Marcos Paulo da Silva
SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E ESTUDOS CINÉTICOS DE COMPLEXOS DE COBRE(II) COM
LIGANTES TRIAZÍNICOS COMO MODELOS
BIOMIMÉTICOS DA METALOENZIMA CATECOL OXIDASE
Dissertação submetida ao Programa de Pós-graduação em Química da Universidade Federal de Santa Catarina para a obtenção do Grau de Mestre em Química. Orientador: Prof. Dr. Ademir Neves
Florianópolis 2014
Ficha de identificação da obra elaborada pelo autor, através do Programa de Geração Automática da Biblioteca Universitária
da UFSC.
da Silva, Marcos Paulo
Síntese, caracterização e estudos cinéticos de complexos de cobre(II) com ligantes triazínicos como modelos biomiméticos da metaloenzima catecol oxidase / Marcos Paulo da Silva ; orientador, Ademir Neves – Florianópolis, SC, 2014.
109 p.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas. Programa de Pós-Graduação em Química.
Inclui Referências
1. Química. 2. Catecol oxidase. 3. Complexos de Cu(II). 4. Pireno. 5. DNA I. Neves, Ademir. II. Universidade Federal de Santa Catarina. Programa de Pós-Graduação em Química. III. Título
Marcos Paulo da Silva
SÍNTESE, CARACTERIZAÇÃO E ESTUDOS CINÉTICOS DE COMPLEXOS DE COBRE(II) COMO
MODELOS BIOMIMÉTICOS DA METALOENZIMA CATECOL OXIDASE
Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de “Mestre”, e aprovada em sua forma final pelo Programa de Pós-graduação em Química.
Florianópolis, 27 de fevereiro de 2014. ________________________ Prof. Hugo Alejandro Gallardo Olmedo, Dr.
Coordenador do Curso Banca Examinadora:
________________________ Prof. Ademir Neves, Dr.
Orientador
Universidade Federal de Santa Catarina
________________________ Prof.ª Hérica Aparecida Magosso, Dr.ª Universidade Federal de Santa Catarina
________________________ Prof.ª Maria da Graça Nascimento, Dr.ª Universidade Federal de Santa Catarina
________________________ Prof. Clóvis Piovezan, Dr. Universidade Federal da Fronteira Sul
Este trabalho é dedicado à Deus, à minha família e aos meus queridos amigos.
AGRADECIMENTOS
Primeiro agradeço a Deus por ter me dado muita força para concluir não só este trabalho, mas como uma etapa da minha vida.
Quero aqui agradecer a todos, sem exceção, que tiveram tamanha paciência comigo, até porque neste período nem eu me aguentei direito.
Começarei citando aqueles que amo
profundamente: meu pai Sr. Messias e minha mãe Dona Jô. Vocês me acalmaram e me ajudaram a passar por tudo isso. Obrigado! Também agradeço meus irmãos Bruno e Sandro pela torcida (e pela chatice eterna também) conjuntamente com as cunhadas Carin e Fabi. E a todos da minha família, incluindo primos, primas, tios, tias e adjacentes. Mica, Almir, Kiko, Meire, Tia Dalva, Tia Elza, olha vocês aqui! Todos os outros estão aqui com vocês ok? Não cabem todos!
A todos os meus amigos que, mesmo próximos, ficaram tão distantes... Me desculpem... Haverá um tempo para recuperarmos a saudade.
A Renata Guaita que compartilhou da loucura do mestrado comigo. Por também me oferecer momentos de descontração (pra não dizer bizarros). Aos inesquecíveis Aluísio, Florencia, Larissa Motta, Paty e muitos outros.
Aos queridos “labinquianos” de plantão! Ao Prof. Dr. Ademir Neves pelas palavras de consolo, pela compreensão, pelas ideias e por continuar me aceitando como aluno. Ao meu grande amigo, Prof. Dr. Bernardo de Souza que me ajudou em muitas análises realizadas neste trabalho. O seu jovem pupilo está caminhando também! Ao Prof. Dr. Adailton J.B., pela paciência com meus pseudocristais e a Profª. Dra. Rosely P. pelo incentivo.
A Pós-doc tão querida que me suportou não só no lab, mas também como “estagiário nota 10”, Dra. Renata Osório. Não sei como agradecer por tudo!
Aos meus amigos muito queridos: Graci de PG, Renatinha H., Cacau (tirou quase todas as minhas titulações), Alexandra, Sandro Mireski, Luiza H. Bruna,
Dra. Iolanda C.V., ao Eduardo Zapp e a Dra. Daniela Brondani pela ajuda nas eletroquímicas.
Aos amigos que fiz durante o mestrado e que eu prometi um parágrafo especial: a IC mais legal que já tive, Sheila Meller. Você foi e é muito importante viu? Ao rapaz “precisamente” mais pirado que conheço Thiago Valdares. A pessoa que bem lá no fundo é muito meiga, Beatriz Comelli. Este quarteto promete (me incluí nele) !!!
Aos irmãos da IECODEC, por entenderem este momento. Obrigado pelas orações e pelos momentos de paz e alegria. Deus sempre será conosco.
A Coordenação do PPGQMC, por serem sempre solícitos. Ao Departamento de Química e a UFSC pela estrutura oferecida.
A CAPES pela bolsa concedida. Ao CNPq e INCT-Catálise pelo apoio financeiro.
E novamente a todos que incentivaram (ou não). E a muitos que não foram citados, mas nunca esquecidos. Cheguei de novo! E mais uma vez digo: isto é só o começo!
O temor do Senhor é o princípio do conhecimento; os loucos desprezam a sabedoria e a instrução. (Pv. 1:7)
RESUMO
A influência da segunda esfera de coordenação principalmente na eficiência catalítica de sistemas biológicos, tem sido um importante tema de estudos no contexto da química bioinorgânica. Através de novas estratégias sintéticas, a inserção de agentes intercalantes em ligantes pode ser uma alternativa para potencializar a eficiência de catálise de um complexo. Este trabalho aborda a síntese de dois novos complexos de Cu(II) com ligantes polidentados derivados do núcleo triazínico, utilizando 1,4-diaminobutano como unidade espaçadora e um destes com a unidade pireno como possível agente intercalante do DNA. Ambos foram devidamente caracterizados por técnicas espectroscópicas e eletroquímicas, e estudos cinéticos envolvendo atividade de catecolase dos dois complexos também foram realizados. Os parâmetros cinéticos dos compostos frente à oxidação do substrato modelo 3,5-di-terc-butilcatecol (3,5-DTBC) mostraram que a inserção do espaçador 1,4-diaminobutano e do grupo pireno contribuiu de forma significativa para o aumento da eficiência catalítica desses sistemas. Na verdade, esses grupos influenciam no aumento de Kass, fazendo
com que as interações entre o catalisador e o substrato sejam mais efetivas quando comparadas com o sistema no qual esses grupos estão ausentes.
Testes preliminares em DNA plasmidial revelaram que ambos complexos, em baixas concentrações, são capazes de clivar a dupla fita em suas formas II (circular) e III (linear), ou seja, sua forma totalmente linear. Sendo assim, estes complexos podem ser considerados não só como bons modelos miméticos para a enzima catecol oxidase, mas também como agentes de clivagem do DNA plasmidial.
Palavras-chave: catecol oxidase. complexos de Cu(II). pireno. DNA.
ABSTRACT
The influence of the second coordination sphere on the catalytic efficiency of biological systems has been an important subject of studies in bioinorganic chemistry. By means of new synthetic strategies, the insertion of intercalating agents linked to polydentate ligands represents an interesting alternative to enhance the catalytic efficiency of a biomimetic complex. The work presented here focuses on the synthesis of two new Cu(II) complexes with polydentate ligands derived from a triazine core containing 1,4-diaminobutane as a spacer and a pyrene group as a possible DNA intercalating agent. The complexes were characterized by spectroscopic and electrochemical techniques, and catecholase-like activity of both were also carried out. The kinetic parameters of the complexes in the oxidation of the model substrate 3,5-DTBC revealed that insertion of the spacer 1,4-diaminobutane and the pyrene group, strongly contributed to increase the catalytic efficiency of these systems. In fact Kass
becomes significantly increased, indicating that these groups influence the interactions between the complex and the substrate, which are much more effective when compared do the catalyst without such groups.
Preliminary studies showed that both complexes, at very low concentrations, are capable of cleaving double-stranded plasmid DNA into its form II (circular) and form III (linear). Thus, these complexes can be considered good biomimetic models for catechol oxidase, and also as plasmid DNA cleavage agents.
