Universidade do Vale do Paraíba Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
JULIANA LOUZADA MEDEIROS
ANÁLISE HISTOLÓGICA COMPARATIVA DA REPARAÇÃO TECIDUAL EM DORSO DE RATOS APÓS INCISÃO COM LASER DE DIODO (?970 nm) OU LASER CO2 (?10600 nm), ASSOCIADO OU NÃO À FOTOBIOMODULAÇÃO LASER
(?655 nm) OU LUZ POLARIZADA (?400-2000 nm)
São José dos Campos 2008
Juliana Louzada Medeiros
“ANÁLISE HISTOLÓGICA COMPARATIVA DA REPARAÇÃO TECIDUAL EM DORSO DE RATOS APÓS INCISÃO COM LASER DE DIODO (?970 nm) OU LASER CO2 (?10600 nm), ASSOCIADO OU NÃO À FOTOBIOMODULAÇÃO LASER
(?655 nm) OU LUZ POLARIZADA (?400-2000 nm)”
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-graduação em Engenharia Biomédica, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica.
São José dos Campos, SP 2008
Orientadores: Prof. Dr. Antônio Luiz Barbosa Pinheiro e Profª. Drª. Renata Amadei Nicolau
ratos após incisão cori laser de diodo
associado ou não à fotobiomodulação laser (1655 rrm) ou luz pclarizada (1400-2000 nm)i Juliana Louzada Medeiros;
Orientadores Profs.Drs. Antonio Luiz Barbosa Pinheiro; Renata Amadei Nicolau. São José dos CamPos, 2008'
1 Disco laser: Color
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Engenhária Biomédica do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba, 2008.
1. Cicatrização de feridas 2. Laseres 3. Fototerapia l. Pinheiro, Antonio Luiã Barbosa Orient ll. Nicolau, Renata Amadei, Üo-orlenX' lll' Título
C D U : 6 1 6 - 0 0 3 . 9
Autorizo
exclusivamente
para
Íins acadêmicos
e científicos,
a ÍeproduçãCI
total ou
parcial
desta
dissertação,
por processo
fotocopiadores
oLI
transrnissão
eletrônica,
desde
que citada
a fonte.
Assinatura
da aluna: Ã"^*"'
*'*-üO'ANÁIISE HISTOIÓCICA COMPARATIVA DA REPARAçÃO TTCTï}UAI ' EM DORSO DE RATOS ApÓS rNCISÃO COM LASBR DE DIODO (1970 nm) ou LASER COz (110600 nm)' ASsocrADo ou NÃo A FoToBIoMoDULAçÃo LASER (1655 nm) a\J LÍJT' p6LARIZADA
(1400-2000 nm)"
Dissertação aprovada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Engenharia Biomédica, do Programa de Pós-Graduação em Engenharia Biomédica, do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da universidade do vale do Pataiba,São José dos campos, SP' pela seguinte banca examinadora:
Profl. Dra. RENATA AMADEI NICOLAU GrNIV
Prof. Dr. ANTONIO LAIZBARBOSA PINHEIRO (UNIV Prof. Dra. ESTER MARIA DANIELLI NICOLA GrNIC
Prof. Dr. Marcos Tadeu Tavares Pacheco Diretor do IP&D - UniVaP
Dedico este trabalho ao meu marido Johnny por estar sempre ao meu lado, principalmente, nos momentos mais difíceis e a minha mãe Sueli, por compreender tantas ausências e me incentivar a sempre seguir em frente.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por tantos ensinamentos ao longo de todo este período e por me dar a força necessária para superar cada dificuldade.
Agradeço ao Prof. Dr. Antônio Luiz Barbosa Pinheiro, pela forma brilhante com que soube conduzir todo este estudo, sempre me incentivando e me apoiando nos momentos adequados. Sinto-me honrada em tê -lo tido como orientador.
A Profª Drª Renata Amadei Nicolau por todas as oportunidades de crescimento pessoal e profissional e toda estrutura laboratorial que me foi oferecida.
A Profª Drª Cibelle Barbosa Lopes, da Universidade do Vale do Paraíba, que gentilmente disponibilizou o laser de diodo para a fototerapia experimental.
Ao Dr. Edmyr Rosa dos Reis do núcleo de medicina e cirurgia experimental da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP, pelo apoio e colaboração na cirurgia experimental com o laser de CO2.
Agradeço ao biólogo Rogrigo Ferreira de Oliveira, bolsista de apoio técnico II (FAPESB) do Hospital Universitário Prof. Edgard Santos da Universidade Federal da Bahia pelo excelente trabalho realizado na reação imunohistoquímica.
Ao Prof. Dr. Jean Nunes dos Santos da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal da Bahia, por toda ajuda e orientação durante a fase de análise histológica.
A Profª Adna Conceição Barros, da disciplina de patologia da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal da Bahia, por toda colaboração nas fotomicrografias.
Agradeço a Profª Drª Ester Maria Danielli Nicola da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP, pela extrema colaboração.
Agradeço a Capes-prosup pelo suporte financeiro.
Agradeço também a todos os colegas da Universidade do Vale do Paraíba que se dispuseram a ajudar durante todo o período experimental.
ANÁLISE HISTOLÓGICA COMPARATIVA DA REPARAÇÃO TECIDUAL EM DORSO DE RATOS APÓS INCISÃO COM LASER DE DIODO (?970 nm) OU LASER CO2 (?10600 nm), ASSOCIADO OU NÃO À FOTOBIOMODULAÇÃO LASER
(?655 nm) OU LUZ POLARIZADA (?400-2000 nm)
RESUMO
O processo de reparo tecidual de uma ferida cutânea realizada com laser cirúrgico, é mais complexo que em incisões com bisturi convencional, devido à área de necrose térmica formada mediante o emprego de laser. O presente estudo tem por objetivo analisar o efeito de duas fototerapias, laser e luz polarizada em incisões cutâneas feitas com laser de CO2 (?10600 nm) ou com laser de diodo (?970 nm) em dorso de
ratos. O experimento utilizou 62 animais divididos em seis grupos. Todos os animais receberam incisão em pele de dorso, com medidas aproximadas de 20 mm X 2 mm de profundidade. Três grupos tiveram a incisão realizada com laser de CO2 (GI, GII,
GIII) e três grupos com o laser de diodo (GIV, GV, GVI). Os grupos GI e GIV foram mantidos como controle e não receberam tratamento adicional por fototerapia. Os grupos GII e GV receberam fotobiomodulação laser (λ655nm, 30 mW, φ ~ 3 mm, 12 J/cm2). Os grupos GIII e GVI receberam tratamento com luz polarizada (λ400-2000 nm, 40 mW, φ ~ 5,5 cm, 12 J/cm2). Os animais foram sacrificados imediatamente, sete e 14 dias após a cirurgia. As amostras foram rotineiramente processadas e coradas com H&E, Picrosirius e reação imunohistoquímica com Monoclonal Anti-Actin, a-Smooth Muscle. Os resultados deste estudo demonstraram um maior atraso de regeneração epitelial das incisões realizadas com laser de diodo, sem associação à fototerapia, quando comparadas às incisões realizadas com laser de CO2, com
número significativamente menor de miofibroblastos, principalmente no processo inicial de reparação. As incisões com laser de CO2 responderam melhor à
iluminação de luz polarizada, com uma reepitelização mais avançada aos sete dias de cirurgia. As incisões com laser de diodo responderam melhor à iluminação de luz polarizada, com incrementos significativos na quantidade de fibras colágenas, número de miofibroblastos e um processo de reepitelização mais avançado aos 14 dias de cirurgia.
Palavras chave: reparação tecidual, diodo (?970 nm), CO2 (?10600 nm), fotobiomodulação laser
COMPARATIVE HISTOLOGICAL ANALYSIS OF TISSUE REPAIR IN DORSUM RATS AFTER INCISION WITH DIODE LASER (?970 nm ) OR CO2 LASER (?10600
nm), ASSOCIATED OR NOT LASER PHOTOBIOMODULATION (?655 nm) OR POLARIZED LIGHT(?400-2000 nm)
ABSTRACT
The tissue repair process of the laser wounds is more complex than incisions with conventional scalpel due to the thermal damage that follows irradiation of living tissues. The aim of this study is to analyze the effect of two phototherapy, laser and polarized light on CO2 laser (?10600 nm) or diode laser (?970 nm) wound. The
experiment used sixt y-two Wistar rats divided in six groups, with incision of 20 mm x 2 mm created on the dorsum. Three groups had the incision treated with CO2 laser
(GI, GII, GIII) and three groups with the diode laser (GIV, GV, GVI). The groups GI and GIV were maintained as control group. The groups GII and GV received additional treatment of diode laser (λ655 nm, 30mW, φ ~ 3mm, 12 J/cm2) and groups GIII and GVI were illuminated with polarized light (λ400 – 2000 nm, 40 mW, φ ~ 5.5cm, 12 J/cm2). The animals were sacrificed 0, 7 and 14 days after the surgery. The specimens were taken and routinely processed and stained with Hematoxylin and Eosin, Sirius Red, and alpha -Smooth Muscle Actin (aSMA). The results of this study demonstrated a delay in epithelial regeneration of incisions with diode laser, without association to phototherapy, when compared to incisions with CO2 laser. The
number of miofibroblasts present in diode laser wound was smaller than CO2 laser
wound. The illumination of polarized light in the CO2 laser wound showed a better
result at 7 days after surgery with a quicken reepitheliazation. The illumination of polarized light in the diode laser wound showed a better result at 14 days after surgery with significant increment in the quantity of collagen fibers, miofibroblastic proliferation and quicken reepitheliazation process.
