Boletim de Pesquisa 69
e Desenvolvimento
ISSN 1676 - 1340 Outubro, 2004ESTUDO DA VARIABILIDADE GENÉTICA ENTRE INDIVÍDUOS DE
POPULAÇÕES DE Heliconia bihai e Heliconia rostrata.
República Federativa do Brasil
Luiz Inácio Lula da Silva
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ISSN 1676 - 1340 Outubro, 2004
Boletim de Pesquisa
e Desenvolvimento 69
ESTUDO DA VARIABILIDADE GENÉTICA ENTRE
INDIVÍDUOS DE POPULAÇÕES DE Heliconia bihai e
Heliconia rostrata
Jaqueline Matos Marques Paulo J. A. Coelho
Marco Antônio Ferreira
Zilneide Pedrosa de Souza Amaral Antônio Carlos Torres
Jaqueline Ceolin de Amorim Gláucia Salles Cortopassi Buso
Brasília, DF 2004
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Normalização Bibliográfica: Maria Alice Bianchi e Maria Iara Pereira Machado Editoração eletrônica: Maria da Graça S. P. Negrão
1ª edição
1ª impressão (2004): 150 unidades
Estudo da variabilidade genética entre indivíduos de populações de Heliconia bihai e Heliconia rostrata / Jaqueline Matos Marques ... [et al.]. – Brasília, DF : Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2004.
15 p. -- (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento / Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, ISSN 1676-1340 ; n. 69)
1. Helicônia – Variabilidade genética. 2. Helicônia – RAPD. 3. Helicônia – Marcadores moleculares. 4. Heliconia bihai 5. Heliconia rostrata. I. Marques, Jaqueline Matos. II. Série.
SUMÁRIO Resumo... 6 Abstract ... 8 INTRODUÇÃO ... 9 MATERIAIS E MÉTODOS... 10 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 11 CONCLUSÕES ... 14 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 14 Bibliografia complementar... 14 5
ESTUDO DA VARIABILIDADE GENÉTICA ENTRE INDIVÍDUOS DE POPULAÇÕES DE Heliconia bihai e Heliconia rostrata.
_________________________________________________________
1 Jaqueline Matos Marques
2 Paulo J. A. Coelho Marco Antônio Ferreira
Zilneide Pedrosa de Souza Amaral3 Antônio Carlos Torres4
Jaqueline Ceolin de Amorim5 6 Gláucia Salles Cortopassi Buso
Resumo
As helicônias são plantas de origem tropical, mais precisamente da região noroeste da América do Sul. São as únicas representantes da família Heliconiaceae. Devido ao colorido de suas brácteas são muito usadas para fins ornamentais. O gênero Helicônia com mais de 150 espécies ainda é muito pouco estudado. No Brasil encontram-se cerca de quarenta espécies, distribuídas principalmente na região Amazônica e na Mata Atlântica. As helicônias vêm apresentando crescente comercialização no mercado internacional, sendo cultivada na América Latina e na Europa. No Brasil, áreas de cultivo já são encontradas em vários estados. A comercialização de flores e plantas ornamentais está em franco crescimento no Brasil, onde o PIB do negócio está estimado em US$ 1,2 bilhões, entretanto, as exportações brasileiras não têm ultrapassado os US$ 15 milhões por ano, o que representa 0,2% do total mundial. Esse valor é muito baixo, se comparado com países de menor potencial econômico como o Equador, que exporta US$ 150 milhões por ano. O meio de propagação mais utilizado no cultivo de helicônias é através de rizomas já que a obtenção de plantas por sementes é um processo lento e difícil. Para a maioria das espécies, a germinação ocorre no prazo de 120 dias, mas algumas chegam a levar três anos, pois cada fruto normalmente contém três sementes envolvidas por um endocarpo bastante duro dificultando a germinação. Além disso, para se identificar o híbrido e a variabilidade resultante do cruzamento é necessário esperar o florescimento para se fazer uma análise do fenótipo resultante. Uma forma de se detectar a variabilidade ainda no início do desenvolvimento da planta e com grande rapidez é através da utilização de marcadores moleculares. Dentre estes, RAPD se caracteriza por ser uma técnica simples, rápida e que requer baixos custo e mão-de-obra. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi verificar a variabilidade genética dentro de duas populações de helicônia obtidas através da extração dos embriões das sementes de plantas de duas espécies distintas: Heliconia rostrata e H. bihai (cultivadas em
1
Estudante de graduação, Universidade de Brasília. 2
Pesquisador, Embrapa Agroindústria Tropical. 3
Assistente de operações I, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia.
4
Pequisador, Embrapa Hortaliças.
