1 Pesquisador do Laboratório de Monitoramento Sanitário do Biotério Geral da Prefeitura do Campus Administrativo de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo - USP - Ribeirão Preto - SP.
2 Professor Assistente do Departamento de Microbiologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo -USP - São Paulo - SP.
3 Professor Titular do Departamento de Patologia Veterinária da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias do Campus de Jaboticabal - UNESP - Jaboticabal - SP.
AVALIAÇÃO DA IMUNOGENICIDADE DE UMA VACINA
EXPERIMENTAL OBTIDA A PARTIR DE Mycoplasma pulmonis
ISOLADO DE RATOS (Rattus norvegicus)
NATURALMENTE INFECTADOS
(IMMUNOGENICITY EVALUATION OF AN EXPERIMENTAL VACCINE
OBTAINED BY Mycoplasma pulmonis ISOLATED FROM NATURALLY
INFECTED RATS (Rattus norvegicus))
J. I. ARAÚJO
1, J. TIMENETSKY
2, F. A. ÁVILA
3RESUMO
A ocorrência de micoplasmose foi investigada em um biotério de um centro de pesquisas da região de Ribeirão Preto - SP, com histórico de doença clínica que acometia de forma enzoótica o plantel. O diagnóstico comprobatório foi efetuado mediante triagem sorológica por ELISA e exame microbiológico de material oriundo de ratos sadios e doentes. Foi desenvolvida uma vacina formolada contendo como antígeno uma suspensão de Mycoplasma pulmonis, adsorvida em hidróxido de alumínio e administrada por via subcutânea na dosagem de 0,5 ml. O experimento foi efetuado em ratos (Rattus norvegicus) criados em um biotério convencional. A quantificação dos níveis de anticorpos foi feita por ELISA nos intervalos de 15 e 30 dias após a vacinação e resultou em soroconversão, sugerindo que esta pode atuar como uma barreira imunológica eficaz no controle da micoplasmose, vislumbrando uma provável forma de erradicação da doença em animais de experimentação.
PALAVRAS-CHAVE: Mycoplasma pulmonis. Micoplasmose. Vacinas. Biotério.
SUMMARY
The occurrence of mycoplasmosis was investigated in the animal house of a research center in the Ribeirão Preto – SP region with a history of clinical diseases attacking the entire stock in an enzootic manner. The confirmatory diagnosis was made by serologic screening by ELISA and by microbiological examination of material obtained from healthy and sick rats. A vaccine was developed containing a formolized Mycoplasma pulmonis suspension adsorbed to aluminum hydrox-ide and administered subcutaneously at the dose of 0.5 ml. The experiment was conducted on rats (Rattus norvegicus) reared in a conventional animal house. Antibody levels were quantified by ELISA at 0, 15 and 30 days after vaccination and serum conversion was observed, suggesting that vaccination can act as an effective immunological barrier for the control of mycoplasmosis, hopefully representing a probable means of eradication of the disease among experimental animals.
INTRODUÇÃO
Dentre os diversos organismos que acometem os animais de laboratório, os micoplasmas merecem atenção redobrada por parte dos bioteristas, em especial o
Mycoplasma pulmonis, agente causal da Micoplasmose
Respiratória Murina (MRM), o qual é responsável por uma infecção respiratória insidiosa e crônica no rato (CASSELL, 1982), muito embora outros organismos tam-bém possam estar associados (HOWARD et al., 1978).
O organismo responsável pela MRM localiza-se no trato respiratório, nasofaringe e ouvido médio (DAVIDSON et al., 1981; CASSELL et al., 1981a), po-dendo, também, ser encontrado no aparelho genital (CASSELL et al., 1981a). Sua transmissão pode ocorrer por via aerógena (MISTSCHERLICH & MARTH, 1984) e por via transplacentária (CASSELL et al., 1985), sendo esta a responsável pela prevalência da micoplasmose em biotérios mantidos sob barreiras sanitárias (SPARROW, 1976; CASSELL et al., 1981b).
O estudo das espécies de micoplasmas que aco-metem animais de laboratório é pouco explorado no Bra-sil, muito embora o primeiro relato seja de 1983, quando ROSSINI et al. (1983) isolaram Mycoplasma sp. de ratos e camundongos. TIMENETSKY & DE LUCA (1998) iso-laram Mycoplasma pulmonis de ratos e camundongos de biotérios situados na cidade de São Paulo. Segundo os autores, o organismo foi isolado da maioria dos animais criados em condições convencionais, o mesmo não ocor-rendo naqueles biotérios nos quais os animais eram man-tidos sob barreiras sanitárias.
