ABSTRACT
Guided bone and tissue regeneration using collagen-derived membranes (M) is a common practice. Topical application of tetracycline or its association to membranes intends to complement guided tissue regeneration, however, accelerated degradation was observed. Lysosomal enzymes are involved in the cell response to biomaterials. The aim of this work was to evaluate the effect of tetracycline association to the membrane (MT) obtained from demineralized bovine cortical bone to lysosomal enzymes. Membranes (M and MT) were implanted in the subcutaneous tissue of rats (n=120) 1, 3, 7, 14, 28 and 60 days after implantation the animals were killed and the granuloma removed for enzymatic analysis. Tissue lyses was obtained using 0.1M acetate buffer, pH 5.0, plus 1 mM of EDTA and β-mercaptoethanol for determination of acid phosphatase isoforms, cell membrane alkaline phosphatase, arilsulfatase and β-hexosaminadase activities. MT group showed higher lysosomal activity at 1, 3 and 7 days (p<0.05) than M group. Based on the results it could be concluded that the treatment of membranes with tetracycline signifi cantly altered the specifi c activity of the enzymes, increasing MT degradation in the tissue.
Key words: Membranes. Alkaline phosphatase. Enzymes.
RESUMO
A regeneração tecidual e óssea guiadas utilizando membranas (M) à base de colágeno é usual. A tetraciclina é utilizada algumas vezes para auxiliar a regeneração tecidual na forma tópica ou associada às barreiras absorvíveis, contudo acelerando a degradação da membrana. Enzimas lisossomais estão envolvidas na resposta celular a biomateriais. O objetivo deste estudo é avaliar o efeito da associação da tetraciclina à membrana derivada do osso cortical bovino desmineralizado (MT) na atividade de enzimas lisossomais. As membranas (M e MT) foram implantadas no tecido subcutâneo de ratos (n = 120) e 1, 3, 7, 14, 28 e 60 dias após a cirurgia os animais foram mortos e os respectivos tecidos reacionais coletados para análise bioquímica. O lisado do tecido foi obtido em tampão acetato 0,1 M, pH 5, contendo EDTA e β-mercaptoetanol 1 mM para a determinação da atividade das isoformas da fosfatase ácida, fosfatase alcalina de membrana e arilsultase e β-hexosamidase. No grupo MT observou-se maior atividade das enzimas lisossomais nos períodos de 1, 3 e 7 dias (p < 0,05). Os resultados obtidos permitem concluir que a associação de tetraciclina à membrana aumenta a atividade específi ca das enzimas analisadas, concorrendo para a aceleração da degradação da membrana + tetraciclina.
Palavras-chave: Membranas. Fosfatase alcalina. Enzimas.
Rodrigo Cardoso de OLIVEIRA1, Willian Fernando ZAMBUZZI2, Thelma Lopes da SILVA3, José Mauro GRANJEIRO4
Association of tetracycline and membrane of demineralized bovine cortical bone
increase lysosomal enzyme activity
Associação de tetraciclina à membrana de osso cortical bovino
desmineralizado aumenta atividade de enzimas lisossomais
1. Professor Doutor do Departamento de Ciências Biológicas, Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo, Bauru, SP, Brasil. 2. Pós-Doutorando em Enzimologia do Departamento de Bioquímica, Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP, Brasil. 3. Doutoranda em Biologia Funcional e Molecular do Instituto de Biologia, Universidade Estadual de Campinas, Campinas, SP, Brasil.
4. Professor Adjunto do Departamento de Biologia Celular e Molecular, Instituto de Biologia, Universidade Federal Fluminense, Niterói, RJ, Brasil. Professor Visitante da Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo, Bauru, SP, Brasil.
Endereço para correspondência:
José Mauro Granjeiro
Universidade Federal Fluminense - Instituto de Biologia Departamento de Biologia Celular e Molecular
Outeiro de São João Baptista, s/n - Campus do Valonguinho - Centro 24020-150 - Niterói - Rio de Janeiro - Brasil
E-mail: jmgranjeiro@vm.uff.br
Recebido: 11/02/2009 Aceito: 05/04/2009
A regeneração tecidual e óssea guiadas utilizando membranas à base de colágeno têm sido largamente utilizadas na clínica odontológica8,18,20, algumas vezes associadas à antibióticos como
a tetraciclina. Um estudo recente demonstrou que a associação de tetraciclina à membrana derivada do osso cortical bovino
desmineralizado promovia aceleração de sua degradação21.
Contudo, não se conhece até o momento o mecanismo pelo qual se dá essa maior degradação da membrana.
