo a PCA (Principal Component Analysis) o método mais comumente utilizado 60. A PCA é uma análise exploratória multivariada que se baseia na redução dos dados à dimensões ou componentes. A maior variação entre as amostras pode ser observada no primeiro componente ou PC1, a segunda maior variação, no segundo componente (PC2) e assim por diante. A PCA é utilizada para explorar as relações entre as amostras e tem como objetivo revelar os fatores mais importantes responsáveis pela variabilidade entre elas, caracterizando o conjunto de dados 60.
Um dos principais desafios da metabolômica, principalmente se tratando de métodos baseados em LC-MS, é a identificação dos metabólitos e sua elucidação estrutural, essenciais para obter significado biológico associado às features detectadas no estudo metabolômico
60,61. Devido à grande variação nos padrões de fragmentação para iferentes tipos de
instrumentos utilizados, não é possivel comparar diferentes espectros, sendo possível realizar a indentificação apenas com a utilização de padrões analíticos. Desta forma, grande esforço tem sido direcionado na última década para tornar este processo mais eficiente e barato 60.
Por fim, a interpretação biológica dos resultados é o passo que demanda maior tempo e recurso uma vez que a função dos metabólitos é diretamente relacionada às vias metabólicas que, uma vez determinadas, possibilitam interpretações biológicas dos resultados obtidos 61.
Baseado nisso, este trabalho descreve um estudo de metabolomica untargeted, com a finalidade de verificar as alterações no metaboloma de duas espécies de Espinheira Santa –
Maytenus ilicifolia e Maytenus aquifolium – e de indivíduos híbridos derivados de seu
cruzamento, em amostras coletadas ao longo de um ano O workflow descrito anteriormente foi implementado para as análises, nas quais foi utilizado equipamento de cromatografia liquida de ultra alta eficiência acoplado à espectrometria de massas (UHPLC-MS).
1.2. OBJETIVO
Avaliar a variação na composição química dos extratos de folhas de M. ilicifolia, M.
aquifolium e da população híbrida derivada do cruzamento de ambas as espécies por LC-MS e
1.3. MATERIAL E MÉTODOS
1.3.1. Material vegetal e Sazonalidade
Foram utilizadas folhas de Maytenus ilicifolia Mart ex Reiss, Maytenus aquifolium Mart. e da população híbrida derivada do cruzamento de ambas as espécies, localizadas no Centro de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) em Paulínia (SP). Os indivíduos híbridos foram cultivados ativamente, após observada a hibridização natural entre M.ilicifolia e M. aquifolium no campo experiemental do CPQBA.
Os indivíduos de M. ilicifolia e M. aquifolium estavam dispostos em fileiras, com espaçamento de 4 x 4 metros entre cada planta, porém, devido ao acentuado crescimento da copa, apresentavam contato entre os ramos de diferentes indivíduos. Os indivíduos híbridos, por sua vez, estavam isolados em relação aos parentais, também dispostos em fileiras, com espaçamento de 4 x 2 metros.
Cada espécie e o híbrido foram amostrados por 5 indivíduos. As coletas foram realizadas preferencialmente na penúltima semana do mês, a partir do dia 20, sempre no período da manhã, por volta das 9h (Tabela 1).
Tabela 1. Datas das coletas realizadas
COLETA Data 1 29/11/2016 2 20/12/2016 3 25/01/2017 4 22/02/2017 5 21/03/2017 6 26/04/2017 7 24/05/2017 8 21/06/2017 9 26/07/2017 10 23/08/2017 11 26/09/2017 12 25/10/2017
As folhas foram coletadas sempre dos mesmos indivíduos, mensalmente durante um ano, em alturas diferentes ao redor de toda a planta. Logo após a coleta, as folhas foram congeladas e mantidas em freezer a -80 ºC e depois liofilizadas e trituradas. Ao término do ciclo de coletas foram realizadas as extrações aquosas e análise por UHPLC-MS.
Os dados meteorológicos do ano de coleta (Novembro de 2016 a Outubro de 2017) foram obtidos da Estação Meteorológica CEPAGRI –UNICAMP (22°48´56"S, 47°03´28"W, 664 m), e com os dados de temperatura, radiação incidente e pluviosidade foram plotados gráficos com as médias mensais.
