Centro Universitário do Planalto Central Apparecido dos Santos - UNICEPLAC Curso de Medicina Veterinária
Trabalho de Conclusão de Curso
Avaliação da função luteal em ovelhas, comparativo entre
diâmetro do corpo lúteo e fluxo sanguíneo luteal.
Gama-DF 2019
LUCAS MACEDO SANTOS
Avaliação da função luteal em ovelhas, comparativo entre
diâmetro do corpo lúteo e fluxo sanguíneo luteal.
Artigo apresentado como requisito para conclusão do curso de Bacharelado em Medicina Veterinária pelo Centro Universitário do Planalto Central Apparecido dos Santos – Uniceplac.
Orientadora: Profª. Ms. Caroline Lavocat Nunes Pollini
Gama-DF 2019
Avaliação da função luteal em ovelhas, comparativo entre
diâmetro do corpo lúteo e fluxo sanguíneo luteal.
Lucas Macedo Santos1 Caroline Lavocat Nunes Pollini 2
Resumo:
A ultrassonografia modo Doppler é uma técnica na qual se consegue avaliar o fluxo sanguíneo de tecidos e órgãos pelos aspectos vasculares e hemodinâmicos, podendo estimar sua funcionalidade. Objetivou-se avaliar o fluxo sanguíneo luteal durante a luteólise em ovelhas. Foram ultilizadas 20 ovelhas Santa Inês aptas a reprodução, submetidas a protocolo de sincronização de estro com dispositivo intravaginal de P4 por 7 dias, aplicação de 300 UI de eCG e 0,275 mg de PGF2α na retirada do dispositivo. A observação de estro foi realizada 48 a 56 horas após a retirada do dispositivo, com auxílio de um rufião. As avaliações de diâmetro e fluxo sanguíneo foram realizadas com ultrassom Doppler, nos dias 13, 15, 17, 19, 21 e 23 após a observação do estro. O grau de irrigação foi avaliado pelo percentual de vascularização do CL, em grau 1 (0-25 %), grau 2 (26-50%), grau 3 (51-75%) e grau 4 (76-100%). Os resultados dos diâmetros foram analisados pelo teste de ANOVA, e o grau de irrigação pelo teste de Kruskal-Wallis (P<0,05). Houve uma redução no diâmetro médio dos CLs entre o D15 (9,55±0,82 mm) e D17 (8,43±1,20 mm), assim como no grau de irrigação (2,44±0,86;1,80±1,01; D15 e 17, respectivamente), nos demais dias as avaliações permaneceram semelhantes entre-se. Apesar de visível o CL não tinha mais irrigação em D23 (5,27±0,82 mm, grau 1,00±0,00). Conclui-se que foi possível observar a luteólise entre os dias 15 e 17, quando ocorre a redução da porcentagem de vascularização e diâmetro do CL.
Palavras-chave: Doppler. Ultrassonografia. Vascularização. Diâmetro. Luteólise.
Abstract:
Doppler mode ultrasound is a technique in which the blood flow of tissues and organs can be evaluated by vascular and hemodynamic aspects, and its functionality can be estimated. The aim of this study was to evaluate luteal blood flow during luteolysis in sheep. Twenty breeding Santa Inês ewes were submitted to estrus synchronization protocol with P4 intravaginal device for 7 days, 300 IU eCG and 0.275 mg PGF2α were removed at device removal. Oestrus observation was performed 48 to 56 hours after device removal, with the help of a ruffian. Diameter and blood flow evaluations were performed with Doppler ultrasound on days 13, 15, 17, 19, 21 and 23 after estrus observation. The degree of irrigation was evaluated by the percentage of CL vascularization, in grade 1 (0-25%), grade 2 (26-50%), grade 3 (51-75%) and grade 4 (76-100%). The results of the diameters were analyzed by NOVA test and degree of irrigation by the Kruskal-Wallis test (P <0.05). There was a reduction in the mean CL diameter between D15 (9.55 ± 0.82 mm) and D17 (8.43 ± 1.20 mm), as well as the degree of irrigation (2.44 ± 0.86; 1 80 ± 1.01; D15 and 17, respectively), on the other days the evaluations remained similar. Although visible, the CL had no more irrigation at D23 (5.27 ± 0.82 mm, grade 1.00 ± 0.00). It was concluded that it was possible to observe luteolysis between the 15th and 17th, when the percentage of vascularization and CL diameter decreased.
