DA INOVAÇÃO
SIMONY PIMENTA MASCARENHAS COTTA
ISOLAMENTO E SELEÇÃO DE MICRORGANISMOS RESISTENTES À ELEVAÇÃO DE TEMPERATURA E PRODUTORES DE ENZIMAS HIDROLÍTICAS
AMILASE, CELULASE E FITASE
SETE LAGOAS 2016
ISOLAMENTO E SELEÇÃO DE MICRORGANISMOS RESISTENTES À ELEVAÇÃO DE TEMPERATURA E PRODUTORES DE ENZIMAS HIDROLÍTICAS
AMILASE, CELULASE E FITASE
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado Profissional em Biotecnologia e Gestão da Inovação do Centro Universitário de Sete Lagoas – UNIFEMM, como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre.
Área de Concentração: Biotecnologia e Gestão Inovação
Orientadora: Profa. Dra. Christiane Abreu Paiva
Co-orientador: Prof. Dr. Ivanildo Evódio Marriel
SETE LAGOAS 2016
C846i Cotta, Simony Pimenta Mascarenhas 2016
Isolamento e seleção de microrganismos resistentes à elevação de temperatura e produtores de enzimas hidrolíticas amilase, celulase e fitase. / Simony Pimenta Mascarenhas Cotta. – 2016.
57f.
Orientadora: Profª. Christiane Abreu de Oliveira Paiva
Dissertação (Mestrado Profissional em Biotecnologia e Gestão da Inovação). UNIFEMM. COPPEX.
1.Agricultura e tecnologias relacionadas. 2. Biotecnologia. 3. Microbiologia 4. Microrganismos termorresistentes. 5. Enzimas. 6. Fertilizante organomineral. I. Paiva, Christiane Abreu de Oliveira. II. UNIFEMM-Centro Universitário de Sete Lagoas. Coordenação de Pós-Graduação, Pesquisa e Extensão . III. Título.
ISOLAMENTO E SELEÇÃO DE MICRORGANISMOS RESISTENTES À ELEVAÇÃO DE TEMPERATURA E PRODUTORES DE ENZIMAS HIDROLÍTICAS
AMILASE, CELULASE E FITASE
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado Profissional em Biotecnologia e Gestão da Inovação do Centro Universitário de Sete Lagoas – UNIFEMM, como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre.
Aprovada em 20 de Dezembro de 2016, pela Banca Examinadora constituída pelos seguintes professores:
_________________________________
ProfaDra Christiane Abreu de O.Paiva - Orientadora UNIFEMM/Embrapa Milho e Sorgo
_________________________________
ProfDr Ivanildo EvódioMarriel – Coorientador UNIFEMM/Embrapa Milho e Sorgo
_________________________________ ProfDr Ivan Cruz
UNIFEMM/Embrapa Milho e Sorgo _________________________________ Dr. Maycon Campos Oliveira
UNIFEMM/Embrapa Milho e Sorgo
À minha família, pelo apoio, pela paciência e compreensão nas minhas “ausências”. À Dra Christiane Abreu de O. Paiva e Dr Ivanildo EvódioMarriel pelas valiosas orientações, atenção, disponibilidade, boa vontade e por me proporcionarem a realização deste trabalho.
Aos membros da Banca Examinadora, Dr. Ivan Cruz e Dr. Maycon Campos Oliveira, pela valiosa contribuição.
À querida amiga Profa. Dra. Adelaide Baeta, pelo enorme entusiasmo e empenho para tornar este Mestrado possível.
À Carolina Campolina, pela atenção, auxílio e valiosas contribuições.
Às secretárias Tamires, Isabela e Carina pela atenção, carinho e disposição.
Aos meus queridos colegas do Mestrado pela ótima convivência e amizade, em especial Mariana Campolino, Ana Luíza, Euládia e Sinval.
Aos amigos do Laboratório de Microbiologia do Solo da Embrapa Milho e Sorgo pela ótima convivência e colaboração.
À Mikaely Souza Marins (minha “anjinha”), pela enorme contribuição para a realização deste trabalho e à Fernanda de Cássia Batista e Felipe pelo enorme auxílio prestado. À Denise Pacheco, pelo auxílio e boa vontade.
Ao Adenilson de Freitas, pela colaboração para a realização deste trabalho. À UNIFEMM, pela disponibilização da bolsa de estudo.
À Embrapa Milho e Sorgo pela disponibilização de suas instalações. Aos meus amigos de Luz que sempre estiveram ao meu lado.
Á Embrapa Milho e Sorgo, Fapemig, CNPq pelo apoio financeiro.
Enfim, a todos que contribuíram para a realização deste trabalho, a minha enorme gratidão.
“A sabedoria de um ser humano não está no quanto ele sabe, mas no quanto ele tem consciência de que não sabe. Você tem esta consciência?”
O uso de fertilizantes organominerais enriquecidos com microrganismos é uma alternativa ao uso de fertilizantes sintéticos na agricultura. Durante o processo de formulação e secagem dos fertilizantes organominerais, a temperatura elevada compromete as funções microbianas. Procurou-se isolar e selecionar microrganismos termorresistentes em compostos orgânicos e avaliar o seu potencial de produção de algumas enzimas hidrolíticas. Coletou-se amostras de três leiras de compostagem produzidas a partir de misturas de resíduos vegetais e animais e diferentes tempos de compostagem (composto 1-C1, 33 dias, 51,9 ºC; composto 2-C2, 60 dias, 63,13 ºC e composto 3 - C3, estabilizado acima de 12 meses, 25,7 ºC). Os microrganismos foram extraídos dos substratos pelo método de diluição seriada e submetidos a choque térmico de 80 ºC por 30 minutos. Para a contagem, efetuou-se o plaqueamento em meios sólidos específicos para bactérias, fungos e actinomicetos. Os microrganismos foram caracterizados macro morfologicamente e um representante de cada grupo de morfotipos semelhantes foi submetido a um estresse térmico de 60 ºC e 100 ºC por duas e quatro horas. Os mais resistentes foram avaliados para a produção de enzimas hidrolíticas amilase, fitase e celulase e foi calculado o índice enzimático (IE). Os compostos C1 e C2 apresentaram maior densidade de bactérias termorresistentes (4,0 x 107 ufc/g em C1 e 5,8 x 106 ufc/g em C2), ficando os actinomicetos com a
segunda maior população (2,0 x 107 ufc/g em C1 e 1,8 x 106 ufc/g em C2), e por último
os fungos (1,1 x 103 ufc/g em C1 e 1,7 x 105 ufc/g em C2). C3 apresentou 1,0 x 105
ufc/g de bactérias e ausência de fungos e actinomicetos. Isolou-se 85 morfotipos bacterianos, sete de fungos e 20 de actinomicetos para avaliação da termorresistência. Desses, 42 microrganismos foram selecionados para avaliação da produção de amilase, fitase e celulase. As bactérias foram mais resistentes ao estresse térmico e mais eficientes na produção de enzimas, destacando-se os morfotipos 6 (IE de 6,6 para amilase e resistência a 100 ºC/2h), 2 e 17 (produtores de amilase e resistentes a 60 ºC e a 100 ºC por duas e quatro horas). Os microrganismos selecionados poderão ser incorporados a fertilizantes organominerais e testados em plantas e/ou como fonte de enzimas para aceleração de processos de compostagem e em outras aplicações biotecnológicas industriais.
The use of enriched organomineral fertilizers supplemented with microorganisms is an alternative to the use of synthetic fertilizers in agriculture. The use of high temperature during the formulation and drying process of organomineral fertilizers compromise the microbial functioning. The aim of this study was to isolate and select thermoresistant microorganisms of organic compounds and evaluate their hydrolytic enzyme production potential. The samples were collected from three windrow compost produced from plant and animal residues and different composting times (1: C1, 33 days, 51.9 °C; 2: C2, 60 days, 63.13 °C, and 3: C3, stabilized over 12 months at 25.7 °C). The microorganisms were extracted from the substrates by the serial dilution method and subjected to thermal shock at 80 °C for 30 minutes. For counting, the samples were inoculated on the agar plate containing selective medium for bacteria, fungi or actinomycetes. After counting, the microorganisms were characterized by their macromorphological traits and separated in different groups. One representative isolate of each morphotype group was submitted to a thermal stress in an incubator at 60 °C and 100 °C for two and four hours. The most resistant morphotypes were tested for the following hydrolytic enzyme production: amylase, phytase and cellulase and the enzymatic index (EI) were calculated. The C1 and C2 samples showed the higher density of heat-resistant bacteria (4.0 x 107 cfu / g and 5.8
x 106 cfu / g, respectively), followed by the actinomycetes (2.0 x 107 cfu / g, in C1 and
1.8 x 106 cfu / g in C2), and fungi (1.1 x 103 cfu / g in C1 and 1.7 x 105 cfu / g in C2).
