ISSN 0101-5230 Recebido/Received: junho 2001
RESUMO
O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência de diferentes períodos de equilíbrio, pré-congelamento, a 22-26ºC, e da remoção do plasma seminal na qualidade espermática do sêmen suíno pós-descongelamento. Foram utilizados 3 machos suínos adultos, sendo coletada a fração total de 15 ejaculados, os quais foram fracionados e submetidos aos seguintes tratamentos: equilíbrio de 1,5h (T1); equilíbrio de 20h (T2) e equilíbrio de 20h com remoção do plasma seminal (T3). O congelamento foi realizado pelo método modificado de Westendorf, com 2% de glicerol e envase em palhetas médias (0,5 mL). O descongelamento foi realizado em banho-maria a 37ºC por 20 segundos e o conteúdo da palheta foi diluído (1:6) em BTS. Como parâmetros de qualidade espermática foram utilizados os percentuais de motilidade (Mot), acrossomas normais (Nar) e de membranas íntegras (MI), avaliados após o descongelamento (PD) e após teste de termoresistência a 37ºC, por 2h (pós-TTR). A integridade das membranas foi analisada através dos corantes fluorescentes diacetato de carboxifluoresceína e iodeto de propídio. Para as amostras equilibradas na presença de plasma seminal, houve uma diminuição de 13% na MIPD (P<0,05) utilizando 20h de equilíbrio em relação a 1,5h, mas não houve diferenças (P>0,05) na Mot e Nar, tanto PD como pós-TTR. O equilíbrio de 20h, associado à remoção do plasma seminal, resultou em uma diminuição (P<0,05) na Mot e na MI, tanto PD como pós-TTR, em relação ao período de equilíbrio de 1,5h. Para as amostras equilibradas por 20h, a remoção do plasma seminal resultou em diminuição (P<0,05) da motilidade e MI, somente após TTR. Na temperatura utilizada (22-26ºC), um período longo de equilíbrio (20h) e a ausência de plasma seminal durante este equilíbrio afetaram negativamente a viabilidade dos espermatozóides suínos submetidos ao congelamento.
Descritores: congelamento, plasma seminal, sêmen, suíno.
VIABILIDADE DO SÊMEN SUÍNO CONGELADO SUBMETIDO A UM PERÍODO
DE EQUILÍBRIO PRÉ-CONGELAMENTO COM OU SEM A PRESENÇA
DE PLASMA SEMINAL
VIABILITY OF FROZEN SWINE SEMEN SUBMITTED TO A PRE-FREEZING EQUILIBRIUM TIME IN THE PRESENCE OR ABSENCE OF PLASMA SEMINAL
P.M. OHATA1, I. WENTZ2, M.L. BERNARDI3, C. CASTAGNA4 & F.P. BORTOLOZZO2
ABSTRACT
The aim of this work was to evaluate the influence of different pre-freezing equilibrium periods and the removal of seminal plasma on spermatic vi-ability of swine semen after thawing. From 3 adult boars, 15 whole ejaculates were collected which were fractionated and submitted to the following treatments: equilibrium for 1.5h (T1); equilibrium for 20h (T2) and removal of plasma seminal with equilibrium for 20h (T3). Freezing method was that of Westendorf, with 2% glycerol and storage in 0.5 mL straws. The straws content, thawed at 37oC for 20 seconds, was diluted (1:6) in BTS. The parameters of spermatic quality evaluated after thawing (PD) and after a thermoresistance test, at 37oC, for 2h (TTR), were motility (Mot), normal acrosomes (Nar) and membrane integrity (MI). MI was evaluated by fluorescence with propidium iodide and carboxyfluorescein diacetate staining. In the presence of plasma seminal, there was a decrease (P<0.05) of 13% in MI PD using 20h equilibrium as compared to 1.5h, but there was no differences (P>0.05) in Mot and Nar, both after thaw-ing and TTR. Equilibrium time of 20h associated to the removal of seminal plasma resulted in a decrease (P<0.05) of Mot and MI, after PD and TTR, as com-pared to 1.5h. When plasma seminal was removed in the samples equilibrated for 20h, there was a decrease (P<0.05) in Mot and MI, only after TTR. A long equi-librium time (20h) and the absence of seminal plasma during this equilibrium, at 22-26ºC, had negative ef-fects on the viability of swine spermatozoa submitted to freezing.
Key words: freezing, semen, seminal plasma, swine.