Keywords: Doppler. Ultrasonography. Vascularization. Diameter. Luteolysis.
1Graduando do Curso de Medicina Veterinária, do Centro Universitário do Planalto Central Apparecido dos Santos– Uniceplac. E-mail: lucas099macedo@gmail.com.
2Professora do Curso de Medicina Veterinária, do Centro Universitário do Planalto Central Apparecido dos Santos– Uniceplac.
1 INTRODUÇÃO
O rebanho brasileiro de ovinos em 2017 foi contabilizado em cerca de 13,7milhões de cabeças, concentrados principalmente nas regiões nordeste e sul do país, tendo em destaque os estados da Bahia e Rio Grande do Sul como as unidades da federação com os maiores rebanhos. O Distrito Federal possui um rebanho estimado em 11,8 mil cabeças, representando apenas 0,11% do rebanho nacional (IBGE, 2018).
A ovinocultura apresenta-se como uma atividade agropecuária de grande importância para a economia brasileira, sendo realizado principalmente na forma de subsistência. Buscando aumentar a eficiências dos animais, tem-se tornado crescente a busca por melhorias nas técnicas produtivas (JESUS JUNIOR et al., 2010) e biotecnias reprodutivas aplicadas a ovinocultura (OLIVEIRA, 2009).
As ovelhas são animais poliéstricos estacionais de dias curtos, com ciclo estral de 17 dias (±1 dia) e sensibilidade ao fotoperíodo. A sensibilidade a variação da luz vai de acordo com a localização geográfica que o animal se encontra, com seus efeitos proporcionais a distancia que esse está da linha do equador (GORDON, 1997), já sendo descrito por Costa e Fidelis (2018), a ocorrência anestro estacional em ovelhas criadas no Distrito Federal nas estações de primavera e verão.
O corpo lúteo (CL) é uma glândula endócrina temporária formada principalmente por células da teca e células da granulosa luteinizadas (SALLES E ARAÚJO, 2010), com desenvolvimento inicial caracterizado pelo aumento da vascularização e pela ocorrência de repetidas mitoses. Sendo que após dois a três dias da ovulação há uma intensidade no processo angiogênico dentro do CL (REYNOLDS et al., 2000), onde o processo hiperplásico atinge seu máximo no décimo segundo dia (GORDON, 1997). Com todo esse processo, o CL torna-se uma das estruturas mais vascularizadas do organismo (GAYTAN et al., 1999), recebendo a maior taxa de fluxo sanguíneo por tecido de todo o organismo (WILTBANK et al., 1988).
O sistema de vascularização do CL funciona como um entregador biológico de nutrientes para as células lúteas, indispensáveis para produção e manutenção da secreção de progesterona (AYRES e MINGOTI, 2012), que tem a importante função de preparar o ambiente uterino para receber o embrião (SALLES E ARAÚJO, 2010). A produção e liberação da progesterona são realizadas de maneira gradual, atingindo auge da atividade secretora entre o sexto ao oitavo dia após a ovulação, que em gestação ira se manter ou reduzir por ação da luteólise decimo quinto dia (GORDON, 1997). A liberação de progesterona é proporcional ao efeito de inibição da luteólise, e quando essa está reduzida
consequentemente reduz o tempo para o embrião sinalizar gestação (OLIVEIRA, 2009). Em bovinos foi realizado um trabalho por Herzog et al. (2010), mostraram uma alta correlação entre o fluxo sanguíneo luteal e a concentração de P4, principalmente na fase de luteólise. A correlação entre fluxo sanguíneo e P4 foi maior que entre o diâmetro do CL e a P4.