C3 sample presented 1.0 x 105 cfu / g of bacteria and absence of fungi and
actinomycetes. A total of eighty-five bacterial morphotypes, seven of fungi, and twenty morphotypes of actinomycetes were evaluated for thermal resistance. Forty-two microorganisms were selected to evaluate the amylase, phytase and cellulase production. Bacteria were more resistant to thermal stress and more efficient in enzymes production, especially the morphotypes 6 (EI of 6.6 for amylase and resistance at 100 ºC / 2h), 2 and 17 (both amylase producers and resistant to 60 °C and 100 °C for 2h and 4h). The selected heat-resistant microorganisms may be incorporated into organomineral fertilizers during formulation and tested in plants, to accelerate the composting processes, or as a source of industrial enzymes.
Figura 1 – Contagem e isolamento de microrganismos ... 30
Figura 2 – Avaliação da resistência a temperaturas superiores a 50 ºC ... 31
Figura 3 – Avaliação da produção enzimática ... ... 32
Figura 4 – Composto 1 (C1) ... 34
Figura 5 – Medição da temperatura do composto 1 (C1) ... 34
Figura 6 – Composto 2 (C2) ... 35
Figura 7 – Medição da temperatura do Composto 2 (C2) ... 35
Figura 8 – Composto 3 estbilizado (C3) ... 36
Figura 9 – Medição da temperatura do Composto 3 estabilizado (C3) ... 36
Figura 10 – População de bactérias, fungos e actinomicetos termorresistentes em C1... 39
Figura 11 – População de bactérias, fungos e actinomicetos termorresistentes em C2 ... 39
Figura 12 – População de bactérias, fungos e actinomicetos termorresistentes em C3 ... 40
Figura 13 – Contagem em placa de bactérias, fungos e actinomicetos termorresistentes ... 40
Figura 14 - Número de morfotipos de bactérias, fungos e actinomicetos termorresistentes isolados em C1, C2 e C3 ... 41
Figura 15 - Morfotipos de bactérias termorresistentes isolados de C1, C2 e C3 ... 42
Figura 16 - Número de morfotipos de bactérias, fungos e actinomicetos resistentes ao estresse térmico de 60 º/ 2h e 4h e 100 ºC / 2h e 4h ... 43
de amilase (AMI), fitase (FIT) e celulase (CEL) por bactérias isoladas de C1, C2 e C3 ... 44 Tabela 2. Resistência ao estresse térmico e avaliação da produção de amilase (AMI), fitase (FIT) e celulase (CEL) por fungos isolados de C1, C2 e
C3 ... 46 Tabela 3. Resistência ao estresse térmico e avaliação da produção de amilase (AMI), fitase (FIT) e celulase (CEL) por actinomicetos isolados de C1, C2 e
1.1 Objetivo ... 14
1.2 Hipótese ... 14
2 REFERENCIAL TEÓRICO ... 15
2.1 O setor agrícola no Brasil ... 15
2.2 Disponibilização de fósforo para as plantas ... 16
2.3 Fertilizantes organominerais ... 17
2.4 Microrganismos termófilos ... 20
2.5 Enzimas microbianas e sua aplicação biotecnológica ... 21
2.5.1 Amilases ... 23
2.5.2 Fitases ... 25
2.5.3 Celulases ... 26
3 METODOLOGIA ... 28
3.1 Coleta de amostras para isolamento de microrganismos ... 28
3.2 Contagem, isolamento e caracterização morfológica dos microrganismos ... 28
3.3 Avaliação da resistência a temperaturas superiores a 50 ºC ... 30
3.4 Avaliação da produção enzimática ... 31
3.4.1 Amilase ... 32
3.4.2 Fitase ... 33
3.4.3 Celulase ... 33
3.5 Análise estatística ... 33
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 34
4.1 Temperatura das amostras C1, C2 e C3 e fases do processo de compostagem ... 34
4.2 Contagem de bactérias, fungos e actinomicetos ... 37
4.3 Isolamento e caracterização morfológica dos microrganismos ... 40
4.4 Avaliação da resistência a temperaturas superiores a 50 ºC ... 42
4.5 Avaliação da atividade enzimática ... 43
5 CONCLUSÃO ... 49
1 INTRODUÇÃO
O setor agrícola no Brasil exerce forte influência no desempenho econômico do país, contribuindo para o equilíbrio da balança comercial. Dados apontam que até 2024 o Brasil estará pronto para atender a demanda mundial de produtos agrícolas e se tornar o principal fornecedor, e um dos desafios a enfrentar é aumentar tanto a produtividade como a produção com base na sustentabilidade ambiental (OCDE-FAO, 2015).
Para completar seu desenvolvimento, as plantas necessitam de carbono, oxigênio e nitrogênio retirados da água e da atmosfera e de outros nutrientes que são provenientes do solo; mas raramente os solos apresentam todos os nutrientes necessários e nas quantidades adequadas para o desenvolvimento apropriado das plantas cultivadas (OLIVEIRA, 2016). Portanto, para suprir as necessidades nutricionais utiliza-se a aplicação de adubos, sendo os fertilizantes minerais os mais utilizados.
O fósforo é um nutriente essencial para os vegetais, mas apesar de ser abundante no solo, as plantas só conseguem utilizá-lo na forma de fosfato solúvel, forma que se apresenta em pequenas quantidades (SILVA et al., 2012). Assim sendo, utiliza-se normalmente fertilizantes sintéticos produzidos a partir de fosfato de rocha, cujas reservas podem ser esgotadas até o final deste século (VASSILEV et al, 2014). Esses fertilizantes, quando aplicados no solo, além de apresentarem um potencial poluidor para o meio ambiente, rapidamente se tornam indisponíveis para as plantas porque se ligam a outros compostos (SILVA et al., 2012; MENDES; REIS JÚNIOR, 2003).
O uso de fertilizantes organominerais enriquecidos com microrganismos é uma alternativa promissora. No entanto, é preciso selecionar corretamente o microrganismo para que este sobreviva no fertilizante e exerça sua função biológica quando o fertilizante for aplicado no solo. Alguns destes fertilizantes são produzidos após a transformação biológica dos resíduos animais associados com minerais, via compostagem. Outros são produzidos pela simples mistura dos componentes orgânicos e minerais. Porém, atualmente, a maior parte desses fertilizantes é comercializada na forma de farelo ou em pó, apresentando algumas limitações, como
empedramento, compactação, formação de poeiras e dificuldade de aplicação (BENITES et al., 2010).
A forma granulada de fertilizantes organominerais apresenta maiores vantagens e sua produção representa um desafio tecnológico. A adição dos microrganismos poderá ocorrer durante o processo de mistura dos componentes ou na compostagem. Durante o processo de granulação, há uma elevação da temperatura em até 104 ºC, o que poderia prejudicar o desenvolvimento dos microrganismos ou desnaturar enzimas microbianas presentes no fertilizante (BENITES et al., 2010; MORAIS, 2014).
Microrganismos termófilos são capazes de crescer em temperaturas acima de 55 ºC e produzir enzimas que apresentam atividade em condições extremas de temperatura, possibilitando seu uso em muitos processos industriais, onde esta condição é necessária. Muitos destes microrganismos estão presentes no solo e são capazes de solubilizar o fósforo para as plantas e mineralizar as formas orgânicas de fósforo, através da produção de ácidos orgânicos e de enzimas (DELATORRE et al., 2010; ROCHA, 2010; LARA et al., 2011).
Existe também uma ampla diversidade bioquímica de enzimas microbianas da classe das hidrolíticas que degradam várias substâncias naturais. Tais enzimas possuem vasta aplicação biotecnológica industrial, como por exemplo nas indústrias têxteis, alimentícias, de couro, de papel e de detergentes.
Buscou-se, com este trabalho, isolar estirpes de microrganismos termófilos (bactérias, fungos e actinomicetos) provenientes do processo de compostagem e testar o seu potencial para a tolerância ao estresse térmico e produção das enzimas hidrolíticas amilase, celulase e fitase. Uma vez obtidos os microrganismos eficientes, os mais promissores serão caracterizados molecularmente. Com os resultados obtidos, poderão ser realizados testes futuros com os produtos de fertilizantes organominerais enriquecidos com microrganismos termófilos, avaliando-se a sobrevivência destes microrganismos nos grânulos ou fertilizante farelado. Espera-se também poder contribuir para futuros testes com tais enzimas na aceleração dos processos de compostagem e na resistência das enzimas ao processo de granulação, bem como com outras aplicações biotecnológicas industriais.