1.3.2. Preparação dos extratos
Após testes preliminares para determinação do método analítico foi padronizado o preparo dos extratos das folhas da seguinte forma: 20 mg de folhas liofilizadas para 10 mL de água purificada Milli-Q, com maceração assistida por ultrassom por 30 minutos. Estes extratos foram analisados por UHPLC-MS.
1.3.3. Análise por UHPLC-MS de baixa resolução
Para as análises cromatográficas foi utilizado um Cromatógrafo Líquido de Ultra Alta Eficiência–UPLC® Acquity da Waters acoplado com um espectrômetro de massas TQD Acquity com fonte de ESI, utilizando uma coluna C18 BEH Acquity Waters (1,7μm x 2,1mm x 50mm) com temperatura do forno em 30°C e um gradiente de fase móvel utilizando 0.1% ácido fórmico em água purificada (A) e acetonitrila (B).
As condições do gradiente de fase móvel foram: 95% A e 5% B no início da corrida, 75% A e 25% B em 4 minutos, 50% A e 50% B em 6,10 minutos, 1% A e 99% B em 6,20 minutos, retornando para 95% A e 5% B em 8,50 minutos, estabilizando até 10 minutos, tudo em vazão de 200 μL/min.
Os espectros de massa foram obtidos com ionização por eletrospray em modo negativo (ESI-) nas seguintes condições: Capilar à 4.00 kV, Cone à 25 V, Extrator à 3 V, temperatura da fonte à 150 ºC, temperatura de dessolvatação à 250 ºC.
1.3.4. Análise por UHPLC-MS de alta resolução
Para auxiliar na identificação de compostos encontrados nos extratos, foram também realizadas análises em aparelho de espectrometria de massas de alta resolução, utilizando-se Cromatógrafo Líquido de Ultra Alta Eficiência–UHPLC® da Agilent. A coluna e as condições cromatográficas foram as mesmas usadas com nas análises de baixa resolução. Os espectros de massas foram obtidos com ionização por eletrospray em modo negativo no Q-TOF da Agilent na faixa entre m/z 50 e 1000, nas seguintes condições: capilar 3,5 KV, voltagem do cone 320 V e vazão do gás 12 L/min, temperatura de gas de nebulkização 290 oC, temperaturas de gas de dessolvatação 350 oC.
1.3.5. Estatística
Os cromatogramas e espectros obtidos por UHPLC-MS foram préprocessados e alinhados através do software XCMS Online e desta forma foram obtidos features identificados inicialmente pelo seu tempo de retenção e valor de massa carga (m/z) do composto, para cada espécie de Espinheira Santa. Utilizando valores de intensidade (decorrentes da área do pico) de cada feature foi possível realizar Análises de Componentes Principais multivariada (PCA), utilizando o software online MetaboAnalyst e testes one-way ANOVA e Tukey através do software GraphPad 6.
1.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
1.4.1. Material Vegetal e Sazonalidade
Durante o primeiro período deste trabalho foram realizadas todas as 12 coletas propostas no projeto como constam na Tabela 1. Foram coletadas amostras de 5 indivíduos de cada espécie e da população híbrida, mensalmente, totalizando 180 amostras durante o ano. As excicatas de Maytenus ilicifolia, Maytenus aquifolium e Híbridas foram depositadas no Herbário do Institulo de Biologia – Unicamp, sob códigos UEC199156, UEC199157 e UEC199158, respectivamente. Além disso, o projeto de pesquisa foi devidamente registrado na plataforma SisGen, como exigido pela Lei nº 13.123.
Logo após as coletas, como previsto no projeto, as plantas foram congeladas a -80ºC, liofilizadas e trituradas, sendo mantidas em local fresco e seco, até o dia das análises cromatográficas, que ocorreram no mês de Dezembro de 2017.
1.4.2. Preparação dos Extratos
A preparação dos extratos e as análises por UHPLC-MS foram realizadas utilizando-se o método analítico previamente otimizado pelo grupo de pesquisa. Através de testes preliminares, verificou-se que a proporção de folhas e líquido extrator indicada na Farmacopéia Brasileira de 3 g para 150 mL, era demasiadamente concentrada para análises cromatográficas, saturando o solvente.
Desta forma, todos os extratos analisados por UHPLC-MS foram preparados utilizando-se 20 mg de folhas liofilizadas e trituradas para 10 mL de água purificada Milli-Q, com apenas uma extração por 30 minutos em sonicador e filtradas para análise via UHPLC-MS.