Os dados de crescimento folicular ovariano em ovelhas durante o ciclo estral eram realizados mediante laparotomia, laparoscopia ou com materiais coletados em matadouros (DRIANCOURT et al. 1985; DRIANCOURT et al., 1991; NOEL et al., 1993), apesar de mostrarem o crescimento e regressão folicular eram técnicas bastante invasivas. Além disto, nestas avaliações se obtinham apenas uma “fotografia” estática de determinados momentos do ciclo estral e não uma avaliação contínua em tempo real, dos processos (LUCY et al., 1992). A partir dos anos 1980, com a utilização da ultrassonografia em estudos da fisiologia ovariana de ruminantes domésticos, pode-se acompanhar de modo contínuo e não invasivo o comportamento das estruturas ovarianas ao longo do ciclo estral. Deste modo, houve um grande avanço no entendimento da fisiologia reprodutiva destes animais (BARTLEWSKI et al., 1998; EVANS et al., 2000; CONTRERAS-SOLIS et al., 2008; RAVINDRA et al., 1994; REYNA et al., 2007; RUBIANES et al., 1997; RUBIANES et al., 2003; URIBE-VELÁSQUEZ et al., 2008; VIÑOLES et al., 2004).
Existem inúmeros estudos de imagens ultrassonográficas que investigam processos reprodutivos relacionados ao ovário, útero e função fetal em bovinos (GASPERIN et al., 2017). Métodos ultrassonográficos também levaram a diagnósticos mais acurados no manejo reprodutivo, como o diagnóstico precoce de gestação comparado a palpação retal (SANTOS, et al. 2017). A ultrassonografia transretal também é utilizada para exames gestacionais em larga escala na ovinocultura atualmente, e sua eficiência foi comprovada no experimento realizado por Wurst et al. (2007), onde ficou definido que era uma técnica segura e de baixo estresse.
A ultrassonografia Doppler foi uma técnica descrita por Christian Johann Doppler em 1842, a qual se consegue avaliar o fluxo sanguíneo de tecidos e órgãos a partir do movimento do sangue no sistema cardiovascular podendo estimar a sua funcionalidade dos mesmos (SANTOS, et al. 2017). Esse método consiste na emissão de ondas (sonoras ou eletromagnéticas) por um transdutor em sentido as estruturas, onde que a frequência das ondas emitidas ira se altera ao se chocar com as células sanguíneas que estão em movimento em relação ao receptor. Esse contato entre o fluxo sanguíneo com as ondas emitidas acaba alterando a frequência da mesma, assim aumentando a frequência durante a aproximação da
fonte e diminuindo durante o seu distanciamento (MATSUI e MIYAMOTO, 2009).
A ultrassonografia Doppler detecta o movimento das células sanguíneas nos vasos e projeta isso no monitor do aparelho através de cores, tornando possível a avaliação do fluxo sanguíneo luteal. Os vasos sanguíneos circundam o CL, e em avaliação irão aparecer principalmente como um círculo colorido nas bordas e no interior da estrutura lútea (LÜTTGENAU e BOLLWEIN, 2014), dessa forma o Doppler é um método preciso, não invasivo e reprodutível para avaliação do fluxo sanguíneo no CL.
Em um programa de transferência de embriões é importante saber a qualidade do CL, tanto para a doadora quanto para a receptora de embriões, devido a regressão precoce do CL em ovelhas. A ocorrência de regressão precoce de CL esta relacionado aos protocolos de superovulação, que devido à quantidade de hormônios utilizado esse interfere no desenvolvimento adequado do mesmo, gerando uma estrutura de pouca funcionalidade e produzindo embriões de baixa qualidade (RODRIGUEZ, et al. 2015).
A avaliação das estruturas ovarianas e eventos ocorrentes eram realizados com ultrassonografia modo B ou laparoscopia (MUTERLLE, 2014), entretanto nenhuma das técnicas é capaz de estimar a funcionalidade do CL, a não ser através da medida da concentração de P4 no sangue que tem uma boa eficiência (LÜTTGENAU et al., 2011). A avaliação do fluxo sanguíneo luteal através da ultrassonografia Doppler pode ser uma boa ferramenta para avaliar a funcionalidade do CL em ovelhas próximo a luteólise.
