1 DISTRIBUIÇÃO DE ESTÔMATOS EM FOLHAS DE DIFERENTES IDADES DE ERVA-MATE CULTIVADA EM MONOCULTURA E SUB-BOSQUE
Miroslava Rakocevic1, Aurélio Vinícius Borsato2, Cleusa Bona3, Moacir José Sales Medrado4 1 Instituto Agronômico do Paraná - IAPAR, Rodovia Celso Garcia Cid km 375, 86047-902 Londrina, Paraná, Brasil, e-mail: miroslava@iapar.br
2 Embrapa Pantanal, Rua 21 de Setembro 1880, 79320-900 Corumbá, Mato Grosso do Sul, Brasil, e-mail: borsato@cpap.embrapa.br
3 Universidade Federal do Paraná - UFPR, Setor de Ciências Biológicas, Jardim das Américas, 81531-970 Curitiba, Paraná, Brasil e-mail: cleusabona@ufpr.br
4 Pesquisador aposentado da Embrapa Florestas, Estrada da Ribeira km 111, 83411-000 Colombo, Paraná, Brasil, e-mail: mjsmedrado@hotmail.com
Resumo
Objetivou-se determinar o tempo necessário para o crescimento de folhas e avaliar a distribuição de estômatos em folhas de idades distintas de erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hil.), provenientes de monocultura (MO) e sub-bosque (FUS). No início da brotação de outono, do ano de 2005, foram coletadas folhas de um e cinco meses de idade em ambos os ambientes, e folhas de 13 e 17 meses apenas em FUS. Quatro regiões foliares (apical, mediana-central, mediana-lateral e basal) foram avaliadas por meio de microscopia eletrônica de varredura. Os estômatos se encontram somente na face abaxial, com maior densidade em folhas de MO do que de FUS. Maior densidade de estômatos foi encontrada nas folhas jovens de MO e menor densidade na região apical das folhas, independente da idade e do ambiente. As folhas crescem até cinco meses de idade em MO e até o fim do ciclo anual em FUS (13 meses).
Palavras chave: abaxial, crescimento foliar, densidade de estômatos, idade foliar, região foliar. STOMATAL DISTRIBUTION AT DIFFERENT AGE LEAVES OF YERBA-MATE CULTIVATED IN MONOCULTURE AND UNDER FOREST SHADE
Abstract
The aim of this work was to determine the time of leaf growth and differences in stomatal distribution at leaves of distinct age of yerba-mate (Ilex paraguariensis St. Hil.) originated in monoculture (MO) and forest understorey (FUS). In the beginning of the autumn growth flush of 2005, one and five month-old leaves were presented in both environments, while leaves of 13 and 17 months were collected only in FUS. Four leaf regions (apical, middle-central, middle-lateral and basal) were analyzed by scanning electronic microscopy. Stomata are formed only in abaxial face in yerba-mate leaves, more frequent when originated in MO than in FUS. The young leaves from MO show more stomatal density than any other analyzed situation, while the apical leaf region showed the lowest stomatal density independently of leaf age or environment. The leaves in MO grow until age of five, while in FUS until the age of 13 months.
Key words: abaxial, leaf age, leaf growth, leaf region, stomatal density. Introdução
Erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hill) é considerada uma espécie umbrófila (Carpanezi 1995), mas muitas características a colocam no grupo que evita a sombra, como é o caso da emissão de menor número de metâmeros (Rakocevic e Martim, 2010) e a formação de menor área foliar (da Silva e Rakocevic, 2010) quando cultivada em sub-bosque comparada com a área aberta (monocultura). Esses estudos recentes relataram as análises morfológicas e arquiteturais relacionadas à forma foliar e
2 distribuição de folhagem em dossel de erva-mate cultivada em condições distintas quanto a disponibilidade de radiação solar (Rakocevic et al., no prelo), porém a distribuição de aparelho estomático dependente de ambiente luminoso ainda não foi detalhado.