O controle da micoplasmose em biotérios faz-se necessário por que animais de experimentação infectados, embora aparentemente sadios, podem ter seu quadro fisio-lógico alterado, levando a mudanças nas respostas bioló-gicas (BAKER et al., 1971; LINDSEY et al., 1971). Di-ferentes métodos têm sido utilizados na tentativa de erradicar a MRM, entre eles: 1) A triagem sorológica se-guida da eliminação dos animais infectados e prevenção de recontaminações por meio da interposição de barreiras sanitárias (CASSELL et al., 1981a); 2) O tratamento oral com cloridrato de oxitetraciclina associado à obtenção de crias por meio de histerectomia (BANERJEE et al., 1987) e 3) A associação de tratamentos medicamentosos, como o uso de antibióticos (oxitetraciclina) e antiinflamatório (dexametazona) (BOWDEN et al., 1994).
No Brasil, a tentativa de se eliminar a MRM tor-na-se difícil por várias razões, entre elas: 1) a maioria dos biotérios nacionais utiliza sistema de criação convencio-nal em instalações que não permitem um adequado con-trole sanitário e 2) mesmo em ambientes controlados, onde se utiliza a derivação por meio de operação cesariana, a
perpetuação da micoplasmose pode ocorrer por via transplacentária.
Outra medida preconizada é a eliminação do plantel acometido (KLEVEN et al., 1984), contudo, em se tratando de biotério, tem como inconveniente a repovoação do mesmo, já que a aquisição de animais sa-dios é difícil e onerosa. Além disso, deve-se ter em mente que em um sistema de criação convencional existe a pos-sibilidade de recontaminações, o que torna a maioria das medidas de controle sem efeito.
O uso de vacinas como meta de controle da MRM em biotérios vem sendo tentado há várias décadas. Dife-rentes formulações e formas de administração foram tes-tadas, entre elas, a utilização de vacina formolada e adsorvida em adjuvante oleoso administrada por via sub-cutânea (TAYLOR et al., 1977), vacina formolada admi-nistrada via intraperitonial e endovenosa (CASSELL & DAVIS, 1978), vacinas vivas contendo como antígeno cepas mutantes sensíveis à temperatura (LAI et al., 1990; LAI et al., 1991) e vacinas genéticas (LAI et al., 1994; BARRY et al., 1995), as quais estimulam tanto a produ-ção de anticorpos quanto a imunidade mediada por célu-las, com efeito protetor contra a infecção por Mycoplasma
pulmonis.
Uma vez que as medidas higiênico-sanitárias e medicamentosas preconizadas para o controle da micoplasmose não têm produzido os resultados esperados e levando-se em conta que a resposta imune decorrente da vacinação pode ser protetora, uma alternativa que se apre-senta como prática, econômica e funcional é a imunização dos animais através de uma vacina específica, a qual pro-porcionaria uma barreira imunológica contra a infecção por Mycoplasma pulmonis.
Os objetivos do presente experimento foram iso-lar Mycoplasma pulmonis de ratos com infecção natural, produzir uma vacina homóloga específica com quantida-des distintas de antígeno e testar sua capacidade imunogênica em ratos criados em biotério convencional com histórico de micoplasmose enzoótica, mediante a quantificação do nível de anticorpos, por ELISA, aos 15 e 30 dias após a vacinação.
MATERIAL E MÉTODOS
Animais: Foram utilizados 96 ratos (Rattus norvegicus),
machos, com idade de 45 dias, criados em condições con-vencionais, provenientes de um biotério de um centro de pesquisas da região de Ribeirão Preto - SP.
Durante a fase experimental, os animais foram mantidos em gaiolas plásticas com tampa de grade con-feccionada em material inoxidável, que também serve
como comedouro, e alimentados com ração comercial pró-pria para roedores e água “ad libitum”. A sala foi climatizada para manter uma temperatura de 22ºC ± 2ºC, umidade relativa de ar em torno de 60% e um fotoperíodo de 12h. Foram adotadas medidas higiênico-sanitárias vi-sando a minimizar os riscos de contaminações dos ani-mais em testes, por organismos infectocontagiosos.