1.1 Objetivo
Isolar e selecionar microrganismos resistentes a altas temperaturas e eficientes na produção das enzimas hidrolíticas amilase, celulase e fitase.
1.2 Hipótese
Microrganismos isolados de substratos provenientes de compostagem são resistentes a altas temperaturas e são produtores das enzimas hidrolíticas amilase, celulase e fitase.
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 O setor agrícola no Brasil e o uso de fertilizantes
Nas últimas três décadas a produção agrícola quase que dobrou de volume, se comparado aos registros de 1990. O Brasil é o segundo maior exportador agrícola mundial, ultrapassando os Estados Unidos em 2013 como o maior fornecedor de soja, sendo um grande produtor de milho, arroz e carne bovina e o maior fornecedor de açúcar, suco de laranja e café. Segundo o relatório OCDE-FAO – Perspectivas Agrícolas 2015-2024 – o Brasil está pronto para atender a demanda mundial de produtos agrícolas e se tornar o principal fornecedor, e um dos desafios a enfrentar está em manter a produtividade e o crescimento da produção com base na sustentabilidade ambiental (ODCE – FAO, 2015). A agricultura no Brasil está caminhando para uma produção eficiente, com a preocupação de proteger o meio ambiente, e neste cenário, a utilização de tecnologias agrícolas adequadas pode reduzir o impacto ambiental significativamente (INAMASU et al., 2011). Para atender a esta demanda de crescimento da produção, o país necessita de dar saltos de produtividade, ocorrendo, com isso, o aumento da demanda por fertilizantes (RESENDE et al., 2006). No entanto, o uso excessivo de fertilizantes pode causar impactos negativos, contribuindo para o esgotamento das reservas naturais, contaminação do solo e das águas, além das emissões de dióxido de carbono (CO2),
amônia e óxido nitroso (N2O) para a atmosfera. Há um aumento anual de 20% de
emissão antropogênica de gases de efeito estufa, principalmente CH4 e N2O
decorrente das atividades agrícolas, e a agricultura é responsável por 70% de todas as emissões antropogênicas de N2O (LANA, 2009).
N, P e K são os principais componentes dos fertilizantes usados para adequar os solos às necessidades nutricionais das plantas. O petróleo e o gás natural são matéria-prima para a produção de adubos nitrogenados (fertilizantes nitrogenados são derivados da amônia, que é obtida a partir da transformação química do gás natural, que é um combustível fóssil que se encontra na natureza, associado ou não ao petróleo); os adubos fosfatados são produzidos a partir de enxofre e rocha fosfática; e a produção dos adubos potássicos, necessita das rochas potássicas como matéria-prima. O mercado brasileiro consome mais fertilizante (6% de todo o fertilizante
utilizado no mundo) que sua produção nacional (2% da produção mundial) (CELLA; ROSSI, 2010).
No caso do fósforo, para suprir as necessidades deste elemento para as plantas são adicionados ao solo normalmente fertilizantes solúveis, cuja maior parte se liga rapidamente a cátions e compostos orgânicos, tornando-se indisponíveis, contribuindo para o baixo nível de eficiência (10% - 25%) dos adubos fosfatados aplicados ao solo, tornando-se necessário o uso de grandes quantidades. O acúmulo desses fertilizantes fosfatados no solo gera um efeito potencialmente poluente, pois sua lixiviação gera eutrofização, hipóxia e degradação de ecossistemas, principalmente os aquáticos. (SILVA et al., 2012; FRANDOLOSO et al., 2010). As indústrias de fertilizantes fosfatados, durante a produção do ácido fosfórico, geram um resíduo (fosfogesso) de grande impacto ambiental, pelo grande volume produzido e difícil disposição, levando à contaminação do solo, rios, lagos, e até mesmo do lençol freático, quando depositado em solo não impermeabilizado (ARAÚJO; FERNANDES, 2013).
2.2 Disponibilização do Fósforo para as Plantas
O fósforo é um nutriente essencial para os vegetais. Está presente em abundância no solo tanto na forma orgânica quanto na inorgânica, mas as plantas só conseguem utilizá-lo na forma de fosfato, que está disponível no solo, na fase líquida, em pequenas quantidades. São naturalmente adicionados ao solo fosfatos inorgânicos cuja origem está nas rochas fosfáticas que sofreram intemperização, principalmente aquelas ricas em minerais de apatita. Superfosfato simples, superfosfato triplo, mono-amonio fosfato, fosfatos de rocha reativos e ácido superfosfórico são exemplos de fertilizantes fosfatados sintéticos (compostos industriais à base de P) utilizados (RABELO, 2015). Já o fósforo orgânico presente no solo tem sua origem nos restos vegetais e animais e células microbianas em decomposição, e os microrganismos mineralizam esses compostos, disponibilizando o P (SILVA et al., 2012; RABELO, 2015).
O emprego de fosfatos naturais como fonte de P a preços menos elevados que os dos superfosfatos aumentou o seu consumo significativamente. Fazem parte do grupo dos fosfatos naturais um grande número de minerais fosfatados de diferentes origens e composição. Um dos grandes obstáculos para se estabelecer sistemas
agrícolas sustentáveis é a pouca eficiência da utilização dos adubos fosfatados. Como os fosfatos naturais brasileiros são pouco eficientes, tem-se buscado alternativas para reduzir os custos, como o uso de os fosfatos naturais reativos (FNR) importados (MENDES; REIS JÚNIOR, 2003; SILVA et al., 2015) ou de uso conjunto com microrganismos (OLIVEIRA et al, 2013).
O fósforo pode ser adicionado ao solo, pelo homem, através dos adubos minerais ou através de resíduos orgânicos, tornando-se necessário a compreensão da sua dinâmica no solo, bem como os mecanismos de sua liberação. Diante da sua pouca disponibilidade no solo e da grande necessidade de sua utilização pelas plantas, e frente aos impactos negativos ao meio ambiente causados pelo alto consumo de fertilizantes fosfatados exclusivamente minerais e sintéticos, além dos altos custos de sua importação, estão se desenvolvendo novas tecnologias para suprir a demanda nacional de fertilizantes, como as tecnologias de produção de fertilizantes orgânicos e organominerais, nos sistemas de produção agrícola (FERREIRA, 2014).
2.3 Fertilizantes Organominerais
Dos nutrientes que as plantas necessitam para completar seu desenvolvimento, o carbono, o oxigênio e o nitrogênio têm sua fonte na água e na atmosfera, e o restante é retirado do solo. Entretanto, raramente os solos apresentam todos os nutrientes nas quantidades suficientes, sendo necessária a aplicação de adubos para suprir as necessidades nutricionais. Os fertilizantes minerais são os mais utilizados. A maioria dos fertilizantes fosfatados é obtida quimicamente a partir de fosfato de rocha, cujas reservas naturais irão se esgotar até o final deste século. São obtidos através de processos ecologicamente indesejáveis, pois gastam muita energia e liberam contaminantes para o produto final. (VASSILEV et al., 2014; OLIVEIRA, 2016; CARDOSO et al., 2015). A maior parte dos fertilizantes aplicados no solo se liga rapidamente a cátions e compostos orgânicos, tornando-se indisponíveis para as plantas. O acúmulo desses fertilizantes fosfatados no solo gera um efeito potencialmente poluente, pois sua lixiviação gera eutrofização, hipóxia e degradação de ecossistemas, principalmente os aquáticos (SILVA et al., 2012).
A adubação orgânica apresenta aspectos favoráveis, pois melhora as características físicas e biológicas do solo, acrescenta carbono, propicia a diminuição da erosão, aumenta a taxa de retenção de água, propicia maior disponibilidade de
nutrientes às plantas, estimula a atividade biológica, diminui a diferença de temperatura do solo durante o dia e a noite, aumenta a taxa de infiltração e possibilita uma maior agregação de partículas do solo. Entretanto, por apresentarem baixas concentrações de N, P, K, os adubos orgânicos podem ser complementados com adubação mineral (RABELO, 2015).
Uma alternativa promissora para suprir as necessidades nutricionais das plantas é a utilização do fertilizante organomineral, que segundo Brasil (2004), é o “produto resultante da mistura física ou combinação de fertilizantes minerais e orgânicos”, e de acordo com a Instrução Normativa (IN) 25, de 23 de Julho de 2009, do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento – MAPA – os fertilizantes organominerais sólidos para aplicação no solo devem ter no mínimo 8% de carbono orgânico; no máximo 30% de umidade; CTC, mínimo 80 mmolc/kg; os micronutrientes N, P, K, isolados ou combinados devem estar em 10 % e os macronutrientes secundários em 5%. Além de reterem os nutrientes no solo, diminuem a lixiviação, possibilitando um maior aproveitamento desses nutrientes pelas plantas, reúnem em um só fertilizante o componente orgânico, como potencial fonte de carbono para o solo e o químico, com os nutrientes (CARDOSO et al., 2015).