5
Estudante de graduação, Universidade de Brasília
6
Pesquisadora, Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
condições naturais). Obteve-se uma população com 31 indivíduos de Heliconia bihai e 33 de
Heliconia rostrata, constituídas de indivíduos meio-irmãos. Foram identificados 101
marcadores polimórficos, observando-se diferenças entre e dentro de cada população. Assim, observou-se considerável variabilidade genética em plantas de helicônia regeneradas por meio de cultura de embriões extraídos de sementes.
Palavras chaves: Diversidade genética, marcadores moleculares, RAPD, helicônia.
STUDY OF GENETIC VARIABILITY AMONG INDIVIDUALS OF Heliconia bihai AND Heliconia rostrata POPULATIONS.
_________________________________________________________
Abstract
The heliconias are plants of tropical origin, more precisely from the North-west Region of South America. They are the only representatives of the Heliconiacea family. Due to the colors of their bracteas they are often used for ornamental purposes. The Heliconia genus with more than 150 species is seldom studied. There are about 40 species, in Brazil, distributed mainly in the Amazon region and in the Atlantic Forest. The heliconias have been showing a crescent commercialization in the international market and they have been cultivated in Latin America and Europe. In Brazil, they are cultivated in many states. The commercialization of ornamental flowers and plants are increasing in Brazil, the NGP (National Growth Product) of this market is estimated in about US$ 1,2 billions, however, the Brazilian exportations are not surpassed the US$ 15 millions per year, what means 0,2% of the whole global negotiations, this is not enough if we compare with some countries which have a minor economic potential, like Equator, for example, US$ 150 millions per year. The most used propagation mean of heliconia is through rhizomes as the plants obtained through seeds are a slow and difficult process. For most species germination occurs within 120 days, although some take even three years as each fruit usually contains three seeds wrapped by a quite hard endocarp making germination more difficult. Besides, in order to identify the hybrid and the resulting variability from the cross-over it is necessary to wait the flourishing to make an analysis of the resulting phenotype. A way to detect the variability still in the beginning of the plant development and faster would be through the use of molecular markers. Among those, RAPD is characterized for being a simple and fast technique, which requires low cost and workforce. This work objective was to verify the genetic variability inside two heliconia populations obtained through the extraction of seed embryos of plants from two different species: Heliconia rostrata and H. bihai (grown in natural conditions). Two populations were achieved, one with 31 individuals of H. bihai and other with 33 of Heliconia rostrata, constituted by half siblings individuals. One hundred and one polymorphic markers were identified, showing differences among and within each population. It was possible to verify that there was considerable genetic variability in heliconia plants regenerated from cultured embryos extracted from seeds.
Keys-words: Genetic diversity, molecular markers, RAPD, heliconia
INTRODUÇÃO
As helicônias (Figura 1) são plantas de origem tropical, mais precisamente da região noroeste da América do Sul sendo as únicas representantes da família Heliconiaceae. São grandes herbáceas perenes com brácteas de cores muito vivas e por isso são muito usadas para fins ornamentais. O gênero Helicônia é muito pouco estudado e ainda é incerto o número de espécies existentes, porém estima-se que haja entre 150 a 250 espécies. No Brasil encontram-se cerca de quarenta espécies distribuídas principalmente na Mata Atlântica (até o norte do estado de Santa Catarina) e na região Amazônica (Helicônias, 2004). As helicônias vêm apresentando crescente comercialização no mercado internacional em função do aumento da área de produção nos países da América Central e da América do Sul, proporcionando uma maior oferta e divulgação do produto. Existem também cultivos comerciais na Europa (Holanda, Alemanha, Dinamarca e Itália), mas sob condições protegidas. No Brasil, áreas de cultivo já são encontradas nos estados do Rio de Janeiro, São Paulo, Santa Catarina e Pernambuco, com expansão para os estados do Amazonas e Ceará (Helicônias, 2004). A comercialização de flores e plantas ornamentais está em franco crescimento no Brasil, onde o PIB do negócio está estimado em US$ 1,2 bilhões, entretanto, as exportações brasileiras não têm ultrapassado os US$ 15 milhões por ano, ou apenas 0,2% do total mundial, o que demanda rápidas mudanças de postura em termos de política agrícola, uma vez que países de menor potencial econômico e tecnológico da América Latina, como a Colômbia (US$ 560 milhões), Equador (US$150 milhões) e Costa Rica (US$125 milhões), e da África, como Quênia (US$132 milhões) e Zimbabwe (US$ 60 milhões) têm na comercialização de flores um forte componente de suas economias (Lamas, 2002). Além disso, a produção de flores gera muitos empregos, principalmente na etapa de colheita, pois demanda basicamente mão-de-obra humana, sendo a utilização de maquinário muito reduzida. Portanto, tem importante papel social, na geração de empregos, por poder proporcionar maior rentabilidade por área cultivada (3 a 5 vezes superior à fruticultura), e ser praticada em pequenas áreas de agricultura familiar. São grandes as oportunidades para as espécies tropicais, em razão da crescente procura por flores não tradicionais, a proximidade com os países importadores e a existência de vários ecossistemas distintos, com temperaturas amenas e estáveis durante todo o ano, principalmente nas serras úmidas, onde a altitude de 750 a 950 metros e a luminosidade intensa (3.000 horas de sol anuais) conferem melhor qualidade ao produto.