Microrganismo: Foi utilizada uma cepa selvagem de Mycoplasma pulmonis isolada de um animal doente,
pro-veniente do plantel em estudo. Ratos apresentando sintomatologia clínica sugestiva de micoplasmose foram sacrificados com uma dose letal de anestésico e submeti-dos à lavagem traqueobronquial (TBL) com 10 ml de cal-do SP4 (TULLY, 1996), em capela de fluxo laminar. O material aspirado foi dispensado em um tubo de ensaio com tampa rosqueável (16X150 mm), após filtração em membrana “millipore” com poros de 0,45 mm de diâme-tro. A filtração teve como meta eliminar contaminantes do TBL. Em seguida, as culturas foram levadas a uma es-tufa bacteriológica, onde ficaram em observação por um período de até 15 dias a uma temperatura constante de 37ºC.
Os tubos de ensaio cujo meio de cultura apre-sentaram mudança de coloração de vinho para amarelo foram repicados em placas “Corning” (35X10 mm) con-tendo aproximadamente 3 ml de meio SP4 semi-sólido e mantidas em cultivo. Dentre as colônias com crescimento sugestivo de micoplasma, uma foi selecionada, clonada 3 vezes para garantir a pureza da cepa isolada (SENTERFIT, 1983) e cultivada em caldo SP4 por meio de repiques se-riados, usando-se 1/10 (v/v) do inóculo até atingir 200 ml da cultura. Em seguida, foi distribuído em alíquotas de 1,0 ml e congelado a –70ºC.
A caracterização morfológica da cepa isolada foi feita mediante observação microscópica, com base nos re-latos de CHANOCK & TULLY (1980). Os testes de ini-bição do crescimento, em presença de digitonina (DAVIDSON et al., 1994) e de soro específico contra
Mycoplasma pulmonis (CLYDE, 1983), foram feitos em
paralelo com a cepa ATCC-19.612. O clone selecionado foi denominado de Mycoplasma pulmonis Clone-4 (MPC-4) e utilizado durante toda as fases do experimento.
Vacina: Uma alíquota do MPC-4 foi descongelada e
cul-tivada em caldo SP4 por meio de repiques seriados até atingir 2.000 ml da cultura. Em seguida, a suspensão foi inativada mediante a adição de 0,1% (v/v) de formalina a 40% (p/v) e mantida sob agitação em estufa a 37ºC, du-rante 24h. A cultura morta foi centrifugada 3 vezes a 20.000 x g por 15 minutos e o sedimento foi ressuspendido em 100 ml de tampão salina fosfato, contendo 0,025% (v/v)
de formalina a 40% (p/v) e pH 7,2 (CASSELL & DAVIS, 1978).
Alíquotas da suspensão antigênica concentrada, tomadas ao acaso, foram repicadas nos meios SP4 líquido e semi-sólido, BHI (Difco), Tioglicolato de Sódio (Merck) e Sabouraud (Difco) para a confirmação da esterilidade.
Com a finalidade de facilitar os cálculos durante a preparação da vacina, a suspensão bacteriana foi padro-nizada para conter 1,0 mg de proteína total por ml. A do-sagem de proteína foi feita utilizando-se o “Kit reagente de Coomasie” (Pierce Chemical Company) para proteí-nas totais (BRADFORD, 1976) e a leitura feita em espectrofotômetro “Spectra Max-2.500”, em um compri-mento de onda de 595nm.
Foi produzida uma bacterina inativada pelo formol e adsorvida em adjuvante aquoso, composta de 70% (v/v) de antígeno e 30% (v/v) de um gel de hidróxido de alumínio, previamente esterilizado e contendo 2,5% de extrato seco, pH 8,0 e ausência de sulfato (SO4—) e amônia
(NH4+).
Imunização: Para o teste de imunização foram adotados
dois tipos de ensaios. Estes requereram que a vacina fosse subdividida em 3 alíquotas e padronizada para conter, respectivamente, 100, 250 e 500μg de proteína total por dose de 0,5 ml.