Estão sendo desenvolvidas tecnologias alternativas para a produção de fertilizantes organominerais, aproveitando-se, de forma segura, os resíduos provenientes da pecuária, suinocultura e avicultura, viabilizando a sustentabilidade deste setor produtivo. Segundo Benites et al. (2010), são gerados no Brasil anualmente 7,8 milhões de toneladas de cama-de-aviário e 105 milhões de m3 de
dejetos líquidos de suínos. De acordo com Fiori et al. (2008), as atividades agrícola e industrial geram resíduos com potencial para causar danos ambientais, se não forem adequadamente tratados, e a taxa de geração desses resíduos é muito maior que a taxa de degradação, o que vem provocando impactos ambientais; assim, fica claro a necessidade de reduzir, reciclar e aproveitar os resíduos gerados para recuperar matéria e energia. O Brasil produz por ano 120 milhões de toneladas de biomassa seca como resíduos dos principais produtos agropecuários, representando uma das melhores fontes de material para compostagem, tornando-a um meio de reciclagem da matéria orgânica, bem como um requisito para a produção orgânica (CARVALHO
et al., 2013). Resultados de campo apresentam semelhanças entre a eficiência dos
fertilizantes solúveis e fertilizantes organominerais, com relação à disponibilidade de fósforo. É possível sua produção na forma granulada, com alto teor de fósforo solúvel,
após a transformação biológica dos resíduos animais, associados com minerais. Atualmente a maior parte dos fertilizantes organominerais é comercializada na forma de farelo ou em pó, e somente uma pequena parte é destinada à produção de grãos e fibras. Sua pouca utilização pode ser atribuída à baixa concentração de nutrientes e às suas características físicas (FERREIRA, 2014; REBELLATTO, 2013; BENITES et
al., 2010).
A forma granulada dos fertilizantes apresenta vantagens, como melhoria na estocagem, eliminando ou reduzindo problemas de empedramento; facilita a dosagem e aplicação no campo, pelas suas propriedades físicas; reduz ou elimina as poeiras durante a produção, ensaque e aplicação no campo (MORAIS, 2014).
As formas insolúveis do fósforo são convertidas em formas assimiláveis pelas plantas por algumas espécies microbianas do solo, pelos processos de mineralização e solubilização. Os ácidos orgânicos excretados por esses microrganismos atuam diretamente na dissolução do fósforo ou provocam uma ação quelante sobre os cátions, liberando fosfatos solúveis. As enzimas fosfatases também podem mineralizar as formas orgânicas de fósforo e catalisar a hidrólise de ésteres e anidridos de H3PO4 (LARA et al., 2011; CEREZINI et al., 2009). Segundo Jorquera et al. (2011), a habilidade de certos microrganismos em aumentar as concentrações de
P solúvel, ou degradando fitato ou produzindo ácidos orgânicos que mobilizam o fosfato mineral, tem levado ao desenvolvimento de vários biofertilizantes que podem ser aplicados ao solo para melhorar a disponibilidade do fósforo para as plantas.
Destaca-se a incorporação de microrganismos do solo aos fertilizantes organominerais granulados para melhorar sua eficiência e ampliar sua utilização na agricultura, uma vez que esses microrganismos obtém energia a partir da matéria orgânica para disponibilizar o fósforo para as plantas através do processo de mineralização via produção de ácidos orgânicos, enzimas, etc. De acordo com Oliveira
et al. (2004), a matéria orgânica traz vários benefícios ao solo, como fornecer
nutrientes, melhorar o nível de aproveitamento dos adubos minerais, promover a solubilização de nutrientes em solos minerais, melhorar a estrutura (granulação) do solo, favorecer uma maior atividade microbiana, melhorar a capacidade tampão do solo, reduzir a toxidez por pesticidas e outras substâncias tóxicas. A produção de fertilizantes organominerais granulados representa um grande desafio tecnológico para ampliar o uso desses fertilizantes no Brasil, havendo uma elevação da temperatura a até 104 ºC durante o processo de granulação, o que poderia
comprometer as funções microbianas, dependendo do microrganismo utilizado (MORAIS, 2014; BENITES et al., 2010).
2.4 Microrganismos Termófilos
Microrganismos termófilos são aqueles capazes de crescer em altas temperaturas, muitos deles possuindo uma temperatura ótima de crescimento entre 50 ºC e 60 ºC. Tais temperaturas podem ocorrer no solo exposto ao sol e em águas termais. Muitos termófilos não conseguem se desenvolver em temperaturas abaixo de 45 ºC. Microrganismos chamados de hipertermófilos, ou termófilos extremos, membros das Arquibactérias, tem uma temperatura ótima de crescimento de 80 ºC ou mais. A maioria desses organismos vive em fontes de água quente associadas à atividade vulcânica (TORTORA et al., 2012).
Os microrganismos termófilos não apenas resistem, mas requerem altas temperaturas para sobreviver. Por outro lado, os termófilos moderados apresentam crescimento entre 20 ºC e 55 ºC (Bacteria, Archaea e fungos filamentosos), com temperatura ótima entre 40 ºC e 50 ºC; termófilos extremos, que crescem otimamente entre 65 ºC e 85 ºC (Bacteria e Archaea); e os hipertermófilos (Archaea), com temperatura ótima de crescimento entre 85 ºC e 110 ºC (GOMES et al., 2007). Tolner
et al. (1997), menciona os termófilos facultativos, capazes de crescer em uma ampla
faixa de temperatura.
Para um microrganismo crescer em altas temperaturas, seus principais componentes, incluindo proteínas, ácidos nucléicos e lipídios devem ser estáveis ao calor (MADINGAN; OREN, 1999). Organismos com estrutura simples podem crescer sob condições mais extremas que organismos com estruturas mais complexas; daí a preeminência dos microrganismos em ambientes extremos. Há três maneiras pelas quais um organismo pode se adaptar a um ambiente extremo: (1) pode desenvolver um mecanismo para excluir o fator de sua estrutura; (2) pode desenvolver um mecanismo para detoxificar o fator; (3) pode aprender a viver com o fator. Em alguns casos, é esta última situação que ocorre, e a adaptação evolutiva é tal que o organismo se torna dependente do fator que para outros organismos é letal. Para sobreviver em condições ambientais extremas os microrganismos foram obrigados a desenvolver componentes celulares e estratégias bioquímicas.
Os termófilos podem responder ou se adaptar ao estresse térmico alterando a composição lipídica e a energia de transdução e a permeabilidade da membrana citoplasmática aos íons (TOLNER et al. 1997; DELATORRE et al., 2010). Nos termófilos há uma substituição dos ácidos graxos insaturados por ácidos graxos saturados, permitindo um equilíbrio entre a densidade e fluidez da membrana, o que é necessário para a sua integridade física ante às temperaturas elevadas (GOMES et
al., 2007). Rodríguez (2005) destaca que as enzimas e outras proteínas dos
microrganismos termófilos são muito mais estáveis que a dos mesófilos e seu funcionamento é ótimo a temperaturas extremas. Segundo o autor, muitas vezes observa-se que as enzimas termoestáveis diferem muito pouco das normais, havendo a substituição de um aminoácido, que é crítico para o enovelamento, e que confere maior estabilidade. Isto se deve também ao denso empacotamento do interior das proteínas, que é altamente hidrofóbico e faz com que elas resistam à desnaturação. Além disso, os hipertermófilos produzem certos solutos, como o glicerol fosfato, que ajuda a estabilizar as proteínas, evitando a sua degradação térmica. A manutenção da estrutura do DNA é imprescindível para a estabilidade dos termófilos, que possuem no citoplasma grande quantidade de 2,3-difosfoglicerato cíclico de potássio, que impede danos químicos à molécula de DNA em alta temperatura. Além disso, os hipertermófilos possuem uma DNA topoisomerase tipo I, a Girase Reversa, que produz superenovelamentos positivos no DNA, conferindo maior resistência térmica (MADINGAN; OREN, 1999; GOMES et al., 2007; STETTER, 1999).
