Dr. Sérgio Sousa
Estudante de Doutoramento em Ciências Veterinárias da Fa-culdade de Medicina Veterinária (FMV), Universidade de Lisboa (UL).
Bolseiro da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Bolsa de Doutoramento SFRH/BD/65407/2009.
Docente de Parasitologia e Patologia e Clínica das Doenças Parasitárias da Escola Universitária Vasco da Gama (EUVG). Escola Universitária Vasco da Gama (EUVG), Av. José R. Sousa Fernandes, Campus Universitário, Bloco B, Lordemão 3020-210 Coimbra, Portugal.
Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal (CIISA), Faculdade de Medicina Veterinária (FMV), Universidade de Lisboa (UL), Pólo Universitário do Alto da Ajuda, Avenida da Universidade Técnica, 1300-477 Lisboa, Portugal.
Prof. Doutor Adolfo Paz Silva
Professor Titular do Departamento de Patologia Animal. Faculdade de Veterinária de Lugo, Universidade de Santiago de Compostela.
Faculdade de Veterinária, Departamento de Patoloxia Animal, Campus Universitario, s/n, 27002 Lugo, España.
Prof. Doutor Luís Madeira de Carvalho
Professor Associado com Agregação de Parasitologia e Doen-ças Parasitárias, Departamento de Sanidade Animal, Faculda-de Faculda-de Medicina Veterinária, UniversidaFaculda-de Faculda-de Lisboa.
Centro de Investigação Interdisciplinar em Sanidade Animal (CIISA), Faculdade de Medicina Veterinária (FMV), Universidade de Lisboa (UL), Pólo Universitário do Alto da Ajuda, Avenida da Universidade Técnica, 1300-477 Lisboa, Portugal.
Financiado pela Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT), Bolsa de Doutoramento SFRH/BD/65407/2009
ratório e processamento laboratorial.2
As técnicas laboratoriais frequentemente utilizadas em copro-logia parasitária são simples e fiáveis, permitindo um diagnósti-co parasitológidiagnósti-co qualitativo rápido assim diagnósti-como uma avaliação quantitativa da infecção parasitária.3
COLHEITA DE FEZES
O procedimento de colheita da amostra fecal, a sua conserva-ção e envio ao laboratório, assim como o seu processamento laboratorial podem condicionar o diagnóstico coprológico.4
A colheita de fezes para exame parasitológico pode ser indi-vidual ou em grupo e sempre que possível a partir da ampola rectal do animal. É facilmente realizada por palpação digital nos pequenos animais ou por palpação rectal nos grandes animais, com o auxílio de luva obstétrica descartável ou saco de plástico, com lubrificante para reduzir o desconforto do animal.5
A colheita da amostra fecal a partir do solo é menos recomen-dada do que a anterior e deve ser realizada colhendo pequenas porções da superfície e do interior da matéria fecal recentemen-te emitida.1 A exposição e permanência da amostra fecal às condições ambientais pode, não só alterar a sua composição como, permitir a sua invasão por organismos coprófagos de vida livre, que contaminam a amostra com ovos e larvas e ain-da permitir o desenvolvimento dos organismos parasitas pre-sentes, alterando a sua viabilidade e morfologia.6 As alterações morfológicas das formas parasitárias presentes na amostra fecal podem dificultar um correcto diagnóstico parasitológico.4
A colheita de fezes a um grupo de animais deve ser feita de forma a se obter uma amostra representativa. Pelo que devem ser colhidas amostras a cerca de 10% dos animais, alguns dos quais doentes e outros saudáveis.1,6
A cada animal deve-se colher entre 50 a 100 gramas de fe-zes. No entanto, sempre que possível deve-se respeitar a indi-cação de 500 g de fezes para equídeos e bovinos, 100 a 50 g para pequenos ruminantes, suínos e canídeos, e de 50 a 20 g de fezes para gatos.6
CONSERVAÇÃO DAS FEZES
Quando o diagnóstico parasitológico não pode ser realizado logo após a defecação, a amostra fecal deve ser acondiciona-da e conservaacondiciona-da.3
A amostra pode permanecer no interior da luva ou saco de plástico, utilizados na recolha, ou pode ser transferida para um frasco de vidro ou de plástico com tampa hermética. O recipiente que acondiciona a amostra fecal deve ser estan-que e impermeável, não deve ser nunca de material poroso como cartão ou madeira, de forma a impedir a desidratação da
Exames coprológicos: Considerações para
um diagnóstico correcto
Dr. Sérgio Sousa; Prof. Doutor Adolfo Paz Silva; Prof. Doutor Luís Madeira de Carvalho O exame fecal permite evidenciar e identificar os parasitas que