Keywords: Cathecol oxidase. Cu(II) complexes. Pyrene. DNA.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Representação esquemática da enzima catecol oxidase,
encontrada na batata doce Ipomoeas batatas (PROTEIN DATA BANK, 2014). ... 29
Figura 2. Representação esquemática do sítio ativo da enzima catecol
oxidase em seu estado oxidado (KLABUNDE et al., 1998). As esferas azuis claro representam os átomos de cobre, a esfera vermelha representa o átomo de oxigênio da ponte exógena µ-hidroxo modelada e os anéis aos resíduos de histidina presentes neste sítio ativo. ... 29
Figura 3. Mecanismo de atividade da catecol oxidase proposto por
Solomon (1996). ... 30
Figura 4. Estrutura tridimensional do DNA, e seus respectivos pares de
bases nitrogenadas (WHEELER, 2011). ... 32
Figura 5. Estrutura da dupla fita do DNA com íons Ag+ em azul, os
pares de base em estado natural na cor verde e com os pares de base mediados por íons Ag+ em amarelo (JOHANNSEN, 2010). ... 32
Figura 6. Exemplo de interação de sulco exercida pela esperamicina
com o DNA (ADTBIO, 2014). ... 33
Figura 7. Interação eletrostática da polietilenoimina com o DNA
(MCBAIN; YIU, EL HAJ, DOBSONA, 2007) ... 33
Figura 8. Interação covalente da cisplatina com o
DNA (ADTBIO, 2014). ... 34
Figura 9. Intercalação do Bromopireno entre os pares de base do DNA
(ADTBIO, 2014). ... 34
Figura 10. Reações de substituição nucleofílica aromática do cloreto
cianúrico com aminas primárias. ... 37
Figura 11. Ligantes LCl e Len. ... 38
Figura 12. Exemplos de ligantes contendo agentes intercalantes
descritos na literatura. ... 38
Figura 13. Alguns complexos que possuem a unidade pireno como
agente intercalante. ... 39
Figura 14. Ligantes sintetizados neste trabalho. ... 40 Figura 15. Representação esquemática das sínteses dos ligantes
realizadas neste trabalho. ... 51
Figura 16. Espectro de RMN de 1H do pró-ligante bpma em CDCl 3... 57
Figura 17. Espectro de RMN de 13C do precursor bpma em CDCl 3. .... 58
Figura 18. Espectro do pró-ligante bpma na Região do IV em pastilha
de KBr. ... 58
Figura 19. Espectro de RMN de 1H do ligante L
Cl em CDCl3. ... 59
Figura 20. Espectro de RMN de 13C do ligante L
Cl em CDCl3. ... 60
Figura 21. Espectro do ligante LCl na Região do IV em pastilha de
KBr. ... 60
Figura 22. Espectro de RMN de 1H do ligante L4S em CDCl
3. ... 62
Figura 23. Espectro de RMN de 13C do ligante L4S em CDCl
Figura 25. Espectro de RMN de H do ligante L4P em CDCl. ... 65
Figura 26. Espectro de RMN de 13C do ligante L4P em CDCl
3. ... 67
Figura 27. Espectro na região do IV do ligante L4P em pastilha de
KBr. ... 68
Figura 28. Sobreposição dos espectros na região do IV dos ligantes
L4S e L4P. ... 72
Figura 29. Espectro de massa do ligante L4S e respectiva simulação da
espécie isotópica (M+1). ... 73
Figura 30. Espectro de massa do ligante L4P e respectiva simulação da
espécie isotópica (M+1). ... 74
Figura 31. Espectro na região do IV do complexo CCl em pastilha de
KBr. ... 75
Figura 32. Sobreposição dos espectros na região do IV do ligante L4S e
do complexo C4S. ... 77
Figura 33. Sobreposição dos espectros na região do IV do ligante L4P e
do complexo C4P. ... 78
Figura 34. Espectros na região do UV-Vis do complexo C4S em MeOH,
nas concentrações de A) 1x10-2 mol.L-1 B) 1x10-3 mol.L-1. ... 80
Figura 35. Espectros na região do UV-Vis do complexo C4P em MeOH,
nas concentrações de A) 1x10-2 mol.L-1 B) 1x10-3 mol.L-1. ... 81
Figura 36. Espectros na região do UV-Vis em estado sólido dos
complexos C4P e C4S em pastilha de KBr. ... 82
Figura 37. Espectros na região do UV-Vis para o complexo C4S em
CH3CN/tampão aquoso (50/50% v/v) em pHs de 3,50 a 10,02
a 25 ºC. ... 83
Figura 38. Espectro de massas do complexo C4S em MeOH e seus
principais fragmentos. ... 84
Figura 39. Espectro de massas do complexo C4P em MeOH e seus
principais fragmentos. ... 85
Figura 40. Estrutura parcialmente obtida do complexo C4P A) com B)
sem os átomos de hidrogênio, para fins de clareza. ... 87
Figura 41. Voltamogramas cíclicos do complexo C4S em MeOH (0,1
mol L-1 em NaClO
4) a 25°C, com velocidades de varredura de 25 a 300
mV.s-1 no pH de dissolução (pH ~ 5,0). Os potenciais estão
representados versus ENH. [C4S] = 2 x 10-3 mol.L-1. ... 88
Figura 42. Voltamogramas cíclicos do complexo C4P em MeOH (0,1
mol L-1 em NaClO
4) a 25°C, com velocidades de varredura de 50 a 200
mV.s-1 no pH de dissolução (pH ~ 5,0). Os potenciais estão
representados versus ENH. [C4P] = 2 x 10-3 mol.L-1. ... 89
Figura 43. Espectros de fluorescência do complexo C4P em diferentes
concentrações. λexc. = 426 nm e Janela = 10 nm. ... 90
Figura 44. Espectros de fluorescência do ligante L4P e dos complexos
C4S e C4P, em concentração de 1 x 10-5 mol.L-1
Figura 45. Gráfico de distribuição de espécies para o ligante L4S em
função do pH com força iônica de 0,1 mol.L-1 KCl à 25ºC. ... 92
Figura 46. Gráfico de distribuição de espécies para o complexo C4S em
função do pH com força iônica de 0,1 mol.L-1 KCl à 25ºC. ... 93
Figura 47. Reação de oxidação do 3,5-DTBC na presença de O2,
formando 3,5-DTBQ e H2O. ... 94
Figura 48. Gráfico de kobs em função do pH para a reação de oxidação
do substrato 3,5-DTBC catalisada pelos complexos A) C4S B) C4P em MeOH/H2O (1:1) à 25°C nas seguintes condições: [C]final = 5 x 10-5
mol.L-1; [3,5-DTBC]
final = 8 x 10-4 mol.L-1; [tampões]final = 0,1 mol.L-1 sem
força iônica. ... 96
Figura 49. Gráfico de kobs em função da concentração do substrato para
a reação de hidrólise do 3,5-DTBC em pH = 6,49, catalisada pelo complexos A) C4S B) C4P em MeOH/H2O (1:1) à 25°C nas seguintes
condições: [C]final = 5 x 10-5 mol.L-1; [3,5-DTBC]final = 6 x 10-5 a 1,8 x 10-3
mol.L-1; [tampões] = 0,1 mol.L-1 sem força iônica. ... 97
Figura 50. Proposta de mecanismo de oxidação do 3,5-DTBC pelos
complexos C4S e C4P. ... 99
Figura 51. Eletroforese em gel de agarose para clivagem do DNA
plasmidial pelos complexos CCl, C4S e C4P em diferentes
concentrações, em tampão [10 mmol.L-1] HEPES (pH 7). DNA (330ng) +
Complexos nas concentrações de 0; 2,5; 5,0; 10,0; 25,0 e 50 μmol.L-1.