Keywords: tissue repair, diode (?970 nm), CO2 (?10600 nm), laser photobiomodulation (?655 nm),
Índice de figuras e quadros
Quadro 1: Grupos e subgrupos experimentais (LOUZADA, 2008)... 28
Quadro 2: Critério utilizado para análise histológica por microscopia óptica... 33
Quadro 3: Sumário das análises semi qualitativa e semi quantitativa. (LOUZADA, 2008)... 52
Figura 1: Procedimento cirúrgico com laser de CO2 (LOUZADA, 2008) ... 30
Figura 2: Procedimento cirúrgico com laser de diodo (LOUZADA, 2008)... 30
Figura 3: Fotobiomodulação laser (LOUZADA, 2008)... 30
Figura 4: Iluminação com luz polarizada (LOUZADA, 2008) ... 30
Figura 5: Fotografia realizada imediatamente após a cirurgia com laser de CO2 (LOUZADA, 2008) .. 35
Figura 6: Aspecto da ferida aos sete dias PO após incisão com laser de CO2, sem tratamento adicional (LOUZADA, 2008) ... 35
Figura 7: Aspecto da ferida aos sete dias PO após incisão com laser de CO2, com FBML (LOUZADA, 2008) ... 35
Figura 8: Aspecto da ferida aos sete dias PO após incisão com laser de CO2 e tratamento com luz polarizada (LOUZADA, 2008) ... 35
Figura 9: Fotografia realizada imediatamente após cirurgia com laser de diodo (LOUZADA, 2008)... 35
Figura 10: Aspecto da ferida aos sete dias PO após incisão com laser de diodo, sem tratamento adicional (LOUZADA, 2008) ... 35
Figura 11: Aspecto da ferida aos sete dias PO após incisão com laser de diodo, com FBML (LOUZADA, 2008) ... 35
Figura 12: Aspecto da ferida aos sete dias PO após incisão com laser de diodo e tratamento com luz polarizada (LOUZADA, 2008) ... 35
Figura 13: Aspecto da ferida aos 14 dias pós-incisão com laser de CO2, sem tratamento adicional (LOUZADA, 2008) ... 36
Figura 14: Aspecto da ferida realizada com laser de CO2 aos 14 dias PO, com FBML (LOUZADA, 2008) ... 36
Figura 15: Aspecto da ferida realizada com laser de CO2 aos 14 dias PO, tratada com luz polarizada (LOUZADA, 2008) ... 36
Figura 16: Aspecto da ferida aos 14 dias pós-incisão com laser de diodo, sem tratamento adicional (LOUZADA, 2008) ... 36
Figura 17: Aspecto da ferida realizada com laser de diodo aos 14 dias PO, com FBML (LOUZADA, 2008) ... 36
Figura 18: Aspecto da ferida realizada com laser de diodo aos 14 dias PO, tratada com luz polarizada (LOUZADA, 2008) ... 36
Figura 19: Fotomicrografia do grupo GI (0 dia) mostrou total inviabilidade celular na região, com área de necrose estendendo-se da supefície epitelial até a derme (Hematoxilina Eosina; magnificação de 100X). (LOUZADA, 2008) ... 38
Figura 20: Fotomicrografia do grupo GI (7 dias) mostrando tecido de granulação e ausência de reepitelização (Hematoxilina- eosina; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008) ... 38
Figura 21: Fotomicrografia do grupo GI (7 dias). A imunomarcação por a-SMA mostrou uma presença moderada de miofibroblastos (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008) ... 39
Figura 22: Fotomicrografia do grupo GIII (7 dias) mostrou pavimentação epitelial completa (Hematoxilina- eosina; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008) ... 41
Figura 23: Fotomicrografia do grupo GIII (7 dias). A imunomarcação por a-SMA mostrou miofibroblastos apresentando-se de maneira moderada (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008) ... 41
Figura 24: Fotomicrografia do grupo GIII (14 dias). A imunomarcação por a-SMA mostrou miofibroblastos apresentando-se de forma marcante (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008) ... 42
Figura 25: Fotomicrografia do grupo GIV (0 dia) mostrou total inviabilidade celular na região, com área de necrose estendendo-se da superfície epitelial até a hipoderme (Hematoxilina Eosina; magnificação de 40X). (LOUZADA, 2008) ... 43
Figura 26: Fotomicrografia do grupo GIV (7 dias). A imunomarcação por a-SMA mostrou uma
presença discreta de miofibroblastos (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 40 X).
(LOUZADA, 2008) ... 44
Figura 27: Fotomicrografia do grupo GIV (14 dias) mostrando início de migração epitelial e correspondeu a uma área menor que 50% da ferida em (Hematoxilina- eosina; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008) ... 44
Figura 28: Fotomicrografia do grupo GIV (14 dias) mostrou presença marcante de miofibroblastos (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008) ... 45
Figura 29: Fotomicrografia do grupo GV (7 dias) mostrou discreta presença de miofibroblastos (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008) ... 46
Figura 30: Fotomicrografia do grupo GV (14 dias) mostrou reepitelização recobrindo uma área maior que 50% da ferida (Hematoxilina- eosina; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008) ... 47
Figura 31: Fotomicrografia do grupo GV (14 dias) mostrou presença moderada de miofibroblastos (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008) ... 47
Figura 32: Fotomicrografia do grupo GVI (7 dias) mostrou moderada deposição de fibras colágenas (Picrosirius; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008) ... 49
Figura 33: Fotomicrografia do grupo GVI (7 dias) mostrou uma presença moderada de miofibroblastos (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 100 X ). (LOUZADA, 2008) ... 49
Figura 34: Fotomicrografia do grupo GVI (14 dias) mostrou características de reepitelização avançadas recobrindo 100% da ferida (Hematoxilina- eosina; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008) ... 50
Figura 35: Fotomicrografia do grupo GVI (14 dias) mostrou intensa deposição de fibras colágenas (Picrosirius; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008) ... 50
Figura 36: Fotomicrografia do grupo GVI (14 dias) mostrou miofibroblastos apresentando-se de forma marcante (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 40 X ). (LOUZADA, 2008) ... 51
Figura 37: Reepitelização das feridas aos sete dias PO (LOUZADA, 2008) ... 57
Figura 38: Reepitelização das feridas aos 14 dias PO (LOUZADA, 2008) ... 57
Figura 39: Infiltrado inflamatório aos sete dias PO (LOUZADA, 2008) ... 58
Figura 40: Infiltrado inflamatório aos 14 dias PO (LOUZADA, 2008)... 58
Figura 41: Presença de tecido de granulação aos sete dias PO (LOUZADA, 2008) ... 59
Figura 42: Presença de tecido de granulação aos 14 dias PO (LOUZADA, 2008) ... 59
Figura 43: Neovascularização aos sete dias PO (LOUZADA, 2008) ... 60
Figura 44: Neovascularização aos 14 dias PO (LOUZADA, 2008) ... 60
Figura 45: Presença de fibroblastos aos sete dias PO (LOUZADA, 2008) ... 61
Figura 46: Presença de fibroblastos aos 14 dias PO (LOUZADA, 2008) ... 61
Figura 47: Deposição de fibras colágenas aos sete dias PO (LOUZADA, 2008) ... 62
Figura 48: Deposição de fibras colágenas aos 14 dias PO (LOUZADA, 2008) ... 62
Figura 49: Presença de miofibroblastos aos sete dias PO (LOUZADA, 2008) ... 63
Lista de abreviaturas e siglas
µm Micrometro
CO2 Dióxido de Carbono
COBEA Colégio Brasileiro de Experimentação Animal
g Gramas He Hélio ml Mililitro mm Milímetros N2 Nitrogênio nm Nanometro PO Pós-operatório W Watts J Joule cm2 Centímetro quadrado cm Centímetro mW Milliwatt FBML Fotobiomodulação Laser
Lista de símbolos
λ Comprimento de onda (lambda)
® Marca registrada
~ Aproximadamente
φ Diâmetro
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 20 2 REVISÃO DE LITERATURA ... 21 2.1 Cicatrização de feridas ... 21 2.2 Fototerapia... 22 2.2.1 Cirúrgica... 22 2.2.1.1 Laser cirúrgico de CO2... 22 2.2.1.2 Diodo... 23 2.2.2 Não Cirúrgica... 23 3 OBJETIVOS ... 25 4 MÉTODOS... 26 4.1 Aspectos éticos ... 26 4.2 Animais... 26 4.3 Equipamentos ... 26
4.3.1 Equipamentos para realização da ferida cirúrgica... 27
4.3.2 Equipamentos para fototerapia... 27
4.4 Grupos Experimentais... 27
4.5 Procedimento Cirúrgico... 28
4.6 Fototerapia... 29
4.7 Morte Animal e obtenção das amostras... 30
4.8 Preparação das lâminas para análise histológica... 31
4.9 Critérios para análise histológica das amostras ... 31
5 RESULTADOS ... 34 5.1 Evolução macroscópica ... 34 5.2 Análise microscópica... 36 5.3 Análise estatística... 54 6 DISCUSSÃO ... 64 7 Conclusão ... 69
1 INTRODUÇÃO
É crescente a utilização de fontes de luz mono e policromáticas em especialidades médicas e odontológicas. Estudos da interação da energia eletromagnética com os tecidos vivos, operando tanto em altas quanto em baixas potências, vêm demonstrando resultados positivos e vantagens sobre métodos terapêuticos convencionais.1,2,3,4,5,6,7
Laseres operando em alta potência são descritos como instrumentos precisos em incisões cirúrgicas, principalmente na Dermatologia, Oftalmologia, Cirurgia Geral e Cirurgia Oral. Estudos descrevem diferentes tipos de laseres, como eficazes em procedimentos cirúrgicos, entre eles o laser de CO2 e o laser de diodo.1,2,8,9 As
desvantagens deste tipo de terapia são os efeitos térmicos causados pelas altas densidades de energia utilizadas, que podem interferir diretamente no processo de cicatrização. A fim de reduzir os efeitos negativos, a fotobiomodulação laser (FBML) pode ser associada às cirurgias realizadas com alta potência.