utilizam as fezes como veículo das suas formas de dissemi-nação no exterior. Os parasitas do aparelho digestivo e seus órgãos anexos, como fígado, assim como do aparelho respira-tório produzem ovos ou larvas que abandonam o hospedeiro através das fezes.1
Para se proceder a um correcto exame coprológico é ne-cessário considerar os procedimentos básicos de colheita da amostra fecal, assim como da sua conservação, envio ao
labo-amostra com consequente alteração das formas parasitárias.1 A amostra fecal deve permanecer sem ar, de forma a atrasar o desenvolvimento das formas parasitárias.2
A conservação temporária da amostra fecal por refrigeração, entre 4 a 5ºC, permite interromper o desenvolvimento das for-mas parasitárias sem as inviabilizar, podendo ocorrer a retoma o seu desenvolvimento em laboratório.1
Para atrasar ou mesmo interromper o desenvolvimento das formas parasitárias presentes numa amostra fecal é neces-sário acondicioná-la em recipiente hermético e refrigerá-la à temperatura de 4 a 5ºC.4 Com este procedimento é possível conservar as formas parasitárias durante uma semana sem se observar alterações morfológicas consideráveis.7
A conservação definitiva das fezes com recurso a líquidos fixadores, como etanol a 70% e formaldeido a 10%, não permi-te o desenvolvimento pospermi-terior das formas parasitárias. Despermi-te modo quando se pretende identificar parasitas por coprocultu-ra a conservação definitiva não deve ser utilizada.1,2
ENVIO DA AMOSTRA FECAL AO LABORATÓRIO
A amostra fecal deve ser enviada ao laboratório perfeitamente acondicionada, conservada e correctamente identificada com a data, número e origem da colheita.8
A amostra deve ser acompanhada por um relatório com to-das as indicações importantes para um correcto diagnóstico laboratorial.3 Os dados sobre o animal, o proprietário, o Médi-co Veterinário assistente, a localidade, a doença ou parasitose suspeita, assim como o número de animais afectados ou mor-tos, sintomas e lesões, podem ser importantes para a realiza-ção de um correcto diagnóstico coprológico.8
PROCEDIMENTO GERAL DOS EXAMES FECAIS
Independentemente do procedimento laboratorial a desen-volver, é necessário respeitar as regras básicas de higiene de forma a diminuir o risco de zoonoses parasitárias assim como a disseminação de formas parasitárias para o meio ambiente.2
Em helmintologia, a coprologia recorre frequentemente à ob-servação directa da amostra fecal assim como à identificação morfológica das formas parasitárias como ovos, larvas e para-sitas adultos. Deste modo o conhecimento da sua morfologia é necessário para um correcto diagnóstico parasitológico directo.4
Exame macroscópico das fezes
O exame macroscópico das fezes pode auxiliar e orientar o diag-nóstico parasitológico. A aparência geral das fezes, a sua con-sistência e cor devem ser normais para o hospedeiro em causa.4 A alteração destas características pode indicar alguma infecção parasitária.8 O exame macroscópico das fezes permite realizar o diagnóstico parasitológico directo avaliando a presença de para-sitas adultos ou fragmentos destes na amostra de fezes.2
Exame microscópico das fezes
A identificação das formas parasitárias cujas dimensões são inferio-res ao limite de inferio-resolução do olho humano, como ovos e larvas de helmintes, só é possível por observação microscópica das fezes.2
Exame microscópico directo das fezes frescas O exame microscópico directo das fezes frescas, em prepa-rações lâmina-lamela, permite fazer um diagnóstico parasito-lógico correcto, no entanto este exame coproparasito-lógico apresenta uma baixa sensibilidade pela ocorrência frequente de resulta-dos falsos negativos. O facto de se observar uma pequena amostra fecal numa preparação microscópica com muito re-síduo, na qual se encontram diluídas as formas parasitárias, dificulta o correcto diagnóstico parasitológico.8
Exames fecais de concentração ou enriquecimento Os exames fecais de concentração ou enriquecimento são os mais frequentemente utilizados em coprologia veterinária.8
Estes exames permitem separar as formas parasitárias dos constituintes fecais e concentrá-las de modo a facilitar a sua observação. Para suspender e separar os constituintes fecais é necessária a utilização de uma solução que permita diluir a amostra fecal. Após obter uma suspensão fecal é possível es-tratificar os constituintes de acordo com as suas densidades ou gravidade específica. Esta estratificação pode ser lenta, devido apenas à acção da força da gravidade, ou rápida com a aplicação de uma força centrífuga. A centrifugação permite uma melhor separação entre as formas parasitárias e os res-tantes constituintes fecais, aumentando a sensibilidade dos métodos, sendo particularmente importante quando o número de formas parasitárias é muito baixo ou quando se utilizam so-luções viscosas que atrasem a separação dos vários consti-tuintes fecais.4