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Exemplos de enzimas e proteínas que contêm ou necessitam de elementos inorgânicos ... 27 Tabela 2. Solventes e reagentes utilizados. ... 43 Tabela 3. Deslocamentos químicos (ppm), observados nos espectros de RMN de 1H e 13C atribuídos ao ligante L
Cl
(OLIVEIRA, 2013). ... 61 Tabela 4. Deslocamentos químicos (ppm), observados nos espectros de RMN de 1H e 13C atribuídos ao ligante L4S. ... 64
Tabela 5. Deslocamentos químicos (ppm), observados nos espectros de RMN de 1H e 13C atribuídos ao ligante L4P. ... 69
Tabela 6. Picos de RMN de 1H e 13C do ligante LCl descrito pela
literatura e dos ligantes sintetizados neste trabalho. ... 70 Tabela 7. Principais bandas e atribuições (SILVERSTEIN, 1994), em cm-1, dos espectros no infravermelho para os ligantes L4S e
L4P. ... 72 Tabela 8. Principais bandas e atribuições, em cm-1 dos espectros
na região do IV para o ligante L4S e o complexo C4S. ... 77 Tabela 9. Principais bandas e atribuições, em cm-1 dos espectros
na região do IV para o ligante L4P e o complexo C4P. ... 78 Tabela 10. Logβ determinado para o ligante L4S in situ determinados utilizando 0,1 M KCl em DMSO/H2O 50:50 v/v à 25
°C. ... 92 Tabela 11. Valores de pKas potenciométricos para o complexo C4S. ... 94 Tabela 12. Logβ determinado para o complexo C4S in situ determinados utilizando 0,1 M KCl em DMSO/H2O 50:50 v/v à 25
°C. ... 94 Tabela 13. Valores dos pKas2 e 3 encontrados para os complexos C4S e C4P pelas análises potenciométricas e cinéticas. ... 96 Tabela 14. Comparação dos parâmetros cinéticos de alguns complexos selecionados e da catecol oxidase da Ipomoea
batatas. Ref.: a(EICKEN, ZIPPEL, et al., 1998); b(OSÓRIO, 2007); c(OLIVEIRA, 2013). ... 98
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
Coeficiente de absortividade molar
Banda de deformação angular na região do
infravermelho 3,5-DTBC 3,5-di-terc-butilcatecol 3,5-DTBQ 3,5-di-terc-butilquinona A Absorbância Å Ângstrom bpma N-Bis(2-piridilmetil)amina C4P Perclorato de (N2 -(4-(metilpirenil)aminobutil)-N4,N4,N6,N6- tetraquis(piridin-2-ilmetil)-1,3,5-triazina-2,4,6-triamina)cobre(II) C4S Perclorato de (N2-(4-aminobutil)-N4,N4,N6,N6- tetraquis(piridin-2-ilmetil)-1,3,5-triazina-2,4,6-triamina)cobre(II) CCl Perclorato de (N2-cloro-N4,N4,N6,N6- tetraquis(piridin-2-ilmetil)-1,3,5-triazina-2,4,6-triamina)cobre(II)
CHES Ácido 2-(ciclohexilamino)etanosulfônico DNA Ácido desoxirribonucleico
ENH Eletrodo normal de Hidrogênio p.e. Ponto de ebulição
HEPES Ácido 2-[4-(2-hidroxietil)-1-piperazino]etanossulfônico
IV Infravermelho
Kass Constante de associação
kcat. Constante catalítica
KM Constante de Michaelis-Menten
L4P N2-(4-(metilpirenil)aminobutil)-N4,N4,N6,N6-
tetraquis(piridin-2-ilmetil)-1,3,5-triazina-2,4,6-triamina
tetraquis(piridin-LCl N -cloro-N ,N,N ,N -
tetraquis(2-piridilmetil)-1,3,5-triazina-2,4,6-triamina
Logβ Constante de dissociação cumulativa logarítmica
MES Ácido 2-morfolinoetanosulfônico monohidratado
pH Potencial hidrogeniônico
ppm Partes por milhão
RMN de 13C Ressonância Magnética Nuclear de Carbono
RMN de 1H Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênio
T Transmitância
UV-Vis Espectroscopia na região do Ultravioleta visível δ Banda de estiramento axial na região do
infravermelho
δC Deslocamento químico de carbono
δH Deslocamento químico de hidrogênio
SUMÁRIO
1.REVISÃO DA LITERATURA ... 27 1.1. INTRODUÇÃO ... 27
1.2. O ELEMENTO COBRE E SUA IMPORTÂNCIA
BIOLÓGICA ... 28 1.3. O DNA E OS TIPOS DE INTERAÇÃO ... 31
1.4. ESTRATÉGIAS DE MODELAGEM BIOMIMÉTICA
EM ESFERAS DE COORDENAÇÃO. ... 35 2.OBJETIVOS ... 41 2.1. OBJETIVO PRINCIPAL... 41 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 41 3.MATERIAIS E MÉTODOS ... 43 3.1. MATERIAIS ... 43 3.2. MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO ... 44 3.2.1. Espectroscopia na região do Infravermelho
(IV) ... 44 3.2.2. Espectroscopia na região do Ultravioleta-visível
(UV-Vis) ... 45 3.2.3. Ressonância Magnética Nuclear ... 45 3.2.4. Espectrometria de massas ... 45 3.2.5. Difratometria de raios X ... 46 3.2.6. Eletroquímica ... 46 3.2.7. Condutimetria ... 46 3.2.8. Espectroscopia de Fluorescência ... 47 3.2.9. Titulação Potenciométrica ... 47 3.2.10. Cinética de oxidação ... 48
3.3.1. Sínteses dos ligantes ... 51
3.3.1.1. Síntese do pró-ligante bpma-bis(piridilmetil)amina 51
3.3.1.2. Síntese do ligante LCl - N2-cloro-N4,N4,N6,N6-
tetraquis(2-piridilmetil)-1,3,5-triazina-2,4,6-triamina 52
3.3.1.3. Síntese do ligante L4S - N2
-(4-aminobutil)-N4,N4,N6,N6- tetraquis(2-piridilmetil)-1,3,5-triazina-2,4,6-triamina 53
3.3.1.4. Síntese do ligante L4P - N2
-(4-(metilpirenil)aminobutil)-N4,N4,N6,N6-
tetraquis(2-piridin-2-ilmetil)-1,3,5-triazina-2,4,6-triamina 54
3.3.2. Sínteses dos complexos ... 55 3.3.2.1. Síntese do complexo CCl - Perclorato de (N2
-cloro-N4,N4,N6,N6-
tetraquis(piridin-2-ilmetil)-1,3,5-triazina-2,4,6-triamina)cobre(II) 55
3.3.2.2. Síntese do complexo C4S - Perclorato de (N2
-(4-aminobutil)-N4,N4,N6,N6-
tetraquis(piridin-2-ilmetil)-1,3,5-triazina-2,4,6-triamina)cobre(II) 55
3.3.2.3. Síntese do complexo C4P - Perclorato de (N2
-(4-(metilpirenil)aminobutil)-N4,N4,N6,N6-
tetraquis(piridin-2-ilmetil)-1,3,5-triazina-2,4,6-triamina)cobre(II) 56
4.RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 57 4.1. CARACTERIZAÇÕES DOS LIGANTES ... 57 4.2. CARACTERIZAÇÕES DOS COMPLEXOS ... 75 4.2.1. Espectroscopia na Região do Infravermelho ... 76
4.2.2. Espectroscopia Eletrônica na Região do UV-Vis ... 78 4.2.3. Espectrometria de massas ... 83 4.2.4. Difração de Raios X ... 86 4.2.5. Eletroquímica... 87 4.2.6. Condutimetria ... 89 4.2.7. Fluorescência ... 90 4.2.8. Titulação Potenciométrica ... 91 4.2.9. Cinética de Oxidação do 3,5-DTBC ... 94
4.2.10. Testes de clivagem de DNA plasmidial ... 100
5.CONCLUSÕES ... 102 6.REFERÊNCIAS ... 104
1. REVISÃO DA LITERATURA
1.1. INTRODUÇÃO
A Química se mantém em constante expansão no que envolve objetos de pesquisa, interagindo com diversas outras áreas da ciência, que por sua vez, adquirem cada vez mais um caráter multidisciplinar, à medida que os problemas a serem resolvidos tendem a ter respostas mais amplas. A Química Bioinorgânica atua justamente nesta interface, estudando diversos tópicos, com foco no papel dos íons metálicos em inúmeros processos biológicos (COWAN, 1993).
Sabemos que tais processos são acelerados por biopolímeros formados por sequências de aminoácidos, conhecidos como enzimas. Elas se organizam de modo a formar um ambiente químico favorável às reações e são extremamente eficientes no que diz respeito à velocidade das reações realizadas. Além disto, atuam como catalisador, ou seja, catalisam a mesma reação diversas vezes se regenerando ao final de cada reação, compondo o que chamamos de ciclo catalítico. Cerca de 30% das enzimas possuem ou necessitam de um íon metálico para realizar sua função, o que são por definição, as metaloenzimas. São descritos na literatura, trabalhos que comparam velocidades de reações na presença de enzimas e reações não catalisadas, comprovando assim, o excelente potencial catalítico enzimático (WOLFENDEN, 2011). A Tabela 1 cita algumas metaloenzimas e metaloproteínas, bem como os metais presentes em seus sítios ativos.