Laseres operando em baixas potências atuam como antiinflamatório, analgésico e tem ação biomoduladora. A ação este tipo de terapia se baseia na capacidade dos tecidos biológicos em absorver energia luminosa transformando-a em energia útil para células, com incrementos na produção de ATP e conseqüente aceleração de processos metabólicos.10,11,12,13,14 A FBML se apresenta como uma forma de tratamento sem efeitos colaterais e normalmente é bem tolerada pelos pacientes.
Atualmente, estudos divergem sobre o verdadeiro valor da coerência da luz em fototerapia, para se alcançar resultados benéficos na modulação de processos biológicos e autores relatam que fontes de luz não coerentes mono e policromáticas produzem efeitos similares ao da luz laser com efeitos positivos na biomodulação tecidual.15,16,17,5,18
O restrito número de trabalhos realizados sobre o emprego da fototerapia com fontes de luz coerente comparadas a não coerente em feridas cirúrgicas realizadas com laseres justificam novos estudos nesta área.
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Cicatrização de feridas
A cicatrização de feridas é um processo dinâmico que envolve diversas respostas teciduais e sua evolução passa por uma série de acontecimentos inter-relacionados e superpostos, que vão determinando gradualmente a substituição do tecido lesado por um tecido conjuntivo vascularizado, o tecido de granulação.19,1,3,20
A ferida é definida como a solução de continuidade anatômica ou funcional do tecido, seguida de dano e morte celular na região em decorrência de trauma mecânico, físico ou térmico;19 e dependendo do grau de destruição do tecido pode apresentar seu processo cicatricial por primeira ou segunda intenção.19,3;21,2,1 O processo primário se refere a feridas incisionais e acontecem de maneira mais favorável, devido ao limitado número de células lesadas e bordas coaptadas. Já os ferimentos que apresentam suas margens separadas e têm perda excessiva de tecido, como no caso da cicatrização por segunda intenção, apresentam um processo reparacional mais complexo, com uma quantidade maior de tecido de granulação.19
A cicatrização por segunda intenção baseia seu processo de reparação no fenômeno da contração da ferida, diminuindo a extensão dos tecidos conectivos envolvidos e os miofibroblastos, são as células apontadas como responsáveis por tal contração.22,23, 21 Miofibroblastos são células originadas de fibroblastos diferenciados que apresentam características de células musculares lisas.19
Como o processo reparacional de feridas é um mecanismo dinâmico que requer a participação de várias linhagens celulares e pode ser influenciado por uma série de fatores locais ou sistêmicos que podem acelerar ou retardar a cicatrização, o conhecimento dos possíveis efeitos dos métodos terapêuticos utilizados é de fundamental importância para o sucesso de seu tratamento. 5,24,25,26
2.2 Fototerapia
2.2.1 Cirúrgica
Laseres operando em alta potência tem alto poder de corte e a ablação acontece devido a absorção do comprimento de onda empregado pelos tecidos biológicos.26,25,9 A energia térmica absorvida é também responsável pela denaturação de proteínas tissulares em células circundantes promovendo a obliteração de vasos de calibre igual ou inferior a 0,5 mm com coagulação instantânea do sangue,26 fato que o torna um excelente instrumento para pacientes com distúrbios de coagulação e sangramento excessivo.3 Além disso, tem poder antibacteriano devido às altas temperaturas empregadas.27
As vantagens da utilização dos laseres operando em alta potência em relação aos métodos cirúrgicos convencionais são a fotocoagulação, diminuição do edema pós-operatório devido à pequena manipulação da área, precisão cirúrgica, facilidade de acesso ao campo operatório e diminuição do tempo cirúrgico.3,8,2,1 Porém, o uso de altas densidades de energia pode levar ao acúmulo de calor e conseqüente dano térmico as estruturas adjacentes à ferida interferindo diretamente no processo de cicatrização.28,29, 9,1
Como os efeitos dos lasers em tecidos moles variam de acordo com a potência e densidades de energia utilizadas é importante o conhecimento das características de cada tipo, visando minimizar a agressão tecidual e conseqüentes danos que poderiam levar a um retardo acentuado do processo de reparação.26,25,9,1
2.2.1.1 Laser cirúrgico de CO2
O laser de CO2 é uma mistura de gases de CO2, N2 e He cujo comprimento
Laseres de CO2 apresentam alta absorção pela água fato que restringe sua
absorção a camadas mais superficiais, com zonas de danos térmicas mais estreitas e controladas.30,31
Como todos os tecidos humanos possuem grande quantidade de água, o laser de CO2 tem sua energia bem absorvida por todos os tipos de tecido e
provocando mínima condução térmica para os tecidos adjacentes. Sua absorção é rápida e superficial, tornando-o um instrumento eficaz para cortes precisos. 30,1,9
2.2.1.2 Diodo
Os primeiros trabalhos com laseres de diodo operando em alta potência em tecidos moles surgiram na década de 90. A penetração de seus feixes é mais profunda que a penetração dos feixes de CO2, devido à transparência de seu
comprimento de onda pela água e alta absorção pela hemoglobina e melanina.32,1 O laser de diodo por sua propriedade de condução por fibra óptica, é utilizado em locais não acessíveis a outros tipos de laser como o de CO2. e possui excelente
capacidade de coagulação.3,26 Os comprimentos de onda de 810 nm e 980 nm são recomendados nas cirurgias de tecidos moles, periimplantar e pré-protética.9,28,8
2.2.2 Não Cirúrgica
A modulação de processos biológicos através da aplicação de luz, é vastamente descrita na literatura. Diversos comprimentos de ondas, tanto na faixa espectral visível como infravermelha vem sendo utilizados como método terapêutico para tratamento de patologias inflamatórias,33,7,34 redução de edemas, controle de quadros álgicos,6 prevenção de infecções27 e otimização do processo de reparação tecidual.35,33,5,20
A radiação de ondas eletromagnéticas em tecidos vivos, quando utilizada em doses adequadas,5,51,53 é caracterizada por sua capacidade de normalizar ou modular atividades celulares através de alterações físicas e/ou químicas no fotorreceptor molecular e componentes da cadeia respiratória, principalmente em
células que sofreram stress.36,10,12,11,13 Os efeitos deste tipo de terapia não causam danos celulares nos tecidos irradiados por não apresentarem características térmicas.37,38,12
Atualmente, diferentes fontes de luz mono e policromáticas estão sendo utilizadas como método terapêutico nas diversas especialidades médicas e odontológicas.