1 Médica Veterinária - MSc em Ciências Veterinárias - Faculdade de Veterinária/UFRGS. e-mail: pmohata@hotmail.com
INTRODUÇÃO
A inseminação artificial em suínos tem crescido amplamente na última década. Atualmente, estima-se que sejam realizadas em torno de 19 milhões de inseminações no mundo, sendo que destas, menos de 1% envolvem o uso de sêmen congelado (Johnson et al., 2000). A maioria das inseminações é conduzida com sêmen resfriado a 15-18ºC, proporcionando resultados de fertilidade similares aos da monta natural. Apesar disto, o sêmen resfriado possui limitações na sua viabilidade temporal, restringindo o uso das doses inseminantes por períodos médios de dois a três dias após a coleta. Este problema poderia facilmente ser superado com o emprego de sêmen congelado. No início da década de 60 já eram desenvolvidos trabalhos no intuito de otimizar o protocolo de congelamento de sêmen suíno (Hess et al., 1960). Apesar dos avanços efetuados, no entanto, o uso de sêmen congelado ainda está associado a índices reprodutivos insatisfatórios, quando comparados aos obtidos com o emprego de sêmen resfriado (Almlid & Hofmo, 1996; Mileham et al., 1997; Woelders, 1997). Johnson (1998) cita uma variação de 50 a 70% na taxa de parição e de 7 a 10 leitões no tamanho de leitegada. Deste modo, o emprego do sêmen congelado ainda está restrito ao melhoramento genético, intercâmbio de material genético entre os países, repovoamento de granjas, formação de bancos genéticos e pesquisas científicas (Reed, 1985; Scheid et al., 1990).
Durante o período de equilíbrio, a influência do plasma seminal, na qualidade espermática pós-descongelamento, tem causado controvérsias. Em alguns casos, a retirada do plasma seminal teve um efeito negativo (Butler & Roberts, 1975), mas em outros a viabilidade espermática pós-descongelamento não foi afetada (Salamon, 1973; Fazano, 1986; Kotzias–Bandeira, 1997).
Pelo acima exposto, evidencia-se a necessidade de mais estudos para aperfeiçoar o protocolo de congelamento, de modo a obter-se maior viabilidade espermática pós-descongelamento e, assim, maiores índices de fertilidade in vivo, viabilizando economicamente o emprego desta biotecnologia. O presente trabalho teve como objetivo verificar se diferentes tempos (1,5h e 20h) de equilíbrio pré-congelamento e a presença do plasma seminal, durante o período de equilíbrio, influenciam na qualidade espermática após o congelamento.
MATERIAIS E MÉTODOS
Foram coletados cinco ejaculados de cada um dos três machos adultos híbridos. A coleta do sêmen foi realizada com intervalos de três a quatro dias pelo método da estimulação com a mão enluvada (Hancock & Hovell, 1959) e auxílio de um manequim fixo ao piso. O ejaculado total foi coletado em saco plástico descartável protegido por um recipiente térmico, previamente aquecido a 38ºC, com dupla camada de gaze para a separação da fração gelatinosa. O sêmen foi mantido em banho-maria, a 32ºC, para avaliação da cor, aspecto, volume e odor, sendo também avaliadas a motilidade, a concentração e a morfologia espermática. Os critérios utilizados para a escolha dos ejaculados a serem congelados fo-ram os de motilidade superior a 75% e alterações morfológicas inferiores a 20%. O congelamento foi realizado segundo a técnica modificada de Westendorf et al. (1975), com concentração fi-nal de 2% de glicerol e envase em palhetas médias (0,5 mL).
Os ejaculados foram fracionados e submetidos aos seguintes tratamentos:
Tratamento 1 (T1) - Período Curto
(1,5h) de equilíbrio a 22-26ºC.
O ejaculado foi diluído 1:1 em BTS, a 32ºC, e mantido à temperatura ambiente (22-26ºC) por 90 minutos. Posteriormente, foi
resfriado a 15ºC por 150 minutos e, ao final deste período, foi centrifugado (800g por 10 minutos), a 15ºC, sendo o sobrenadante desprezado e o sedimento (pellet) ressuspendido com diluente de resfriamento (DR - 80 mL de solução de lac-tose 11%; 20 mL de gema de ovo). A concentração de espermatozóides no pellet foi estimada utilizando a câmara de Neubauer Im-proved e, com isso, foi determinado o volume de ressuspensão do DR necessário para a diluição atingir a concentração de 1,5 x 109
espermatozóides. O pellet ressuspendido foi mantido a 5ºC por 90 minutos (1,5h) e, após esse período, foi adicionado o diluente de congelamento (DC - 72,5 mL de lactose 11%; 20 mL de gema de ovo; 6 mL de glicerol; 1,5 mL de Orvus-es-Paste - Equex-Paste, Ref.13560/ 0030, Minitüb Afüll-und Labortechnik GmbH & Co.KG) até atingir uma concentração final de 1 x 109 espermatozóides. Imediatamente após ter
sido acrescentado o DC, foi realizado o envase em palhetas médias (0,5mL), as quais foram mantidas em vapor de nitrogênio (-120ºC), por 20 minutos e, posteriormente, mergulhadas em nitrogênio líquido a -196ºC.
