AVALIAÇÃO
DE
PROPRIEDADES
DE
PARTÍCULAS
DE
SERICINA E ALGINATO CONTENDO DICLOFENACO DE SÓDIO
J. M. M.VIDART1, M. NAKASHIMA1, T. L. da SILVA1, P. C. P. ROSA2, M. L. GIMENES3, M. G. A. VIEIRA1 e M. G. C da SILVA1
1
Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química, Departamento de Desenvolvimento de Processos e Produtos
2
Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Farmacêuticas
3
Universidade Estadual de Maringá, Departamento de Engenharia Química E-mail para contato: meuris@feq.unicamp.br
RESUMO – O presente estudo visa à caracterização de partículas de sericina e alginato contendo o fármaco diclofenaco de sódio incorporado em sua estrutura. A sericina é uma proteína globular presente nos casulos do bicho-da-seda (Bombyx mori) e o alginato é um polissacarídeo natural extraído de algas marrons. A blenda entre sericina e alginato pode fornecer características adequadas para a incorporação de fármacos, sendo uma promissora matriz gastrorresistente para a encapsulação de diclofenaco de sódio (DS), um anti-inflamatório não-esteróide que apresenta diversos efeitos colaterais relacionados ao trato gastrointestinal e que deve ser protegido do meio gástrico após a sua administração. Formulações com diferentes frações de sericina e alginato em sua composição foram produzidas e caracterizadas pelas técnicas analíticas de espectroscopia no infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR), difração de raios X (DRX) e análise termogravimétrica e termodiferencial (TGA/DTA). As técnicas analíticas utilizadas evidenciaram a incorporação do fármaco.
1. INTRODUÇÃO
O casulo do bicho-da-seda Bombyx mori é composto, majoritariamente, por duas proteínas: a fibroína e a sericina, sendo essa última tratada como um resíduo da mesma. Devido à possibilidade da sericina causar impactos negativos ao ambiente, uma vez que sua degradação por microorganismos exige uma alta demanda de oxigênio, encontrar meios viáveis de reutilizar essa proteína traria benefícios ambientais e econômicos (Aramwit et al., 2012).
A sericina é uma proteína globular hidrossolúvel, facilmente solubilizada em água quente, e atua como um agente colante dos fios de seda (Cao et al., 2015). Algumas de suas principais características são a sua biocompatibilidade, biodegradabilidade e atividade antibiótica. Além disso, a sericina pode ser combinada com outros biopolímeros para melhorar suas propriedades, permitindo, por exemplo, a sua aplicação para fins medicinais (Lamboni et al., 2015).
O alginato é considerado um excelente polissacarídeo para o transporte de drogas devido a sua facilidade de modificação química e degradação controlável (Jabeen et al., 2016), além de possuir vantagens como a sua não toxicidade e sua resistência ao pH ácido, o que protege as drogas sensíveis ao meio gástrico (Hwang et al., 1995). Sendo assim, a produção de blendas a partir da sericina e do alginato pode fornecer uma matriz com propriedades adequadas para a incorporação de fármacos (Khandai et al., 2010).
O diclofenaco de sódio (DS) é um anti-inflamatório não esteroidal amplamente utilizado para o alívio da dor, febre e inflamações diversas, como artrite reumatoide e osteoartrite (Alok et al., 2013). Sua meia-vida biológica é de 1-2 h, o que requer dosagens múltiplas para manter o nível terapêutico da droga no sangue (Nayak e Pal, 2011). Esse fármaco causa reações adversas como gastrite, úlcera péptica e insuficiência renal, que são agravadas pela liberação imediata do fármaco no organismo, não havendo um controle de sua absorção no mesmo (Sinha et al., 2015). Dessa forma, torna-se importante o estudo de meios de incorporação do DS em matrizes que permitam uma liberação modificada do fármaco, diminuindo os efeitos colaterais do mesmo e proporcionando uma maior adesão dos pacientes ao tratamento.