Tabela 1. Exemplos de enzimas e proteínas que contêm ou necessitam
de elementos inorgânicos
METAL ENZIMAS E PROTEÍNAS
Fe2+ ou Fe3+ Citocromo oxidase, catalase, peroxidase
Cu2+ Citocromo oxidase, tirosinase, catecol
oxidase
Zn2+ Anidrase carbônica, álcool desidrogenase
O motivo de tais estudos se deu justamente pela necessidade de saber como as enzimas aceleram diversas reações em meio biológico e qual a influência destes íons metálicos nas catálises, propondo mecanismos de atuação para as mesmas.
1.2. O ELEMENTO COBRE E SUA IMPORTÂNCIA
BIOLÓGICA
Por serem excelentes ácidos de Lewis, a natureza adquiriu como mecanismo de potencialização, a inserção de metais como cofatores enzimáticos. O cobre, assim como diversos elementos de transição, é de extrema importância para o ser humano. Está biodisponível há cerca de 1,7 bilhões de anos (KAIM, 1996) e cerca de 5 mg de cobre ao dia são necessários na dieta de uma pessoa adulta. Sabe-se que a falta de cobre em humanos pode causar enfraquecimento das artérias, desordem no fígado e anemia secundária (KUMAR, 2006).
Dentre diversos tipos de enzimas, podem-se destacar as oxirredutases, que auxiliam em mecanismos de catálise de transferência de elétrons. Segundo Koval e colaboradores (2006), existem diversos tipos de enzimas de cobre, sendo as do tipo III as que englobam os complexos de cobre(II) binucleares e que se caracterizam por catalisar reações de oxirredução (KOVAL, GAMEZ, BELLE, SELMECZI, REEDJIK; 2006). Enzimas e proteínas importantes em vários ciclos biológicos como tirosinase, hemocianina e catecol oxidase apresentam em seu sítio ativo um centro binuclear de cobre.
A catecol oxidase é uma enzima que catalisa reações de oxidação de catecóis a suas respectivas quinonas. A enzima tem uma massa molar que varia de 38 a 45 kDa e uma forma elipsoidal com dimensões de 55 x 45 x 45 Å. A estrutura secundária é dominada por regiões de α-hélices (GERDEMANN; EICKEN; KREBS, 2002), como mostra a Figura 1.
A estrutura tridimensional da catecol oxidase, extraída da batata doce Ipomoeas batatas, foi resolvida, nas formas oxidada Cu(II)-Cu(II) e reduzida Cu(I)-Cu(I). Na Figura 2 (EICKEN;
ZIPPEL; BÜLDT-KARENTZOPOULOS; KREBS, 1998;
KLABUNDE et al., 1998) está representada a forma oxidada do sítio ativo da enzima catecol oxidase.
Figura 1. Representação esquemática da enzima catecol
oxidase, encontrada na batata doce Ipomoeas batatas (PROTEIN DATA BANK, 2014).
Figura 2. Representação esquemática do sítio ativo da enzima
catecol oxidase em seu estado oxidado (KLABUNDE et al., 1998). As esferas azuis claro representam os átomos de cobre, a esfera vermelha representa o átomo de oxigênio da ponte exógena µ-hidroxo modelada e os anéis aos resíduos de histidina presentes neste sítio ativo.
Em sua forma oxidada (met), os átomos de cobre estão separados por uma distância de 2,9 Å. Já na forma reduzida (deoxi) esta distância passa a ser 4,4 Å. Como na forma reduzida, os átomos de cobre tem seus orbitais d totalmente preenchidos, a interação entre os dois cobres passa a ser menor, fato comprovado pela existência da espécie deoxi, que não possui pontes entre os dois sítios de Cu(I) (PERALTA, 2005).
O ciclo catalítico da catecol oxidase ainda não está totalmente elucidado. O mecanismo mais aceito atualmente foi proposto por Solomon (1996) e indica que o substrato coordena-se à enzima de forma bidentada, tanto na forma met, quanto na forma deoxi, para formar, durante o ciclo catalítico, duas moléculas da respectiva quinona e água (Figura 3).
Figura 3. Mecanismo de atividade da catecol oxidase proposto por Solomon (1996). CuII His His His CuII His His His OH estado met Cu His His His Cu His His His OH O Complexo inibidor OH H + 3H+ H2O + O O O O CuII His His His CuII His His His O O OH OH 2H+ O O CuII His His His CuII His His His OH CuI His His His estado deoxi CuI His His His O2 CuII His His His CuII His His His O O estado oxi OH OH 2H+ H2O + O O H+
Os estudos envolvendo algumas enzimas isoladas, principalmente no caso das oxirredutases, tem pouca viabilidade, tanto pelo custo quanto pela acessibilidade das mesmas. Por estes e outros motivos, sintetizam-se compostos que possam simular a ação das enzimas, inclusive em meio biológico. A reatividade de complexos binucleares de cobre, modelos para catecol oxidase, tem sido objeto de estudos de diversos grupos de pesquisa. Estes estudos têm fornecido subsídios para um melhor entendimento do mecanismo de ação dos complexos modelos na catálise da oxidação de catecóis a quinonas, o que
reforça ainda mais a importância da síntese destes compostos. Além destes complexos poderem atuar como modelos estruturais de enzimas, estima-se que pela semelhança do composto biomimético com a sua enzima correspondente, ele pode ser utilizado também como modelo funcional no desenvolvimento de fármacos ou de novos materiais.
1.3. O DNA E OS TIPOS DE INTERAÇÃO
A partir de estudos prévios realizados por Mieschen (1868) e Chargaff (1950), Watson e Crick (1953) idealizaram de forma brilhante a estrutura do DNA e propuseram que duas fitas de DNA estão ligadas através da interação de quatro bases nitrogenadas em pares purina-pirimidina: adenina (A) e timina (T), e guanina (G) e citosina (C), formando respectivamente 2 e 3 ligações de hidrogênio entre elas (Figura 4). Estas, por sua vez, se organizam numa estrutura tridimensional de forma helicoidal, e criam cavidades, maiores e menores. Cada base nucleotídica está pareada no mesmo plano com a base da outra fita (NELSON; COX, 2013). Através destas investigações, posteriormente, o estudo genômico se tornou algo de grande interesse no contexto científico. Íons e complexos metálicos em geral, podem ser capazes de clivar as ligações entre os pares de bases do DNA, assim como mostra a figura 5, onde íons Ag+ se
mantêm dentro da dupla fita, como propõe Johannsen et al. (2010).
Figura 4. Estrutura tridimensional do DNA, e seus respectivos
pares de bases nitrogenadas (WHEELER, 2011).
Figura 5. Estrutura da dupla fita do DNA com íons Ag+ em azul,
os pares de base em estado natural na cor verde e com os pares de base mediados por íons Ag+ em amarelo (JOHANNSEN, 2010).
Complexos metálicos, de forma geral, podem interagir com o DNA por diferentes formas, dentre elas: as interações de sulco ou cavidade (maiores e menores), as interações externas, as interações covalentes e as intercalações.
As interações de sulco geralmente são as de menor efetividade. É comum que proteínas prefiram interagir com o DNA pelo sulco maior, visto que há uma melhor adequação
espacial ao DNA, onde dos 36Å do comprimento unitário, aproximadamente 23Å se referem ao sulco maior e os 13Å restantes, ao sulco menor. A Figura 6 traz o exemplo da esperamicina, um fármaco antitumoral que interage com o DNA pelo sulco menor.
Figura 6. Exemplo de interação de sulco exercida pela
esperamicina com o DNA (ADTBIO, 2014).
As interações externas são puramente eletrostáticas e são constituídas por compostos carregados positivamente, assim como a polietilenoimina, e pelos sítios de fosfato carregados negativamente presentes na estrutura do DNA (Figura 7).
Figura 7. Interação eletrostática da polietilenoimina com o DNA
(MCBAIN; YIU, EL HAJ, DOBSONA, 2007) .
As interações covalentes se caracterizam pela ligação covalente do composto às duplas fitas do DNA, como são os casos dos compostos derivados da cisplatina (Figura 8).
Figura 8. Interação covalente da cisplatina com o DNA (ADTBIO,
2014).