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Avaliar, histologicamente, o processo de reparo em feridas cirúrgicas realizadas com laser de CO2 (?10600 nm) ou com laser de diodo (?970 nm)
associado ou não ao uso da fotobiomodulação laser e da luz polarizada.
3.2 Objetivos Específicos
− Avaliar histologicamente o efeito da fotobiomodulação laser (?655 nm) e da fototerapia com luz polarizada (?400–2000 nm) em feridas cirúrgicas realizadas com laser de CO2 (?10600 nm);
− Avaliar histologicamente o efeito da fotobiomodulação laser (?655 nm) e da fototerapia com luz polarizada (?400-2000) em feridas cirúrgicas realizadas com laser de diodo (?970 nm).
4 MÉTODOS
4.1 Aspectos éticos
Este estudo seguiu os princípios éticos do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal – COBEA, sendo aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade do Vale do Paraíba (CEP–UNIVAP) sob protocolo Nº: A043/CEP/2007.
4.2 Animais
Utilizou-se neste estudo 62 ratos, albinos, machos, jovens, linhagem Wistar (~350 g, ~ 90 dias, Biotério da Anilab, Paulínia, São Paulo).
Os animais foram mantidos no Biotério do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da Universidade do Vale do Paraíba em gaiolas apropriadas de polietileno padrão, em grupos aleatórios de cinco animais por gaiola, com acesso a água e ração ad libitum. A sala foi mantida com temperatura constante (24°C) e com ciclo claro/escuro de 12 horas. Os animais permaneceram por um período de ambientação de 15 dias no biotério de passagem do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento (IP&D) da Universidade do Vale do Paraíba antes do inicio do experimento.
4.3 Equipamentos
Para realização do presente estudo foram utilizados dois laseres operando em alta potência, um laser operando em baixa potência e um equipamento de luz não coerente polarizada.
4.3.1 Equipamentos para realização da ferida cirúrgica
- Laser de CO2 (λ10600 nm, 8 W, φ ~ 0.3 mm, Union Medical®, modelo
UM-L30), procedente da Faculdade de Ciências Médicas da UNICAMP;
- Laser de diodo (λ970 nm, 4 W, com fibra óptica de 320 µm, Sirona®), procedente do Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento da UNIVAP.
4.3.2 Equipamentos para fototerapia
- Laser de diodo (λ655 nm, 30 mW, φ ~ 3 mm, Kondortech®, São Carlos, SP, Brasil), pertencente a Profª Drª Cibelle Barbosa Lopes;
- Luz polarizada policromática não coerente (λ400-2000 nm, 40 mW, φ ~ 5,5 cm, Bioptron®, Suíça), procedente da Faculdade de Odontologia da UFBA.
4.4 Grupos Experimentais
Os 62 animais foram aleatoriamente divididos em seis grupos (Quadro 1). Três grupos tiveram a pele do dorso incisionada com laser de CO2 (Grupos I, II e III)
e três grupos tiveram a pele do dorso incisionada com laser de diodo (Grupos IV,V e VI).
Dos grupos onde a incisão foi realizada com laser de CO2, o grupo I foi
considerado o grupo controle, ou seja, aquele que não recebeu nenhum tratamento adicional após a cirurgia. Este grupo foi subdividido em outros três: morte animal imediatamente após a cirurgia (n=5), morte aos sete dias após a cirurgia (n=3) e morte aos 14 dias após a cirurgia (n=3). O grupo II recebeu a FBML de 48 em 48 horas até o dia do sacrifício e foi subdividido em morte animal com sete dias do pós-operatório (n=5) e 14 dias do pós-pós-operatório (n=5). O grupo III recebeu iluminação
com luz polarizada diariamente até a morte animal e foi subdividido em morte animal com sete dias de pós-operatório (n=5) e 14 dias de pós-operatório (n=5).
Dos grupos incisionados com laser de diodo, o grupo IV foi o grupo controle, subdividido em outros três: morte animal imediatamente após a cirurgia (n=5), morte aos sete dias após a cirurgia (n=3) e morte aos 14 dias após a cirurgia (n=3). O grupo V foi fotoirradiado de 48 em 48 horas até o dia do sacrifício, subdividido em morte animal com sete (n=5) e 14 (n=5) dias do pós-operatório. O grupo VI foi iluminado diariamente até a morte animal, subdividido em morte animal com sete dias de pós-operatório (n=5) e 14 dias de pós-operatório (n=5).
Quadro 1: Grupos e subgrupos experimentais (LOUZADA, 2008) GRUPO SUBGRUPOS (dias de morte animal) N FERIDA CIRÚRGICA TRATAMENTO I 0, 7 e 14 11 Laser CO2 (λ=10600 nm) - II 7 e 14 10 Laser CO2 (λ=10600 nm) Laser (λ=655 nm) III 7 e 14 10 Laser CO2 (λ=10600 nm) Luz polarizada (λ=400 - 2000 nm) IV 0, 7 e 14 11 Laser de diodo (λ=970nm) - V 7 e 14 10 Laser de diodo (λ=970nm) Laser (λ=655 nm) VI 7 e 14 10 Laser de diodo (λ=970nm) Luz polarizada (λ=400 - 2000 nm) 4.5 Procedimento Cirúrgico
Foi realizada uma incisão em pele de dorso, com medidas aproximadas de 20 mm X 2 mm de profundidade, para ambos os laseres. Todos os animais receberam, por via subcutânea, um pré-tratamento com Atropina (1%, 20 ml, Fagra®, 0,04 ml/100 g), aguardando repouso de 15 minutos para o procedimento anestésico39. A droga anestésica foi administrada em associação por via intramuscular de Cloridrato de Cetamina (10%,10 ml, Syntec®, 0,1 ml/100 g) e Cloridrato de Xilazina (2%,10ml, Syntec®, 0,1 ml/100 g,40 com a utilização de seringa de insulina de 1ml para cada animal. Em seguida a região dorsal foi tricotomizada em uma área de 80 cm2. Para a realização das feridas cirúrgicas foram utilizados os laseres de CO2 (Fig.1) e de
diodo (Fig. 2). Após a cirurgia os animais foram submetidos à profilaxia antibiótica com o uso de Pentabiótico (Fort Dodge®, 0,02 ml/100 g). O procedimento experimental teve início no período da manhã e todos os animais receberam a mesma manipulação.
4.6 Fototerapia
Para o procedimento terapêutico, os animais foram posicionados decúbito dorsal e imobilizados manualmente. Os grupos submetidos à fototerapia com laser foram irradiados duas horas após a cirurgia e de 48 em 48 horas até o sacrifício. A irradiação foi realizada de maneira pontual em seis pontos ao redor da ferida com laser de diodo (λ655 nm, 30 mW, φ ~ 3 mm, Kondortech®, São Carlos, SP, Brasil, 2 J/cm2 por ponto, dose total de 12 J/cm2, Fig. 3). Os iluminados com luz polarizada receberam tratamento diário durante cinco minutos (λ400-2000 nm, 40 mW, φ ~ 5,5 cm, Bioptron®, Suíça, distância focal de 10 cm, dose total de 12 J/cm2, Fig. 4).
Figura 1: Procedimento cirúrgico com
laser de CO2 (LOUZADA, 2008)
Figura 2: Procedimento cirúrgico com
laser de diodo (LOUZADA, 2008)
Figura 3: Fotobiomodulação laser
(LOUZADA, 2008)
Figura 4: Iluminação com luz
polarizada (LOUZADA, 2008)
4.7 Morte Animal e obtenção das amostras
Para a morte animal foi utilizada o mesmo pré-tratamento e administração de drogas anestésica do dia do procedimento cirúrgico. Depois de anestesiados os
animais receberam por via intracardíaca a aplicação do anestésico Tiopental Sódico (0,05 ml/100 g, Cristália®) seguido de aplicação de cloreto de potássio (1ml). Uma área de 16 cm2 ao redor da ferida cirúrgica foi removida e fixada em solução de formol a 10% por 24 horas e posteriormente encaminhado para processamento histológico.
4.8 Preparação das lâminas para análise histológica
Os cortes histológicos correspondentes à região da ferida foram semi-seriados, no sentido transversal. As amostras foram rotineiramente processadas em parafina, cortadas em secções de 5 µm de espessura para coloração com Hematoxilina-eosina e Picrosirius e de 3 µm para a reação com a Alfa actina de músculo liso (Monoclonal Anti-Actin, a-Smooth Muscle, Sigma-Aldrich®).
Para reação de imunohistoquímica as lâminas foram silanizadas, desparafinizadas, foi procedido o bloqueio da peroxidase endógena e marcação do corte com caneta Dako Pen® para incubação do anticorpo primário (a-Smooth
Muscle Actin). O anticorpo foi utilizado com diluição de 1:100, sem recuperação
antigênica. Em uma segunda etapa foi realizado a incubação do anticorpo secundário com aplicação do complexo streptoavidina através do Kit LSAB 2 (Streptoavidina-biotina -peroxidase, Dako Cytomation®). A reação foi revelada pelo líquido DAB (diaminobenzidina, Dako Cytomation®). A contracoloração foi realizada com hematoxilina de Harris.