O começo de estudos da anatomia foliar de Ilex sp. situa-se nos anos noventa (Valduga 1994, Mariath et al., 1995). Eles mostraram que Ilex paraguariensis possui estômatos só na face inferior das folhas, podendo ocorrer estômatos pequenos e gigantes. Os estômatos pequenos podem esporadicamente estar aderidos aos estômatos gigantes. Posteriormente foram estudadas as relações entre anatomia foliar e funcionalidade fisiológica (Sansberro et al., 2004). Este estudo mostrou que o ABA (ácido abscísico) externamente adicionado e o sombreamento artificial, não influenciaram o número de estômatos, mas mudaram o grau de fechamento dos mesmos no meio dia. Os autores declararam a presença de estômatos nas faces adaxial e abaxial.
O objetivo deste trabalho foi determinar a presença de estômatos nas faces foliares (adaxial e abaxial), analisar as diferenças no número e na distribuição de estômatos na epiderme de folhas de idades distintas e avaliar o tempo de crescimento de folhas, originadas em plantas cultivadas em monocultura e na sombra de sub-bosque.
Material e métodos
Em uma área de produção de matéria prima da Indústria Barão, em Barão de Cotegipe (27° 37’ 15’’ S e 52° 22’ 47’’ W, 765m de altitude) no estado Rio Grande do Sul, foram selecionadas duas parcelas (uma no sub-bosque da floresta com Araucaria angustifolia enriquecida com erva-mate – FUS - que apresenta um habitat parecido como nativo desta espécie e outra em um plantio de erva-mate a pleno sol em monocultura - MO), distantes 100 m uma da outra. Temperatura e radiação que definem dois ambientes de cultivo foram descritos em Rakocevic et al. (2008).
As plantas de erva-mate de quatro anos de idade foram podadas em abril de 2003 em MO e FUS. Desde junho de 2003 as populações de folhas foram marcadas em intervalo de dois meses. Em março de 2005, na fase de crescimento que define o início de brotação de outono, foram coletadas folhas de todas as populações foliares presentes. Durante a coleta nos dois sistemas, apenas folhas provenientes das duas últimas brotações, ou unidades de crescimento (mais sobre unidades de crescimento em da Silva e Rakocevic, 2010), apresentaram as populações foliares de um e cinco meses de idade. Estas folhas foram emitidas em março 2005 (unidade de crescimento formado pela brotação de outono) e em novembro de 2004 (unidade de crescimento formado pela brotação de primavera). Folhas com 13 e 17 meses foram coletadas apenas na FUS, já que em MO ocorreu uma acentuada queda de folhas emitidas no ciclo anual precedente. As folhas foram coletadas ao meio-dia, para considerar o fechamento na redução de transpiração.
Em laboratório, as amostras de folhas foram fixadas por 48 horas em solução de FAA 70%, transferidas para solução de álcool etílico 70% e posterior desidratação em série etílica até álcool absoluto, por duas horas em cada série. Estas amostras foram processadas no Centro de Microscopia Eletrônica – CME da UFPR, onde foram submetidas às técnicas de ponto crítico no equipamento BAL-TEC CPD – 030 e metalização no equipamento SCD 030 – Balzers Union FL 9496. A análise microscópica foi realizada no microscópio eletrônica de varredura – MEV (JEOL JSM – 6360LV) (Grinmstone, 1980; Bozzola e Russell, 1992). Para cada folha foram analisadas seções das regiões apical, mediana central, mediana lateral e basal, nas faces adaxial e abaxial. As análises foram feitas em triplicata, para avaliação do número de estômatos e do grau de fechamento.
O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, com cinco idades em FUS e duas em MO, para quatro posições foliares (em total 16 tratamentos) em três repetições. A análise se efetuou por Kruskal-Wallis teste não paramétrico, aplicado para pequenas amostras que não apresentam a distribuição normal.
Resultados e discussão
A Figura 1 ilustra exemplo da epiderme na face abaxial e adaxial da região basal das folhas de um mês de idade provenientes de dois ambientes de cultivo da erva-mate (monocultura e sub-bosque). Na Figura 2 é apresentada epiderme da face abaxial e adaxial das folhas provenientes de sub-bosque, com 13 e 17 meses de idade.