1.4.3. Análise por UHPLC-MS
Durante o desenvolvimento do método, foram testados outros solventes analíticos como metanol e água purificada com 0,1% (v/v) de hidróxido de amônio. Porém, foi observado que tanto com a utilização de metanol quanto acetonitrila não havia modificação na resolução e na separação cromatográfica, e foi preferido o uso do solvente acetonitrila devido à menor pressão no sistema. Com relação à água purificada com 0,1% (v/v) de hidróxido de amônio (água básica), foi observado uma piora na resolução cromatográfica e, por isso, foi determinado o uso de água purificada com 0,1% (v/v) de ácido fórmico (água ácida).
Os espectros de massa foram adquiridos em modo Full Scan (m/z 100 a 1500), com ionização por eletrospray modo negativo (ESI-) nas condições descritas no item Error!
Reference source not found.Error! Reference source not found.MATERIAL E
MÉTODOS.
A escolha pela ionização em modo negativo (ESI-) foi pautada em análises prévias, nas quais foram feitas comparações entre os diferentes modos de ionização. Foi observado que os cromatogramas e os espectros em modo positivo (ESI+) eram pouco reprodutíveis e os compostos presentes nos extratos eram pouco ionizados, se comparados com a ionização em modo negativo (ESI-) (Figura 2 e Figura 3, respectivamente). Tal resultado corrobora com o observado em outros estudos, nos quais foi verificado que a composição das espécies do gênero Maytenus, é predominantemente formada por flavonóides e compostos fenólicos, de caráter ácido, cuja ionização é maior em modo negativo 62.
Figura 2. Cromatogramas UHPLC-MS típicos dos extratos e do híbrido (A), M. aquifolium
(B) e M. ilicifolia (C), com ionização em modo positivo (ESI+).
A
B
Figura 3. Cromatogramas UHPLC-MS típicos dos extratos e do híbrido (A), M. aquifolium
(B) e M. ilicifolia (C), com ionização em modo negativo (ESI-).
Além das análises dos extratos das plantas coletadas mensalmente, foram preparadas amostras de controle de qualidade (QC), compostas por folhas liofilizadas e trituradas de todos os indivíduos de cada espécie e de todos os meses coletados. As amostras QC foram utilizadas para acompanhar o funcionamento do aparelho de UHPLC-MS e verificar a consistência do mesmo durante as corridas cromatográficas, cuja duração total foi de uma semana. Todas as amostras foram analisadas em duplicata e as amostras QC foram adicionadas a cada 12 injeções, totalizando 42 amostras de QC.
1.4.4. Análise metabolômica e estatística
Os 402 cromatogramas e espectros obtidos através da análise por UHPLC-MS foram préprocessados através do software XCMS Online no qual foi realizado o alinhamento dos picos, possibilitando detecção de features (tempo de retenção e m/z) para cada espécie de Espinheira Santa.
Os parâmetros fornecidos ao software XCMS Online para realização desta etapa estão disponíveis no Anexo 1. O software detectou 157 features, mas muitos eram redundantes;
A
B
eram adutos e /ou fragmentos do mesmo composto. Portanto os resultados forarm inspecionados e filtrados de acordo com a relação massa/carga, adutos e tempo de retenção, reduzindo para 24 features descritas na Tabela 2.
Tabela 2. Features observadas nas análises de LC-MS dos extratos das duas espécies de
Maytenus e suas híbridas. Rt (tempo de retenção), m/z ( relação massa/carga do composto).
Feature m/z Rt (min) M305T2 305 2,449 M625T1 625 1,370 M315T2 315 1,799 M451T2 451 1,895 M461T2 461 2,094 M289T2 289 2,756 M577T3 577 2,978 M369T3 369 3,091 M329T3 329 3,157 M289T3 289 3,253 M917T3 917 3,425 M755T4 755 3,517 M901T4 901 3,697 M739T4 739 3,782 M431T4 431 3,885 M433T4 433 3,956 M833T4 833 4,086 M593T4 593 4,098 M463T4 463 4,181 M725T5 725 4,535
M469T6 469 5,993
M689T7 689 7,228
M703T7 703 7,289
M293T7 293 7,430
Após a detecção das features, utilizando valores de intensidade do íon de cada uma, foi possível realizar as Análises de Componentes Principais (PCA), utilizando o software online MetaboAnalyst e os testes estatísticos de ANOVA e Tukey, utilizando o software GraphPad 6.