Quando não é possível centrifugar e não se pretende uma diminuição da sensibilidade do exame fecal, é frequente utilizar uma maior amostra fecal ou um período de repouso mais longo.8
Os exames fecais de concentração mais frequentemente utilizados baseiam-se na sedimentação ou na flutuação das formas parasitárias.1,2
Métodos de sedimentação
Os métodos de sedimentação utilizam soluções diluidoras me-nos densas do que as formas parasitárias e mais densas do que os restantes constituintes fecais. A diluição da amostra fecal em água, solução com gravidade específica de 1, permite a sedi-mentação de formas parasitárias mais densas e a flutuação dos restantes constituintes fecais, menos densos do que a água. As formas parasitárias concentram-se no sedimento de onde são facilmente recuperadas e observadas.8 Estes métodos de sedi-mentação são frequentemente utilizados para pesquisa de ovos de tremátodes, cuja densidade é superior a 1.4, sendo os ovos de nemátodes e céstodes, de densidade inferior a 1.2, frequen-temente observados em métodos de flutuação.3
Métodos de flutuação
Os métodos que se fundamentam na flutuação utilizam solu-ções mais densas do que as formas parasitárias e menos den-sas do que os restantes constituintes fecais de modo a estra-tificá-los e separá-los de acordo com a gravidade específica. Deste modo as formas parasitárias concentram-se à superfície
da mistura fecal, de onde podem ser facilmente recuperadas e observadas por microscopia, e os restantes constituintes fe-cais sedimentam.8
As soluções de flutuação podem ser escolhidas de acordo com a sua gravidade específica e composição. As soluções mais frequentemente utilizadas em métodos de flutuação com-preendem limites de gravidade específica entre 1.10 e 1.35, a 20ºC.1 Soluções de flutuação com gravidade específica entre 1.10 e 1.20 permitem a flutuação de uma grande variedade de formas parasitárias, como ovos e larvas da maioria dos nemá-todes e ovos de césnemá-todes. A flutuação de ovos de tremánemá-todes só é possível com soluções muito densas, com 1.30 a 1.35 de gravidade específica.4 O aumento da gravidade específica da solução promove a flutuação de mais constituintes fecais e aumenta o risco de deformação das formas parasitárias, difi-cultando a sua observação (Figura 1).5
As soluções de flutuação utilizadas em parasitologia vete-rinária incluem solução de açúcar a 1.20 e 1.25 de gravidade específica e várias soluções salinas como soluções de nitrato de sódio (NaNO3) a 1.20 e 1.30, sulfato de zinco (ZnSO4) a 33% com 1.18 de densidade, cloreto de sódio (NaCl) a 1.20 e sulfato de magnésio (MgSO4) a 1.32.8
A solução de flutuação de açúcar permite uma boa separa-ção entre os constituintes fecais, cristaliza lentamente e man-tém as formas parasitárias sem alterações morfológicas duran-te alguns dias.7 No entanto as soluções salinas são preferíveis à solução de açúcar devido à menor viscosidade e ao maior período de conservação.3
UTILIZAÇÃO DO MICROSCÓPIO ÓPTICO
A correcta utilização do microscópio óptico é fundamental para a observação de preparações assim como para o bom diag-nóstico parasitológico microscópico.2
A maior parte das formas parasitárias dos helmintes são des-coradas ou apresentam uma coloração que dificulta a sua dife-renciação no meio em que encontram, pelo que é importante
maximizar o contraste entre o parasita e o meio da preparação microscópica a observar. A forma de aumentar o contraste é pela utilização do condensador baixo, afastado da preparação microscópica, pela redução da intensidade da luz ou ainda pela diminuição da abertura da íris do diafragma.8
Quando há necessidade de tornar mais visíveis pequenas estruturas das formas parasitárias é utilizado o parafuso micro-métrico do microscópico óptico de forma a focar a imagem que se pretende observar.7
Observação microscópica de preparações
A observação microscópica deve ser o mais completa e sis-temática possível para que os resultados obtidos possam ser correctos e comparáveis (Figura 2).