O presente trabalho teve por objetivo o desenvolvimento de partículas de sericina e alginato contendo DS incorporado em sua estrutura, além de caracterizar todas as formulações produzidas pelas técnicas analíticas de Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR), Análise Termogravimétrica e Termodiferencial (TGA/DTA) e Difração de Raios X (DRX), possibilitando a identificação das interações do fármaco com a blenda.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.1. Extração da Sericina
Os casulos do bicho-da-seda (Bombyx mori) foram cedidos pela empresa de fiação de seda BRATAC, com sede na cidade de Londrina – PR. Inicialmente, a sericina foi extraída dos casulos pelo método apresentado por Silva et al. (2013), onde 40 g de casulos limpos e secos foram colocados em contato com 1 L de água deionizada e em seguida, submetidos a temperatura de 120 °C e pressão manométrica de 1 kgf.cm-2, por 40 min, em autoclave.A solução de sericina extraída foi
acondicionada em recipiente fechado a temperatura ambiente durante 12 h, e após esse período, foi colocada em freezer convencional, onde permaneceu por 24 h sendo, em seguida, descongelada e filtrada com papel filtro de porosidade 14 μm. A concentração da solução obtida foi ajustada para 2,5 % (m/v).
2.2. Incorporação de Fármaco e Preparação das Partículas
A metodologia utilizada foi apresentada por Vidart et al. (2015).Para a preparação da blenda entre sericina e alginato, a solução de sericina 2,5 % (m/v) foi aquecida a 70 °C por 10 min e submetida a agitação de 4000 rpm em Ultraturrax® até que atingisse 55 °C, sendo então adicionado alginato de sódio à solução de sericina, mantendo-se a agitação até a completa homogeneização da blenda. Para a incorporação do DS, adicionou-se o fármaco à blenda e a solução foi agitada a
8000 rpm até completa homogeneização. As diferentes formulações preparadas são apresentadas na Tabela 1.
Tabela 1 – Composição das formulações preparadas Formulação Sericina (g) Alginato (g) DS (g)
F1 2,5 2,0 2,0 F2 2,5 2,5 2,0 F3 2,5 2,6 2,0 F4 2,5 2,8 2,0 F5 2,5 3,0 2,0 F6 2,5 3,3 2,0 F7 2,5 3,6 2,0 F8 - 4,0 2,0
As partículas de sericina e alginato contendo DS incorporado em sua estrutura foram preparadas pelo método de gotejamento seguido de reticulação, seguindo a metodologia utilizada por Silva et al. (2013). Para tanto, a mistura de sericina, alginato e DS, foi gotejada em solução de cloreto de cálcio 3 % (m/v), sob agitação magnética, de maneira a ocorrer uma rápida gelificação da solução polimérica contendo o fármaco. Após o gotejamento, as partículas foram mantidas sob agitação a 100 rpm em jar-test por 30 min e, em seguida, lavadas com água deionizada e secas à temperatura ambiente.
2.3. Caracterização das Partículas
A fim de avaliar as propriedades das partículas de sericina e alginato contendo DS, foram realizadas as seguintes análises de caracterização:
Espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (FTIR): A interação entre o fármaco e a blenda de sericina e alginato foi avaliada através da análise de FTIR, utilizando um espectrômetro da marca Thermo Scientific, modelo Nicolet 6700. As medidas foram realizadas no modo de transmitância, utilizando o acessório snap-in baseplate (método KBr), na faixa de 4000 - 400 cm-1, com resolução de 4 cm-1 e 32 scans.
Análise Termogravimétrica e Termodiferencial (TGA/DTA): A estabilidade térmica dos materiais foi avaliada por análise termogravimétrica (TGA), enquanto que a identificação das
transformações endotérmicas ou exotérmicas presentes foi avaliada pela análise térmica diferencial (DTA). Para tanto, utilizou-se um equipamento da marca Shimadzu, modelo DTG-60, o qual realiza simultaneamente as análises de TGA e DTA, sob atmosfera inerte de nitrogênio, fluxo de 50 mL/min e taxa de aquecimento de 20 °C/min. As amostras foram aquecidas de 30 °C a 1000 °C.
Difração de Raios-X (DRX): A técnica de difração de raios-x foi empregada com a finalidade de avaliar a estrutura cristalina das partículas. Para isso, utilizou-se um equipamento da marca Philips, modelo X’Pert-MPD, radiação Kα do cobre com comprimento de onda de 1,54 Å, voltagem de 40 kV, corrente de 40 mA, 2θ na faixa de 5 a 50°, com passo de 0,02° e velocidade de 0,02°/s.
3. RESULTADOS E DISCUSSÕES
A Figura 1 mostra as partículas obtidas para cada formulação produzida. É possível observar que as partículas de todas as formulações, exceto F8, apresentaram forma esférica bem definida. As partículas de F8, que não contém sericina em sua composição, apresentaram forma oval e irregular, indicando que a presença dessa proteína auxilia na esfericidade das partículas.
Figura 1 – Partículas produzidas conforme formulações da Tabela 1.