O procedimento foi realizado no Hospital Universitário Prof. Edgard Santos. da Universidade Federal da Bahia.
4.9 Critérios para análise histológica das amostras
Análises descritivas e semi-quantitativas foram realizadas através do microscópio óptico (AxioLab Zeiss®) da Faculdade de Odontologia da Universidade
Federal da Bahia, quanto à presença de reepitelização, infiltrado inflamatório, tecido de granulação, neoangiogênese e fibroblastos, para os espécimes corados com HE. O Picrossirius foi utilizado para descrição de fibras colágenas e o anticorpo de actina de músculo liso para avaliação dos miofibroblastos. Os critérios de avaliação deste estudo podem ser vistos no quadro 2.
A análise estatística foi realizada através do teste exato de Fisher com grau de significância de p ≤ 0,05.
O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para identificação estatística da tendência de desempenho do grupo como um todo.
Critério Marcação PRESENTE Recobrindo < 50% da ferida PRESENTE Recobrindo > 50% da ferida PRESENTE
Recobrindo 100% da ferida com espessura irregular
Reepitelização AUSENTE
PRESENTE
Recobrindo 100% da ferida com espessura irregular
Inflamação aguda
DISCRETA
Presença de < 25% de neutrórilos entre as células presentes na área correspondente a ferida
MODERADA
Presença de 25-50% de neutrórilos entre as células presentes na área
correspondente a ferida
INTENSA
Presença de > 50% de neutrórilos entre as células presentes na área
correspondente a ferida Inflamação crônica DISCRETA
Presença de < 25% de células inflamatórias crônicas na área correspondente a ferida
MODERADA
Presença de 25-50% de células inflamatórias crônicas na área correspondente a ferida
INTENSA
Presença de > 50% de células inflamatórias crônicas na área correspondente a ferida Inflamação mista
DISCRETA
Presença de < 25% de leucócitos mono e polimorfonucleares na área correspondente a ferida
MODERADA
Presença de 25-50% de leucócitos mono e polimorfonucleares na área correspondente a ferida
INTENSA
Presença de > 50% de leucócitos mono e polimorfonucleares na área correspondente a ferida
Tecido de granulação DISCRETA Discreta presença de fibroblastos. Fibras colágenas e celulas inflamatórias.
MODERADA
Moderada presença de fibroblastos. Fibras colágenas e celulas inflamatórias.
MARCANTE
Intensa presença de fibroblastos. Fibras colágenas e celulas inflamatórias. Neovascularização DISCRETA Quantidade de neovasos menor do que observado no
tecido adjacente saudável.
MODERADA
Quantidade de neovasos similar ao observado no tecido adjacente saudável.
INTENSA
Quantidade de neovasos maior do
que observado no tecido adjacente saudável. Presença de fibroblastos DISCRETA Presença de < 25% de fibrolastos jovens e
menos diferenciados que outros tipos celulares.
MODERADA
Presença de 25-50% de fibrolastos jovens e menos diferenciados que outros tipos celulares.
MARCANTE
Presença de > 50% de fibrolastos jovens e menos diferenciados que outros tipos celulares.
Fibras colágenas DISCRETA
Menos marcado por picrosirius vermelho que o tecido adjacente saudável.
MODERADA
Marcação por picrosirius vermelho similar ao tecido adjacente saudável.
INTENSA
Mais marcado por picrosirius vermelho que o tecido adjacente saudável.
Presença de miofibroblastos
DISCRETA
Presença de < 25% de células alfa actina positivas, excluindo-se parede de vasos sanguíneos e pequenos lúmen na área correspondente a ferida.
MODERADA
Presença de 25-50% de células alfa actina positivas, excluindo-se parede de vasos sanguíneos e pequenos lúmen na área correspondente a ferida.
MARCANTE
Presença de > 50% de células alfa actina positivas, excluindo-se parede de vasos sanguíneos e pequenos lúmen na área correspondente a ferida.
5 RESULTADOS
5.1 Evolução macroscópica
A avaliação macroscópica das feridas feitas com o laser de CO2 (grupo I)
mostrou uma área carbonizada ao redor da ferida com ausência total de sangramento imediatamente após a cirurgia (Fig. 5). Aos sete dias pós-operatório (PO) foi observada a presença de uma crosta na superfície da ferida na maioria dos animais (Fig. 6). A associação da FBML neste tipo de incisão (grupo II), causou diferenças clínicas nos animais quando comparados aos animais do grupo controle (grupo I), com um aspecto de cicatrização mais avançado (Fig. 7). Contudo, no grupo iluminado com luz polarizada (grupo III), observou-se presença de bordas mais regulares e uma redução da ferida aos sete dias PO, quando comparado ao grupo controle ou ao que recebeu FBML (Fig. 8). Aos 14 dias PO as feridas apresentavam características semelhantes em todos os grupos (Fig. 13,14 e 15).
No grupo incisionado com laser de diodo (grupo IV) observou-se, imediatamente após a cirurgia, aspecto semelhante ao grupo incisionado com laser de CO2, com área
carbonizada e ausência de sangramento (Fig. 9). Porém, uma área edemaciada foi observada ao redor da ferida algumas horas após a incisão e esta permaneceu até aproximadamente o sexto dia PO (Fig. 10). A evolução clínica deste grupo se deu com uma maior necrose na área adjacente à da ferida percebida a partir do segundo dia PO que evoluiu até aproximadamente o quarto dia PO. As feridas que receberam FBML (grupo V) não apresentaram sinais de evolução de necrose ao redor da ferida, assim como menor área edemaciada (Fig. 11). Nas feridas iluminadas com luz polarizada (grupo VI) os resultados foram semelhantes ao laser, porém observou-se uma pequena área de necrose ao redor da incisão nos primeiros dias PO, contudo, menor que o grupo que não recebeu tratamento (grupo IV, Fig. 12). Aos 14 dias observou-se redução da ferida, em relação ao grupo controle (Fig. 16), nos grupos que receberam tanto FBML (grupo V, Fig. 17) quanto à iluminação com luz polarizada (grupo VI, Fig. 18).
Figura 5: Fotografia realizada
imediatamente após a cirurgia com laser de CO2 (LOUZADA,
2008)
Figura 6: Aspecto da
ferida aos sete dias PO após incisão com laser de CO2, sem tratamento
adicional (LOUZADA, 2008)
Figura 7: Aspecto da ferida
aos sete dias PO após incisão com laser de CO2, com FBML
(LOUZADA, 2008)
Figura 8: Aspecto da
ferida aos sete dias PO após incisão com laser de CO2 e tratamento com luz
polarizada (LOUZADA, 2008)
Figura 9: Fotografia realizada
imediatamente após cirurgia com laser de diodo (LOUZADA, 2008)
Figura 10: Aspecto da
ferida aos sete dias PO após incisão com laser de diodo, sem tratamento adicional (LOUZADA, 2008)
Figura 11: Aspecto da ferida
aos sete dias PO após incisão com laser de diodo, com FBML (LOUZADA, 2008)
Figura 12: Aspecto da
ferida aos sete dias PO após incisão com laser de diodo e tratamento com luz polarizada (LOUZADA, 2008)
Figura 13: Aspecto da
ferida aos 14 dias pós -incisão com laser de CO2, sem tratamento
adicional (LOUZADA, 2008)
Figura 14: Aspecto da
ferida realizada com laser de CO2 aos 14 dias
PO, com FBML (LOUZADA, 2008)
Figura 15: Aspecto da
ferida realizada com laser de CO2 aos 14 dias
PO, tratada com luz polarizada (LOUZADA, 2008)
Figura 16: Aspecto da
ferida aos 14 dias pós -incisão com laser de diodo, sem tratamento adicional (LOUZADA, 2008)
Figura 17: Aspecto da
ferida realizada com laser de diodo aos 14 dias PO, com FBML (LOUZADA, 2008)
Figura 18: Aspecto da
ferida realizada com laser de diodo aos 14 dias PO, tratada com luz polarizada (LOUZADA, 2008)
5.2 Análise microscópica
Grupo I
No grupo controle onde a ferida foi realizada com laser de CO2 e o sacrifício foi
imediato, em 100% dos espécimes observou-se uma área de necrose tecidual que se estendia da superfície epitelial até a derme. Nesta área observou-se total inviabilidade celular e presença de núcleos picnóticos residuais. Os anexos cutâneos também se apresentavam inviáveis (Fig. 19). A marcação por Picrosirius mostrou a presença de fibras colágenas, com feixes dispostos paralelamente à superfície, distantes da área de necrose.