2.5 Enzimas Microbianas e sua Aplicação Biotecnológica
De acordo com Nelson & Cox (2014), as enzimas são as proteínas mais notáveis e mais altamente especializadas, catalizadores das reações dos sistemas biológicos. Com alto grau de especificidade para seus respectivos substratos, aceleram as reações químicas e atuam em soluções aquosas sob condições suaves de temperatura e pH. De estrutura molecular complexa, são proteínas globulares, heteropolímeros de pelo menos vinte aminoácidos, e algumas possuem em sua estrutura um grupo prostético, que é um componente não proteico. Sua parte proteica pode estar ligada a outras moléculas, como carboidratos e lipídios. São agrupadas em função do tipo de reação em que atuam em: oxirredutases, transferases, hidrolases, liases, isomerases e ligases, e em sua nomenclatura é adicionada a terminação ase
ao nome do substrato em que atuam, como por exemplo amilase, celulase, urease, etc.
A estrutura primária das enzimas é conferida pelo número de aminoácidos de sua cadeia e pela ordem em que eles se encontram; a estrutura secundária é caracterizada pela formação de alfa hélice e folha beta pregueada, formadas por arranjos entre os segmentos de aminoácidos da estrutura primária; a estrutura terciária é a conformação tridimensional assumida pela molécula protéica, resultante das interações entre aminoácidos não próximos, provocando torções e dobramentos; e a estrutura quaternária é a organização presente nas proteínas com mais de uma cadeia polipeptídica, ou seja, a interação entre as cadeias polipeptídicas (ORLANDELI
et al., 2012; WANDERLEY et al., 2011).
Apesar da ampla ocorrência das enzimas em animais e plantas, as de origem microbiana representam maior interesse industrial em razão de sua grande diversidade e susceptibilidade à manipulação genética, além de possuírem menor custo de produção e possibilidade de produção em larga escala em fermentadores industriais. A aplicação enzimática consome pouca energia e gera mínimo impacto ambiental, sendo considerada uma tecnologia limpa, alternativa aos processos químicos convencionais (FIGUEIREDO et al., 2010; BASTOS, 2015). Binod et al. (2013), apresenta como vantagens do uso da biotecnologia industrial a remoção e a prevenção de fontes de poluentes. Segundo os autores, os esforços para se alcançar uma tecnologia industrial limpa irão trazer grandes benefícios às indústrias nos próximos dez ou vinte anos.
Atualmente as principais enzimas de uso industrial são as de ação hidrolítica, usadas para a degradação de várias substâncias naturais; estas enzimas possuem a propriedade singular de terem grande especificidade pelo substrato. As proteases são o tipo dominante, por causa de seu uso em indústrias de detergentes e laticínios. O segundo tipo mais usado industrialmente são as carboidrases, principalmente amilases e celulases, em indústrias de amido, têxteis, de detergentes e de panificação, mas de modo geral, as enzimas são utilizadas em grande escala em indústrias têxteis (amilase, celulase, pectinase, oxirredutase), de detergentes (celulase, lipase, protease, oxirredutase), alimentícia (celulase, lactase, lípase, pectinase, protease, oxirredutase), de papel (lipase, oxirredutase, xilanase) e de couro (lipase, protease) (KIRK et al., 2002; FIGUEIREDO, 2010) .
Segundo Baratto et al. (2011), o Brasil possui um grande potencial para produção de enzimas pela abundância de substrato de baixo custo para as fermentações, como os resíduos agrícolas (palha de arroz, bagaço de cana).
A adaptação dos microrganismos à termofilia tem despertado grande interesse na biotecnologia pela possibilidade do uso de suas enzimas em bioprocessos, e ainda, os mecanismos de termorresistência desses microrganismos podem servir de modelo para a bioengenharia. Podemos citar alguns exemplos de termoenzimas, como a Taq polimerase, utilizada na Biologia Molecular, proteases e celulases, usadas como aditivos de detergentes e sabões, α-amilase, glucose isomerase, utilizadas no processamento industrial do amido, xilanase, utilizada na indústria de polpa e papel, e outras no tratamento de resíduos, setor de diagnóstico e produção de ração animal (GOMES et al., 2007).
Os microrganismos termófilos são de grande interesse para as bio-indústrias emergentes pela possibilidade de melhorar os bioprocessos sob condições de altas temperaturas. Suas enzimas termoestáveis apresentam potencial industrial considerável oferecendo melhores rendimentos sob condições operacionais extremas. A descoberta dessas enzimas, com suas inúmeras aplicações biotecnológicas, vem revolucionando o mercado industrial, principalmente as hidrolases extracelulares (proteases, amilases, pectinases e celulases), estáveis à temperatura e ao pH extremo. Por isso, torna-se de grande relevância para a comunidade científica o isolamento de bactérias termófilas para a produção de enzimas com novas propriedades (DELATORRE et al., 2010; MONTEIRO; SILVA, 2009).
2.5.1 Amilases
As amilases são enzimas que hidrolizam moléculas de amido, originando diversos produtos, incluindo dextrinas e polímeros menores de glicose. O amido é encontrado principalmente em sementes de cereais como milho, cevada, trigo e arroz, e em tubérculos ou raízes como batata e mandioca, possuindo em sua constituição 25% de amilose (polímero constituído de 6.000 resíduos de glicose) e 75% de amilopectina (pequenas cadeias laterais de 15 a 45 resíduos de glicose). Embora as amilases possam ser derivadas de várias fontes, como plantas, animais e microrganismos, as microbianas geralmente são as mais utilizadas industrialmente.
Atualmente conhece-se um grande número de enzimas que hidrolizam moléculas de amido em diferentes produtos, e para a hidrólise completa do amido é necessário a ação combinada de várias enzimas. As amilases podem ser divididas em exoamilases e endoamilases. As α-amilases (endoamilase) e as glicoamilases (exoamilase) constituem um dos grupos mais importantes de amilases utilizadas industrialmente. As α-amilases catalisam a hidrólise aleatória das ligações glicosídicas α-1,4 no interior da molécula de amido, formando cadeias de oligossacadídeos ramificadas de vários comprimentos, e as glicoamilases liberam β-D-Glicose das extremidades não redutoras das cadeias de amilose, amilopectina e glicogênio pela hidrólise consecutiva das ligações α-1,4; α-1,6, produzindo glicose ou maltose. Além das endoamilases e exoamilases, fazem parte do grupo das amilases as enzimas de desramificação (pululanase, isoamilase) e as transferases (FIGUEIREDO et al., 2010; GRUPTA et al., 2003; PEIXOTO et al., 2003; MAAREL et al., 2002). As amilases são umas das mais importantes enzimas e possuem uma ampla aplicação industrial, na panificação, indústria química e farmacêutica e na fabricação de etanol. Essas enzimas perfazem cerca de 30% da produção mundial de enzimas (PANDEY et al., 2006;)
As plantas utilizam as amilases para assimilar o amido acumulado em alguns tipos de raízes; os animais, para digerir o amido contido nos alimentos e muitos microrganismos procariotas e eucariotas as utilizam como fonte de carbono. O interesse biotecnológico em amilases microbianas tem aumentado, especialmente as amilases produzidas por microrganismos termofílicos e termotolerantes que, por causa da sua termoestabilidade, podem ser usadas em processos que ocorrem em altas temperaturas. Como aplicações industriais das amilases, podemos citar seu uso (1) na indústria de alimentos, para obtenção de xaropes de glicose e frutose, que por sua vez irão adoçar refrigerantes; para melhorar as características organolépticas de produtos de panificação; (2) na indústria têxtil, para proteger os fios durante a tecelagem, através da degradação do amido neles aplicado; (3) na indústria de papel, para remover o amido aplicado ao mesmo para dar proteção contra danos mecânicos durante o processamento; e (4) para remover manchas amiláceas, na indústria de detergente (PEIXOTO et al., 2003; DELATORRE et al., 2010).
2.5.2 Fitases
As fitases (mio-inositolhexaquifosfatofosfohidrolase – EC 3.1.3.8) são enzimas que catalisam a hidrólise do fitato (mio-inositolhexaquifosfato), que é a principal fonte de fósforo presente nos grãos de cereais, leguminosas e sementes oleaginosas. A hidrólise do ácido fítico (fitato) a mio-inositol e ácido fosfórico é um processo metabólico importante em vários sistemas biológicos. As fitases estão amplamente distribuídas na natureza e já foram isoladas de várias fontes, incluindo plantas, animais e microrganismos (PANDEY et al., 2001; SHOBIRIN et al., 2009).