No primeiro ensaio foram testadas as diferentes concentrações de antígeno. Esta etapa teve como meta de-terminar a concentração ideal de antígeno a ser utilizada como vacina. A imunização foi feita mediante a adminis-tração de uma dose única de 0,5 ml da vacina por via sub-cutânea na região do gradil costal. Foram vacinados 36 ratos, divididos em 3 grupos (G) de 12 animais cada, como se segue: o G-I recebeu 100μg de proteína total, o G-II recebeu 250 μg e o G-III recebeu 500 μg.
Nos dias zero, 15 e 30 após a vacinação (DPV), todos os animais foram anestesiados com “thionembutal” na dosagem de 50 mg/kg de peso vivo e, em seguida, sub-metidos a uma sangria de prova, mediante a punção car-díaca. Foi coletado aproximadamente 1,5 ml de sangue total de cada rato. Após o processamento do sangue, os soros foram estocados em congelador a –20ºC e destina-ram-se ao estudo sorológico.
O segundo ensaio foi realizado com a vacina na concentração antigênica que apresentou melhor desempe-nho em termos de estímulo à produção de anticorpos (IgG) contra Mycoplasma pulmonis. Foram vacinados 60 ratos, divididos em dois grupos. O primeiro grupo de 30 ratos (G-IV) recebeu apenas uma dose da vacina, enquanto que os animais do segundo grupo (G-V) foram revacinados. De modo semelhante aos ratos utilizados no primeiro en-saio, estes também foram submetidos a uma sangria de
prova antes de receberem a primeira dose de vacina. Trans-corridos 15 dias da primeira vacinação, foi feita uma se-gunda sangria, após a qual 50% dos ratos receberam uma dose de reforço, igual à primeira, no gradil costal contralateral. Trinta dias após a primeira vacinação todos os ratos foram submetidos a uma terceira sangria. As amos-tras de sangue coletadas foram processadas e estocadas de maneira semelhante às do primeiro ensaio e tiveram a mesma finalidade.
Sorologia: A avaliação da soroconversão foi feita pelo
Ensaio Imunoenzimático (ELISA) e obedeceu a metodologia descrita por CASSELL & BROWN (1983), sendo utilizado um anticorpo biotinilado anti-IgG de rato (Vector Laboratories Inc.) como segundo anticorpo e a avidina – HRP (Dako A/S.) como substrato. A revelação foi feita com o reagente cromógeno O-Phenylenediamine (Sigma) em presença de H2O2. A leitura foi feita em espectrofotômetro “Spectra Max 2.500”, a 490 nm.
Os valores de absorbância correspondentes às atividades imunológicas de cada amostra de soro foram corrigidos com base na relação A/P (Taxa de Amostra Positiva de cada diluição) (MACHADO et al., 1997).
Análise Estatística: A comparação das médias de
soroconversão (níveis de IgG contra Mycoplasma
pulmonis) expressas em valores A/P foi feita
utilizando-se o teste não paramétrico de Mann-Whitney (NORMAM & STREINER, 1986), com significância estabelecida em *p < 0,05, **p<0,01 e ***p<0,001.
RESULTADOS
A confirmação do isolamento de organismos com características de micoplasma foi feita mediante a obser-vação dos tubos de ensaio nos quais o meio de cultura mudou da cor vinho para amarelo (viragem do pH em con-seqüência do metabolismo da glicose pelo organismo, in-dicado pelo vermelho de fenol) e das placas de cultura que deram origem a colônias diminutas, opacas e que ao microscópio estereoscópico apresentaram-se com o for-mato de “ovo frito”, como conseqüência da peculiaridade do micoplasma em escavar o ágar, dando ao núcleo da colônia uma coloração mais densa e opaca, ficando a bor-da com um crescimento superficial translúcido.
A caracterização da cepa, por meio de teste de inibição do crescimento, foi feita levando-se em conta o surgimento de uma zona na qual não foi observada a pre-sença de colônias. A inibição do crescimento em prepre-sença de digitonina foi sugestiva para o gênero, enquanto que a inibição frente ao anti-soro específico foi sugestiva para a
espécie. Como estas etapas foram feitas em paralelo com a cepa de referência ATCC-19.612, por similaridade, o organismo isolado ficou caracterizado como Mycoplasma
pulmonis.