Aos sete dias pós-operatório (PO) observou-se a presença de uma extensa úlcera recoberta por crosta espessa, ao lado de remanescente de tecido necrótico; além disso, observou-se ausência de reepitelização na maioria dos casos (66,67%), e em 33,3% dos animais verificou-se que a ferida estava recoberta em uma proporção menor que 50% de sua extensão (Fig. 20). Adicionalmente, o tecido conjuntivo subjacente apresentava um discreto infiltrado inflamatório crônico em 33,37% dos espécimes, inflamação mista discreta em 33,3%, e inflamação aguda moderada em outros 33,3% dos espécimes. O tecido de granulação, rico em vasos sanguíneos, apresentava-se de forma marcante em 66,67% dos casos, com presença marcante de fibroblastos em meio à intensa deposição de fibras colágenas localizadas paralelas à superfície da ferida. A imunomarcação com a-Smooth Muscle Actin mostrou uma quantidade moderada de miofibroblastos distribuidos na área adjacente à ferida em 100% dos animais (Fig. 21).
Aos 14 dias PO foi observada a presença de uma ulceração recoberta por crosta espessa com remanescente de tecido necrótico. Foi detectada uma migração epitelial em estágio inicial recobrindo uma pequena área (< 50% da ferida). Foi observada a presença de infiltrado inflamatório crônico discreto em 66,67% e infiltrado misto discreto em 33,3% dos casos; uma quantidade moderada de tecido de granulação bem vascularizado e; uma marcante presença de fibroblastos. A marcação por picrosirius mostrou uma intensa deposição de fibras colágenas. Estes dois últimos elementos descritos estavam dispostos paralelamente à superfície da ferida. Observou-se marcante presença de miofibroblastos em 100% dos casos.
Figura 19: Fotomicrografia do grupo GI (0 dia) mostrou total inviabilidade celular na região, com área
de necrose estendendo-se da supefície epitelial até a derme (Hematoxilina Eosina; magnificação de 100X). (LOUZADA, 2008)
Figura 20: Fotomicrografia do grupo GI (7 dias) mostrando tecido de granulação e ausência de
Figura 21: Fotomicrografia do grupo GI (7 dias). A imunomarcação por a-SMA mostrou uma presença
moderada de miofibroblastos (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008)
Grupo II
A FBML na região da ferida realizada com laser de CO2 mostrou aos sete dias
PO, a presença de uma úlcera recoberta por crosta não espessa com área de necrose residual na superfície. Um animal não apresentou necrose residual. Quanto ao revestimento epitelial, foi observada migração epitelial em 40% dos casos, com recobrimento de uma pequena área da ferida, porém, nos 60% dos casos restantes a reepitelização apresentou-se ausente. A inflamação foi discreta, aguda ou crônica na maioria dos animais, sendo que dois animais apresentaram inflamação mista. Um marcante tecido de granulação, ora organizado ora desorganizado, altamente neovascularizado também pode ser observado neste tempo; assim como a presença marcante de fibroblastos em meio à discreta deposição de fibras colágenas. Os miofibroblastos apresentaram-se de maneira moderada em 80% dos casos.
Aos 14 dias, 60% dos casos apresentaram recobrimento epitelial correspondendo a uma área menor que 50% da ferida; em 20% foi observada uma área maior que 50% da ferida e em 20% a migração epitelial foi completa. Em adição, a presença de infiltrado inflamatório crônico foi predominantemente moderado, com uma
quantidade marcante tecido de granulação moderadamente vascularizado. De permeio, foi observada marcante presença de fibroblastos e uma quantidade moderada de fibras colágenas. Os miofibroblastos apresentaram-se de maneira marcante na área adjacente à incisão em 60% dos casos e de maneira moderada em 40% dos casos.
Grupo III
Aos sete dias foi observada a presença predominante de úlcera recoberta por crosta espessa, com remanescentes de tecido necrótico. Migração epitelial completa foi observada em 40% dos casos e recobrindo uma área menor que 50% da ferida em 40% dos casos (Fig. 22). Um animal não apresentou sinais de reepitelização (20% dos casos). A presença de um infiltrado inflamatório crônico discreto foi observada em 40% dos espécimes e moderado em outros 20%. A presença de inflamação aguda também foi observada em 20% dos casos, assim como uma inflamação mista moderada em outros 20%. O tecido de granulação mostrou-se marcante e altamente vascularizado. Os fibroblastos apresentaram-se de maneira marcante e localizados paralelamente à superfície da ferida, em meio a uma discreta deposição de fibras colágena s. Os miofibroblastos apresentaram-se de maneira discreta em 40% dos casos e moderada em outros 40% (Fig. 23).
Aos 14 dias observou-se predominantemente a presença de uma úlcera recoberta por necrose fibrinóide, com migração epitelial recobrindo uma área menor que 50% da ferida em 80% dos casos, bem como recobrimento maior que 50% em 20% dos animais. Estava presente um infiltrado inflamatório crônico que variou de moderado a intenso, com marcante tecido de granulação moderadamente vascularizado. Presença marcante de fibroblastos e moderada quantidade de fibras colágenas também puderam ser vistos neste tempo e estavam dispostos paralelos à superfície da ferida. Em 100% dos casos os miofibroblastos se apresentavam de forma marcante (Fig. 24).
Figura 22: Fotomicrografia do grupo GIII (7 dias) mostrou pavimentação epitelial completa
(Hematoxilina- eosina; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008)
Figura 23: Fotomicrografia do grupo GIII (7 dias). A imunomarcação por a-SMA mostrou
miofibroblastos apresentando-se de maneira moderada (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008)
Figura 24: Fotomicrografia do grupo GIII (14 dias). A imunomarcação por a-SMA mostrou
miofibroblastos apresentando-se de forma marcante (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008)
Grupo IV
Nas feridas cirúrgicas realizadas com laser de diodo com sacrifício imediato observou-se área de necrose tecidual que se estendia da superfície até a hipoderme; presença de alguns núcleos picnóticos residuais; fibras colágenas localizadas distante do local da ferida (Fig. 25).
Aos sete dias PO, observou-se extensa ulceração recoberta por uma crosta espessa. A reepitelização estava ausente em 100% dos casos. Evidenciou-se a discreta presença de infiltrado inflamatório que se apresentou ora agudo ora crônico ou misto. Outro aspecto freqüente foi a presença de um marcante tecido de granulação, que se mostro u rico em vasos sanguíneos. Adicionalmente foi observada uma presença marcante de fibroblastos e intensa deposição de fibras colágenas. Os miofibroblastos apareceram de forma discreta em 100% dos casos (Fig. 26).
Aos 14 dias PO, observou-se uma úlcera recoberta por uma crosta espessa com reepitelização ausente em 33,3% dos casos. Quando o revestimento epitelial estava presente, recobria uma área menor que 50% da ferida em 66,67% dos casos (Fig. 27).
Observou-se também um infiltrado inflamatório discreto ora agudo, ora crônico ou misto, com uma presença moderada de tecido de granulação, moderadamente vascularizado. De permeio, observou-se uma presença marcante de fibroblastos e uma intensa deposição de fibras colágenas. Na maioria dos casos, foi notada presença marcante de miofibroblastos (66,67%) e uma presença moderada foi observada em 33,3% dos casos (Fig. 28).
Figura 25: Fotomicrografia do grupo GIV (0 dia) mostrou total inviabilidade celular na região, com
área de necrose estendendo-se da superfície epitelial até a hipoderme (Hematoxilina Eosina; magnificação de 40X). (LOUZADA, 2008)
Figura 26: Fotomicrografia do grupo GIV (7 dias). A imunomarcação por a-SMA mostrou uma
presença discreta de miofibroblastos (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008)
Figura 27: Fotomicrografia do grupo GIV (14 dias) mostrando início de migração epitelial e
correspondeu a uma área menor que 50% da ferida em (Hematoxilina - eosina; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008)
Figura 28: Fotomicrografia do grupo GIV (14 dias) mostrou presença marcante de miofibroblastos
(Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008)
Grupo V
Nos casos no qual a FBML foi utilizada em ferida cirúrgica realizada com laser de diodo, observou-se ora a presença de uma úlcera revestida por crosta de espessura variável ora somente crosta irregular com presença de remanecentes de tecido necrótico. A reepitelização foi ausente em 100% dos animais. O infiltrado inflamatório variou de discreto a moderado e pode ser classificado ora como agudo; crônico; ou misto. Marcante presença de tecido de granulação com neovascularização de moderada a intensa; marcante presença de fibroblastos, organizando-se paralelamente à superfície; em meio à moderada quantidade de fibras colágenas também foi observada neste estágio. Evidenciou-se também uma discreta presença de miofibroblastos em 100% dos animais (Fig. 29).