O fósforo orgânico (Po) está presente no solo na forma de fitato, representando de 20% a 50% do total de Po no solo, e as plantas não conseguem utilizar esse fósforo satisfatoriamente. Os microrganismos do solo, benéficos para a mobilização do P, secretam fosfatases, que são enzimas requeridas para mineralizar o Po, liberando fosfato (forma em que as plantas conseguem utilizar o P). Segundo Oliveira et al (2013), as fosfomonoesterases são as enzimas que hidrolizam o Po, utilizando o fitato como substrato, tornando o fósforo solúvel disponível no ambiente. As fosfomonoesterases são enzimas do grupo das fosfatases. Estas incluem as fitases microbianas, enzimas envolvidas na nutrição de P para as plantas (RICHARDSON et al., 2001). Este grupo de enzimas engloba uma variedade de tamanhos, estruturas e mecanismos catalíticos. Baseado nos mecanismos catalíticos as fitases podem ser fitases ácidas de histidina (HAPhy), fitases de β hélice (BPPhy), fitases de cisteína (CPHy) ou fitases ácidas púrpuras (PAPhy). Baseado no pH ótimo, são divididas em ácidas e alcalinas, e também baseado no carbono do anel de mio-inositol do fitato no qual a desfosforilação é iniciada, podem ser 3-fitase (E.C. 3.1.3.8), 6-fitase (E.C.3.1.3.26) and 5-fitase (E.C. 3.1.3.72) (GREINER; KONIETZNI, 2011).
Apesar de o fitato ser a principal fonte de P estocado em cereais, pólen, grãos e leguminosas, é considerado um fator anti-nutricional porque quela vários íons metais, como Mg2+, Ca2+ e Zn 2+, além de complexar proteínas. Além disso, ele não é
metabolizado pelos animais monogástricos. Assim, é necessário adicionar fosfato inorgânico na alimentação animal para assegurar o suprimento de fósforo. Consequentemente, o fitato da alimentação é liberado nas fezes desses animais, resultando em uma contaminação grave dos cursos de água. Deste modo, uma das maneiras de aprimorar a utilização do fosfato proveniente do fitato é o uso das fitases na alimentação animal. A produção de fitases de origem microbiana permitem um alto
rendimento, além de produção em larga escala, podendo ser utilizadas na indústria de ração animal peletizada. As fitases microbianas extracelulares toleram moderadamente o calor; a enzima de Aspergillusfumigatus apresentou atividade a 100 ºC por 20 minutos, ou a 120 ºC por 90 minutos, possuindo um alto potencial comercial, podendo resistir ao processamento da ração peletizada, onde as temperaturas alcançam de 70 ºC a 90 ºC (QUAN et al., 2001; KIM et al., 2006; LANA, 2009). Fitases acrescentadas às rações animais possibilitam um aumento da digestibilidade de nutrientes, maior absorção do fosfato pelos animais, aproveitando melhor o alimento, além de reduzir a excreção de nutrientes, diminuindo a quantidade de fósforo desprezada no ambiente (DECHAVEZ et al., 2011).
Microrganismos produtores de fitase podem ser adicionados a biofertilizantes que, quando aplicados ao solo, contribuem para uma melhor disponibilidade de fósforo para as plantas (JORQUERA, et al., 2011; PACHECO; DAMASIO, 2013)
2.5.3 Celulases
As celulases são um complexo de enzimas que atuam na decomposição da biomassa celulósica em glicose, que por sua vez é convertida em outros compostos químicos e energia. A celulose é um polímero linear de subunidades de glicose, ligadas por ligações β-1,4. Cada subunidade de glicose gira 180° em relação à subunidade vizinha, sendo a unidade básica de repetição a celobiose. É o principal carboidrato sintetizado pelas plantas, sendo o componente mais abundante da biomassa vegetal. Encontrada na natureza quase que exclusivamente na parede celular dos vegetais, sua degradação representa uma parte importante do ciclo do carbono na biosfera. Na maioria dos casos as fibras de celulose estão mergulhadas em uma matriz de outros biopolímeros estruturais, as hemiceluloses e a lignina (CASTRO; PEREIRA JÚNIOR 2010; BÉGUIN; AUBERT, 1994; LYND et al., 2002).
O complexo multienzimático da celulase contém três tipos básicos de enzimas que atuam em sinergia na degradação da celulose em glicose: exoglucanases, endoglucanases e β glicosidases. As endoglucanases atuam aleatoriamente, clivando ligações no interior da molécula de celulose; as exoglucanases removem unidades de celobiose da extremidade não redutora da molécula de celulose; e a β-glicosidade divide a celobiose em duas unidades de
glicose (MUKATAKA et al., 1988; LIMA et al., 2005). Entretanto, as plantas desenvolveram mecanismos complexos para resistir aos ataques em seus açúcares estruturais pelos microrganismos e pelos constituintes do reino animal, tornando a biomassa vegetal recalcitrante. Um exemplo é a barreira de lignina das células vegetais, que torna difícil o acesso das celulases às fibras de celulose, dificultando sua ação (RUEGGER; TAUK-TORNISIELO, 2004). Na natureza vários microrganismos celulolíticos produzem enzimas que funcionam sinergicamente, como os celulossomas, produzidos por bactérias anaeróbias, ou agem isoladamente, como a maioria das celulases fúngicas e bacterianas (HIMMEL et al., 2007).
As celulases são utilizadas em várias indústrias, incluindo as de alimentos, cerveja, vinhos, agrícola, têxtil, de detergentes, de nutrição animal, de papel, bem como em pesquisa e desenvolvimento. A demanda por enzimas mais estáveis em muitas aplicações industriais vem aumentando rapidamente. Um exemplo se aplica ao processo de compostagem de resíduos agrícolas, onde os microrganismos termófilos e mesófilos decompõem a lignina e a celulose. Celulases termoestáveis produzidas por microrganismos termofílicos são utilizadas em indústrias de detergentes, couro e papel, bem como outros processos que demandam altas temperaturas (JANG; CHEN, 2003; LIMA et al., 2005). Destacam-se as pesquisas com a utilização dessas enzimas na produção de biocombustíveis de 2ª geração a partir de resíduos lignocelulolíticos, advindos de fontes renováveis de biomassa, como por exemplo, o bagaço de cana, sendo uma fonte alternativa para a produção de combustíveis (ARANTES; SADDLER, 2010; FLORÊNCIO, 2011).
3 METODOLOGIA
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Microbiologia do Solo da Embrapa Milho e Sorgo, em Sete Lagoas, MG, Brasil.
3.1 Coleta de amostras para isolamento de microrganismos
Amostras de composto orgânico foram coletadas na cidade de Capim Branco, MG, em áreas de produção de hortaliças monitoradas pela EMATER-MG. Foram escolhidas três leiras de compostagem: composto 1 (C1), leira no 33º dia de compostagem, preparada com capim colonião picado, cama de frango, esterco bovino, fosfato de Araxá, fosfato Natural, pó de rocha (verdete), adicionado de inoculante microbiano (IM) constituído de uma mistura de dois isolados de bactérias, Bacillus sp (B116) , previamente selecionado como eficientes na solubilização de fósforo (P) e de potássio (K) e Bulrlkoderia sp (B30K) (OLIVEIRA et
al., 2013; SILVA et al., 2015); composto 2 (C2), leira no 60º dia de compostagem,
preparada com capim colonião, cama de frango, esterco bovino, esterco caprino, Yoorin (termofosfato) e pó de carvão (fonte de K) e composto 3 (C3), estabilizado, com mais de 12 meses, preparado com resto de hortaliças, esterco bovino e capim cameron picado. As amostras foram coletadas em sacos plásticos devidamente identificados, em porções de no mínimo 500g, em triplicata, em 3 regiões diferentes da leira, no ápice, meio e base. No momento da coleta foi registrada a temperatura de cada amostra. Logo após a coleta as amostras foram colocadas em caixa de isopor e levadas para o laboratório.