Através das análises de PCA foi possível observar três agrupamentos bem definidos, que coincidiram com as duas espécies e os híbridos. Apesar de possuírem perfis cromatográficos semelhantes (Figura 3), possuem áreas relativas diferentes para cada feature, sendo possível realizar a diferenciação entre elas (Figura 4 e Figura 5).
Figura 4. Score Plot de PCA com os agrupamentos das amostras analisadas por UHPLC-MS
Figura 5. Biplot do PCA indicando as features responsáveis pelas separações observadas.
Ao lado esquerdo do Score plot de PCA, como mostra a Figura 4, encontram-se as amostras de M. aquifolium, à direita as amostras de M. ilicifolia e ao centro, juntamente com as QCs, encontram-se as amostras de plantas híbridas indicando que sua composição química é intermediária entre ambas as espécies. Os agrupamentos observados podem ser explicados por 52,4% da variação da análise de PCA (PC1 + PC2).
Entretanto, como é possível observar, alguns pontos podem ser considerados como outliers em relação aos demais da populaçao híbrida. Tais pontos representam o indivíduo hibrido 4 que mais se assemelham à M. ilicifolia (Figura 4).
As diferenças observadas nos gráficos de PCA se devem principalmente a algumas
725, 703, 689, 369, 461 e 433 foram responsáveis pela diferenciação das amostras de M.
aquifolium em relação às demais. Em contrapartida, as features de m/z 469, 451, 315, 625,
739, 593, 833, 755 e 289 foram responsáveis pela separação da as amostras de M. ilicifolia (Figura 5).
Além disso, através da PCA foi demonstrada a qualidade e reprodutibilidade no preparo e extração das amostras além da consistência do equipamento de UHPLC-MS durante as análises, uma vez que as amostras de QC se mostraram bem agrupadas ao centro do gráfico de PCA (Figura 4).
Para confirmar os resultados obtidos pelas análises de PCA, em especial com relação às diferenças entre as espécies e as features responsáveis pelas separações observadas, foram realizadas análises estatísticas de ANOVA e teste Tukey e foram plotados gráficos com média e desvio padrão das intensidades de cada feature, por espécie (Figura 6 e Figura 7).
Figura 6. Intensidades médias de cada feature por cada as duas espécies de Espinheira Santa
e seu híbrido. Letras diferentes dentro do mesmo gráfico indicam diferença significativa pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Barras representam o erro padrão (n=120) (p ≤ 0,05).
Figura 7. Intensidades médias de cada feature por cada as duas espécies de Espinheira Santa e seu híbrido. Letras diferentes dentro do mesmo gráfico indicam diferença significativa pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Barras representam o erro padrão (n=120) (p ≤ 0,05).
As features mais intensas em M. ilicifolia foram: M625T1, M315T2, M451T2, M755T4, M739T4, M833T4, M593T4, M463T4, M469T4 podendo ser considerados marcadores desta espécie. Por outro lado os features mais intensos em M. aquifolium foram: M369T3, M917T3, M9014, M433T4, M689T7, M703T7, podendo ser considerados marcadores desta espécie.
Os indivíduos híbridos apresentaram áreas intermediárias entre as duas espécies para a maioria das features. Para algumas, porém, a área era equivalênte à uma das espécies parentais e somente para as features M577T3 e M293T7 foi observada uma maior abundância. Este comportamento possivelmente é decorrente da mistura entre genótipos presentes nos híbridos.
Foi observado, portanto, que todas as 24 features demonstraram diferença significativa por ANOVA, com valor de p ≤ 0,05 quando analisadas e comparadas por espécie, sendo responsáveis pela separação observada no score plot de PCA. Entretanto, por tais análises não foram observados agrupamentos indicando variação sazonal, desta forma, foi realizada análise de PCA com cada espécie separadamente e ANOVA com suas respectivas features.
1.4.5. Análise metabolômica e estatística das amostras por espécie
Ao analisar cada espécie separadamente, nas PCA realizadas por espécie também não foi possível observar agrupamentos indicando variação sazonal, o que demonstra que as diferenças entre espécies foram maiores que a sazonalidade, reforçando a importância da identificação taxonômica, independente da época do ano (Figura 8, Figura 9 e Figura 10).