Determinados eventos fi siológicos e patológicos podem ser detectados, ou mesmo monitorados por marcadores biológicos. Especifi camente, os processos de degradação e remodelação tecidual são orquestrados pela atividade de enzimas lisossomais como fosfatase ácida, arilsulfatase, ß-hexosaminidase e proteases5.
Alguns relatos na literatura têm avaliado a possibilidade das fosfatases e enzimas lisossomais servirem como marcadores biológicos na tentativa de conhecer em maior detalhe os mecanismos celulares e moleculares frente a diferentes contextos1,10.
As fosfatases são hidrolases que utilizam como substratos fosfomonoésteres, as quais estão amplamente distribuídas na natureza, tendo sido encontradas em animais27, vegetais9
e em microorganismos13. Estas enzimas são divididas em 3
grupos principais: fosfatases alcalinas, fosfatases ácidas e proteínas fosfatases16.
Na natureza, o balanço entre a fosforilação e a desfosforilação de proteínas é a base para o controle de diversos eventos biológicos disparados por efetores extracelulares, como hormônios, mitógenos, carcinógenos, citocinas, neurotransmissores, substâncias ou metabólitos tóxicos17. Em consequência à ação destes efetores
ocorre regulação, principalmente, da divisão, diferenciação, desenvolvimento e morte celular3,12,27,29.
Nos últimos anos, tem sido investigado o potencial destas enzimas como biomarcadores teciduais em resposta a diferentes biomateriais xenogênicos e importantes resultados tem sido alcançados2,22-24,28. Assim, o objetivo geral deste trabalho foi
analisar o efeito da associação da tetraciclina à membrana de osso cortical bovino desmineralizado na atividade específi ca de enzimas lisossomais envolvidas na resposta tecidual ao implante da membrana.
MATERIAL E MÉTODOS
Um total de 120 ratos albinos da linhagem Wistar (Rattus norvegicus), machos adultos (70 dias e 250 g), provenientes do Biotério Central da Faculdade de Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo, foram divididos aleatoriamente em dois grupos de 60 ratos, os quais foram sacrifi cados em subgrupos de 10 animais cada após 1, 3, 7, 14, 28 e 60 dias da implantação da membrana. A pesquisa foi realizada segundo as normas
Animal (COBEA).
PREPARO DO MATERIAL
As membranas derivadas do osso cortical bovino desmineralizado (M) foram obtidas no mercado nacional e utilizadas conforme indicação do fabricante ou associadas à tetraciclina após imersão da membrana em solução de tetraciclina (5%) durante 10 minutos (MT). Todas as membranas utilizadas foram esterilizadas previamente por radiação gama (25 KGy).
PROCEDIMENTOS CIRÚRGICOS
Em todos os animais foi seguida a mesma sequência operatória21. Primeiramente os animais foram anestesiados via
intramuscular com associação de 0,5 mL/Kg de peso de Dopalen (Agribrands do Brasil Ltda., Paulínia,SP, Brasil) e Anasedan (Agribrands do Brasil Ltda., Paulínia,SP, Brasil) na proporção 1:1 (v:v). Seguiu-se a tricotomia e assepsia (com álcool iodado) da pele na região dorsal do animal. A incisão (1,5 cm) reta na pele dos animais foi realizada no centro da região dorsal, no sentido crânio-caudal. Utilizando uma tesoura de ponta romba, o tecido conjuntivo foi divulsionado para a colocação da membrana (1cm2). Foi realizada a sutura descontínua (fi o de seda 4.0) e assepsia com álcool iodado. Por todo o período experimental os animais receberam dieta normal ad libitum composta de ração granulada e água, sendo mantidos em gaiolas com forragem de maravalha.
Decorridos os períodos experimentais particulares a cada grupo de animal, o tecido reacional foi localizado visualmente e pela palpação, sendo removido da região original seguindo os mesmos procedimentos acima descritos. Em seguida os animais foram submetidos à eutanásia pelo deslocamento cervical, seguindo as normas éticas nacionais. Imediatamente após a coleta, as biópsias foram congeladas a -80°C e armazenadas até o momento da manipulação para a dosagem enzimática.
OBTENÇÃO DAS AMOSTRAS: EXTRATOS TECIDUAIS
A amostra, depois de descongelada, foi homogeneizada em tampão acetato 0,1 M, pH 5, contendo EDTA e β-mercaptoetanol 1 mM e centrifugada a 10.000 rpm durante 30 minutos. O sobrenadante constituiu o extrato a ser utilizado para a quantifi cação de proteína e da atividade enzimática das diferentes isoformas da fosfatase ácida (através da inibição diferencial por tartarato, fl uoreto, e pHMB), da arilsulfatase e β-hexosamidase (enzimas lisossomais). O precipitado foi ressuspendido em tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 7,5 (contendo Triton X-100 0,2%, MgCl2 2 mM e NaCl 150 Mm). Após 30 minutos à temperatura ambiente, a solução ressuspendida foi centrifugada a 12.000 rpm durante 20 minutos e o sobrenadante foi utilizado para a quantifi cação da fosfatase alcalina de membrana.
DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNA
Oliveira RC de, Zambuzzi WF, Silva TL da, Granjeiro JM
descrito anteriormente4 utilizando a albumina do soro bovino
como padrão.
DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE FOSFATÁSICA
- Fosfatase Ácida Solúvel: Fosfatase Ácida Total (FAT): Para um volume fi nal de 1,0 mL, a reação foi iniciada pela adição de 50 µL do extrato a um meio contendo 100 mM de tampão acetato de sódio, pH 5,0, e 5 mM do p-nitrofenilfosfato (pNPP). A paralisação ocorreu pela adição de 1,0 mL de NaOH 1,0 M, após incubação por 10 min a 37 °C14-15.
A formação do p-Nitrofenol foi determinada espectrofotometricamente pela leitura da absorção a 405 nm (espectrofotômetro Ultrospec 2000), tomando-se o valor de 18.000 M-1 cm-1 como coefi ciente de extinção molar da forma do p-nitrofenóxido6.
A FAT é constituída pela atividade de três isoformas distintas: fosfatase ácida resistente ao tartarato (FART), fosfatase ácida lisossomal (FAL) e fosfatase ácida de baixo peso molecular, com atividade fosfotirosina proteína fosfatase (PTP-BMr). Em resumo, FAT = FART + FAL + PTP-BMr. Na Tabela 1 temos um resumo do modo como a atividade de cada uma das isoformas pode ser determinada.
Tabela 1 - Determinação da atividade enzimática da fosfatase
ácida por meio de inibidores seletivos.
Atividade Inibidores
FAT sem inibidor
FART Tartarato e pHMB
FAL pHMB (inibe PTP-BMr); FAL = FAT – FART PTP-BMr Fluoreto e Tartarato (inibem FAL e FART)
Fosfatase Ácida Resistente ao Tartarato (FART): o
ensaio foi realizado como descrito acima, exceto pela adição de p-hidroximercuribenzoato (pHMB,1 mM) e Tartarato (10 mM). O pHMB inibe toda atividade da fosfatase ácida de baixo peso molecular (FABMr) e a atividade residual na presença do tartarato foi correspondente à FART.
Fosfatase Ácida Lisossomal (FAL): o ensaio foi realizado
como descrito acima, exceto pela adição de p-hidroximercuribenzoato (pHMB), um potente inibidor da FABMr14. A atividade obtida foi subtraída da Atividade FART uma vez que esta enzima não é inibida pelo pHMB.
Fosfatase Ácida de Baixa Massa Molecular Relativa: o
ensaio foi realizado como descrito acima, exceto pela adição de Tartarato e Fluoreto-inibidores das fosfatases de alto e médio peso molecular.
Determinação da Fosfatase Alcalina de Membrana (Falc): a atividade enzimática foi determinada a 37ºC, através da
formação do p-nitrofenol (coefi ciente de extinção molar de 18.000
M-1 cm-1, em pH alcalino), utilizando-se o tampão glicina 25 mM, pH 9,4, contendo 2 mM de MgCl2 e 1 mM de p-nitrofenilfosfato em um volume fi nal de 1,0 mL7. A reação foi iniciada pela adição de 0,05 mL da amostra obtida como indicado na Figura 3. Em todos os ensaios, uma unidade de atividade enzimática (UE) foi defi nida como a quantidade de enzima necessária para produzir 1 µmol de p-Nitrofenol por minuto. A atividade enzimática específi ca (AE) é expressa como unidade de atividade enzimática por miligrama de proteína (AE = UE/mg).
Determinação da Arilsulfatase: a atividade da arilsulfatase
foi determinada pelo método descrito por Waheed & Van Etten26.
O extrato foi incubado em meio de reação contendo 1,0mL de p-nitrocatecol-sulfato 5 mM em tampão acetato 0,05 M, pH 5,0. Após 30 minutos a reação foi paralisada pela adição de 1,0 mL de NaOH 1,0 M. A absorbância foi determinada pela leitura da cor do comprimento de onda de 515 nm. A unidade de atividade enzimática é defi nida como a quantidade de enzima que hidrolisa um µmol de substrato por minuto, sendo o coefi ciente de extinção molar do p-nitrocatecol de 1,24 x 104 M-1cm-1.