3.2 Contagem, isolamento e caracterização morfológica dos microrganismos
Para obtenção de morfotipos termorresistentes, as amostras foram homogeneizadas e diluídas em solução salina (NaCl a 0,85%) e as diluições 10-1
foram submetidas a 80 ºC por 30* minutos, sob agitação de 120 rotações por minuto (OLIVEIRA et al., 2009 modificado*). Em seguida, foram feitas diluições seriadas e alíquotas de 0,1 ml foram transferidas para os seguintes meios sólidos, pela técnica de semeadura em superfície: meio sólido ágar batata dextrose pH 7,0 acrescido de 5ml/L de solução de cicloheximida (cicloheximida: 0,3g dissolvidos em 30mL de água
destilada e após o volume completado para 50 mL, esterilizada por filtração em membrana milipore – POP PS MBS – RV 00 – Emissão: 03/12/2013 – Embrapa Milho e Sorgo) para enumeração de bactérias (diluições 10-4 e 10-6, em duplicata), meio
Martin adicionado de 1ml/L de solução de estreptomicina (0,825g de sulfato de estreptomicina dissolvidos em 20 ml de água destilada, e após seu volume completado para 25 ml, esterilizado por filtração em membrana milipore - POP PS MBS – RV 00 – Emissão: 03/12/2013 – Embrapa Milho e Sorgo) para fungos (diluições 10-2 e 10-4 , em duplicata) meio específico de actinomicetos (L-Asparagina: 1 g/L;
Glicerol: 10 g/l; KH2PO4: 1 g/L; solução micronutrientes ( FeSO4.7H2O, MnCl2.4H2O e
ZnSO4.7H2O, cada um na concentração de 100g/100mL): 1ml/L e Agar Bacteriológico:
15g/L. Adicionou-se ao meio de actinomicetos 5ml/L de solução de cocloheximida. Para a contagem de actinomicetos foram plaqueadas as diluições 10-4 e 10-6, em
duplicata. As placas foram incubadas a 46-48 ºC até o crescimento dos microrganismos (POP – Análise Qualitativa e Quantitativa da População Microbiana do Solo – Embrapa Milho e Sorgo, 2012). Após o período de incubação, o número de colônias foi contado e estimou-se o número de bactérias, fungos e actinomicetos presente em cada amostra, considerando-se as devidas diluições, e o resultado, apresentado em log de unidades formadoras de colônia (ufc) por grama de composto (ufc.g-1 composto). Posteriormente as colônias de bactérias foram caracterizadas
morfologicamente, segundo o Manual de Gestão da Coleção de Microrganismos Multifuncionais e Fitopatogênicos – CMMF – da Embrapa Milho e Sorgo (PAIVA, et
al., 2013). As colônias de bactérias, fungos e actinomicetos foram agrupadas de
acordo com a semelhança da morfologia macroscópica observadas em estereomicroscópio LEICA, mod. EZ-4. Das colônias morfologicamente semelhantes, apenas uma foi transferida para Ágar Tripticaseína Soja (TSA) e incubada a 46-48 ºC pelo tempo necessário para crescimento (Figura 1).
As colônias selecionadas de bactérias, fungos e actinomicetos foram transferidas para Ágar Nutriente, e após crescidas a 46-48 ºC, conservadas em óleo mineral (ROMEIRO, 2006).
Figura 1 - Contagem e isolamento de microrganismos.
Fonte: A autora.
3.3 Avaliação da resistência a temperaturas superiores a 50 ºC
As colônias de bactérias, fungos e actinomicetos isoladas na etapa anterior foram suspensas em solução salina estéril a 0,85%. Realizou-se a contagem de bactérias em cada suspensão (contagem no tempo zero de incubação) nas diluições 10-3 e 10-5, em triplicata, em TSA. Posteriormente 0,1 ml de cada suspensão de
bactérias, fungos e actinomicetos foi inoculado em TSB (Caldo Tripticaseína Soja), em duas repetições, para incubação a 60 ºC e a 100-110 ºC por 2h e 4h. A contagem de bactérias de cada repetição após incubação a 60 ºC por 2h e 4h foi feita, em duplicata, nas diluições 10-2 e 10-3, e na diluição 10-1, após incubação a 100-110 ºC
por 2h e 4h. Para fungos e actinomicetos foi observado somente a presença ou ausência de crescimento, inoculando-se 0,1 ml de cada uma das duas repetições do TSB (após incubação por 2h e 4h a 60 ºC e a 100-110 ºC) em TSA, em triplicata (Figura 2).
Figura 2. Avaliação da resistência a temperaturas superiores a 50 ºC.
Fonte: A autora.
3.4 Avaliação da produção enzimática
Os microrganismos que apresentaram melhor resistência à incubação a 60 ºC e a 100-110 ºC por 2h e 4h foram inoculados em triplicata, em meios sólidos específicos para a produção de cada enzima e avaliação do potencial de produção pela formação do halo ao redos das colônias. As placas inoculadas foram incubadas a 46-48ºC por 7 dias para a produção de amilase e fitase e por 10 dias para a produção de celulase (Figura 3). Após incubação, foram medidos, em centímetros, os diâmetros das colônias e dos halos evidenciados, e o Índice Enzimático (IE), expresso pela relação entre o diâmetro médio da colônia e o diâmetro médio do halo, foi estimado. Assim, os microrganismos que apresentaram maior índice apresentaram a maior atividade enzimática (OLIVEIRA et al., 2006).
Figura 3. Avaliação da produção enzimática.
Fonte: A autora.
3.4.1 Amilase
Para teste de produção de amilase foi utilizado o Ágar Amido (protocolo Embrapa Milho e Sorgo: NaCl: 0,5g/L; extrato de carne: 3,0g/L; peptona bacteriológica: 5,0g/L; amido solúvel: 1,0g/L; ágar bacteriológico: 15,0g/L e pH 7,0). Os microrganismos foram inoculados com alça de platina em triplicata e incubados a 46 ºC – 48 ºC por 7 dias. Após incubação, as placas foram cobertas com solução de lugol (I2: 5,0g; KI: 10g, completando o volume para 100 ml e no momento do uso, diluindo esta solução 1:10) e os halos claros em torno das colônias foram revelados na cor roxa, indicando secreção de amilase. Após a medição (cm) do diâmetro das colônias e dos halos, o IE foi calculado.
3.4.2 Fitase
A produção de fitase foi evidenciada no meio Fitato (Pikovskaya, 1948 modificado por Oliveira* et al, 2009), composto de (NH4)2SO4: 0,5g/L; NaCl: 0,2g/L; KCl: 0,2g/L; MgSO4.7H2O: 0,1g/L; MnSO4: 0,001g/L; *CaCl2.2H2O: 2,94g/L; MgCl2.6H2O: 1,9g/L; Na-IHP (Fitato de Sódio): 5g; Glicose: 10g/L; Ágar Bacteriológico: 15g/L. Os microrganismos foram inoculados com alça de platina, em triplicata, e as placas foram incubadas por 7 dias a 46 ºC- 46 ºC. Após a incubação, o diâmetro das colônias e dos halos transparentes foram medidos (cm) e o IE foi calculado.
3.4.3 Celulase
Para testar a produção de celulase os microrganismos foram inoculados com alça de platina em meio sólido suplementado com carboximetilcelulose (CMC) como única fonte de carbono (NaNO3 3,0 g/L; K2HPO4 1,0 g/L; MgSO4 0,5 g/L; KCl 0,5
g/L; FeSO4.7H2O 10,0 g/L; CMC 10,0 g/L; Ágar 20,0 g/L) (SILVA et al., 2015). As
placas foram incubadas por 10 dias a 46 ºC – 48 ºC. Após a incubação, as placas foram cobertas com solução de vermelho congo (vermelho congo: 1,4g/L em tampão tampão tris-HCl 0,1M, pH 8,0) por 15 minutos. Posteriormente, o excesso da solução foi drenado e as placas foram cobertas com solução de NaCl (1M) por 30 minutos (protocolo Embrapa Milho e Sorgo; SILVA et al., 2015). Em seguida a solução de NaCl foi drenada, os diâmetros das colônias e dos halos revelados na cor amarela foram medidos (cm) e o IE, calculado.
3.5 Análise Estatística
Os dados obtidos foram submetidos à análise de variância com três repetições e, quando necessário, as médias foram comparadas pelo teste de Skott-Knott a 5% de probabilidade (p<0,05). A análise estatística foi realizada com auxílio do programa SISVAR (FERREIRA, 2008). As análises estatísticas dos índices enzimáticos foram realizadas de acordo com um delineamento experimental inteiramente casualizado.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Temperatura das amostras C1, C2 e C3 e fases do processo de compostagem
No instante da coleta, a leira de compostagem C1, no 33º dia, apresentou temperatura média de 51,9 ºC (Figuras 4 e 5); a leira C2, no 60º dia, apresentou temperatura média de 63,13 ºC, (Figuras 6 e 7) e o composto estabilizado C3, com mais de 12 meses, apresentou uma média de temperatura de 25,7 ºC (Figura 8).
Figura 4. Composto 1- C1, (33º dia, 51,7 ºC).
Fonte: Fotos da autora.
Figura 5. Medição da temperatura do Composto 1 (C1).
Figura 6. Composto 2 - C2 (60º dia, 63,13 ºC).
Fonte: Fotos da autora.
Figura 7. Medição da temperatura do Composto 2 (C2).
Figura 8. Composto 3 estabilizado - C3 (25,7 ºC, com mais de 12 meses).
Fonte: Fotos da autora.
Figura 9. Medição da temperatura do Composto 3 estabilizado (C3).
Fonte: Fotos da autora.