Os intercaladores são grupos que se caracterizam por interagir e se incluir entre dois pares de bases e de certa forma, interferir em alguma função exercida por elas. São geralmente constituídos de anéis policíclicos, aromáticos e planares. Bons exemplos de intercaladores são os capazes de realizar ligações π-stacking, como os anéis benzênicos dos ligantes pireno. Como exemplo, na Figura 9 pode-se visualizar a intercalação do Bromopireno entre os pares de bases do DNA. Além disto, a unidade pireno possui propriedades fluorescentes, o que pode levar ao acompanhamento de um possível medicamento contendo esta unidade, em sistema biológico (YAMANA et al., 2001).
Figura 9. Intercalação do bromopireno entre os pares de base do
Acerca da quebra de ligações da dupla fita do DNA, tem-se a preferência por estudos hidrolíticos ao invés de oxidativos pois, sabe-se que os fragmentos gerados oxidativamente não são regenerados pela ação das enzimas ligases (GONZÁLEZ-ÁLVAREZ et al., 2008). Contudo, com o avanço de novas tecnologias, a clivagem oxidativa poderá vir a ser monitorada e possivelmente controlada. Portanto, somado a sua efetividade nas quebras deste tipo de ligação, vem a ser uma vantagem estudar este mecanismo de clivagem.
Existem duas proposições mecanísticas para a clivagem oxidativa: uma delas propõe a oxidação da deoxirribose, através da perda de um átomo de hidrogênio; outra indica a oxidação das bases nucleotídicas por absorção de elétrons (JIANG et al., 2007; METCALFE; THOMAS, 2007; DeROSA; CRUTCHLEY, 2002).
1.4. ESTRATÉGIAS DE MODELAGEM
BIOMIMÉTICA EM ESFERAS DE COORDENAÇÃO. Desde a descoberta de compostos como a cisplatina, a síntese de complexos metálicos com possível atividade biológica tem tido destaque. Muitas modificações sintéticas à cisplatina já foram reportadas, visando uma maior especificidade a tumores malignos. Pela imensa especificidade de atuação, busca-se sintetizar compostos que se assemelham às enzimas, os denominados compostos biomiméticos. Para tal, deve-se conhecer o ambiente de coordenação da enzima a qual se quer mimetizar. Apesar do avanço crescente da síntese de catalisadores artificiais, a diferença de atividade destes e dos naturais ainda é bastante discrepante, em média centenas de milhões de vezes.
O foco no desenvolvimento da catálise esteve na busca de compostos que fossem os mais ativos possíveis para diversas reações, com esta atividade sendo avaliada pelo número de ciclos que estes poderiam fazer num determinado tempo (o número de turnovers) ou no fator de aumento da velocidade da reação (kcat/kuncat). Baseados
nesses estudos, diversos catalisadores que atuam com grande eficiência foram sintetizados e o conhecimento geral sobre “como desenvolver um catalisador para determinada reação” ficou relativamente bem estabelecido. Por isso,
atualmente, o alvo do desenvolvimento de novos catalisadores vem mudando para uma catálise cada vez mais refinada, onde é desejável obter seletividade e controle sobre a formação dos produtos, evitando reações paralelas e subprodutos indesejados como misturas racêmicas, polimerizações e etc., à semelhança das enzimas (FARRAUTO; HECK, 2000; TORELLI et al., 2000, SOUZA, 2013).
Em geral, ligantes contendo grupos doadores de elétrons, como piridinas, imidazóis e álcoois, por exemplo, que possuem átomos de oxigênio e nitrogênio disponíveis para coordenação, são ligantes potenciais para a síntese de compostos biomiméticos porque podem formar ligações semelhantes aos resíduos de aminoácidos presentes no ambiente enzimático.
Através de ligantes multidentados podem ser sintetizados complexos mono e binucleares de diversos metais, incluindo Cu, Fe, Zn, Mn, dentre outros, que são reportados, em grande maioria, como ativos na hidrólise e/ou oxidação de alguns substratos modelos para estes tipos de reações.
No caso de um modelo para catecol oxidase, preferencialmente opta-se por ligantes simétricos, visto que a primeira esfera desta enzima é composta apenas de resíduos de histidina, salvo a ponte entre os dois sítios de cobre, composta de uma molécula de H2O/OH-, e a cisteína que não participa
diretamente da catálise na primeira esfera de coordenação. Além disto, sítios nitrogenados, de forma geral, possuem um caráter mais macio, segundo teoria de Pearson e, portanto, podem se coordenar mais facilmente à sítios de cobre(II), haja vista que trata-se de um metal de fronteira na escala de maciez e dureza.
O cloreto cianúrico é um ótimo reagente para a síntese destes ligantes, pois além de ser de fácil obtenção, seu custo é baixo, sendo muito utilizado em tratamento de águas. Outro ponto de interesse é que a labilidade dos cloretos deste composto é controlada pela temperatura, o que pode oferecer um amplo número de rotas sintéticas para diferentes precursores e ligantes (BLOTNY, 2006) (Figura 10).
Figura 10. Reações de substituição nucleofílica aromática do
cloreto cianúrico com aminas primárias.
N N N Cl Cl Cl 0°C + NH2R N N N Cl Cl NHR + HCl N N N Cl Cl NHR 25°C + NH2R N N N Cl NHR NHR + HCl N N N Cl NHR NHR 60°C + NH2R N N N RHN NHR NHR + HCl OH -OH -OH
-Através de substituições nucleofílicas aromáticas na triazina, podem ser criados novos ligantes que, por sua vez, possibilitam a origem de diferentes complexos metálicos, visando uma atividade catalítica na hidrólise e/ou oxidação de determinados substratos ou até mesmo na clivagem de regiões específicas do DNA. Isto vem a ser útil para o desenvolvimento de fármacos e compostos antitumorais, que tem como característica uma específica interação que faz com que novas células defeituosas deixem de ser produzidas.
São reportados na literatura, a síntese de alguns ligantes triazínicos com foco na obtenção de complexos capazes de atuar na clivagem oxidativa da dupla fita do DNA, tais como o LCl e Len,
cujas estruturas seguem na Figura 11 (MASSOUD et al., 2012; OLIVEIRA, 2013).
Figura 11. Ligantes LCl e Len.
A respeito da inserção de intercalantes, diversos ligantes já foram descritos na literatura (Figura 12), não só contendo pireno, mas também outras unidades planares e aromáticas (OSTASZEWSKI et al., 1998; AMANN et al., 2002).
Figura 12. Exemplos de ligantes contendo agentes intercalantes
descritos na literatura.
Estudos recentes envolvem o efeito da segunda esfera de coordenação com melhoras significativas em catálises. Sabe-se que além do sítio ativo, o qual envolve a primeira esfera de coordenação, os complexos metálicos e as metaloenzimas, possuem outras esferas de coordenação, as quais podem realizar importantes interações com os ligantes e/ou substratos coordenados ao metal, como por exemplo ligações de hidrogênio. Estruturas maiores tendem a ter um número maior de interações com seu substrato diminuindo a entropia do sistema e,
por conseguinte aumentando a constante de origem termodinâmica, potencializando a eficiência catalítica. Além disto, os resíduos de aminoácidos formam núcleos hidrofóbicos que auxiliam na interação do substrato com a enzima. Alguns complexos reportados na literatura possuem sítios intercalantes (Figura 13), tais como pireno, antraceno, justamente sintetizados com estes intuitos (OSÓRIO, 2012; MARIAPPAN, 2005). São reportados nestes trabalhos o efeito sinérgico entre sítio ativo e segunda esfera, que juntos atingem um potencial catalítico maior que ambos separados.
Figura 13. Alguns complexos que possuem a unidade do pireno como
agente intercalante.
Portanto, a estratégia de sintetizar compostos não apenas visando o seu sítio ativo, mas também suas interações secundárias pode contribuir para aumentar a atividade destes, se comparado apenas com seu sítio de primeira esfera.
Em resumo, através destas justificativas este trabalho visa à síntese de complexos com ligantes formados a partir de precursores piridínicos, juntamente com uma unidade do cloreto cianúrico (Figura 14), visando sua possível atividade catalítica como catecolases, além de averiguar o efeito da unidade pireno nas catálises de oxidação do substrato modelo 3,5-DTBC e de clivagem do DNA plasmidial.
Figura 14. Ligantes sintetizados neste trabalho.