O objetivo desse trabalho foi avaliar o fluxo sanguíneo luteal durante a fase lútea final em ovelhas, comparando-o com o diâmetro do CL antes, durante e depois a luteólise, determinando assim se somente a avaliação de fluxo sanguíneo luteal é suficiente para indicar a funcionalidade do CL.
2 PROCEDIMENTOS METODOLÓGICOS
O experimento foi realizado entre os meses de março a maio de 2019, no Setor de Campo Experimental Fazenda Sucupira (SCEFS) da Embrapa Recursos Genético e Biotecnologia - Cenargen, situada em Brasília, DF. Localizado a 15°47' de latitude sul e 47°55' de longitude oeste, a 1080 metros de altitude e em região de clima tropical.
Foram utilizadas 20 ovelhas da raça Santa Inês, com idade entre 2 e 5 anos, média de escore corporal 2,5 (na escala de 1 a 5), previamente avaliadas quanto ao estado clínico geral e reprodutivo. Os animais eram criados em piquete de brachiaria spp. com sal mineral e agua ad libitum.
dispositivo intravaginal de progesterona (EAZI-BREED CIDR - OVINOS E CAPRINOS®, InterAg), que permaneceu por 7 dias, aplicação de 300 UI de eCG (gonadotrofina coriônica equina, NOVORMON®, Zoettis) e 0,275 mg de análogo sintético de PGF2α (prostaglandina F2α, SICRONIZE, Calbos) na retirada do dispositivo. Foi realizada observação de estro com rufião de peitoral previamente pintado com mistura à base de corante vermelho em pó e óleo vegetal, durante o período de 53 a 76 horas após a retirada do dispositivo (Figura 1).
Figura 1 – Identificação de estro com rufião de peitoral pintado; ovelha com garupa marcada pelo rufião após manifestação de estro.
Para obter os dados de diâmetro e vascularização dos corpos lúteos (CLs), os animais foram avaliados com ultrassom Color Doppler (MyLab™ 30GoldVET, Esaote) com transdutor linear adaptado em tubo de policloreto de vinila (PVC) via transretal (Figura 2), nos dias 13 (D13), 15 (D15), 17 (D17), 19 (D19), 21(D21) e 23 (D23) após a observação do estro. O fluxo sanguíneo luteal foi avaliado subjetivamente pela porcentagem de vascularização do CL, sendo grau 1 entre 0 e 25 % de vascularização (Figura 3), grau 2 entre 26 e 50% (Figura 4), grau 3 entre 51 e 75% (Figura 5), e grau 4 entre 76 e 100% (Figura 6).
Figura 2 – Cabo de PVC, transdutor linear e fita adesiva; transdutor já fixadono cabo de PVC com fita adesiva.
Figura 3 – Corpo lúteo grau 1 apresentando irrigação entre 0 e 25%.
Figura 4 – Corpo lúteo grau 2 apresentando irrigação entre 26 e 50%.
Figura 6 – Corpo lúteo grau 4 apresentando irrigação entre 76 e 100%.
Os animais com mais de 1 CL foram analisados pela média das estruturas, estimando assim o diâmetro e grau de irrigação. O CL com cavidade teve o diâmetro total subtraído pelo diâmetro da cavidade presente nos dias das avaliações. Os resultados dos diâmetros médio diários dos CLs foram analisados pelo teste de ANOVA, e o grau de irrigação pelo teste de Kruskal-Wallis. Considerando grau de significância P<0,05.
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
Dos animas utilizados no experimento, 70% (n=14) tiveram a formação de apenas 1 CL e sem cavidade, 20%(n=4) tiveram a formação de 2 CL, 5% (n=1) apresentaram três CL e 5% (n=1) apresentaram CL cavitário. Não foi observada presença de CL cavitários em animais de múltiplas ovulações.
Nas avaliações de D13 para D15 não foi observado diferença no padrão de irrigação e tao quanto no padrão de irrigação do mesmo. Já nas avaliações de D15 para D17 foi observado uma redução no grau de irrigação tão quanto no diâmetro luteal, sendo que essa alteração se manteve constante ao longo das avaliações seguintes, e já não apresentando mais diferença entre-se (Tabela 1). Como as ovelhas são animais poliéstricas estacionais com ciclo estral médio de 17 dias, sendo dividido em fase lútea e fase folicular com duração de 14 a 15 dias e 2 a 3 dias, respectivamente (GORDON, 1999), essas alterações observadas foram encontradas durante a divergência entre as duas fases.