Entretanto, durante o período de coleta, os indivíduos das espécies M. ilicifolia e M.
aquifolium estavam sob constante estresse devido à plantas parasitas. No mês de Setembro,
porém, foi realizada poda e limpeza do campo experimental no qual tais espécies se encontravam. Desta forma, alguns dos indivíduos de M. ilicifolia, selecionados para a coleta sofreram poda acidental e através da PCA é possível perceber um agrupamento destes indivíduos para os meses de Setembro e Outubro (Figura 8).
Além disso, com relação aos indivíduos híbridos, é possível observar um agrupamento à direita do score plot de PCA, formado pelo indivíduo morfologicamente semelhante à espécie M. ilicifolia (indivíduo 4). Tal indivíduo apresenta porte e folhas menores e ramificações desde a base, diferentemente dos demais indivíduos da população híbrida, que à
semelhança da espécie M. aquifolium, apresentam porte e folhas maiores e um tronco central, não ramificado. Através da PCA é possível perceber que as diferenças químicas refletiram as diferenças morfológicas, separando os demais indivíduos daquele semelhante à M. ilicifolia (Figura 10).
Figura 8. PCA com amostras analisadas por UHPLC-MS dos extratos da espécies M.
Figura 9. PCA com amostras analisadas por UHPLC-MS dos extratos da espécies M.
Figura 10. PCA com amostras analisadas por UHPLC-MS dos extratos dos indivíduos
híbridos. Biplot em Anexo 4.
Porém, ao comparar a variação de cada feature por mês, dentro de cada espécie, 16
features mostraram diferenças estatisticamente significativas dentre as amostras de M. ilicifolia, 8 features nas amostras de M. aquifolium e 5 features nas amostras dos indivíduos
Figura 11. Variação de intensidade média e erro padrão das features válidas por mês nos
indivíduos da espécie M. ilicifolia. Os asteriscos indicam diferença significativa pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Barras representam o erro padrão (n=10) (p ≤ 0,05).
Figura 12. Variação de intensidade média e erro padrão das features válidas com valor p ≤
0,05 por mês nos indivíduos da espécie M. aquifolium. Os asteriscos indicam diferença significativa pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Barras representam o erro padrão (n=10). (p ≤ 0,05).
Figura 13. Variação de intensidade média e erro padrão das features válidas com valor p≤
0,05 por mês nos indivíduos Híbridos. Os asteriscos indicam diferença significativa pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Barras representam o erro padrão (n=10). (p ≤ 0,05).
Para tais features, foi possível observar diferenças nas intensidades de cada uma, mês a mês. Para os indivíduos de M. ilicifolia, em relação à todos os outros meses, houve variação mensal significativa para a feature M289T2, cuja intensidade foi maior no mês de outubro (Figura 11e).
Para confirmar tal resultado, foi realizado o teste Tukey para a feature M289T2, mês a mês, por indivíduo, para verificar se a poda acidental, que afetou somente dois indivíduos, foi de fato responsável pelo resultado observado em M. ilicifolia. Nota-se, a partir da observação
dos gráficos, o aumento da feature M289T2 nos indivíduos podados já em Setembro e se mantendo alta no mês seguinte. Porém, em outubro, os demais indivíduos de M. ilicifolia também apresentaram aumento significativo (Figura 14).
Figura 14. Variação de intensidade da feature M289T2, mês a mês nos cinco indivíduos de
M. ilicifolia. Os asteriscos indicam diferença significativa pelo teste de Tukey a 5% de
Para os indivíduos de M. aquifolium em relação a todos os outros meses, houve variação mensal significativa para a feature M625T1, cuja intensidade foi maior no mês de maio (Figura 12b). Para os indivíduos híbridos, as features M689T7 e M703T7 também apresentaram maior intensidade no mês de outubro que nos outros meses (Figura 13c, d). As demais features apresentaram variabilidade mensal, porém sem diferenças estatisticamente significativas.
1.4.6. Identificação de features
Com a finalidade de compreender a relação entre as mudança de intensidade observadas, foi realizada revisão bibliográfica a fim de obter propostas de identificações das
features observadas neste trabalho. Foi verificado que algumas das features detectadas no
presente estudo também foram observadas por outros autores, como no caso das análises realizadas por Tiberti et al, (2007) 20 no qual foram detectados as m/z 917, 901, 755, 463, 593 e 725, nos extratos de folhas de M. ilicifolia, M. aquifolium e dos indivíduos híbridos.
