15° Congresso de Iniciação Científica
DETERMINAÇÃO DE MERCÚRIO TOTAL E INORGÂNICO EM TECIDOS BIOLÓGICOS
ATRAVÉS DE INJEÇÃO EM FLUXO ACOPLADO À ESPECTROMETRIA DE
FLUORESCÊNCIA ATÔMICA (FI-AFS)
Autor(es)
GABRIEL GUSTINELLI ARANTES DE CARVALHO
Orientador(es)
José Roberto Ferreira
1. Introdução
A toxicidade dos elementos químicos, como o mercúrio, está intimamente relacionada à sua forma química. Compostos orgânicos mercuriais, principalmente metilmercúrio, são reconhecidos há muitas décadas por serem mais tóxicos que as espécies inorgânicas deste metal (Domi, 2005; Storelli et al., 2001). Devido a seu caráter lipofílico, compostos organomercuriais podem atravessar membranas biológicas e fixar-se às proteínas através dos grupos sulfidrilas (Boening, 2000; Cabañero, et al., 2005), principalmente nas do sistema nervoso central, conferindo o potencial neurotóxico deste elemento (Grandjean et al., 1997). Análises de mercúrio total em certos tipos de amostra podem não ser completamente aceitáveis, uma vez que proporcionam uma informação parcial sobre a toxicidade oferecida à saúde e ao ambiente (Puk e Weber, 1994). Desta forma, técnicas de especiação química de elementos traços em amostras biológicas estão ganhando importância, uma vez que a toxicidade de muitos elementos não depende somente de sua concentração, mas principalmente de sua forma química. Neste sentido, várias técnicas e métodos para a separação das espécies químicas de mercúrio foram desenvolvidas nas últimas décadas, como extração da fase orgânica a partir de solventes orgânicos, cromatografia gasosa (GC) e líquida (HPLC), espectrometria de massas acoplado indutivamente ao plasma induzido (ICP-MS) e fluorescência de raio-X. A espectrometria de absorção atômica (AAS) é sem dúvida a técnica mais utilizada para a determinação de mercúrio total em todo o mundo. Estudos conduzidos por Tao et al. (1998), Tao et al. (1999), Barbosa et al. (2004) e Torres et al. (2005) descreveram extrações de diferentes espécies químicas de mercúrio de tecidos biológicos utilizando hidróxido de tetrametilamônio (TMAH) em temperatura ambiente, sendo a detecção do elemento obtida por diferentes métodos analíticos. Os teores totais de mercúrio podem ser determinados através de pré-oxidação com KMnO4, conforme descrito por Guo e Baasner (1993). Mercúrio inorgânico é determinado através da complexação da fase orgânica com L-cisteína, onde a etapa de redução é verificada somente para Hg2+ (Magos, 1971; Tao et al., 1999). As formas orgânicas são determinadas pela diferença entre os teores totais e os inorgânicos. O acoplamento de técnicas de geração de vapor frio à espectrometria de fluorescência atômica (AFS) resulta em melhor sensibilidade, ou seja, limites de detecção mais baixos,
proporcionando uma ferramenta analítica muito eficiente e de baixo custo para determinações de mercúrio (Morita et al., 1995).
2. Objetivos
O objetivo deste artigo é apresentar um método simples e rápido para análises de mercúrio total e inorgânico em tecidos biológicos, a partir da extração a frio pelo TMAH seguida pela detecção por AFS.
3. Desenvolvimento
Todos os reagentes utilizados nas etapas experimentais possuem grau analítico, isentos de mercúrio. A água desmineralizada de alta pureza (18,2 MΩcm) foi produzida através de sistema Milli-Q (Millipore, Belford). Utilizou-se metodologia baseada nos ensaios conduzidos por Tao et al. (1998), Tao et al. (1999), Barbosa et al. (2004) e Torres et al. (2005), a qual consistia em extração dos analitos do tecido biológico através do hidróxido de tetrametilamônio (TMAH - Sigma-Aldrich, Milwaukee). Para tanto, adicionou-se 50mg de amostra e 4,0mL de TMAH 25% (m/v) em frascos tipo Falcon de polipropileno. A extração procedeu-se em temperatura ambiente sob sonicação, durante 30 minutos (Santos Jr et al., 2006). Diluiu-se a amostra até o volume de 50,0 mL. O sistema de fluxos foi constituído de uma bomba peristáltica (Ismatec® IPC) e de um injetor manual (Figura 1). As análises se deram a partir de injeção em fluxo de 500µL de amostra em solução carregadora HCl 0,1% (v/v) destilado (Merck, Darmstadt) (Figura 1). Para a determinação de mercúrio total, solução de KMnO4 0,25% (m/v) (Merck, Darmstadt) foi adicionada em linha na amostra para oxidar a matéria orgânica, formando íons Hg2+, conforme proposto por Guo e Baasner (1993). Posteriormente, esta solução foi reduzida na presença de SnCl2 5,0% (m/v) (Merck, Darmstadt) em HCl 10% (v/v), reduzindo-se o mercúrio para a forma de Hg0, o qual foi separado da fase líquida na câmara de separação líquido-gasosa (CS), e retirado pelo gás de arraste (argônio 0,3Lmin-1). Este vapor de analito foi direcionado para detecção através de uma membrana de Nafion® a fim de reduzir-se a umidade do vapor. A Figura 1 ilustra o diagrama de fluxo utilizado. A presença de cloridrato de hidroxilamina (Merck, Darmstadt) para neutralizar o excesso de KMnO4 também foi avaliada. O mercúrio