3 Figura 1. Região basal da folha de um mês de idade: A/ face abaxial em FUS, B/ face abaxial em MO, C/ face adaxial em FUS; D/ face adaxial em MO.
Figura 2. Região basal da folha proveniente de FUS de: A/ face abaxial de 13 meses de idade, B/ face
abaxial de 17 meses de idade, C/ face adaxial de 13 meses de idade; D/ face adaxial de 17 meses de idade.
O registro de estômatos apenas na região abaxial das folhas (Figuras 1 e 2) classifica a erva-mate no grupo de espécies que foram as folhas hipoestomáticas. Isso caracteriza as espécies que evitam a sombra e protegem o aparelho fotossintético de excesso de radiação solar, o que reforça observações anteriores sobre as reações fotomorfogenéticas desta espécie (Rakocevic et al., 2003). Assim sendo, pode-se acreditar que as amostras de Sansberro et al. (2004) vieram de alguma outra espécie de gênero Ilex, ou que I. paraguariensis apresenta uma larga amplitude de formas anatômicas, o que indicaria ser interessante o desenvolvimento de estudos no futuro. As espécies com maior plasticidade para caracteres
4 ligados à sobrevivência apresentam vantagens adaptativas em ambientes instáveis, resultando no aumento da tolerância ambiental.
Tabela 1: P-valor de teste Kruskal-Wallis de número de estômatos (por mm2) em folhas de erva-mate dependente de: A/ idade de folha, posição de estômatos na folha e sistema de cultivo, B/ idade de folha e posição de estômatos de folhas provenientes de monocultura (MO) e sub-bosque (FUS). Nível estatístico para p<0.05 foi considerado significante e marcado em negrito.
O p-valor de Kruskal-Wallis teste (Tabela 1A) mostrou uma variação no número de estômatos entre folhas de plantas cultivadas em ambientes distintos. A maior densidade de estômatos apresentada em MO em relação a FUS (Figuras 1 e 3), pode ser devido ao tamanho menor de folhas individuais em MO – pleno sol (Rakocevic et al., no prelo) e muito maior assimilação de carbono (Rakocevic et al., 2009). Existem evidências de que altos valores de radiação fotossinteticamente ativa (PAR) são capazes de provocar aumentos na densidade estomática em muitas outras espécies (Larsen e Buch 1994). A sombra de dossel é caracterizada por diminuição não somente de PAR, mas de simultânea modificação da sua qualidade, pela reduzida proporção de luz vermelha (R) em comparação ao vermelho distante (FR) causado pela seletiva absorção de radiação visível pelos pigmentos fotossintéticos e reflexão e transmissão de FR (Holmes e Smith, 1977). As plantas percebem a sombra - a baixa razão R: FR - através de bateria de fitocromos, especialmente o fitocromo B (Yanovsky et al., 1995). Recentemente foi mostrado que além de alto PAR, as altas razões de R: FR (condições de pleno sol) também aumentam a densidade de estômatos na Arabidopsis thaliana, o que se relaciona com aumento de proporção de forma ativa de fitocromo B (Boccalandro et al., 2009).
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
MO 1m MO 5m FUS 1m FUS 5m FUS 13m FUS 17m
CULTIVO E IDADE DE FOLHAS
N Ú M E R O D E E S T Ô M A T O S /m m 2 base mediana-central mediana-lateral apical
Figura 3. Número de estômatos (por mm2) em folhas de erva-mate dependente de idade de folha (1-17 meses), posição de estômatos na folha (apical, mediana-central, mediana-lateral e basal) e sistema de cultivo (monocultura – MO e sub-bosque – FUS).