Determinação da β-hexosaminidase: a determinação da
ß-hexosaminidase foi realizada pelo método descrito por Taga25.
O extrato foi incubado em meio de reação contendo 1,0mL de p-nitrofenil-N-acetil-ß-D-glucosaminida 3 mM em tampão acetato 0,05 M, pH 4,5 a 37 0C. Após incubação por 20 minutos a reação
foi paralisada pela adição de 1,0 mL de NaOH 1,0 M.
Uma unidade de atividade enzimática é defi nida como 1 µmol de p-nitrofenol liberado por minuto, sendo o coefi ciente de extinção molar 1,8 x 104 M-1cm-1, no comprimento de onda de 405 nm.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
A análise estatística foi realizada utilizando o programa InStat®
(GraphPad Software, Inc.), utilizando um teste não paramétrico (Teste de Múltiplas Comparações de Dunn com análise estatística por Kruskal Wallis).
RESULTADOS
A atividade específi ca da FAT foi diferente para os dois grupos experimentais (M e MT) em todos os períodos (p < 0,05), exceto com 60 dias (Figura 1). De modo geral, a atividade da FAT nos dois grupos teve um aumento com o decorrer do tempo, ocorrendo atividade máxima no período de 7 dias no grupo M (28 nmol/min. mg) e 14 dias para o grupo MT (24 nmol/min.mg). A atividade da FAT nos períodos de 1, 3 e 14 dias foi maior no grupo MT, enquanto nos períodos de 7 e 28 dias a atividade registrada foi maior para o grupo M.
A atividade da fosfatase ácida lisossomal (Figura 2A) correspondeu, em média, a cerca de 30-40% da FAT, apresentando uma evolução temporal similar à da FAT. Picos de atividade aos
Figura 1 - Representação dos valores da atividade específi ca
(AE) da enzima fosfatase ácida total (FAT) para os dois grupos nos diferentes períodos experimentais. Diferença entre os grupos tratados e não tratados em cada período (* p < 0,05).
Figura 3 - (A) Gráfi co representando os valores da atividade
específi ca (AE) da enzima fosfatase ácida de baixa massa molecular relativa (PTPs) para os dois grupos nos diferentes períodos experimentais. Diferença entre os grupos tratados e não tratados em cada período (* p<0,05). (B) Gráfi co representando os valores da atividade específi ca (AE) da enzima fosfatase alcalina (Falc) para os dois grupos nos diferentes períodos experimentais. Diferença entre os grupos tratados e não tratados em cada período (* p < 0.01).
Figura 2 - (A) Representação dos valores da atividade específi ca
(AE) da enzima fosfatase ácida lisossomal (FAL) para os dois grupos nos diferentes períodos experimentais. Diferença entre os grupos tratados e não tratados em cada período (* p < 0,05). (B) Gráfi co representando os valores da atividade específi ca (AE) da enzima fosfatase ácida tartarato resistente (FART) para os dois grupos nos diferentes períodos experimentais. Diferença entre os grupos tratados e não tratados em cada período (* p < 0,05).
Pode-se observar que a atividade específi ca da FART foi extremamente baixa, sendo menor que 10% em relação à FAT. A atividade máxima observada ocorreu aos 7 dias pós-implantação para os grupos M e MT, com uma AE de 1,1 e 1,4 nmol/min.mg, respectivamente (Figura 2B). Em ambos os grupos a atividade enzimática após 60 dias foi similar ao observado no período inicial.
diferença entre as AE dos grupos experimentais M e MT perdurou até o período de 28 dias. A AE máxima para o grupo M ocorreu aos 7 dias (20 nmol/min.mg) e para o MT aos 14 dias (16,5 nmol/min. mg) (Figura 3A).
Bastante interessante foi o perfi l exibido pela fosfatase alcalina, cujo pico de atividade máxima ocorreu com 3 dias (M, 19 nmol/min. mg) e 1 dia (MT, 8 nmol/min.mg), diminuindo progressivamente e sem diferença signifi cativa após 14 dias, atingindo uma atividade residual por volta de 1,5 nmol/min.mg (Figura 3B). A atividade relativamente baixa da Falc após 28 dias, quando praticamente não se encontra mais a membrana no tecido, indica uma forte modulação desta enzima.
Um perfi l semelhante foi observado para a atividade de arilsulfatase cujos picos de atividade ocorreram nos períodos iniciais, entre 1 e 3 dias para M e MT. Após 28 dias a atividade não apresentou diferença em função do período ou tratamento da membrana (Figura 4A).