Tratamento 2 (T2) - Período Longo
(20h) de equilíbrio a 22-26ºC.
Imediatamente após a coleta, o ejaculado foi diluído (1:1) em BTS, a 32ºC, e mantido à temperatura ambiente (22-26ºC) por 20h. Após este período, o ejaculado diluído foi resfriado a 15ºC por 150 minutos. As etapas seguintes, envolvendo a centrifugação, até o armazenamento das palhetas em nitrogênio líquido, foram similares às descritas para o T1.
Tratamento 3 (T3) - Período Longo
(20h) de equilíbrio a 22-26ºC, na ausência de plasma seminal.
Após a diluição do ejaculado na proporção 1:1 em diluente BTS, a 32ºC, foi realizada a centrifugação (800g por 10 minutos), para a retirada do plasma seminal e a reposição de BTS, no mesmo volume do plasma retirado. Esta ressuspensão foi mantida em temperatura ambiente (22-26ºC) durante 20h e, posteriormente, resfriada a
15ºC por 150 minutos (2,5 h). Após esta etapa, foi novamente centrifugada a 800g, a 15ºC, por 10 minutos e, ao final deste processamento, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento (pellet) ressuspendido com o diluente de resfriamento. Os procedimentos restantes fo-ram efetuados da mesma forma que os descritos para o T1.
Descongelamento do sêmen e avaliação da qualidade espermática
O descongelamento foi realizado através da agitação da palheta com uma pinça, em banho-maria a 37ºC, por 20 segundos (Max-well & Johnson, 1997). Posteriormente, a palheta foi seca com papel toalha, as extremidades cortadas com uma tesoura e seu conteúdo ressuspendido com 3mL de diluente BTS, a 37ºC. O teste de termoresistência (TTR) foi realizado pela incubação do sêmen diluído por 2h, em banho-maria a 37ºC (Almlid & Johnson, 1988). A qualidade espermática foi verificada pela análise da motilidade, do percentual de acrossomas normais e do percentual de membranas íntegras, após o descongelamento e após o TTR.
A análise da motilidade foi realizada pelo método subjetivo de microscopia (100x), entre lâmina e lamínula. Foram avaliadas três amostras de cada palheta descongelada e diluída com BTS, mantida a 37ºC por 10 minutos ou por 2 h (TTR).
A morfologia do acrossoma foi avaliada a partir da mistura de uma alíquota de 40µl de sêmen descongelado em 1mL de formol citrato 2,94%. A amostra, depositada entre lâmina e lamínula, foi avaliada pela contagem de 200 células espermáticas em microscópio óptico de contraste de fase (1000x).
A integridade das membranas espermáticas foi avaliada pelo método de Harrison & Vickers (1990), no qual uma solução contendo 950µl da dose descongelada e diluída em BTS, 20µl de diacetato de carbo-xifluoresceína (20mM), 10µl de iodeto de propídio
(7,3mM) e 20µl de paraformaldeído (1,7mM) foi incubada por 8 minutos, a 30ºC, em banho-maria. Após esse período, uma alíquota de 4µL foi examinada, entre lâmina e lamínula, em microscópio de epifluorescência (filtro EX/DM/ BF=450-490/510/ 520nm) em aumento de 1000x. Foram examinadas 400 células para cada amostra de sêmen descongelada.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, e a influência dos tratamentos, dos machos doadores e da sua interação, sobre a motilidade, percentual de acrossomas normais e integridade das membranas, após o descongelamento e após o TTR, foi analisada através de análise de variância utilizando o procedimento GLM (SAS, 1998). As médias foram calculadas pela opção LSMeans e o teste de Tukey foi utilizado para a comparação das médias.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados médios de motilidade ( 5 4 % ) e N a r ( 6 9 % ) , o b t i d o s a p ó s o descongelamento do sêmen, no presente estudo, encontram-se dentro das variações observadas em outros trabalhos realizados na área de criopreservação de sêmen suíno. Com o uso de palhetas médias, Fazano (1986) e Berger & Fischerleitner (1992) obtiveram, respectivamente, valores de 19% e 30% de motilidade, e de 34% e 50% de Nar. N o p r e s e n t e e s t u d o , a a v a l i a ç ã o d a integridade das membranas espermáticas (MI), através de coloração fluorescente, resultou em valores médios de 36% e de 26%, após o descongelamento e após o teste de termoresistência, respectivamente. Com o uso de macrotubos, Almlid & Johnson (1988) obtiveram índices de MI de 38%, após o descongelamento, e de 33%, após o teste de termoresistência. A MI também foi avaliada, a p ó s o d e s c o n g e l a m e n t o d e s ê m e n congelado em bolsas plásticas, sendo obtidas m é d i a s d e 2 3 % ( O r t m a n & R o d r i g u e z
-Martinez, 1994) e 41% (Rodriguez-Martinez et al., 1996).