Tais features foram identificadas como sendo flavonóides e foram detectadas nas mesmas espécies, com a m/z 725 presente em maior quantidade na M. aquifolium e na hibrida e a m/z 593 sendo mais abundante em M. ilicifolia 20. Além disto, neste mesmo estudo, o íon de m/z 463 foi detectado em dois tempos de retenção diferentes (12,0 e 12,4 minutos) e foi identificado como Hiperosídio e Isoquercitrina respectivamente. É possível que este mesmo íon, encontrado no presente trabalho no tempo de reteção 4,18 minutos, seja um destes compostos,embora não foi possível sua identificação por comparação com padrão.
Em estudo realizado por Souza et al. (2008) 63, também foram detectadas, nos extratos de M. ilicifolia, algumas features com o mesmo valor de m/z: 289, 463, 577, 593 e 833, identificados como pertencentes aos grupos dos taninos e flavonóides 64. Em outro estudo, Souza et al. (2009) também obtiveram os seguintes íons detectados em análises dos extratos de M. ilicifolia: m/z 917, 901, 755, 739, 625, 433, 593, 463 e 433, identificados como pertencentes à família dos flavonóides glicosilados.
Baggio et al. (2009) 65, através do uso de HPLC-MS, também detectaram e identificaram parcialmente, em extratos de M. ilicifolia, os m/z 289 (catequina e epicatequina), 463 e 433 (flavonoides monoglicosilados), 593 (flavonoide diglicosilados), 755 e 739 (flavonoide triglicosilado), 917 e 901 (flavonoides tetraglicosilados) e 833 e 577 (taninos), corroborando com os estudos citados anteriormente.
Em estudo realizado por Fonseca et al. (2007) 66, mesmo em análise de extrato de folhas de outra espécie deste gênero (M. truncata), foram detectados dois íons com os m/z 901 e 917 também encontrados no presente trabalho. Através do uso de espectrometria de massas (MS) e ressonância magnética nuclear (NMR), os autores identificaram o íon 901 como
Canferol-3-O-ramnopiranosil-O-glicopiranosil-O-ramnopiranosil-O-galactopiranosídeo e o íon 917 como
Quercetina-3-O-ramnopiranosil-O-glicopiranosil-O-ramno-piranosil-O- galactopiranosídeo, ambos flavonoides glicosilados.
As amostras de M. ilicifolia, M. aquifolium e dos indivíduos Híbridos foram também analisadas em equipamento de alta resolução. Tal análise forneceu valores de m/z mais precisos para algumas das features detectadas e através do uso da ferramenta de pesquisa “Elemental Composition” (EleComp) do software MassLynx v.4.1, foi possível obter a fórmula química proposta para 13 features.
Assim, com a fórmula química obtida, com base na massa de alta resolução, no programa MassLynx, juntamente com os dados da literatura citados anteriormente e as propostas de indentificação da literatura em espécies do gênero Maytenus, também foi possível propor identificações para os íons detectados no presente trabalho (Tabela 3).
Tabela 3. Valores de massa de alta resolução, identificações propostas e referências
das features detectadas em extratos de folhas de Espinheira Santa. Afz→afzelequina ou epiafzelequina; Cat→catequina ou epicatequina; Gall→gallocatequina or epigallocatequina; Rha→rhamnose; Ara→arabinose; Kaemp→kaempferol; Hex→glucose ou galactose.
feature
Massa alta resolução
EleComp Proposta de identificação Ref.