2. OBJETIVOS
2.1. OBJETIVO PRINCIPAL
Sintetizar, caracterizar e avaliar a atividade oxidativa de novos complexos de cobre(II) com os ligantes L4S e L4P.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Sintetizar, purificar e caracterizar por técnicas espectroscópicas os ligantes L4S e L4P via IV, -RMN de 1H, RMN de 13C e espectrometria de
massa;
Sintetizar e caracterizar os complexos de cobre(II) com os ligantes L4S e L4P por análises espectroscópicas (IV, UV-Vis, raios X, fluorescência), eletroquímicas (voltametria cíclica, titulação potenciométrica e condutivimetria) e também por espectrometria de massa;
Realizar estudos cinéticos dos complexos citados frente ao substrato modelo para reações de oxidação de catecóis 3,5-di-terc-butilcatecol (3,5-DTBC);
Avaliar o potencial dos complexos sintetizados frente à clivagem do DNA plasmidial;
Avaliar a importância da inserção da unidade pireno tanto na oxidação do substrato modelo 3,5-DTBC quanto na clivagem do DNA plasmidial.
Comparar os dados obtidos com compostos semelhantes descritos pela literatura.
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. MATERIAIS
As sínteses e caracterizações dos ligantes e dos complexos, além dos estudos cinéticos envolveram a utilização dos solventes e reagentes descritos na Tabela 2.
Tabela 2. Solventes e reagentes utilizados. Reagentes e solventes Marca Pureza 3,5-DTBC Sigma-Aldrich Recristalizado para uso em hexano
2-aminometilpiridina Aldrich Destilado para
uso sob
pressão reduzida; p.e.= 82-85 ºC
2-piridilcarboxaldeído Aldrich Destilado para
uso sob pressão reduzida; p.e.= 181ºC Acetona Vetec 99,5% Acetonitrila UV/HPLC e LC/MS Tedia 99,9% Metanol UV/HPLC e LC/MS Tedia 99,9% Dimetilformamida UV/HPLC e LC/MS Merck 99,7% DMSO UV/HPLC e LC/MS Tedia 99,8%
Bicarbonato de sódio Vetec 99,7%-100,3%
CHES Sigma-Aldrich 99,0%
Cloreto cianúrico Sigma-Aldrich 99%
Perclorato de cobre(II) Aldrich 98%
Perclorato hidratado
de sódio
Borohidreto de sódio Aldrich 99%
Diclorometano Vetec 99,5%
HEPES Sigma-Aldrich 99,5%
Hidrogênio White-Martins 5,0 Analítico
MÊS Sigma-Aldrich 99,0%
Metanol Vetec 99,8%
Piridina Nuclear Destilado para
uso sob pressão reduzida; p.e.= 115 ºC Raney-Nickel Aldrich 99,5% Sulfato de sódio anidro Vetec 99%
1,4-butanodiamina Aldrich Destilado para
uso sob
pressão reduzida; p.e.=158-160 ºC
Ácido Clorídrico Aldrich Mínimo 37%
Hidróxido de sódio Química Fina 97%
Cloreto de Potássio Vetec 99%
Tolueno Vetec 99,5% Brometo de Potássio – grau FT-IR Sigma-Aldrich >99% Clorofórmio deuterado Sigma-Aldrich 99,8%
Os tampões HEPES, CHES e MES foram utilizados nas devidas faixa de tamponamento (pH entre 4,0 e 10,0), adquiridos de fontes comerciais e utilizados sem purificação prévia.
3.2. MÉTODOS DE CARACTERIZAÇÃO
3.2.1. Espectroscopia na região do Infravermelho (IV)
Os espectros na região do infravermelho foram obtidos em um espectrofotômetro Perkin-Elmer FT-IR Spectrofotometer Spectrum 100, na região de 4000 a 400 cm-1. As amostras foram
espectroscópico e prensadas, formando pastilhas com cerca de 1 cm de diâmetro e 0,5 mm de espessura. Estas pastilhas foram introduzidas diretamente no caminho óptico do equipamento e desta forma, foram lidas as porcentagens de transmitância (%T).
3.2.2. Espectroscopia na região do Ultravioleta-visível (UV-Vis)
Os espectros eletrônicos na região do Ultravioleta, visível e infravermelho próximo foram obtidos em um espectrofotômetro Varian modelo Cary 50-Bios, no Laboratório de Bioinorgânica e Cristalografia, Departamento de Química-UFSC, na região entre 200 e 1000nm. As análises foram realizadas utilizando soluções do complexo em solvente de grau espectroscópico e cubetas de vidro, com capacidade para 3,5 mL e 1 cm de caminho óptico. Os complexos foram dissolvidos em CH3CN com concentração de
1,0 x 10-3 mol.L-1.
3.2.3. Ressonância Magnética Nuclear
Os espectros de RMN de 1H e RMN de 13C foram obtidos
em um espectrofotômetro Bruker – AC 200, na Central de Análises do Departamento de Química – UFSC, em 200MHz. Os deslocamentos químicos de hidrogênio foram registrados em ppm utilizando como referência interna tetrametilsilano (TMS, δ = 0,00 ppm) e CDCl3 como solvente.
3.2.4. Espectrometria de massas
Os compostos sintetizados (ligantes e complexos) foram estudados via espectrometria de massa com ionização via eletrospray (ESI-MS). Os espectros foram medidos pela técnica Elis Rosa, obtidos no equipamento Amazon - Ions Trap MS do Centro de Biologia Molecular Estrutural – UFSC.
A análise foi realizada a partir das soluções dos ligantes e complexos em MeOH grau MS com concentração de aproximadamente 500 ppb e fluxo de 180 µL.min-1. A
temperatura do capilar foi mantida entre 180 e 200 ºC e a voltagem do capilar entre -400 e -500 V.
3.2.5. Difratometria de raios X
A análise por difração de raios X em monocristal do complexo C4P foi realizada na Central de Análises do Departamento de Química – UFSC. Os dados foram coletados em um difratômetro Bruker APEX II DUO usando radiação gerada por um tubo de molibdênio (MoKα λ = 0,71073 Å) e monocromador de grafite, em temperatura de 190,01K. A estrutura cristalina foi resolvida através dos métodos diretos e parcialmente refinada pelo método dos mínimos quadrados com matriz completa, utilizando-se os programas SIR97 (ALTOMARE
et al., 1999) e SHELXL-97 (SHELDRICK, 1997) respectivamente.
A representação gráfica da estrutura molecular foi gerada utilizando o programa Mercury (MACRAE, et al., 2006).
3.2.6. Eletroquímica
O comportamento redox dos complexos foi investigado por voltametria cíclica em um potenciostato/galvanostato modelo
Epsilon. Os experimentos foram feitos em
MeOH/ DMF (99:1; %v/v), com [C] = 5,0 x 10-3 mol.L-1, sob
atmosfera de argônio. Foi utilizado como eletrólito suporte, NaClO4 (0,1 mol.L-1) e uma célula eletrolítica contendo um
eletrodo de pseudo-referência de Ag/Ag+, um eletrodo de
trabalho de carbono vítreo e um eletrodo auxiliar de platina. Foi utilizado como padrão interno o composto ferroceno (par Fc+/Fc) para correção do eletrodo de referência (GAGNÉ, KOVAL, LISENSKY, 1980).
3.2.7. Condutimetria
As medidas condutimétricas dos complexos foram realizadas no aparelho Metrohm 856, do Laboratório de Bioinorgânica e Cristalografia – UFSC. Os compostos de coordenação foram dissolvidos em CH3CN, com concentração de
1,0 x 10-3 mol.L-1. O aparelho foi calibrado com uma solução
padrão de KCl 0,1 mol.L-1 cuja condutividade é de 100 µS/cm em
3.2.8. Espectroscopia de Fluorescência
Os espectros de fluorescência foram obtidos em um espectrofotômetro Cary Eclipse, através das medidas espectrais de emissão de fluorescência, usando soluções em MeOH, cujas concentrações variaram de 1,0 x 10-3 a 5,0 x 10-5 mol.L-1, a
25 °C.
3.2.9. Titulação Potenciométrica
Os estudos de equilíbrio em solução foram realizados no Laboratório de Bioinorgânica e Cristalografia, Departamento de Química – UFSC, utilizando um titulador automatizado da Metrohm, modelo Titrino Plus 848, acoplado a um eletrodo combinado de vidro (referência Ag/AgCl) calibrado para leitura direta do pH (pH = –log [H+]).