A comprovação de que suspensões antigênicas contendo distintas concentrações de proteína inativada pelo formol e adsorvida em adjuvante aquoso estimularam a produção de anticorpos baseou-se na comparação dos ní-veis séricos de IgG, quantificados por ELISA, antes e após a administração das vacinas. Os resultados expressos em valores A/P revelaram um estímulo imunogênico positivo no G-I (100μg/dose), que foi crescente e muito significa-tivo no intervalo de 0-15 DPV (**p<0,01) e extremamen-te significativo no inextremamen-tervalo de 0-30 DPV (***p<0,001). Entretanto, não foi observada diferença significativa no intervalo de 15-30 DPV (p>0,05). O G-II (250μg/dose) apresentou uma produção de anticorpos crescente e signi-ficativa nos intervalos de 0-15 e 15-30 DPV (*p<0,05) e extremamente significativa no intervalo de 0-30 DPV (***p<0,001). O G-III apresentou uma produção de anticorpos distinta das demais. Ela foi significativa no in-tervalo de 0-15 DPV (*p<0,05), extremamente signifi-cativa no intervalo de 0-30 DPV (***p<0,001) e muito significativa no intervalo de 15-30 DPV (**p<0,01).
O estímulo imunogênico entre os grupos de en-saios foi não significativo em todos os intervalos (p>0,05),
0.0 0.5 1.0 1.5 G-I (100μg/dose) G-II (250μg/dose) G-III (500μg/dose) 0 15 30 ** * * ********* * ** DIAS Va lo re s S /P
Figura 1 - Cinética da produção de anticorpos (IgG)
con-tra Mycoplasma pulmonis em ratos vacinados com uma bacterina formolada e adsorvida em adjuvante aquoso (hidróxido de alumínio). Os animais experimentais receberam doses de 100, 250 e 500 μg de antígeno. A avaliação do ní-vel de anticorpos foi feita por ELISA e os re-sultados estão expressos em valores A/P com Média + EPM (n=36 animais). * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 representam diferenças significativas nos intervalos de tempos anali-sados (0, 15 e 30 dias), usando o teste não-paramétrico de Mann-Whitney.
indicando que as três formulações se comportaram de modo similar quanto à produção de anticorpos.
No segundo ensaio, no qual os animais recebe-ram uma vacina contendo 250μg de proteína total, a via de administração e a dose foram as mesmas do teste ante-rior, tendo como distinção, apenas, a revacinação de 50% dos animais. No G-IV, os níveis de anticorpos revelaram uma imunogenicidade positiva, crescente e extremamente significativa nos intervalos 0-15 e 0-30 DPV (***p<0,001). No entanto, não foi observada diferença significativa no intervalo de 15-30 DPV (p>0,05). No G-V, a produção de anticorpos foi crescente e extremamente significativa (***p<0,001) em todos os intervalos.
O estímulo imunogênico entre os ratos primovacinados e revacinados foi não significativo (p>0,05), indicando que as formas de administração com-portaram-se de modo similar quanto à produção de anticorpos, independentemente do número de vacinações e do intervalo de tempo. 0.0 0.5 1.0 1.5 G-IV (0 DPV) G-V (0 DPV) G-IV (15 DPV) G-V (15 DPV) G-IV (30 DPV) G-V (30 DPV) 0 15 30 *** *** *** *** *** DIAS Va lo re s S /P
Figura 2 - Cinética da produção de anticorpos (IgG)
con-tra Mycoplasma pulmonis em ratos vacinados com uma bacterina formolada e adsorvida em adjuvante aquoso (hidróxido de alumínio). Os animais experimentais receberam uma ou duas doses de 250 μg de antígeno. A avaliação do nível de anticorpos foi feita por ELISA e os resultados estão expressos em valores A/P com Média + EPM (n=60 animais). * p<0,05; ** p<0,01; *** p<0,001 representam diferenças significativas nos intervalos de tempos anali-sados (0, 15 e 30 dias), usando o teste não-paramétrico de Mann-Whitney.
DISCUSSÃO
A MRM é um processo infeccioso, insidioso e crônico (CASSELL, 1982), causada pelo Mycoplasma
pulmonis, que acomete colônias de roedores de todo o
mundo (SPARROW, 1976; CASSELL et al., 1981) e que tem sido observada tanto em animais criados em
condi-ções convencionais quanto naqueles mantidos sob siste-mas de barreiras (LAI et al., 1991), podendo ser encontra-do numa taxa de até 100% em biotérios convencionais e em torno de 18% em biotérios com barreiras (TIMENETSKY & DE LUCA, 1998).