O meio de propagação mais utilizado no cultivo de helicônias é através de rizomas, sendo a variabilidade genética muito baixa. Outra forma de propagação se dá por meio de sementes. Para a maioria das espécies, a germinação ocorre no prazo de 120 dias, mas algumas chegam a levar três anos, já que cada fruto normalmente contém três sementes envolvidas por um endocarpo bastante duro dificultando a germinação, caracterizando-a como um processo lento e difícil (Helicônias, 2004). Além disso, para se identificar o híbrido e a variabilidade resultante do cruzamento é necessário esperar o florescimento para se fazer uma análise do fenótipo resultante. Uma das formas de se detectar a variabilidade no início do desenvolvimento da planta e com grande rapidez é através da utilização de marcadores moleculares. Dentre estes, RAPD se caracteriza por ser uma técnica precisa, rápida e que requer baixos custo e mão-de-obra. O objetivo deste trabalho foi verificar a variabilidade genética dentro de duas populações de helicônia obtidas através da extração dos embriões das sementes de plantas de duas espécies distintas: Heliconia rostrata e H. bihai.
Heliconia rostrata Heliconia bihai
MATERIAIS E MÉTODOS
Material utilizado: As duas populações de helicônia foram obtidas através da extração dos
riões (Duval et al., 2003) das sementes de plantas de duas espécies distintas: Heliconia
Figura 1. Espécies do gênero Heliconia utilizadas para fins ornamentais.
emb
rostrata e H. bihai, cultivadas em condições naturais, no Rancho Paraná, localizado no
município de Brazlândia, Distrito Federal. Esses embriões foram desinfestados com solução a 0,5% de hipoclorito de sódio, lavados com água destilada e colocados em frascos com meio nutritivo MS por 60 dias, depois foram transferidos para vasos contento areia e vermiculita e mantidos em casa de vegetação, obtendo-se uma população com 31 indivíduos de Heliconia bihai e 33 de Heliconia rostrata, constituídas de indivíduos meio-irmãos, cujo pai é desconhecido.
Reações de amplificação: O DNA foi extraído das folhas dos indivíduos constituintes dessas
populações seguindo o protocolo CTAB 2 % (Ferreira e Grattapaglia, 1998). As reações de
e DNA amplificadas e fotografadas foram analisadas como presentes (1) ou ausentes (0) e os dados resultantes foram utilizados na construção de uma
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Para a análise de RAPD, s, 15 foram selecionados
(OP-A1, OP-A7, OP-A3, OP-A4, OP-A20, OP-C2, OP-F3, OP-F5, OP-L2, OP-R2, OP-V17, OP-V1
RAPD foram preparadas com um coquetel de reagentes com as seguintes concentrações: 3,0 µl de DNA genômico a 3,00 ng/µl; 4,92 µl de água milli-Q autoclavada; 1,30 µl Tampão 10X para Taq DNA Polimerase; 1,04 µl de dNTP 2,5 mM; 1,04 µl de BSA 2,5 mM; 1,5 µl de Primer (Operon Technologies, USA) 10ng/µl e 0,2 µl de enzima Taq DNA Polimerase totalizando um volume final de 13µl. As reações de RAPD preparadas foram colocadas em um termociclador PTC-100 (MJ Research) e as condições de amplificação foram: desnaturação por um minuto a 92°C, anelamento do primer por um minuto a 35°C e extensão pela Taq polimerase com incorporação de nucleotídeos por dois minutos a 72°C, esse ciclo foi repetido 40 vezes, adicionando-se ainda um passo final de extensão de 5 minutos a 72°C para finalizar os produtos amplificados (Ferreira e Grattapaglia, 1998). O DNA amplificado foi separado por eletroforese (120 volts por 4 horas) em gel de agarose 1,5 % com brometo de etídio e fotografado sob luz UV.