As diferenças na densidade de estômatos também se manifestaram entre diferentes idades de folhas da erva-mate, ou seja, entre folhas de um e cinco meses na análise geral (Tabela 1A, Figura 3). As
A/ Visão geral DF p-valor Sistema de cultivo 1 0.0001
Idade de folha 1 <0.0001
Posição na folha 3 0.2593
B/ Número de estômatos relativo à posição de
estômatos na folha de diferentes idades
MO DF p-valor 1 mês 3 0.02998 5 meses 3 0.02821 FUS p-valor 1 mês 3 0.02339 5 meses 3 0.2736 13 meses 3 0.4182 17 meses 3 0.0173
5 folhas de um mês em MO (média de 1117 por mm2) apresentaram maior densidade de estômatos em comparação com todas as outras situações. O índice de estômatos (razão entre o número de estômatos e células epidérmicas) é definido cedo no desenvolvimento foliar (Larkin et al., 1997). Por isso, a modificação de densidade de estômatos no desenvolvimento foliar (Figura 3) deve-se ao crescimento celular. Os resultados mostram que as folhas crescem até os cinco meses de idade em MO, enquanto que em FUS crescem até o fim do ciclo anual, ou até os 13 meses.
Quanto à posição de estômatos no limbo foliar, a menor densidade foi encontrada na região apical (Tabela 1 e Figura 3) que é a primeira região a envelhecer. Nas folhas jovens de MO houve maior densidade de estômatos nas regiões basal e mediana, enquanto que em FUS houve nas laterais (Figura 3). Nas folhas maduras e velhas, nos dois ambientes, constatou-se maior número de estômatos nas laterais, mostrando que a elongação longitudinal é predominante na maturação. Folhas de cinco meses de idade, em FUS, apresentaram maior número de estômatos do que as de 17 meses (Figura 3).
A organização das estrias epicuticulares é preferencialmente circular e em volta dos estômatos, mas também ocorrem distribuídas aleatóriamente entre os estômatos. As estrias são mais adensadas na face abaxial (mais curtas e próximas entre si) que na face adaxial (Figuras 1-2). Na face adaxial da folhas de MO aparece menor número de estrias do que em FUS (Figura 1), porém as folhas de mesma idade em MO são mais desenvolvidas do que nas folhas de FUS, com estrias mais longas e mais esparsas. Isso mostra que folhas em monocultura têm processo mais intensivo de maturação, mostrando que as folhas têm maior longevidade na sombra de floresta. A folha com 13 meses, na sua face abaxial e adaxial parece ter estrias mais esparsas do que com 13 meses (Figura 2), o que acontece pela expansão celular.
Neste trabalho não se coletaram as amostras diferenciadas pelo sexo das plantas nos dois ambientes, porém, devido múltiplas características morfofisiológicas que apresentam as diferenças sexuais (Rakocevic et al., 2009; Rakocevic e Martim, 2010), seria interessante, ampliar as futuras pesquisas de anatomia celular com o dimorfismo sexual.
Conclusão
• Os estômatos apareçam somente na face abaxial de folhas da erva-mate;
• O ambiente luminoso influencia no desenvolvimento de folhas onde a sombra atrasa o crescimento e a mortalidade. As folhas de MO desenvolvem-se até cinco meses de idade, enquanto as de FUS crescem até o fim do ciclo anual, ou até 13 meses. Também, a densidade de estômatos diferencia com ambiente e apresenta-se maior em folhas originadas de MO do que da FUS;
• A densidade de estômatos diferencia pelas regiões foliares da erva-mate - está menor na região que envelhece primeiro - a região apical;
• Nas folhas maduras e velhas, nos dois sistemas, consta-se maior número de estômatos nas laterais o que indica que a elongação longitudinal é predominante na maturação foliar.
Agradecimentos
Ao Centro de Microscopia Eletrônica da UFPR, cuja equipe foi bastante prestativa e eficiente no apoio, desde o preparo até a visualização e captura de imagens das amostras. Ao CNPq e IICA que financiaram a bolsa de Pesquisador Visitante para Dra M. Rakocevic.
Referencias bibliográficas
Boccalandro, H.E.; Rugnone, M.L.; Moreno, J.E.; Ploschuk, E.L.; Serna, L.; Yanovsky, M.J. e Casal, J.J. 2009. Phytochrome B enhances photosynthesis at the expense of water-use efficiency in Arabidopsis. Plant Physiology 150: 1083–1092.
Bozzola, J. F. e Russell, L.D. 1992. Electron microscopy – principles and techniques for biologists. Sudbury: Jones and Bartlett Publishers 542p.