O sistema foi calibrado utilizando dados obtidos de uma titulação potenciométrica de um volume conhecido a partir de uma solução padrão de HCl 0,0107 mol.L-1, solução padrão de
KOH 0,0963 mol.L-1 e força iônica ajustada com
KCl 0,1 mol.L-1 em DMSO/H
2O 50:50 v/v. O pKw da solução
DMSO/H2O 50:50 v/v contendo 0,1 mol.L-1 de KCl utilizado para
os cálculos foi -15,48 (previamente refinado). As medidas foram efetuadas em uma célula termostatizada a 25,00 ± 0,05 °C. Os ligantes L4S e L4P foram titulados em duplicata, na concentração de 1,0 x 10-3 mol.L-1 em 50 mL de MeOH/H
2O 50:50 v/v. O
complexo C4S foi titulado in situ a partir de 5,0 x 10-5 mol do
ligante L4S e 5,0 x 10-5 mol de cobre (1:1) e também partindo de
5,0 x 10-5 mol do ligante L4S e 1,0 x 10-4 mol (2:1) de cobre
oriundo de uma solução de perclorato de cobre(II), previamente padronizada por Absorção Atômica com Atomização por Chama ([Cu]= 0,0896 mol.L-1). As concentrações finais do complexo em
cada experimento foram de 1,0 x 10-3 mol.L-1 (1:1) e
2,0 x 10-3 mol.L-1 (2:1) em 50,0 mL de DMSO/H
2O 50:50 v/v,
utilizando KCl 0,1 mol.L-1 como força iônica, sob atmosfera de
argônio. Os dados da titulação foram tratados pelo Prof. Dr. Bernardo de Souza, com o programa BEST7 (MARTELL, 1992) e o diagrama de espécies obtido com o auxílio do programa SPECIES.
3.2.10. Cinética de oxidação
A atividade dos complexos C4S e C4P frente à oxidação do substrato modelo 3,5-DTBC foi averiguada em diferentes valores de pH, afim de avaliar o pH ótimo da reação. A velocidade inicial da reação foi obtida e utilizada como critério de comparação de atividade nos diferentes valores de pH. O acompanhamento das reações foi realizado mediante o monitoramento da variação espectral em 400 nm, considerando-se a absortividade do produto 3,5-DTBQ neste comprimento de onda e nos diferentes valores de pH (TORELLI, et al., 2002; KAIZER et al., 2002; NEVES et al., 2002). O equipamento utilizado para cinéticas de alto desempenho foi o espectrofotômetro de parada de fluxo da Hi-Tech KinetAsyst, modelo SF-61DX2, caminho óptico de 1,0 cm e utilizando-se o arranjo de diodo (Hi-Tech KnetaScan Diode Array) como detector principal acoplado a um banho termostatizado.
Utilizou-se 100 µL de cada solução reacional (complexo/tampão e substrato/tampão, ambos em MeOH/H2O
50:50 v/v) em cada disparo. A pressão dos disparos foi ajustada em 0,5 MPa. Para cada corrida cinética foram processadas de 200 a 300 leituras de absorbância entre 1,5 e 60 s, dependendo da concentração do substrato.
As velocidades iniciais foram obtidas diretamente do gráfico da concentração do produto da oxidação em função do tempo. A dependência da velocidade de oxidação em função do pH para o substrato 3,5-DTBC foi realizada em uma faixa de pH entre 3,5 e 9, obtendo-se, consequentemente, o pH ótimo para a reação, medido a 25°C.
A metodologia descrita a seguir foi realizada em triplicata para os complexos C4S e C4P. Em dois frascos separados foram preparadas soluções do complexo e do substrato, antes da injeção na seringa no equipamento da seguinte forma: em um dos frascos, 500 µL de uma solução do complexo [C] = 2,0 x10-4 mol.L-1 em MeOH foram misturados a 500 µL de
uma solução do tampão, [T] = 0,2 mol.L-1, dessa forma a
concentração do complexo caiu pela metade. Em outro frasco, 200 µL da solução do substrato foi também misturado com 500 µL de solução do tampão [T] = 0,2 mol.L-1 e 300 µL de MeOH.
Para o efeito da variação do pH as concentrações de substrato foram mantidas constantes, [S]estoque = 8,0 x 10-3 mol.L
-1. A próxima etapa foi transferir essas soluções para duas
seringas principais acima do injetor principal.
O sistema foi ajustado previamente para misturar volumes iguais de 100 µL das soluções de complexo e substrato, de cada uma das seringas injetoras, de modo que o volume da solução resultante após a injeção fosse de 200 µL, portanto as concentrações de ambos, substrato e complexo, foram diluídas por dois novamente.
As concentrações finais de complexo, substrato e tampão foram de [C]final = 5,0 x 10-5 mol.L-1, [S]final = 8,0 x 10-4 mol.L-1e
[T]final = 0,1 mol.L-1 em MeOH/H2O 50:50 v/v. Os tampões
utilizados para o efeito de pH foram MES (pH 3,5 a 6,5), HEPES (7,0 e 7,5) e CHES (pH 8 e 9).
O efeito da concentração do substrato foi realizado em pH 6,5 para ambos complexos. O efeito de substrato foi realizado de forma semelhante ao efeito de pH, mantendo-se a concentração do complexo e tampão constantes na cela reacional iguais a [C]final = 5,0 x 10-5 mol.L-1 e [T]final = 0,1 mol.L-1 e variando-se a
concentração do substrato de [S]final = 6,0 x 10-5 mol.L-1 a
1,8 x 10-3 mol.L-1. O tratamento matemático utilizado para a
obtenção dos parâmetros cinéticos foi o ajuste não-linear da equação de Michaelis-Menten. (LEHNINGER; NELSON; COX, 2013).
A formação de peróxido de hidrogênio nas reações de oxidação do 3,5-DTBC catalisadas pelos complexos binucleares de cobre(II) foi detectada por uma modificação do método da iodometria (MEYER; ACKERMANN; KAIFER; PRITZKOW, 2002). Uma mistura reacional foi preparada da seguinte maneira: concentração de complexo [C]final = 2,4 x 10-5 mol.L-1,
concentração de tampão [T]final = 3 x 10-3 mol.L-1, pH = 6,50, e
concentração de substrato [S]final = 5 x 10-3 mol.L-1. Após uma
hora de reação, igual volume de água foi adicionado e a quinona foi extraída com diclorometano. A camada aquosa foi acidificada com ácido sulfúrico ([ácido] = 5x10-3 mol.L-1) a pH2, para
interromper a reação de oxidação e 1 mL de solução aquosa de iodeto de potássio ([iodeto] = 0,3 mol.L-1) e 3 gotas de solução de
molibdato de amônio ([molibdato] = 0,1 mol.L-1) foram
adicionados. Na presença de peróxido de hidrogênio ocorre a seguinte reação: H2O2 + 2I- + 2H+ 2 H2O + I2, e em excesso de
reação geralmente é lenta, mas em meio ácido e com a adição do molibdato de amônio torna-se praticamente instantânea. A formação do I3- pode ser monitorada espectrofotometricamente
devido ao surgimento de uma banda característica em 353 nm ( = 26000 L.mol-1.cm-1).
3.2.11. Testes oxidativos em DNA plasmidial
Os testes oxidativos em plasmídeos de DNA foram realizados em colaboração com o Centro de Biologia Molecular Estrutural – UFSC pela mestranda Cristine Saibert, sob orientação do Prof. Dr. Hernán Terenzi.
A determinação da concentração para atividade ótima dos complexos foi realizada a partir do tratamento de 330 ng do plasmídio pBSK II de DNA superenovelado (~25 μmol.L-1 em pb)
com os complexos em diferentes concentrações na faixa de 0 a 50 µmol.L-1). A reação foi realizada a temperatura de 37°C em
tampão HEPES, pH= 7,0 e o tempo reacional foi de 1h (C4S e C4P) e 2h (CCl).
O término da reação foi feito por adição de 5 μL de tampão de corrida 6X concentrado (EDTA 50 mmol.L-1, glicerol 50% e
azul de bromofenol 0,01% - pH 8,0) às misturas reacionais (20 uL) – o EDTA presente no tampão quela os complexos em solução, impedindo sua reação com o DNA. Após, as amostras foram armazenadas a 4°C até serem submetidas à eletroforese em gel de agarose (1 %) contendo brometo de etídio (0,3 μg.mL-1) por 1h e 40min a 90V em tampão TBE 0,5X (Tris
44,5 mmol.L-1, ácido bórico 44,5 mmol.L-1, EDTA 1mmol.L-1 - pH
8,0). Os géis resultantes foram fotografados pelo sistema de fotodocumentação DigiDoc-It (UVP, USA) e as frações de cada forma de DNA plasmidial foram quantificadas por densitometria, utilizando o software KODAK Molecular Imaging Software 5.0 (Carestream Health, USA).
3.3. SÍNTESES
3.3.1. Sínteses dos ligantes
As sínteses dos ligantes seguem resumidas nos esquemas de reações da Figura 15. As caracterizações de RMN de 1H e de 13C, assim como os espectros de Infravermelho e de massas,
seguem discutidos na Seção 4.1. deste trabalho.