M305T2 - - fragmento principal de m/z 577 64 M625T1 - - Hex-Hex-Quer 65 M315T2 - - - - M451T2 - - - - M461T2 - - - - M289T2 290.079 C15H14O6 Catequina
M369T3 - - - - M329T3 330.099 C14H18O9 - - M289T3 290.079 C15H14O6 Epicatequina M917T3 918.264 C39H50O25 Quercetina-3-O-ramnopiranosil-O- glicopiranosil-O-ramno-piranosil-O-galactopiranosídeo 66 M755T4 756.211 C33H40O20 Rha-Rha-Hex-Quer 65 M901T4 902.269 C39H50O24 Canferol-3-O-ramnopiranosil-O- glicopiranosil-O-ramnopiranosil-O-galactopiranosídeo 66 M739T4 740.217 C33H40O19 Rha-Rha-Hex-Kaemp 65 M431T4 - - - - M433T4 434.215 C20H34O10 Ara-Quer 65 M833T4 834.215 C45H38O16 Afz–Afz–Cat 65 M593T4 594.158 C27H30O15 Kaempferol-deoxihexosil-hexosidio / Quercetina-deoxihexosil-deoxihexosidio / Quercetina-deoxihexosil-hexosidio / Rha-Hex-Kaemp 64,65
M463T4 464.095 C21H20O12 Hex-Quer / Quercetin-hexoside / Hiperosídeo / Isoquercitina 20,64,65 M725T5 - - - - M469T6 - - - - M689T7 690.326 C36H50O13 - - M703T7 704.341 C37H52O13 - -
M293T7 294.183 C17H26O4 - -
De todas as 24 features detectadas, somente 11 foram identificadas parcialmente e duas foram confimadas por comparação com padrão analítico. As features M289T2 e M289T3 foram identificadas respectivamente como catequina e epicatequina.
Assim, é provável que a poda acidental tenha causado, nos indivíduos 2 e 5, um aumento na intensidade da catequina (M289T2), composto pertencente ao grupo químico dos polifenóis que, por sua vez, estão relacionados à resposta ao estresse por dano físico 29–33.
De acordo com a revisão de Baron et al. (1995) 29, em alguns estudos foi verificado que a resposta das plantas à injúria inclui a indução de genes cuja finalidade é reforçar a parede de células danificadas. Além disso, a resposta à injúria pode também promover a defesa contra ataques de herbívoros, através da produção de fitoalexinas, síntese de inibidores de proteinases ou acúmulo de compostos fenólicos.
Edwards et al. (1983) 30 afirmam que a resposta à injúria possui três níveis, dependendo da espécie vegetal afetada ou dos processos químicos envolvidos: (1) a resposta pode ser localizada e mudanças químicas ocorrem como consequência do rompimento das células; (2) as modificações químicas ocorrem aos arredores da área afetada, nos quais os níveis das substâncias sintetizadas em resposta à injúria são altas; (3) as respostas são mais dispersas e podem afetar o órgão todo, partes da planta ou até mesmo todo o indivíduo.
Uma das repostas mais conhecidas associadas à injúria é o aumento dos níveis de compostos fenólicos nos arredores das células danificadas. As substâncias mais comuns formadas em resposta aos danos são acido clorogênico e isoclorogênico, além de ácido p-coumarico, acido cafeico e escopoletina 30. Sun et al. (2018), por exemplo, verificaram, através de análises por HPLC das folhas de árvores de Camelia sinensis, o acúmulo de epigalocatequina galato em folhas dos indivíduos submetidos à poda e a diminuição dos níveis de de cafeína e epicatequina nestes mesmos indivíduos 31.
Karban et al. (1989), em revisão, também apresentam inúmeros trabalhos em que foi observado que uma das respostas à injúria é o aumento dos níveis de taninos e compostos fenólicos nas folhas das plantas afetadas, além da produção de etileno que por sua vez, influencia na concentração de compostos secundários 32. Corroborando com tais estudos, Wun
Ke et al. (2018) observaram que os níveis de epigalocatequina e epicatequina, antocianinas, flavonóides e polifenóis totais foram maiores após exposição plantas de C. sinensis ao precursor de etileno, indicando que a sinalização por tal fitohormônio está envolvida na acumulação de compostos secundários e sua atividade antioxidante 33.
Apesar de tais artigos tratarem principalmente de injúria causada por herbívoros, a poda acidental ocorrida em setembro pode ter mimetizado uma condição semelhante, ainda que extrema, levando à respostas das plantas comumente direcionadas à herbivoria. Alguns trabalhos relataram que a injúria artificial causada pela poda das plantas gera respostas semelhantes às obtidas após injúria por herbivoria, sendo tal resposta o aumento de compostos fenólicos nas plantas estudadas 32,67.
Por outro lado, o aumento na intensidade da feature M289T2 (catequina) nos indivíduos que não sofreram poda acidental pode estar relacionado a mudanças climáticas no mês de outubro (Figura 15), no qual se observou queda na temperatura e radiação incidente média 68,69, ou à sinalização química relacionada à injúria sofrida pelos outros indivíduos no campo experimental, capaz de induzir o acúmulo de compostos fenólicos nos indivíduos que não sofreram a poda 70–73.