Nas avaliações de D13 80% das ovelhas tinham de boa a excelente viabilidade lútea, considerando a média do grau de irrigação e diâmetro, caso ocorresse concepção o padrão inicial de irrigação e diâmetro deveria se manter até próximo ao parto (DAL et al., 2019). Em trabalho realizado por Arashiro et al., (2018) para predizer diagnóstico de gestacional, as avaliações ainda no diestro (D12), foram de baixa correlação com status gestacional que os animais se encontravam, por estarem na fase lútea do ciclo estral.
Mesmo não havendo diferença de irrigações nas avaliações iniciais, foi observado que de D13 para o D15, 35% (n=7) dos animais já apresentavam uma redução média individual no do grau de irrigação, sendo observado que os CLs possuíam uma quantidade de pontos de irrigação igual o inferior a 50% da estimada anteriormente.
Nas avaliações entre o D15 e D17, observou-se que houve uma regressão rápida no grau de vascularização, sendo que em D17 50% dos animais já tinham irrigação lútea grau 1, apresentando pouco ou nenhum sinal de irrigação, onde ocorreu uma redução de 2,44 (±0,86) para 1,80 (±1,01) (P<0,05). Nas avaliações seguintes essa redução se manteve semelhante, mas sendo crescente o número de animais que apresentavam o grau 1 de irrigação, e já no D23 todos os animais todos os animais tinham grau 1, não mais apresentando pontos de vascularização. Essa elevação no numero de CLs grau 1 e redução no padrão de irrigação é decorrente ao inicio do estabelecimento da luteolise, com redução no padrão de irrigação (ARASHIRO et al., 2018), sendo que Figueira et al. (2015) observaram que as alterações no padrão de irrigação ocorrem em até 24 horas do inicio da luteólise, já as diferenças no diâmetro dos corpos lúteos só vão ser observados 48 horas após o inicio do processo.
Para HERZOG et al. (2010) ao avaliar a funcionalidade do CL de vacas em diferentes dias, observou que a concentração de progesterona sérica é estreitamente relacionada à irrigação luteal, mas não tem a mesma relação com o diâmetro. Sem a avaliação com modo Doppler não é possível estimar a funcionalidade do CL utilizando apenas a avaliação de diâmetro, e mesmo apresentando um tamanho considerável já pode estar no estágio de luteólise. De acordo Lüttgenau et al. (2011) mesmo se correlacionar os resultados da Tabela 1- Diâmetro e grau de irrigação do CL durante a luteólise avaliado por ultrassonografia Doppler (M±D.P.). D13 D15 D17 D19 D21 D23 Diâmetro 9,80 ± 0,89 A 9,55 ± 0,82 A 8,43 ± 1,20 B 7,11 ± 0,91 B 6,08 ± 0,95 B 5,27 ± 0,70 B Grau de irrigação 3,21 ± 0,75 A 2,44 ± 0,86 A 1,80 ± 1,01 B 1,25 ± 0,64 B 1,08 ± 0,34 B 1,00 ± 0,00 B
concentração sérica de progesterona com o diâmetro luteal, não se tem informações suficientes para boa estimativa da funcionalidade das células lúteas (LÜTTGENAU et al., 2011).
Correlacionando os resultados dos graus de irrigação e diâmetros dos CL com a fase do ciclo estral (GORDON, 1999), observa-se que em D13 o CL apresenta uma boa funcionalidade lútea quanto ao grau de vascularização por estar no diestro. Nas avaliações de D15 que foi possível observar que algum animal já apresentava uma redução no grau de irrigação, enquanto outros vinham ainda mantendo os valores iniciais de irrigação, sendo correlacionado com início da luteólise. Alteração semelhante foi observada por Arashiro et al., (2018), que classificam esses eventos como pré-luteólise e inicio da luteólise respectivamente.