Aos 14 dias observou-se presença de uma crosta de espessura variável e predomínio de uma discreta inflamação crônica de celularidade mista. A reepitelização se apresentou ausente em 20% dos casos, presente recobrindo uma área menor que 50% da ferida em 40% dos casos, recobrindo uma área maior que 50% da ferida em
20% dos casos e recobrindo 100% da ferida em outros 20% (Fig. 30). O tecido de granulação apresentou-se discreto ou marcante e apresentou moderada neovascularização. De permeio, havia presença marcante de fibroblastos e uma marcação moderada de fibras colágenas. Miofibroblastos se apresentaram de maneira moderada em 80% dos animais (Fig. 31).
Figura 29: Fotomicrografia do grupo GV (7 dias) mostrou discreta presença de miofibroblastos
Figura 30: Fotomicrografia do grupo GV (14 dias) mostrou reepitelização recobrindo uma área maior
que 50% da ferida (Hematoxilina- eosina; magnificação 40 X). (LOUZADA, 2008)
Figura 31: Fotomicrografia do grupo GV (14 dias) mostrou presença moderada de miofibroblastos
Grupo VI
No grupo iluminado com luz polarizada, aos sete dias, observou-se a presença de uma crosta espessa com remanescente de tecido necrótico em 60% dos espécimes e úlcera extensa recoberta por crosta em outros 40%. A reepitelização estava ausente em 80% dos casos e presente recobrindo área menor que 50% da ferida em 20% dos casos. Infiltrado inflamatório foi predominantemente discreto, ora crônico, ora de celularidade mista. A presença de tecido de granulação moderadamente vascularizado foi marcante. De permeio, notou-se a presença marcante de fibroblastos e moderada deposição de fibras colágenas (Fig. 32). Os miofibroblastos se apresentaram de forma moderada em 80% dos casos (Fig. 33). Observou-se a presença de edema intersticial em alg uns espécimes.
Aos 14 dias, 60% dos espécimes mostraram a presença de crosta. A reepitelização aconteceu recobrindo 100% da ferida em 60% dos casos, recobrindo mais que 50% da ferida em 20% dos casos e recobrindo menos que 50% da ferida em 20% dos casos (Fig. 34). Observou-se uma presença moderada de tecido de granulação o qual era moderadamente vascularizado; e o infiltrado inflamatório foi discreto predominantemente crônico em 60%. De permeio, evidenciou-se uma marcante presença de fibroblastos e intensa deposição de fibras colágenas (Fig. 35), ambos distribuídos paralelamente à superfície. Os miofibroblastos se apresentaram de forma marcante em 80% dos casos (Fig. 36).
Figura 33: Fotomicrografia do grupo GVI (7 dias) mostrou uma presença moderada de
miofibroblastos (Streptavidin-Biotin immunoperoxidase; magnificação 100 X ). (LOUZADA, 2008)
Figura 32: Fotomicrografia do grupo GVI (7 dias) mostrou moderada deposição de fibras colágenas
Figura 34: Fotomicrografia do grupo GVI (14 dias) mostrou características de reepitelização avançadas
recobrindo 100% da ferida (Hematoxilina- eosina; magnificação 100 X). (LOUZADA, 2008)
Figura 35: Fotomicrografia do grupo GVI (14 dias) mostrou intensa deposição de fibras colágenas
Figura 36: Fotomicrografia do grupo GVI (14 dias) mostrou miofibroblastos apresentando-se de forma
0 DIA 7 DIAS 14 DIAS
GI GIV GI GII GIII GIV GV GVI GI GII GIII GIV GV GVI
100,00% 100,00% 66,67% 60,00% 20,00% 100,00% 100,00% 80,00% 66,67% 60,00% 80,00% 33,33% 20,00% 20,00% Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Ausente Presente < 50% Presente < 50% Presente < 50% Ausente Ausente Presente < 50%
33,33% 40,00% 40,00% 20,00% 33,33% 20,00% 20,00% 66,67% 40,00% 20,00%
Presente < 50% Presente < 50% Presente < 50% Presente < 50% Presente > 50% Presente > 50% Presente > 50% Presente < 50% Presente < 50% Presente > 50%
40,00% 20,00% 20,00% 40,00% Presente 100% regular Presente 100% irregular Presente > 50% Presente 100% irregular 20,00% 20,00% Reepitelização Presente 100% irregular Presente 100% regular 33,33% 80,00 20,00% 33,33% 20,00% 20,00% 33,33% 20,00% 60,00% 33,33% 60,00% 20,00% Aguda Moderada Mista Discreta Aguda Discreta Aguda Discreta Mista Discreta Aguda Intensa Mista Discreta Mista Moderada Crônica Moderada Aguda Discreta Mista Discreta Mista Discreta 33,33% 20,00% 20,00% 33,33% 60,00% 40,00% 66,67% 20,00% 40,00% 33,33% 40,00% 60,00% Mista Discreta Crônica Moderada Mista Moderada Mista Discreta Mista Moderada Mista Discreta Crônica Discreta Crônica Discreta Crônica Intensa Mista Discreta Crônica Discreta Crônica Discreta 33,33% 40,00% 33,33% 20,00% 40,00% 40,00% 33,33% 20,00% Crônica Discreta Crônica Discreta Crônica Discreta Crônica Discreta Crônica Discreta Crônica Moderada Crônica Discreta Crônica Moderada 20,00% 20,00% Inflamação (Aguda / Mista / Crônica)
Moderada Crônica Crônica Intensa
33,33% 100,00% 20,00% 33,33% 20,00% 20,00% 66,67% 20,00% 40,00% 66,67% 40,00% 20,00% Moderada Marcante Moderada Moderada Moderada Discreta Moderada Moderada Moderada Moderada Discreta Discreta
66,67% 80,00% 66,67% 80,00% 20,00% 33,33% 80,00% 60,00% 33,33% 20,00% 60,00%
Marcante Marcante Marcante Marcante Moderada Marcante Marcante Marcante Marcante Moderada Moderada
60,00% 40,00% 20,00%
Tecido de granulação
0 DIA 7 DIAS 14 DIAS
GI GIV GI GII GIII GIV GV GVI GI GII GIII GIV GV GVI
100,00% 20,00% 40,00% 100,00% 20,00% 20,00% 33,33% 60,00% 20,00% 100,00% 40,00% 100,00% Intensa Discreta Moderada Intensa Discreta Discreta Discreta Moderada Discreta Moderada Discreta Moderada
20,00% 60,00% 40,00% 60,00% 33,33% 40,00% 80,00% 60,00%
Moderada Intensa Moderada Moderada Moderada Intensa Moderada Moderada
60,00% 40,00% 20,00% 33,33%
Neovascularização
Intensa Intensa Intensa Intensa
100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 40,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% 100,00% Marcante Marcante Marcante Marcante Marcante Moderada Marcante Marcante Marcante Marcante Marcante Marcante
60,00%
Presença de Fibroblastos
Marcante
33,33% 80,00% 80,00% 33,33% 40,00% 20,00% 33,33% 20,00% 80,00% 33,33% 20,00% 20,00%
Discreta Discreta Discreta Discreta Discreta Discreta Discreta Discreta Moderada Moderada Discreta Moderada
66,67% 20,00% 20,00% 66,67% 60,00% 80,00% 66,67% 60,00% 20,00% 66,67% 60,00% 80,00%
Intensa Moderada Moderada Intensa Moderada Moderada Intensa Moderada Intensa Intensa Moderada Intensa
20,00% 20,00%
Fibras colágenas
Intensa Intensa
100,00% 80,00% 40,00% 100,00% 100,00% 20,00% 100,00% 40,00% 100,00% 33,33% 20,00% 20,00% Moderada Moderada Discreta Discreta Discreta Ausente Marcante Moderada Marcante Moderada Discreta Moderada
20,00% 40,00% 80,00% 60,00% 66,67% 80,00% 80,00%
Marcante Moderada Moderada Marcante Marcante Moderada Marcante
20,00%
Presença de Miofibroblastos
Marcante
5.3 Análise estatística
A análise estatística, através do teste exato de Fisher, evidenciou diferenças significantes aos sete dias, quando foi observada uma inflamação mais discreta, de celularidade mista, no grupo onde a cirurgia foi realizada com laser de CO2 e associado
à FBML do que quando iluminado com luz polarizada L (p = 0,04). Observou-se também uma maior concentração de fibras colágenas, no grupo onde a cirurgia foi realizada com laser de diodo e iluminado com luz polarizada (grupo VI), em relação ao grupo incisionado com laser de CO2 e tratado com fotobiomodulação laser (grupo II, p =
0,05) ou iluminado com luz polarizada (grupo III, p = 0,05).