inorgânico foi determinado adicionando-se L-cisteína 0,5% (m/v) (Fluka, Buchs) à amostra, objetivando a formação de complexos sulfomercuriais com as espécies orgânicas de mercúrio, impedindo-as de serem reduzidas pela ação do SnCl2 (Tao et al., 1999), o qual foi adicionado à amostra na concentração de 5,0% (m/v) em meio de HCl 10,0% (v/v) (Figura 1). As determinações de mercúrio foram realizadas através da Espectrometria de Fluorescência Atômica (AFS), utilizando-se o detector Merlin (PS Analytical Ltd. Kent, UK). Figura 1. Sistema de injeção em fluxo para determinação de mercúrio total e inorgânico em tecidos biológicos por Espectrometria de Fluorescência Atômica (AFS). A = Amostra; C = HCl 0,1%; R1 = KMnO4 0,25% ou L-cisteína 0,5%; R2 = SnCl2 5,0%; BP = Bomba peristáltica; IM = Injetor Manual; CS = câmara de separação líquido-gasosa; VA = 500µL; L1 = 40cm; L2 = 30cm, MN = membrana de Nafion®. Construiu-se 2 curvas de calibração analítica, 0 a 5,0 μgL-1 CH3Hg+ e 0 a 1,0 μgL-1 Hg2+. Para a validação do método empregado, realizou-se o teste de recuperação dos analitos, utilizando-se como material de referência certificado o DORM-2, constituído de tecido muscular liofilizado de peixe (dogfish), produzido pelo National Research Council of Canadá - NRCC, cuja concentração de mercúrio total é 4,64 (±0,26) mgkg-1 Hg e orgânico (metilmercúrio) é 4,47 (±0,32) mgkg-1 Hg.
4. Resultados
Neste experimento foram construídas 2 curvas de calibração, uma de metilmercúrio para determinação dos teores totais e a outra de Hg2+ para determinação dos inorgânicos (Figura 2). O fato de ambos analitos se apresentarem em concentrações diferentes na amostra demandou esta condição. Figura 2. Curvas de calibração construídas com soluções padrão de metilmercúrio e Hg2+. A concentração de mercúrio total encontrada na amostra foi de 4,60 mgKg-1 Hg, e a de inorgânico foi de 0,40 mg.kg-1Hg. A diferença entre a primeira e segunda revela a fração orgânica, 4,20 mg.kg-1 Hg, correspondente ao metilmercúrio. Recuperações da ordem de 99% e 93,9% foram obtidas para a quantidade total e orgânica,
respectivamente, conforme exposto na Tabela 1. Tabela 1. Concentrações de mercúrio total e orgânico (metilmercúrio) (mgKg-1 Hg) em tecido muscular de dogfish (DORM-2, NRCC) obtidos neste estudo e os valores certificados. Os experimentos indicaram que o reagente TMAH mostra-se efetivo na extração dos analitos a frio em banho ultrasônico a partir da concentração de 6,25% (v/v) para Hg total e 12,5% (v/v) para inorgânico. Verificou-se o papel fundamental do KMnO4 adicionado em linha na oxidação da matéria orgânica presente na amostra, liberando os íons Hg2+ na solução, conforme descrito por Guo e Baasner (1993). Este oxidante mostrou-se eficiente nas concentrações compreendidas entre 0,25 e 0,5% (m/v). Em concentrações inferiores a 0,25%, a decomposição não se mostra completa, oxidando parcialmente as espécies de mercúrio. Contudo, quando em excesso, KMnO4 compromete o potencial redutor do SnCl2, reduzindo a formação de vapor frio (Hg0) e a intensidade do sinal. Verifica-se KMnO4 em excesso através da coloração rósea no percurso analítico após confluência com SnCl2, ou seja, em L2 (Figura 1). Observou-se que cloridrato de hidroxilamina 1,0% (m/v) quando adicionado na solução de SnCl2, com o objetivo de reduzir o KMnO4 em excesso, não aumentou a intensidade do sinal, indicando que o potencial redutor do SnCl2 é suficiente para garantir a total redução dos analitos nestas condições de análise. Na determinação das frações inorgânicas, avaliou-se a intensidade do sinal utilizando-se L-cisteína 0,5 e 1,0% (m/v). Esta última proporcionou respostas mais efetivas, conforme estudos realizados por Tao et al. (1999). Para estas determinações, não houve a necessidade de diluir as amostras, pois o analito (Hg2+) encontrava-se em baixas concentrações (0,17 mgKg-1 Hg). Além disso, a especiação química resultante da detecção das espécies inorgânicas é favorecida quando há matéria orgânica, já que as formas orgânicas podem estar presas a ela, impedindo-as de possível redução pelo SnCl2, caso a complexação pela L-cisteína não seja efetiva.
5. Considerações Finais
Para a extração completa dos analitos são necessárias concentrações de TMAH superiores a 15% (v/v). Para a determinação dos teores totais é fundamental a adição de KMnO4 em linha para a oxidação da matéria orgânica. O papel da L-cisteína na formação de complexos com as espécies orgânicas é o ponto fundamental na especiação química, mostrando grande eficiência tanto como soluções-padrão (CH3Hg+ e Hg2+ equimolares), como para as demais amostras biológicas. As concentrações de SnCl2 utilizadas foram suficientes para a redução dos analitos, mas devem ser estudadas com mais afinco, a fim de se reduzir suas concentrações. Este trabalho foi realizado com o apoio da FAPESP (00/14460-3) e do CNPq (110751/2005-1).
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