A Figura 2 apresenta os resultados de DTA, TGA e DTG para todas as formulações, do diclofenaco de sódio (DS) e das partículas de sericina e alginato sem o DS (Ser/Alg). As curvas decorrentes da análise de TGA informam a perda de massa de cada amostra, conforme o aquecimento, enquanto as curvas de DTG (derivada do TGA) permitem determinar a temperatura em que as perdas de massa são mais acentuadas. Já a análise de DTA permite identificar as transformações endotérmicas ou exotérmicas que ocorrem durante o aquecimento da amostra, sendo, portanto, informações complementares.
F3 F4 F6 F7 F8 Ser/Alg DS 0 200 400 600 800 1000 -90 -60 -30 0 30 60 90 120 150 1 2 3 Temperatura (°C) D if e r e n ç a d e T e m p e r a tu r a ( V ) -0,04 0,00 0,04 0,08 5 10 15 m/ t o u P e r d a d e M a ss a ( m g ) 0 200 400 600 800 1000 -100 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 1 2 3 Temperatura (°C) D if e r e n ç a d e T e m p e r a tu r a ( V ) -0,06 -0,03 0,00 0,03 5 10 15 20 m/ t o u P e r d a d e M a ss a ( m g ) 0 200 400 600 800 1000 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 Temperatura (°C) D if e r e n ç a d e T e m p e r a tu r a ( V ) -0,04 0,00 0,04 0,08 5 10 15 m/ t o u P e r d a d e M a ss a ( m g ) 0 200 400 600 800 1000 -90 -60 -30 0 30 60 90 120 150 180 210 1 2 3 Temperatura (°C) D if e r e n ç a d e T e m p e r a tu r a ( V ) -0,06 -0,03 0,00 0,03 5 10 15 20 m/ t o u P e r d a d e M a ss a ( m g ) 0 200 400 600 800 1000 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 1 2 3 Temperatura (°C) D if e r e n ç a d e T e m p e r a tu r a ( V ) -0,06 -0,03 0,00 0,03 5 10 15 20 25 m/ t o u P e r d a d e M a ss a ( m g ) 0 200 400 600 800 1000 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 Temperatura (°C) D if e r e n ç a d e T e m p e r a tu r a ( V ) -0,09 -0,06 -0,03 0,00 0,03 5 10 15 20 m/ t o u P e r d a d e M a ss a ( m g ) 0 200 400 600 800 1000 -80 -60 -40 -20 0 20 40 60 1 2 3 Temperatura (°C) D if e r e n ç a d e T e m p e r a tu r a ( V ) -0,06 -0,03 0,00 0,03 5 10 15 20 m/ t o u P e r d a d e M a ss a ( m g ) 0 200 400 600 800 1000 -90 -60 -30 0 30 60 90 120 150 1 2 3 Temperatura (°C) D if e r e n ç a d e T e m p e r a tu r a ( V ) -0,10 -0,05 0,00 5 10 15 20 25 m/ t o u P e r d a d e M a ss a ( m g ) 0 200 400 600 800 1000 -60 -40 -20 0 20 40 60 1 2 3 Temperatura (°C) D if e r e n ç a d e T e m p e r a tu r a ( V ) -0,06 -0,04 -0,02 0,00 5 10 15 m/ t o u P e r d a d e M a ss a ( m g ) 0 200 400 600 800 1000 -120 -90 -60 -30 0 30 60 1 2 3 Temperatura (°C) D if e r e n ç a d e T e m p e r a tu r a ( V ) -0,18 -0,12 -0,06 0,00 5 10 15 20 25 m/ t o u P e r d a d e M a ss a ( m g )
Figura 2 – Resultados das análises de DTA (1), TGA (2) e DTG (3) das formulações produzidas.