De acordo com Heck et al. (2013), a temperatura é um dos fatores mais limitantes para a evolução do processo de compostagem. Os resultados obtidos pelo autor revelaram, em uma leira de compostagem de resíduos sólidos, temperatura média de 37,0 ºC no início do processo, alcançando 67,0 ºC durante a fase termofílica e retornando a 37,0 ºC no final do processo. De acordo com Oliveira et al (2004), a energia produzida pelos microrganismos durante o processo de compostagem promove um aumento da temperatura. Quando a temperatura ultrapassa os 40 ºC, os microrganismos termofílicos, responsáveis pela decomposição acelerada da matéria
orgânica, começam a predominar. Acima dos 65 ºC ocorre a eliminação da maioria dos microrganismos, predominando aqueles termoresistentes, ou termofílicos.
Segundo Souza; Filho (2015), a primeira fase do processo de compostagem, mesofílica, dura de 3 a 4 dias e a temperatura fica entre 30 ºC e 40 ºC; a segunda fase, termófila, é a mais longa, dura em torno de 60 dias e a temperatura fica entre 60 ºC e 70 ºC; na fase de resfriamento (terceira fase), a maior parte do material já foi degradada, a quantidade de microrganismos diminui e a temperatura começa a cair; na última fase, a de maturação, começa a transformação do composto em húmus (humificação), e a temperatura é a ambiente. As temperaturas registradas nas amostras C1, C2 e C3, nas respectivas fases do processo de compostagem (C1, 33ºdia, 51,7 ºC; C2, 60º dia, 63,13 ºC e C3, acima de 12 meses, 25,7 ºC), condizem com as informações fornecidas pelos autores.
A leira de compostagem C1 foi adicionada de bioinoculante, e de acordo com os resultados apresentados por Filho (2013), o uso de microrganismos eficientes como bioinoculantes contribui para acelerar o processo de compostagem.
4.2 Contagem de bactérias, fungos e actinomicetos termotolerantes
Os Coeficientes de Variação (CV) apresentados nas contagens de microrganismos em C1, C2 e C3 foram de 5% para a contagem de bactérias, 10,19% para fungos e 2,79% para a contagem de actinomicetos em C1; 2,6% para a contagem de bactérias, 12,01 para a contagem de fungos e 6,30% para a contagem de actinomicetos em C2, e 10,83% para a contagem de bactérias em C3. De acordo com FERREIRA (1991), os valores de CV entre 10 e 15% apresentam um baixo CV e uma ótima precisão.
A contagem de microrganismos resistentes ao choque de 80 ºC/30 minutos em C1, no 33º dia, evidenciou maior população de bactérias, com uma média geral de 4,0 x 107 ufc/g, seguida por uma contagem de actinomicetos de 2,0 x 107ufc/g. A
população de fungos foi menor, totalizando 1,1 x 103 ufc/g (Figura 10). Resultados
semelhantes ao de C1 foram apresentados por Hassen et al (2001), que evidenciaram contagem de bactérias em compostagem de resíduos sólidos na faixa de 1,8 x 107
ufc/g na nona semana de compostagem (por volta do 36º dia).
A leira de compostagem C2, no 60º dia, a 63,13 ºC, apresentou uma população de bactérias termorresistentes de 5,8 x 106 ufc/g, superando a população
de actinomicetos, que totalizou 1,8 x 106 ufc/g. A menor população encontrada foi a
de fungos, que apresentou 1,7 x 105 ufc/g (Figura 11). Heck et al (2013), obtiveram
2,6 x 106 ufc/g de bactérias em processo de compostagem a 63,3 ºC. Silva (2010),
obteve uma contagem de actinomicetos de 2,24 x 107 UFC/g em compostagem a 60,5
ºC. A densidade de fungos encontrada em C2 (1,7 x 105 ufc/g) foi superior à contagem
obtida nos experimentos de Souza (2010), que encontrou populações de fungos da ordem de 104 em compostagem preparada com bagaço de cana e capim coast-cross
suplementada com farelo de trigo, calcário, gesso agrícola e uréia, na fase em que a temperatura variava entre 60 ºC e 76 ºC. Segundo o autor, a ocorrência de baixas populações pode ser explicada pelas altas temperaturas desta fase.
Maior sensibilidade ao choque térmico de 80 ºC foi observada na população de microrganismos de C3, que apresentou 1,0 x 105 ufc/g de bactérias e ausência de
fungos e actinomicetos (Figura 12).
De um modo geral, C1, C2 e C3 apresentaram maior população de bactérias, seguido de actinomicetos, e menor população de fungos (Figura 13). Tais resultados estão de acordo com a afirmação de Epstein (2011), que as bactérias são os principais e mais numerosos microrganismos decompositores, degradando prontamente os compostos carbonados disponíveis. Resultados semelhantes foram encontrados por Aragão et al. (2000), que constatou em seus experimentos com compostagem de resíduos sólidos, baixa ocorrência de fungos e elevada ocorrência de bactérias e actinomicetos. Em seu experimento, o autor constatou ausência de fungos em uma leira cuja temperatura estava estabilizada, em torno de 30 ºC.
Figura 10 - População de bactérias, fungos e actinomicetos termorresistentes no Composto 1 - C1 (60º dia, 63,13 ºC).
Fonte: Dados da pesquisa.
Figura 11. População de bactérias, fungos e actinomicetos termorresistentes no Composto 2 - C2 (33º dia, 51,7 ºC).
Fonte: Dados da pesquisa.
Bactérias Fungos Actinomicetos
N º d e mi cro rg an is mo s (u fc /g d e co mp o sto) 4,0 X 107 1,1 X 103 2,0 X 107
Bactérias Fungos Actinomicetos
N º d e micro rg an is mo s ( u fc /g d e co mp o sto ) 5,8 X 106 1,7 X 105 1,8 X 106
Figura 12. População de bactérias, fungos e actinomicetos termorresistentes no Composto 3 estabilizado - C3 (mais de 12 meses, 25,7 ºC).
Fonte: Dados da pesquisa.
Fig 13. Contagem em placa de bactérias (B), fungos (F) e actinomicetos (A) termorresistentes.
Fonte: Fotos da autora.
4.3 Isolamento e Caracterização Morfológica dos microrganismos termotolerantes
Nas amostras C1, C2 e C3, foi pré-selecionado um total de 85 morfotipos diferentes de bactérias, sete de fungos e 20 de actinomicetos.
Maior diversidade de bactérias foi observado em C1 (37 morfotipos), seguido de C2 (30), ficando C3 com a menor diversidade (18). C2 apresentou cinco morfotipos diferentes de fungos e C1, dois morfotipos. Não foram isolados fungos e actinomicetos de C3. Dos 20 morfotipos diferentes de actinomicetos, 18 foram isolados de C2, e dois
Bactérias Fungos Actinomicetos
N º d e micro rg an is mo s ( u fc /g d e co mp o sto ) 1,0 x 105 0,0 0,0 B F A
de C1 (Figuras 14 e 15). Oliveira (2003) obteve 30 isolados de actinomicetos de compostagem de resíduos sólidos na fase termofílica com 90 dias de compostagem, 30 com 180 dias e nenhum isolado na fase termofílica com 30 dias de compostagem.
Figura 14. Número de morfotipos de bactérias, fungos e actinomicetos termorresistentes isolados no Composto 1 - C1 (33º dia, 51,7 ºC), Composto 2 - C2
(60º dia, 63,13 ºC) e Composto 3 estabilizado - C3 (mais de 12 meses, 25,7 ºC).
Fonte: Dados da pesquisa. 0 5 10 15 20 25 30 35 40 C1 C2 C3 Nº m or fot ip os bactérias fungos actinomicetos
Figura 15. Morfotipos de bactérias termorresistentes isolados do Composto 1 - C1 (33º dia, 51,7 ºC), Composto 2 - C2 (60º dia, 63,13 ºC) e Composto 3 estabilizado -
C3(mais de 12 meses, 25,7 ºC), observados em estereomicroscópio (400X).
Fonte: Fotos da autora.
4.4 Avaliação da resistência a temperaturas superiores a 50 ºC
Dos 85 morfotipos bacterianos isolados e testados para o estresse térmico, 75 sobreviveram à incubação a 60 ºC por duas horas, e desses, 72 sobreviveram a 60 ºC por quatro horas. Desses últimos, 28 foram resistentes a 100 ºC por duas horas e três sobreviveram à incubação a 100 ºC por quatro horas. Dos sete morfotipos de fungos isolados, três sobreviveram à incubação por duas horas a 60 ºC e desses, dois resistiram a 60 ºC por quatro horas. Nenhum fungo foi resistente à incubação por 100 ºC. Dos 20 actinomicetos isolados, oito foram resistentes à incubação por 60 ºC por duas horas e quatro horas, e nenhum sobreviveu aos 100 ºC (Figura 16) .