Figura 15. Médias mensais da Radiação Incidente, Pluviosidade e Temperatura durante o ano
de coleta
Nozzolillo et al. (1989), por exemplo, verificaram mudanças sazonais nos constituintes fenólicos de indivíduos de Pinus banksiana, no qual foi observado que as temperaturas mais baixas estimularam maiores quantidades de proantocianidinas, composto pertencente ao grupo químico dos polifenóis, deixando as plantas com colorações mais arroxeadas em contraste com as épocas mais quentes 68.
Christie et al. (1994), demonstraram em estudo com milho (Zea mays) que a exposição a baixas temperaturas também estimulou aumento de deposição de antocianinas nas plantas estudadas. Além disso, através de análises moleculares, os autores observaram que as temperaturas mais baixas aumentaram os níveis transcricionais dos genes envolvidos na via de fenilpropanóide e antocianina 69.
Ambos os estudos tratam de temperaturas em torno de 10 ºC a 25 ºC, sendo os resultados mais impactantes obtidos nas plantas expostas à 15 ºC. Se comparado com a
temperatura no mês de setembro e outubro, a média caiu de 24 ºC para 20 ºC, uma queda considerável, que poderia ter gerado aumento da feature M289T2 no mês de outubro (Figura 14 e Figura 15) para os indivíduos de M. illicifolia e do híbrido.
Por outro lado, Ellard-Ivey et al. (1996) e Gundlach et al. (1992), demonstraram que a aplicação de metil jasmonato induziu a transcrição de fenilalanina amonia liase (PAL) em culturas de células de soja e salsa, que por sua vez, estimulou acúmulo de compostos secundários, dentre eles, compostos fenólicos 70,71. Corroborando com tais resultados, em trabalho realizado por Campos-Vargas et al. (2001), observou-se que após dano em folhas de alface (Lactuca sativa L. cv. Longifolia), a produção de sinais químicos levou a indução da síntese de PAL, e a acumulação de compostos fenólicos em células fora do sítio da injúria 72.
Além disso, Heredia et al. (2008), em estudo realizado com cenouras (Daucus carota), demonstraram que a exposição à metil jasmonato e etileno, mesmo em plantas que não sofreram injúria, pode levar a uma leve alteração nos níveis de compostos fenólicos, o que também poderia explicar o aumento na intensidade da feature M289T2 nos indivíduos que não sofreram poda acidental 73.
Com relação à feature M625T11, que possivelmente, se trata de um flavonóide monoglicosilado (Tabela 3), foi observada diferença estatística evidente em M. aquifolium, apresentando maior intensidade no mês de maio, no qual houve um grande pico de radiação incidente (Figura 12 e Figura 15). De acordo com a literatura, os flavonóides são compostos cuja produção é maior em exposição à raios UV 74,75.
Chappel et al (1984), por exemplo, demonstraram que em resposta à radiação UV, culturas de células de Petroselinum hortense tiveram a síntese de flavonóides e furanocoumarinas induzida, através da indução da enzima PAL 74. Corroborando com tais resultados, Li et al. (1993), demonstraram que radiação UV-B induziu a produção de compostos derivados de fenilalanina, que possivelmente têm um papel importante na proteção contra radiação devido à capacidade de absorção dos raios UV-B 75.
As features M689T7 e M703T7 dos indivíduos híbridos, podem ter aumentado de intensidade também devido ao clima do mês de outubro, porém, a ausência de dados da literatura não permite sua identificação parcial e consequentemente limita sua discussão. Apesar de tais features apresentarem diferença estatística somente nos indivíduos híbridos, a Figura 7 mostra sua maior intensidade nos indivíduos da espécie M. aquifolium. Neste caso,
portanto, tais features poderiam ser novos marcadores da espécie, não encontrados anteriormente na literatura.
Desta forma, com os análises estatísticas de PCA, ANOVA e Tukey é possível afirmar que todas as 24 features tiveram um papel importante na distinção entre as espécies de Espinheira Santa. As diferenças entre espécies foram maiores que possíveis diferenças sazonais. Além disso, apenas 4 das features detectadas mostraram variação significativa, observada através de um aumento da intensidade de M289T2, M689T7 e M703T7 no mês de outubro – que podem estar relacionadas à poda acidental, à sinalização química ou ao clima deste mês – e de M625T1 no mês de maio – que pode estar relacionada à resposta ao aumento da radiação incidente no mês em questão.