Até o momento, a maioria dos métodos adotados para o controle da micoplasmose mostrou-se ineficiente, mas apenas a vacinação tem apresentado resultados pro-missores. CASSELL & DAVIS (1978) argumentaram que a vacina contendo Mycoplasma pulmonis viável ou inativado pelo formol é capaz de reduzir a incidência e a gravidade das lesões no trato respiratório baixo, após o desafio com organismo viável e que a vacinação sistêmica pode proporcionar maior proteção para o pulmão do que vacinação intranasal. Por sua vez, LAI et al. (1990) utili-zando, como antígeno, uma cepa de Mycoplasma pulmonis modificada, sensível ao calor e administrada por via intranasal, obtiveram significante proteção contra o desa-fio com a cepa virulenta. Relataram, ainda, que houve um estímulo na produção de anticorpo local (IgA), sistêmica (IgG) e, provavelmente também, de imunidade citomediada, com conseqüente prevenção do desenvolvi-mento de lesões no pulmão e tímpano.
LAI et al. (1994) argumentaram que a vacina deve desenvolver não apenas anticorpos séricos, mas também IgA específicos no trato respiratório, uma vez que esses anticorpos interferem nos eventos iniciais de aderência e colonização bacteriana.
O argumento de que o micoplasma é antigênico é incontestável, como também o é a participação de eventos humorais e celulares nos mecanismos de defesa contra a infecção provocada por este agente. A defesa estimulada por vacinas vivas tem se mostrado ser mais efetiva do que as vacinas contendo organismos mortos; por sua vez, as vacinas gênicas são capazes de corrigir os efeitos negati-vos das vacinas contendo o micoplasma vivo. Entretanto, em se tratando de animais de experimentação, existem restrições quanto à utilização deles após serem vacinados, sobretudo com vacinas vivas, que além do risco de rever-são da cepa vacinal apatogênica à sua forma patogênica original, ainda há a possibilidade de a mãe transferir o organismo para seus descendentes, fazendo com que es-ses sejam continuamente estimulados a produzirem anticorpos. Em adição, as vacinas gênicas, apesar de não apresentarem os riscos de reversão de cepa (LAI et al., 1994), têm o inconveniente de poderem estimular antigenicamente, por geração, os filhos de matrizes vaci-nadas.
CASSELL & DAVIS (1978) utilizaram uma vaci-na ivaci-nativada pelo formol, contendo 70μg de proteívaci-na total como antígeno, e argumentaram que a vacinação de ratos contra micoplasmose é viável e que a purificação do
antígeno associada ao uso de maiores doses antigênicas incorporados a adjuvantes podem melhorar sua eficácia. Com base neste argumento e considerando a simplicidade e a praticidade de produção de uma vacina contra micoplasma usando uma cepa selvagem, inativada pelo formol e adsorvida em hidróxido de alumínio, foi feita a opção pelo método adotado.
Este experimento fornece dados que comprovam o estímulo imunogênico de uma bacterina produzida com uma cepa selvagem de Mycoplasma pulmonis, inativada pelo formol e adsorvida em adjuvante aquoso. Desta ma-neira, pode-se esperar que a vacinação de reprodutores e matrizes contribua para a manutenção da colônia no li-miar da infecção. Mesmo em ambientes onde se criam ani-mais mantidos sob barreiras sanitárias, a vacinação de matrizes e reprodutores, com antígeno inativado, pode ser vista como uma alternativa para a erradicação da doença, uma vez que esta não proporcionaria as conseqüências negativas das vacinas vivas, onde a condição de animal SPF poderia ser descaracterizada para a pesquisa biomédica.
CONCLUSÕES
A avaliação dos resultados permite chegar-se às seguintes conclusões:
1- O organismo isolado no plantel de ratos foi iden-tificado como Mycoplasma pulmonis.
2- As formulações das vacinas, levando-se em conta a quantidade de proteína total utilizada como antígeno e as formas de administração, não revelaram diferença sig-nificativa no estímulo imunogênico.
3- A vacinação de ratos com uma bacterina inativada pelo formol e adsorvida em hidróxido de alumí-nio estimulou a produção de anticorpos contra Mycoplasma
pulmonis, os quais foram evidenciados por ELISA nos
intervalos de 0-15 e 0-30 DPV.
ARTIGO RECEBIDO: JANEIRO/2002
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