Em D17 80% dos animais apresentava alguma alteração em relação ao grau de irrigação observado inicialmente, caracterizando o estabelecimento da fase de luteólise.
Inicialmente a luteólise é caracterizada como uma disfunção das células luteinicas para a produção e secreção de P4, sendo possível observação de mudança no padrão de irrigação do CL, já as alterações estruturais só conseguem ser visualizadas algum tempo depois, com redução no diâmetro médio da estrutura (FIGUEIRA et al., 2015). Como a concentração de P4 está mais relacionada ao fluxo sanguíneo do que ao diâmetro lúteo, caso as avaliações fossem realizadas apenas com a ultrassonografia modo B, não se conseguiria estimar com uma maior precisão quando se iniciou a luteólise, podendo o CL está presente com diâmetro considerável, mas sem irrigação ou atividade funcional.
Como a ultrassonografia Doppler é uma excelente ferramenta para avaliação da funcionalidade de tecidos moles, sendo preciso, rápido e pouco invasivo. Tornando-se uma ótima ferramenta com potencial para ser aplicada em programas reprodutivos que necessitam do conhecimento da funcionalidade lútea, e sendo necessários mais estudos para sua aplicação na transferência de embriões. Em trabalho realizado por Bragança et al. (2016) utilizando essa técnica para predizer diagnostico gestacional, obtiveram taxa de sucesso em diagnósticos realizados já no D17, que para Arashiro et al. (2018), o principal limitante dessa técnica é a correta identificação dos graus de irrigação em situações que é avaliado subjetivamente.
Herzog et al. (2010), sugerem que a técnica não é confiável para avaliar o estado reprodutivo de animais onde se desconheça a possível fase do ciclo estral em que ela se encontra, pois, os CLs em luteogênese apresentam semelhança a estruturas em luteólise. Em alguns animais, durante as avaliações de D19 a D23 foi possível observar a neoformação de estruturas lúteas concomitantes a alguns CL que vinham sendo inicialmente analisados. Essas
apresentavam diâmetro e irrigação que evoluíram de forma progressiva ao longo das avaliações, sendo está ocorrência também observada por (Figueira et al., 2015), que também descreve a ser possível observar a formação de CL em menos de 1 dia após a ovulação com a ultrassonografia.
4 CONCLUSÃO
Os resultados demostraram que houve uma diferença no padrão de vascularização tão quanto no diâmetro luteal entre as avaliações de D15 para D17. A ultrassonografia com modo Doppler é uma excelente ferramenta para avaliar a funcionalidade do CL, com excelente correlação com fase do ciclo estral em que os animais se encontram.
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Agradecimentos
A Deus e N. Sra. Aparecida por todas as bênçãos em minha vida.
A minha Mãe Gilvania Macedo, meu pai Gilson Basílio, meus irmãos Gabriela e Antônio e toda minha família pelo amor, apoio e incentivo ao longo de toda essa jornada.
A minha orientadora de PIBIC Dra. Bianca Damiani e ao prof. Dr. Alexandre Ramos pela oportunidade, paciência, confiança, incentivos, ensinamentos e apoio durante todo o
projeto.
A minha orientadora de TCC profª MSc. Caroline Pollini pelo acolhimento como seu orientado, paciência, incentivo, ensinamentos e todo apoio para a conclusão desse projeto.
A minha grande amiga Gabriela Brilhante, pelo total apoio na realização desse projeto. A Embrapa Cenargen e CNPq por apoiar a realização desse projeto.
A todos os professores do curso de Medicina Veterinária por todo o conhecimento, paciência, incentivos, amizade...
Ao Dr. Heitor Teixeira, MSc. Reginaldo Azevedo e MSc. Leo Lucas por todo o apoio, conhecimento, paciência e conselhos ao longo dessa jornada.
Aos amigos da Embrapa/Fazenda Sucupira.
A todos os amigos da graduação, em especial aos grandes amigos de sala e grupo de WhatsApp "Almas Difíceis 🙏🏼".
Aos velhos e bons amigos conterrâneos que me desejaram sucesso nessa caminhada.