A preparação microscópica deve ser examinada com am-pliações crescentes. A primeira observação deve ser rápida mas cuidada de forma a percorrer a totalidade da preparação e a identificar as formas parasitárias, apenas em caso de dúvida de diagnóstico ou necessidade de se obter medidas rigorosas deve-se utilizar ampliações maiores. Como exemplo de am-pliações mais utilizadas na observação de preparações para diagnóstico parasitológico directo pode-se referir as 40x, 60x, 100x, 200x, 400x resultantes da adição de objectivas de 4, 6, 10, 20, 40 a uma ocular de 10x, respectivamente.1,2
A ampliação de 1000x, com objectiva de 100x para óleo de imersão, não deve ser utilizada na observação de preparações a fresco, sem lamela ou de flutuação. O contacto da objectiva com a preparação pode danificar a lente ou a preparação. A pressão da objectiva sobre a preparação pode formar fluxos dificultando a observação.8
Medir as formas parasitárias microscópicas
A mensuração das formas parasitárias é muito útil quando se pretende identificar um parasita pouco comum ou quando di-ferentes organismos são morfologicamente semelhantes mas de diferentes tamanhos.3 Sendo que a maior parte das formas parasitárias utilizadas para diagnóstico microscópico medem entre 10 µm a 100 µm de comprimento.5
Calibrar a ocular micrométrica
Antes de medir é necessário calibrar a ocular micrométrica com as diferentes objectivas do microscópio.7
A ocular micrométrica é uma ocular particular que apresenta uma escala gravada na lente. As dimensões da escala e das
FIGURA 1.Efeito da gravidade específica na flutuação dos ovos.5
Muito baixa Ideal Muito elevada
FIGURA 2.Preparação lâmina-lamela. As setas indicam que a prepa-ração deve ser observada de forma sistemática.3
Detritos
Ovos Ovos
Detritos
Detritos Ovos
suas subdivisões dependem do fabricante e são diferentes de ocular para ocular. A lâmina micrométrica é uma lâmina de vi-dro sobre a qual se encontra gravada uma escala de 1 mm dividida em 100 partes iguais, sendo que cada divisão é igual a 1 mm/100 = 10 µm (Figura 3).8
Para que possa ser utilizada a ocular micrométrica deve ser calibrada individualmente com cada objectiva, sendo que a ca-libração ocorre apenas para uma objectiva e um microscópio particular1, visto que a ampliação real difere com o microscópio.5
A ocular micrométrica é inserida no tubo da ocular do mi-croscópio óptico e a lâmina micrométrica é colocada na platina do microscópio. A escala da lâmina micrométrica é focada e ajustada com a escala da ocular micrométrica de forma que ambas as escalas se sobreponham e se alinhem, com a linha do zero. Contam-se as divisões na escala da ocular micromé-trica e medem-se com a escala da lâmina micromémicromé-trica, como exemplifica o esquema da Figura 4.8
A ocular micrométrica deve ser calibrada com objectivas em ampliação crescente (4x, 10x ...) sendo que quanto maior for a ampliação da objectiva mas largas serão as linhas da esca-la da lâmina micrométrica (Figura 5) e mais rigorosa e precisa será a medição.3
CALCULAR O ÍNDICE DE AMPLIAÇÃO
Para cada microscópio e para cada objectiva deve ser regista-do o índice de ampliação que corresponde à medida, em µm, de cada uma das 100 divisões da escala da ocular micrométri-ca. Esta medida unitária deve ser calculada para as diferentes ampliações ou objectivas utilizadas.7 As Figuras 4 e 5 ilustram dois exemplos de cálculo de diferentes índices de ampliação para diferentes ampliações ou objectivas. Para uma mesma ocular micrométrica, de ampliação 10x, o índice de ampliação
FIGURA 3.Exemplo de lâmina e ocular micrométricas.5
Lâmina micrométrica
Ocular micrométrica Escala
FIGURA 4.Exemplo de calibração de uma ocular micrométrica com uma objectiva de 4x e uma ocular de 10x. As 45 divisões da ocular micrométrica correspondem a 0,76 mm (760 µm) da escala da lâmina micrométrica. Cada divisão da escala da ocular micrométrica corres-ponde a 16,9 µm (760 µm/45).5
FIGURA 5.Exemplo de calibração da ocular micrométrica de 10x com uma objectiva de 100x. As 73 divisões da ocular micrométrica corres-pondem a 0,07 mm (70 µm) da escala da lâmina micrométrica. Cada divisão da escala da ocular micrométrica corresponde a 0,96 µm (70 µm/73).5
objectiva de 100x.5
MEDIÇÃO DE UMA FORMA PARASITÁRIA
Em qualquer preparação microscópica as formas parasitárias podem ser medidas se o microscópio (ocular) estiver calibra-do. Para medir um objecto a ocular normal deve ser substituída por uma ocular micrométrica de forma a sobrepor e alinhar a escala da ocular micrométrica à forma parasitária a medir. O número de divisões da escala da ocular micrométrica que se sobrepõem ao parasita, são contadas e as divisões incom-pletas são estimadas.5,7 Multiplicar o número total de divisões sobrepostas da escala da ocular micrométrica com o parasita, pelo índice de ampliação da objectiva e microscópio utilizados, o que permite medir com rigor a forma parasitária. Como por exemplo, uma forma parasitária ocupa 3 divisões completas da escala da ocular micrométrica e 8/10 de uma divisão, quando observada com uma objectiva de 10x cujo índice de amplia-ção é 15 µm. O comprimento da forma parasitária é calculado multiplicando 3,8 pelo índice de ampliação utilizado, 3,8 x 15 µm = 57 µm.3
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