A redução lenta da temperatura do sêmen suíno, após a coleta e antes de submetê-lo a temperaturas inferiores a 15ºC, tem como objetivo diminuir os efeitos deletérios do choque térmico sobre os espermatozóides, aumentando a sua viabilidade após o descongelamento. No presente estudo, o tempo de equilíbrio não influenciou (P>0,05) a motilidade e o Nar, tanto após o descongelamento como após o TTR (Tabela 1). No tratamento com período longo (20h) de equilíbrio, entretanto, foi observada uma diminuição (P<0,05) de 13% na MI, após o descongelamento, e uma redução de 12% na motilidade pós-TTR (P<0,08), em relação ao período curto (1,5h). Contrariamente aos dados do presente estudo, ao analisar a influência do tempo de equilíbrio a 18ºC sobre a motilidade pós-descongelamento, Kotzias-Bandeira (1997) verificou um aumento significativo de 13%, quando o tempo de equilíbrio passou de 1,5h para 20h. A redução da viabilidade, expressa no presente estudo pela redução da integridade das membranas e da motilidade, pode ter sido causada pelo fato de que o sêmen diluído foi exposto a temperaturas entre 22-26ºC, acima dos 18ºC (Kotzias-Bandeira, 1997) e 17ºC (Eriksson & Rodriguez-Martinez, 2000), utilizados em outros estudos. É possível que a temperatura elevada e o longo tempo de exposição, durante o período de equilíbrio, no presente estudo, tenham sido prejudiciais aos espermatozóides, devido a alterações metabólicas ou mesmo a alterações nas características das membranas espermáticas.
Os índices de motilidade e membranas íntegras, após o descongelamento e pós-TTR, além dos índices de Nar pós-TTR, observados no tempo de equilíbrio de 1,5h (T1), foram superiores (P<0,05) aos observados no tempo de 20h, quando este último foi associado à remoção do plasma seminal (T3). Não houve efeito negativo da remoção do plasma seminal na Mot, Nar e MI, após o descongelamento, mas houve uma redução (P<0,05) na Mot e MI, quando
Tabela 1 – Viabilidade do sêmen suíno (% ± erro-padrão) submetido a diferentes períodos de equilíbrio a 22-26ºC, antes do congelamento Parâmetros de viabilidade Motilidade pós-descongelamento Motilidade pós-TTR Nar pós-descongelamento Nar pós-TTR
Membranas íntegras pós-descongelamento Membranas íntegras pós-TTR T1 (n= 15) 60,2 ± 1,6a 51,0± 2,2a 67,8 ± 3,6a 40,6 ± 3,7a 46,0 ± 2,7a 34,3 ± 2,5a T2 (n= 15) 53,3 ± 2,1ab 39,4 ± 4,0a 71,5 ± 1,8a 33,2 ± 3,1ab 32,9 ± 3,6b 26,8 ± 3,4a T3 (n= 15) 48,3 ± 4,0b 32,5 ± 5,2b 67,4 ± 3,8a 31,5 ± 4,3b 28,5 ± 4,1b 17,1 ± 2,6b Tratamentos
T1=1,5h, T2=20h e T3=20h e sem plasma seminal a, b na mesma linha (P<0,05)
avaliadas após o TTR, em relação ao tratamento com mesmo tempo (20h) de equilíbrio e presença de plasma seminal (T2). É difícil de estabelecer se este efeito se deveu exclusivamente à ausência do plasma seminal ou também ao efeito da centrifugação. Informações quanto à sensibilidade do espermatozóide suíno à centrifugação são escassas. A centrifugação do sêmen suíno, por 10 min a 800g, é classicamente utilizada nos protocolos de congelamento. Salamon (1973) observou que a centrifugação a 1000g por 10 minutos causou efeitos deletérios na motilidade de espermatozóides suínos. Pode ser cogitado que a realização de duas centrifugações, uma para a remoção do plasma seminal e outra no próprio congelamento, tenha acarretado danos aos espermatozóides. Fazano (1986), no entanto, não detectou redução na motilidade e Nar, após o descongelamento, quando o sêmen foi submetido a duas centrifugações de 800g por 10 minutos cada.