F1 F2
Na amostra de Ser/Alg e nas formulações F1-F8, observa-se que ocorre uma perda constante de massa na faixa de 202-585 ºC, a qual refere-se à decomposição do alginato, conforme evidenciado por Soares et al. (2004), sendo que na faixa de 246-300 ºC ocorre a decomposição da sericina, como mostrado por Jo et al. (2015). Na faixa de 588-751 ºC, é possível observar um evento exotérmico causado pela provável formação de carbonato de cálcio (Soares et al., 2004). As curvas obtidas para o DS sugerem uma primeira perda de massa, em torno de 80-100 °C referente à perda de água que pode estar presente na amostra, sendo um evento endotérmico. A segunda perda de massa do DS, em 260-400 °C, indica a eliminação de HCl, NH e CH, CO e formação de Na2CO3, sendo que em 400-545 °C,
a perda de massa pode ser devida à decomposição do anel benzênico, conforme apresentado por Ribeiro et al. (1995). Próximo a 800 °C ocorre um evento exotérmico, que pode indicar uma perda de massa devido à pirólise de resíduos carbonáceos e a uma perda parcial de cloreto de sódio. Em todas as formulações (F1-F8) pode-se verificar que ocorreram eventos, alguns mais pronunciados que outros, na faixa de 850-1000 °C, que pode ser observado também na amostra de DS pura e que é ausente na amostra de Ser/Alg. Desta forma, pode-se inferir que tais eventos provieram do fármaco incorporado, confirmando sua presença nas formulações.
A Figura 3 (a) apresenta os espectros de FTIR de todas as formulações produzidas, da blenda entre sericina e alginato (Ser/Alg) e do diclofenaco de sódio puro (DS). Em todas as formulações produzidas verifica-se a presença de bandas em 1530 cm-1, correspondente ao grupo NH, presente no DS puro. Em 1510 cm-1 e 1580 cm-1, verificam-se as bandas correspondentes ao estiramento C=C e C=O do grupo carboxílico, respectivamente. Evidencia-se ainda a banda em 723 cm-1 correspondente ao grupo alquila do DS, e em 746 cm-1 correspondente a ligação C-H proveniente do anel aromático da molécula de DS. Essas bandas não estão presentes na blenda de sericina e alginato, assim, constata-se que ocorreu a incorporação do fármaco à estrutura da blenda.
Os difratogramas de raios X de todas as formulações produzidas, bem como da sericina, do alginato e do DS puros, e da blenda entre sericina e alginato são apresentados na Figura 3 (b). É possível observar a característica estrutural predominantemente amorfa apresentada pela sericina e alginato puros, embora o alginato apresente um pico de cristalinidade em 13° e a sericina um pico em 19° referente à sua estrutura cristalina folhas-β. Consequentemente, a estrutura da partícula de sericina e alginato também é predominantemente amorfa, porém apresenta picos de cristalinidade em 13° e 19° referentes ao alginato e sericina, respectivamente. O difratograma do DS indica uma estrutura cristalina com diversos picos característicos, os quais se repetem em todas as formulações (F1-F8), notadamente em 20°, 23° e 25°, conforme destacado. Assim, os difratogramas sugerem que as formulações apresentam maior cristalinidade quando comparadas com as partículas sem a presença de fármaco, sendo a cristalinidade das formulações atribuída, portanto, à presença de DS nas amostras, confirmando a incorporação do mesmo.
2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600 400 Comprimento de onda (cm-1) DS Ser/Alg F1 F2 T r a n sm itâ n c ia (% ) F3 F4 F5 F6 F7 F8 0 10 20 30 40 50 19° 2 Ser 19° 13° Alg 13° Ser/Alg 19° 19° 19° 19° 19° 19° 19° 19° DS 13° 13° F1 13° In te n si d a d e F2 F3 13° 13° F4 13° 13° 13° F5 F6 F7 F8 (a) (b)
Figura 3 – (a) Espectroscopia na região do infravermelho para diclofenaco de sódio puro (DS), partículas de sericina e alginato (Ser/Alg) e formulações produzidas (F1-F8) (b) Difratogramas de raios X da sericina pura (Ser), do alginato puro (Alg), das partículas de sericina e alginato (Ser/Alg) e
das formulações produzidas (F1-F8).
4. CONCLUSÕES
Pelas análises de caracterização realizadas, foi possível verificar a incorporação do diclofenaco de sódio à blenda de sericina e alginato em todas as formulações desenvolvidas.
Foi observado que a presença de sericina auxiliou na esfericidade das partículas, uma vez que a formulação F8, sem a presença de sericina, mostrou-se mais ovalada quando comparada com as outras formulações.
A análise térmica evidenciou a presença do alginato, da sericina e do DS nas formulações, sendo que a estabilidade térmica do DS não sofreu alteração na formulação.
A análise de FTIR indicou a presença de DS na estrutura das partículas, assim como a análise de DRX evidenciou o aumento da cristalinidade das formulações devido à presença de DS.
5. AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à BRATAC, pela concessão dos casulos de bicho-da-seda, ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq (Proc. 470615/2013-3 e 300986/2013-0), à CAPES e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo -FAPESP (Proc. 2015/13505-9) pelo apoio financeiro.
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