Figura 15. Representação esquemática das sínteses dos ligantes
realizadas neste trabalho.
3.3.1.1. Síntese do pró-ligante
bpma-bis(piridilmetil)amina
O procedimento descrito foi realizado segundo Mireski (2012). Em um balão de 500 mL, 10,81 g (100,0 mmol,
MM = 108,14 g mol-1) de 2-(aminometil)piridina foram
solubilizados em 100 mL de tolueno e mantidos sob agitação em banho de gelo por 1h. A esta solução foram adicionados 10,71 g (100 mol, MM = 107,11 g.mol-1) de 2-piridilcarboxialdeído. Após a
adição, retirou-se a reação do banho de gelo, permanecendo sob agitação por mais 2 horas. O tolueno foi retirado sob vácuo à temperatura de 15 °C. O óleo resultante foi solubilizado em MeOH, e a esta mistura foram adicionados aproximadamente 30 mg de Pd/C 5% em um recipiente apropriado para a hidrogenação catalítica. Após 15 horas de agitação sob atmosfera de hidrogênio (60 psi), a solução foi retirada filtrada e o solvente foi removido sob pressão reduzida. O produto foi obtido com rendimento quantitativo >99%.
3.3.1.2. Síntese do ligante LCl - N2
-cloro-N4,N4,N6,N6-
tetraquis(2-piridilmetil)-1,3,5-triazina-2,4,6-triamina
A síntese foi realizada conforme descrito por Oliveira (2013): Em um béquer de 150 mL contendo 40,0mL de acetona, foram adicionados 9,65 g de bis(2-piridilmetil)amina (bpma) (48,5 mmol; MM = 199,0 g.mol-1) e 40 mL de NaOH 1mol.L-1. A
esta solução foram adicionados, lentamente, 4,48 g de 2,4,6-tricloro-1,3,5-triazina (24,3 mmol; MM = 184,41 g.mol-1). A
suspensão de coloração avermelhada foi deixada sob agitação em banho de gelo e em seguida por mais uma hora em temperatura ambiente. O precipitado resultante foi filtrado em funil de placa porosa e lavado com acetona (2x de 30 mL) e éter (2x de 20 mL). O sólido lavado, de coloração levemente amarelada, foi então recristalizado em isopropanol a quente (60
mL) e resfriado a
branco cristalino foi novamente recristalizado sob estas condições, seco sob vácuo e posteriormente caracterizado. Rendimento: 6,48 g, 52,5 % em relação ao reagente 2,4,6-tricloro-1,3,5-triazina.
3.3.1.3. Síntese do ligante L4S - N2
-(4-aminobutil)-N4,N4,N6,N6-
tetraquis(2-piridilmetil)-1,3,5-triazina-2,4,6-triamina
Em um balão de fundo redondo de 125 mL, foram adicionados 3 mL de 1,4-butanodiamina (29,8 mmol; d=0,877 g.mL-1; MM = 88,15 g.mol-1). Em seguida, foram
adicionados 10 mL de CHCl3, e por fim, 1,77g do ligante LCl
(3,5 mmol; MM= 509,18 g.mol-1). A mistura reacional foi mantida
a temperatura ambiente e agitação magnética por 24h. Após esse período, o solvente foi retirado sob pressão reduzida e o sólido foi redissolvido em CH2Cl2. Foram realizadas extrações
sucessivas com solução de NaCl saturado (3x de 20 mL) e
NaHCO3 (3x de
20 mL). À fase orgânica, foi adicionado o agente dessecante Na2SO4 e o solvente foi removido por evaporação rotatória,
obtendo-se um sólido espumoso, com 84,7% de rendimento (1,66g; 2,96 mmol; MM= 561,31 g.mol-1).
3.3.1.4. Síntese do ligante L4P -
N2-(4-(metilpirenil)aminobutil)-N4,N4,N6,N6-
tetraquis(2-piridin-2-ilmetil)-1,3,5-triazina-2,4,6-triamina
Em um balão de 250 mL foram dissolvidos em 50 mL de EtOH, 1,66g do ligante L4S (2,96 mmol; MM = 561,31 g.mol-1) e
0,74g de 1-pirenocarboxaldeído (2,96 mmol;
MM = 230,26 g.mol-1). A mistura foi mantida sob refluxo. Após
72h, foram adicionados 0,12g de NaBH4 (2,96 mmols;
MM = 37,83 g.mol-1) e o sistema reacional permaneceu sob
agitação magnética, a temperatura ambiente, durante 2 horas, observando-se uma diminuição na intensidade da coloração. O solvente foi retirado por pressão reduzida e o sólido foi suspenso em H2O. A suspensão sob agitação magnética teve seu pH
ajustado lentamente para aproximadamente 2 com solução de HCl 3,0 mol.L-1. A solução alaranjada foi extraída com CH
2Cl2 (6x
de 20mL). A fase aquosa restante teve seu pH reajustado para 7 com solução de NaOH 1M. A esta suspensão, foram adicionados 30 mL de CH2Cl2. A fase orgânica foi extraída com H2O (3x de 20
mL) e NaHCO3 (3x de 30 mL). Em seguida foi adicionado o
agente dessecante Na2SO4. A solução foi filtrada e o solvente foi
retirado em pressão reduzida. O sólido espumoso amarelado foi obtido com 61% de rendimento (1,41g; 1,81 mmol; MM = 777,40 g.mol-1).
3.3.2. Sínteses dos complexos
3.3.2.1. Síntese do complexo CCl - Perclorato de
(N2-cloro-N4,N4,N6,N6-
tetraquis(piridin-2-ilmetil)-1,3,5-triazina-2,4,6-triamina)cobre(II)
A síntese do complexo foi realizada segundo modificações no procedimento descrito por Massoud e colaboradores (MASSOUD et al., 2011). Em um béquer contendo 0,51 g (1,0 mmol; MM = 509,99 g.mol-1) do ligante L
Cl dissolvido em
20,0 mL de MeOH foram adicionados sob agitação magnética 0,74 g de Cu(ClO4).5H2O (2,0 mmol; MM = 370,54 g.mol-1). A
esta solução, foram adicionados 1,0 mL de NaOH (1,0 mol.L-1).
Em poucos minutos houve formação de precipitado de coloração azul escura. O precipitado foi filtrado e recristalizado em acetona/isopropanol 2:1 (v/v), com rendimento quantitativo.
3.3.2.2. Síntese do complexo C4S - Perclorato de (N2-(4-aminobutil)-N4,N4,N6,N6-
tetraquis(piridin-2-ilmetil)-1,3,5-triazina-2,4,6-triamina)cobre(II)
Em um béquer de 50 mL com 10 mL de MeOH, foram dissolvidos 0,15 g do ligante L4S (0,28 mmol; MM = 561,31 g.mol-1). Sob agitação, em temperatura ambiente,
foram adicionados 0,21 g de Cu(ClO4)2.5H2O (0,56 mmol;
MM = 370,54 g.mol-1). Após 3 dias, houve a formação de um
filme no fundo do béquer. Este filme foi dissolvido em 10mL de acetona e após, foram adicionados 10 mL de isopropanol. Em mais 3 dias, microcristais azuis do complexo C4S (MM = 990,90 g.mol-1) em rendimento quantitativo foram
formados. Os espectros e a caracterização deste complexo seguem discutidos na Secão 4.2. deste trabalho.
3.3.2.3. Síntese do complexo C4P -
Perclorato de (N2 -(4-(metilpirenil)aminobutil)-N4,N4,N6,N6-
tetraquis(piridin-2-ilmetil)-1,3,5-triazina-2,4,6-triamina)cobre(II)
Em um béquer de 50 mL com 10 mL de MeOH, foram dissolvidos 0,38 g do ligante L4P (0,5 mmol; MM = 777,40 g.mol-1). Sob agitação, em temperatura ambiente,
foram adicionados 0,37 g de Cu(ClO4)2 (1 mmol;
MM = 370,54 g.mol-1). Após 3 dias, houve a formação de um
filme no fundo do béquer, além de microcristais adequados apenas para resolução parcial da estrutura de Raios X. A este filme, foram adicionados 10 mL de CHCl3. O filme foi mantido no
solvente, sob agitação ultrassônica por 30 min, em seguida, precipitou um pó cristalino verde do complexo C4P (MM = 1249,13 g.mol-1), o qual foi filtrado em funil de placa porosa, com
rendimento quantitativo. Os espectros e a caracterização deste complexo seguem discutidos na Seção 4.2. deste trabalho.