Carpanezzi, A.A. 1995. Cultura da erva-mate no Brasil: Conflitos e lacunas. In: Winge, H.; Ferreira, A. G.; Mariath, J. E. A. e Tarasconi, L. C. (Eds.). Erva-mate: biologia e cultura no Cone Sul. Porto Alegre: Ed. da UFRGS: 43-46.
6 Grimstone, A.V. 1980. O microscópio eletrônico em biologia. Trad. Marina Silveira. Série: Temas de
biologia. v. 11. São Paulo: Epusp, 70p.
Holmes, M.G. e Smith, H. 1977. The function of phytochrome in the natural environment. I. Characterization of daylight for studies in photomorphogenesis and photoperiodism. Photochemistry and Photobiology 25: 533–538,
Larkin, J.; Marks, M.; Nadeau, J. e Sack, F. 1997. Epidermal cell fate and patterning in leaves. The Plant Cell 9: 1109–1120.
Larsen, J.B. e Buch, T. 1995. The influence of light, NPK-fertilizer, and lime on photosynthesis, respiration, as well as transpiration and water use efficiency of different beech provenances/Fagus sylvatica L.). Forest and Landscape Research 1: 227-240.
Mariath, J.E.A. de; Coelho, G.C.; Santos R.P. dos; Heuser, E.D.; Ayub, D.M. e Cocucci, A.E. 1995. Aspectos anatômicos e embriológicos em espécies do gênero Ilex. In: Erva-mate: biologia e cultura no Cone Sul. In: Winge, H.; Ferreira, A. G.; Mariath, J. E. A. e Tarasconi, L. C. (Eds.). Porto Alegre: Ed. da UFRGS, p. 263-287.
Rakocevic, M.; Medrado, M.J.S. e Takaki, M. 2003. Aspectos fotomorfogenéticos de plantas jovens de erva-mate. In: Anais de 3° Congresso Sul-Americano da erva-mate, 2003, Chapecó, 5(15): 1-8. Rakocevic, M.; Medrado, M.J.S.; Lucambio, F. e Valduga, A.T. 2008. Intensity of bitterness of
processed yerba-mate leaves originated in two contrasted light environments, Brazilian Archives of Biology and Technology 51: 569-579.
Rakocevic, M.; Medrado, M.J.S.; Martim S.F. e Assad, E. 2009. Sexual dimorphism and seasonal changes of leaf gas exchange in the dioecious tree Ilex paraguariensis grown in two contrasted cultivation types. Annals of Applied Biology154: 291-301.
Rakocevic, M. e Martim S.F. 2010 Time series in analysis of yerba-mate biennial growth modified by environment. International Journal of Biometeorology,published online 03 June 2010.
Rakocevic, M.; Costes E. e Assad E. Structural and physiological sexual dimorphism estimated from 3D virtual trees of yerba-mate (Ilex paraguariensis St. Hil.) is modified by cultivation environment. International Journal of Plant Sciences (no prelo).
Sansberro, P.A.; Mroginski, L.A. e Bottini, R. 2004. Foliar sprays with ABA promote growth of Ilex paraguariensis by alleviating diurnal water stress. Plant Growth Regulation 42(2): 105-111.
Silva, M.H.M. da e Rakocevic M. 2010. Software for interpolation of vegetative growth of yerba mate plants in 3D. Pesquisa Agropecuária Brasileira, 5(3): 244-251.
Valduga, E. Caracterização química e anatômica da folha de erva-mate (Ilex paraguariensis St. Hill) e de espécies utilizadas na adulteração do mate. Curitiba, 1994. 119p. Dissertação de Mestrado (Mestre em Tecnologia Química) – Setor de Tecnologia, Universidade Federal do Paraná (UFPR).
Yanovsky, M.J.; Casal, J.J. e Whitelam G.C. 1995. Phytochrome A, phytochrome B and HY4 are involved in hypocotyl growth responses to natural radiation in Arabidopsis: weak de-etiolation of the phyA mutant under dense canopies. Plant Cell and Environment 18: 788–79.