Aos 14 dias, a inflamação se apresentou mais discreta e crônica no grupo não associado a nenhuma fototerapia do que onde a cirurgia foi realizada com laser de CO2
e iluminado com luz polarizada (p = 0,05). Ainda neste tempo observou-se que as feridas feitas com laser de CO2 e tratadas com luz polarizada apresentavam uma
inflamação mais crônica (moderada) que as feridas realizadas com laser de diodo não associada a tratamento adicional ou as associadas à FBML (p = 0,05). Em relação às fibras colágenas observou-se a permanência de uma maior concentração de fibras colágenas no grupo onde a cirurgia foi realizada com laser de diodo e iluminado com luz polarizada (grupo VI), em relação aos outros grupos do mesmo tempo (p = 0,05).
O fator tempo, 0 - 7 dias, mostrou que a FBML associada à incisão com laser de CO2 apresentou um processo inflamatório tipo misto mais discreto quando comparado
aos grupos que não receberam fototerapia, tanto para o operado com laser de CO2 (p =
0,04), quanto para o operado com laser de diodo (p = 0,04). Observaram-se também diferenças no grupo onde a incisão foi realizada com laser de CO2 e iluminado com luz
polarizada (grupo III), com aumento de reepitelização (p = 0,05). O fator tempo, 7 - 14 dias, também foi importante e mostrou um aumento do número de fibras colágenas no grupo onde a cirurgia foi realizada com laser de CO2 e tratado com luz polarizada
(grupo III, p = 0,04), assim como diminuição da neovascularização (p = 0,05). Houve uma diminuição significativa da inflamação tipo mista (passou à crônica) no grupo onde a cirurgia foi realizada com laser de CO2 e tratado com FBML (grupo II, p = 0,04).
Aumento da reepitelização do grupo incisionado com laser de diodo e tratado com FBML (grupo V, p = 0,01). Aumento da reepitelização do grupo incisionado com laser de diodo e tratado com luz polarizada (grupo VI, p = 0,01). Aumento do número de fibroblastos no grupo onde a cirurgia foi realizada com laser de diodo e tratado com luz polarizada (grupo VI, p = 0,04).
Com relação aos miofibroblastos, observou-se aos sete dias uma menor quantidade de miofibroblastos no grupo onde a cirurgia foi realizada com laser de diodo e tratados com fotobiomodulação laser (grupo V) quando comparados ao grupo operados com laser de CO2 e também tratado com FBML (grupo II, p = 0,02). Também
foi observada uma menor quantidade de miofibroblastos nos grupos operados com laser de diodo e tratados com fotobiomodulação laser (grupo V) quando comparado ao grupo operado com laser de diodo e iluminado com luz polarizada (grupo VI, p = 0,04).
Aos 14 dias, observou-se uma menor quantidade de miofibroblastos no grupo onde a cirurgia foi realizada com laser de diodo e tratado com fotobiomodulação laser (grupo V) quando comparado aos grupos operados com CO2 e iluminado com luz
polarizada (grupo III, p = 0,04).
O tempo, 7-14 dias, também foi avaliado neste caso e foi observado um aumento do número de miofibroblastos nos grupos: cirurgia realizada com laser de CO2 e tratado
com luz polarizada (grupo III) (p = 0,04); cirurgia realizada com laser de diodo sem tratamento, grupo controle (grupo IV) (p= 0,02); cirurgia realizada com laser de diodo e tratado com fotobiomodulação laser (grupo V) (p = 0,04); cirurgia realizada com laser de diodo e tratado com luz polarizada (grupo VI) (p = 0,04).
Quando o teste de Kruskal-Wallis foi utilizado foram observadas, aos sete dias, diferenças na reepitelização, onde o grupo que recebeu incisão com laser de CO2 e
tratamento adicional com luz polarizada (grupo III) apresentou melhor desempenho, com diferença estatisticamente significante em relação ao grupo que recebeu incisão com laser de diodo e tratamento adicional com luz polarizada (grupo VI, p = 0,04). Os grupos controle (grupo I e grupo IV), em equivalência, apresentaram maior quantidade de fibras colágenas neste tempo que os grupos que receberam tratamento adicional com ambas as fototerapias (grupos II, III, V e VI, p=0,03). Aos 14 dias, o melhor desempenho na reepitelização foi do grupo incisionado com laser diodo e tratado com
luz polarizada (grupo VI), com diferenças estatísticas para o grupo que não recebeu tratamento adicional (grupo IV p = 0,04) ou ao associado à FBML (grupo V, p = 0,04). Observou-se ainda neste grupo maior concentração de fibras colágenas quando comparados a todos os outros grupos que receberam tratamento adicional por fototerapia (grupo II, III e V, p = 0,04). O grupo incisionado por laser de CO2 e tratado
com FBML (grupo II) apresentou-se com diferenças significativas quanto à presença mais intensa de tecido de granulação em relação ao tecido incisionado pelo laser de diodo e tratado com luz polarizada (grupo VI, p = 0,04). Quanto aos miofibroblastos, o melhor desempenho aos sete dias foi para os grupos incisionados com laser de CO2,
controle (grupo I) e tratado adicionalmente com FBML (grupo II) ou incisionado com laser de diodo e tratado com luz polarizada (grupo VI), com diferença estatística para os grupos incisionados com laser de diodo, controle (grupo IV, p=0,04) ou associado à FBML (grupo V, p=0,04). Aos 14 dias observou-se que havia mais miofibroblastos nos grupos incisionados com laser de CO2, controle (grupo I) e tratado adicionalmente com
luz polarizada (grupo III), com diferenças estatísticas para o grupo onde a incisão foi feita com laser de diodo e tratado com FBML (grupo V, p = 0,01).
A síntese gráfica dos resultados analisados estatisticamente podem ser observadas nas figuras de número 37 a 50.
Reepitelização 7 dias 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% G1 G2 G3 G4 G5 G6 Grupos Porcentagem Ausente Presente < 50% Presente > 50% Presente 100% irregular Presente 100% regular
Figura 37: Reepitelização das feridas aos sete dias PO (LOUZADA, 2008)
Reepitelização 14 dias 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% G1 G2 G3 G4 G5 G6 Grupos Porcentagem Ausente Presente < 50% Presente > 50% Presente 100% irregular Presente 100% regular
Inflamação 7 dias 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 1 2 3 4 5 6 Grupos Porcentagem Aguda Discreta Aguda Moderada Aguda Intensa Crônica Discreta Crônica Moderada Crônica Intensa Mista Discreta Mista Moderada Mista Intensa
Figura 39: Infiltrado inflamatório aos sete dias PO (LOUZADA, 2008)
Inflamação 14 dias 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 1 2 3 4 5 6 Grupos Porcentagem Aguda Discreta Aguda Moderada Aguda Intensa Crônica Discreta Crônica Moderada Crônica Intensa Mista Discreta Mista Moderada Mista Intensa
Tecido de Granulação 7 dias 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% G1 G2 G3 G4 G5 G6 Grupos Porcentagem Discreta Moderada Intensa
Figura 41: Presença de tecido de granulação aos sete dias PO (LOUZADA, 2008)
Tecido de Granulação 14 dias
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% G1 G2 G3 G4 G5 G6 Grupos Porcentagem Discreta Moderada Intensa
Neovascularização 7 dias 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% G1 G2 G3 G4 G5 G6 Grupos Porcentagem Discreta Moderada Intensa
Figura 43: Neovascularização aos sete dias PO (LOUZADA, 2008)
Neovascularização 14 dias 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% G1 G2 G3 G4 G5 G6 Grupos Porcentagem Discreta Moderada Intensa
Fibroblastos 7 dias 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% G1 G2 G3 G4 G5 G6 Grupos Porcentagem Discreta Moderada Intensa
Figura 45: Presença de fibroblastos aos sete dias PO (LOUZADA, 2008)
Fibroblastos 14 dias 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% G1 G2 G3 G4 G5 G6 Grupos Porcentagem Discreta Moderada Intensa
Fibras colágenas 7 dias 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% G1 G2 G3 G4 G5 G6 Grupos Porcentagem Discreta Moderada Intensa
Figura 47: Deposição de fibras colágenas aos sete dias PO (LOUZADA, 2008)
Fibras colágenas 14 dias
0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% G1 G2 G3 G4 G5 G6 Grupos Porcentagem Discreta Moderada Intensa
Miofibroblastos 7 dias 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% G1 G2 G3 G4 G5 G6 Grupos Porcentagem ausente discreta moderada intensa
Figura 49: Presença de miofibroblastos aos sete dias PO (LOUZADA, 2008)
Miofibroblastos 14 dias 0% 20% 40% 60% 80% 100% 120% G1 G2 G3 G4 G5 G6 Grupos Porcentagem ausente discreta moderada intensa