Os grupos experimentais apresentaram diferenças nos valores referentes à atividade específi ca da β-hexosaminidase nos períodos de 1, 3 e 14 dias, sendo maiores no grupo MT, com pico em 3 dias (Figura 4B). Esta enzima lisossomal mostrou um comportamento muito semelhante à arilsulfatase após 28 dias de implantação, onde diferenças não foram observadas entre os grupos e períodos experimentais.
Figura 4 - (A) Gráfi co representando os valores da atividade
específi ca (AE) da enzima arilsulfatase (ARIL) para os dois grupos nos diferentes períodos experimentais. Diferença entre os grupos tratados e não tratados em cada período (* p < 0,05). (B) Gráfi co representando os valores da atividade específi ca (AE) da enzima β-hexosaminidase (β-hexo) para os dois grupos nos diferentes períodos experimentais. Diferença entre os grupos tratados e não tratados em cada período (* p < 0,05).
DISCUSSÃO
Biomateriais à base de colágeno tiveram sua qualidade de aplicação clínica comprovada tanto na regeneração tecidual guiada como na regeneração óssea guiada8,18,20. Contudo, as bases
teciduais, celulares e moleculares da sua degradação ainda não foram completamente desvendadas11. Sabe-se que o processo de
degradação envolveu o recrutamento de células polimorfonucleares na fase inicial de infl amação aguda (dados não apresentados) 21-22. Essa fase também está relacionada ao trauma cirúrgico e os
achados histológicos correlacionaram-se positivamente com a maior atividade das enzimas lisossomais, FAL, arilsulfatase e ß-hexosaminidase. À medida que o processo infl amatório passa a ter um predomínio de macrófagos e células gigantes, com a respectiva diminuição no número de polimorfonucleares, a degradação das membranas acentua-se, em particular a partir do período de 14 dias, quando, ainda, a atividade lisossomal mantém-se em níveis similares aos períodos iniciais.
A quantifi cação da atividade específi ca das várias enzimas nos mostrou dados interessantes. Um dos pontos em comum que percebemos foi a diferença entre a atividade específi ca, de todas as enzimas analisadas, entre a membrana sem tratamento para a membrana com tetraciclina, nos períodos iniciais (1 e 3 dias). Na maioria das enzimas analisadas essa diferença entre os grupos experimentais se estendeu até o período de 7 dias (FAT, FAL, FART, PTPs e Falc).
A análise enzimática mostra claramente que a adsorção de tetraciclina à membrana induziu a uma atividade signifi cativamente maior da FAL, arilsulfatase e ß-hexosaminidase. Associando esta informação ao fato de que a membrana tratada com tetraciclina desapareceu mais rapidamente do tecido, podemos inferir que a ação destas enzimas possa ter sido preponderante para a absorção mais rápida da MT.
Tetraciclina é um antibiótico comumente usado que também parece desempenhar um papel importante na modulação da resposta imuno-infl amatória, verifi cada em várias doenças ósseas. A associação de um agente terapêutico (que impede a infecção bacteriana) a um biomaterial, com o objetivo de reparação e/ ou regeneração de defeitos ósseos, poderia contribuir para uma melhor previsibilidade de resultados clínicos.
A fosfatase ácida resistente ao tartarato (FART) é classicamente um marcador de osteoclastos19. Foi possível observar neste estudo
que, para ambos os grupos, a atividade FART foi extremamente baixa e discreta em relação às outras fosfatase. O aspecto microscópico das células gigantes em contato com as membranas implantadas (dados não apresentados) e a tênue atividade FART indicam que as células gigantes multinucleadas encontradas não possuem características de osteoclastos.
Quanto à fosfatase alcalina (Falc), utilizada como biomarcador para síntese de tecido ósseo, sua atividade foi discreta, o que já era esperado sabendo-se que sua atividade é maior em osteoblastos27,29 e os materiais testados não apresentam
capacidade osteoindutora.
O resultado obtido confi rma estudos anteriores que
demonstraram que a atividade das isoformas da fosfatase ácida são moduladas ao longo dos períodos experimentais, atuando na reabsorção de xenoenxerto bovino28.
Em conjunto, verifi ca-se que a atividade destas enzimas pode ser uma ferramenta interessante no estudo e desenvolvimento de biomateriais, a fi m de se determinar a intensidade da resposta tecidual ao material.
CONCLUSÃO
Concluímos que o processamento da membrana de osso bovino com a tetraciclina modifi ca signifi cativamente a resposta biológica, interferindo na atividade específi ca das enzimas analisadas, em particular das enzimas lisossomais, contribuindo para sua degradação acelerada.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem a Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo pelas bolsas concedidas (WFZ, 08/53003-9).
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