Análise estatística: As bandas d
matriz de similaridade genética utilizando-se o coeficiente de Dice, do programa NTSYS versão 2.10z. (Adams et al, 2002). A partir desta matriz foi gerado um dendrograma utilizando o método de agrupamento UPGMAa fim de se verificar a diferença existente entre os indivíduos de cada população. Com os dados obtidos, foi feita a análise de variância molecular (AMOVA) do programa Arlequin (Schneider, 2000), para verificar a distribuição da variação entre e dentro das populações e se o grau de variação entre os indivíduos de cada população foi estatisticamente significativo.
50 primers foram testados, deste
6, OP-V10, OP-V15 e OP-V18) por serem diferenciadores, ou seja, polimórficos (Figura 2), que geraram 101 marcadores.
Figura 2. Gel de agarose 1,5% corado com brometo de etídio, mostrando os fragmentos de DNA de amplificados ao acaso. As setas indicam os marcadores polimórficos.
H. bihai
Os dados obtidos na análise das bandas foram utilizados para se estimar a similaridade genética entre os indivíduos de cada população a fim de se obter um dendrograma (Figura 3). Analisando o dendrograma gerado, pode-se observar que as duas populações formam dois grandes grupos bem distintos e dentro de cada população verificam-se pequenos agrupamentos. Os individuos BM1, BM2 e RM1, RM2 são as mães da progênie de H .bihai e H. rostrata, respectivamente. O indivíduo BC foi analisado como sendo suposto pai de ambas as populações. No grupo de H. bihai, o indivíduo BC aproximou-se mais dos agrupamentos formados pelos membros da progênie, principalmente dos três pequenos agrupamentos formados pelos indivíduos: 44, 37, 32, 43, 33, 39, 55, 54, 41, 36, 47, 45, 59 e 40 (Figura 3), tendo grandes chances de ser o genitor masculino, pois além do índice de similaridade apresentado ter sido de 0,85 em média, muitos indivíduos presentaram bandas idênticas às dele e que as mães não possuíam. No grupo de .
strat
a
ro
H a esse indivíduo apresentou baixo índice de similaridade (0,66 em média) com relação
aos membros da progênie, fazendo parte do grande agrupamento populacional dessa espécie, porém sem se agrupar especificamente com nenhum outro indivíduo. Portanto não se pode afirmar que os indivíduos que apresentaram bandas semelhantes às dele são seus filhos, porque essas bandas coincidiam com às das mães da progênie (RM1 e RM2), provavelmente esses indivíduos herdaram essas bandas da mãe e não do BC.
RM1M W
O índice de similaridade variou de 0,47 a 0,98 na população de Heliconia rostrata, e de 0,67 a 1,00 na população de H. bihai, mostrando, dessa forma, que a primeira população é mais heterogênea, ou seja, tem uma variabilidade genética maior (Figura 4). Entre as populações esse índice variou de 0,21 a 0,75; porém os indivíduos 29,30 (H. rostrata) e 39 (H. bihai) apresentaram um índice de 0,91, mostrando uma grande proximidade entre eles mesmo sendo de populações e espécies diferentes, não se sabe ao certo o motivo dessa proximidade. Através da análise de variância molecular (AMOVA), constatou-se que o grau de variação entre os indivíduos de cada população foi estatisticamente significativo, sendo a porcentagem de variação 57,33% entre as populações e de 42,67% dentro de cada população. 59 58 5756 55 54 53 52
0.24
0.24
12 51 50 49 48 47 46 45 44 43 42 41 40 39 38 3736 35 33 32 31 BC BM2 BM1 30 29 28 27 26 25 24 23 22 21 BC 20 19 18 17 16 15 14 13 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 RM2RM10.50
0.50
0.26
0.26
C2
C2
0.02
0.02
-0.22
-0.22
-0.46
-0.46
-0.56
-0.56
0.63
0.63
0.70
0.70
-0.36
-0.36
C1
C1
0.77
0.77
C3
C3
-0.16
-0.16
0.85
0.85
0.04
0.04
0.92
0.92
Heliconia bihai Heliconia rostrataFigura 4: Análise de coordenadas principais baseada nas estimativas de similaridade genética de duas populações de Heliconia, 31 indivíduos de Heliconia bihai e 33 de Heliconia
rostrata.
CONCLUSÕES
- A técnica de RAPD foi bastante útil e eficiente para se detectar rapidamente a variabilidade genética de indivíduos híbridos das espécies de helicônia estudadas.
- Foi possível verificar que através da obtenção de plantas de helicônia por meio de cultura de embriões extraídos de sementes alcançou-se considerável variabilidade genética, indispensável nos programas de melhoramento.
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