Resultados contraditórios têm sido observados no que diz respeito à influência do plasma seminal na qualidade espermática (Paquignon, 1985). Pursel et al. (1972) reportaram que o plasma seminal torna o espermatozóide suíno mais sensível ao choque térmico. De fato, espermatozóides ejaculados são mais sensíveis ao congelamento do que espermatozóides epididimários, embora não esteja comprovado que a maior sensibilidade se
deva exclusivamente ao contato com o plasma seminal (Rath & Niemann, 1997). Também há controvérsias no que diz respeito à remoção ou não do plasma seminal, após a ejaculação, an-tes de efetuar o congelamento. Salamon (1973) observou que a retirada do plasma seminal não interferiu na viabilidade pós-descongelamento e Moore & Hibbit (1977) não observaram diferenças na viabilidade dos espermatozóides, antes e após o congelamento, utilizando ejaculado total ou ejaculado de machos sem vesículas seminais. Da mesma forma, Kotzias– Bandeira (1997) também não observou nenhuma influência do plasma seminal na qualidade espermática, ao adicioná-lo na fração rica. A remoção ou não do plasma seminal, após a coleta e diluição, não acarretou em efeitos prejudiciais aos espermatozóides submetidos ao congelamento (Fazano, 1986). Com base nas observações citadas e os resultados obtidos neste experimento, um procedimento extra de centrifugação, envolvendo a remoção do plasma seminal, além de tornar o protocolo de congelamento menos prático, não apresenta benefícios que justifiquem sua inclusão no protocolo de congelamento de sêmen suíno.
Ao considerar o efeito dos machos na qualidade espermática pós-descongelamento foi constatada uma variação significativa (P<0,05) entre os mesmos (Tabela 2), mas não foi observado efeito (P>0,05) da interação macho e tratamento. Essas diferenças observadas
en-tre machos quanto à viabilidade espermática após o congelamento (Tabela 2) confirmam as constatações efetuadas anteriormente por vários pesquisadores (Larsson & Einarsson, 1976; Larsson, 1978; Mies Filho et al., 1978; Cöster-Cuevas, 1978; Fiser et al. 1996; Rodriguez-Martinez et al., 1996; Reed, 1985; Roca et al., 1999). No que diz respeito à espécie suína, alguns autores (Woelders et al., 1996;
Almlid & Hofmo, 1996; Johnson et al., 1981) citam que diferenças raciais influenciam na congelabilidade do sêmen. No presente estudo, apesar da composição genética semelhante, foram observadas diferenças entre os machos, após o descongelamento, de até 18% no Nar e de 10% na motilidade, demonstrando que outros fatores também devem estar envolvidos nessa variação.
Tabela 2 – Efeito do macho sobre a viabilidade de sêmen suíno (% ± erro-padrão) submetido ao congelamento
Parâmetros de viabilidade
Motilidade pós-descongelamento Motilidade pós-TTR
Nar pós-descongelamento Nar pós-TTR
Membranas íntegras pós-descongelamento Membranas íntegras pós-TTR M1 (n=15) 60 ± 1,6a 50 ± 3,9a 73 ± 1,6a 46 ± 2,9a 40 ± 3,5a 30 ± 3,3a M2 (n=15) 50 ± 3,7b 38 ± 3,6ab 76 ± 1,4a 39 ± 1,9a 34 ± 4,0a 28 ± 3,3ab M3 (n=15) 51 ± 2,8b 35 ± 4,8b 58 ± 3,5b 21 ± 3,3b 33 ± 4,1a 20 ± 3,0b
a,b na mesma linha (P<0,05)
CONCLUSÕES
Na presença de plasma seminal, um período longo (20h) de equilíbrio, a 22-26ºC, afetou negativamente a integridade das membranas espermáticas, após o descongelamento, mas não a motilidade e Nar, em relação a um período curto de equilíbrio (1,5h). A ausência de plasma seminal, durante um período de equilíbrio de 20h, diminuiu a viabilidade espermática (motilidade e integridade das membranas) pós-TTR.
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Recebido/Received: junho 2001 Aceito/Accepted: outubro 2001
