SCAFFOLDS DE COLÁGENO/ELASTINA/RESINA DE JATOBÁ:
OBTENÇÃO E CARACTERIZAÇÃO
Lívia Contini Massimino1, Valcinir Aloisio Scalla Vulcani2, Virginia da Conceição Amaro
Martins3, Ana Maria de Guzzi Plepis1,3
1Programa de Pós-Graduação Interunidades em Bioengenharia, Universidade de São Paulo, São Carlos (SP), Brasil
2Laboratório de Anatomia Animal, Universidade Federal de Goiás, Jataí (GO), Brasil 3Instituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos (SP), Brasil
E-mail: liviah.cm@gmail.com
Resumo. O objetivo deste estudo foi obter scaffolds de colágeno e elastina com adição ou não de resina de
jatobá. O colágeno foi extraído do tendão e a elastina da cartilagem auricular de bovinos, ambos por hidrólise alcalina. A resina de jatobá foi purificada e solubilizada em solução etanólica (1:20 massa/massa). Foram obtidos scaffolds de colágeno (SC) e das misturas de colágeno/elastina (SCE), colágeno/resina (SCJ) e colágeno/elastina/resina (SCEJ). Foram caracterizadas por DSC, MEV e cinética de absorção em PBS. As curvas DSC mostraram temperaturas de desnaturação (Td) de 50,6°C (SC), 53,2°C (SCE), 46,5°C (SCJ) e 50,9°C (SCEJ), indicando que a elastina leva a um pequeno aumento na Td, enquanto que a resina diminui. A associação de ambas com o colágeno não altera o valor de Td. As fotomicrografias mostraram scaffolds porosos. SC, SCJ e SCEJ apresentaram poros com tamanho médio de 84,6±14,3 µm, 78,3±11,6 µm e 64,3±13,6 µm, respectivamente. SCE mostrou poros em quantidade menor, com tamanho médio de 70,3±27,6 µm. Os scaffolds tem a seguinte ordem de capacidade de absorção: SCE≤SCEJ<SC<SCJ. A elastina influencia tanto no tamanho de poro quanto na capacidade de absorção, diminuindo-os; enquanto que a resina aumenta essas características.
Palavras-chave: regeneração tecidual, polímero natural, resina
1. INTRODUÇÃO
Engenharia tecidual é um campo interdisciplinar que emergiu no século XX e visa o desenvolvimento de substitutos biológicos que restaurem, mantenham ou melhorem a função de um tecido ou órgão lesado [Kaul e Ventikos, 2015]. Esses substitutos, denominados
scaffolds, têm como função promover um substrato temporário no qual células possam aderir,
migrar, proliferar e diferenciar [Ratner et al., 2004]. Devem ser biocompatíveis, serem produzidos de materiais biodegradáveis, possuírem uma grande área de superfície para adesão celular e terem boa integridade mecânica [Grover et al., 2012; Daskalova et al., 2014]. Para isso, diferentes tipos de biomateriais podem ser empregados, entre eles os biomateriais poliméricos, como o colágeno e a elastina.
O colágeno é a principal proteína estrutural encontrada na matriz extracelular de tecidos conectivos como pele, tendão, cartilagem, ossos e córnea [Daskalova et al., 2014]. Pode ser utilizado na sua forma nativa ou reconstituída, alterando suas propriedades mecânicas e biocompatibilidade, ou ainda sofrer modificação por meio de processos químicos [Batista et
al., 2009], físico-químicos [Zhang et al., 2005] ou enzimáticos, gerando uma matriz
colagênica carregada positiva ou negativamente, dependendo da aplicação que se deseja. Quando se emprega o colágeno em scaffolds, esse material normalmente dá ao tecido força
A elastina é uma importante proteína estrutural encontrada principalmente em tecidos que necessitam de maior elasticidade, como vasos sanguíneos, pulmão e pele [Daskalova et al., 2014]. O uso da elastina em scaffolds promove elasticidade e armazenamento de energia de tensão elástica [Grover et al., 2012]. Essa proteína exibe também propriedades interessantes como biocompatibilidade, estabilidade e apresenta diversos efeitos biológicos [Grover et al., 2012]. A presença da elastina pode influenciar na sinalização, quimiotaxia, proliferação e liberação proteática, permitindo o desenvolvimento de scaffolds altamente definidos [Daamen, 2006].
Outra estratégia no desenvolvimento de scaffolds para regeneração celular é o uso de aditivos que modificam as características dos biomaterias empregados para a obtenção de matrizes com porosidade e tamanho de poros específicos. Um exemplo de aditivo é a resina de jatobá, que é o exsudato produzido pelas árvores do gênero Hymenaea, gênero com cerca de quinze espécies localizadas entre as Américas do Norte e do Sul, México e África [Langenheim et al., 1978; Silva et al., 2012]. Na medicina popular é comum o uso de cascas, flores e resina de jatobá, sendo a resina indicada tanto para o tratamento de bronquites quanto para cicatrização de feridas quando empregada na forma de emplasto [Chaves e Barros, 2012]. É composta por diterpenos e sesquiterpenos, podendo possuir também flavonoides, lipídios, taninos, procianidinas e óleos essenciais [Silva et al., 2012; Vale et al., 2013]. Estudos indicaram atoxicidade para células sadias e efeito antigenotóxico, que pode ser atribuído a uma atividade antioxidante de alguns de seus componentes [Vale et al., 2013]. Assim, o emprego de polímeros naturais, como colágeno e elastina, bem como a associação de resina para a obtenção de substitutos biológicos é de grande valia, uma vez que a ancoragem das células em um scaffold está diretamente relacionada com o tamanho dos poros existentes [Daskalova et al., 2014].
2. MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 Obtenção do colágeno
O colágeno foi extraído a partir do tendão bovino conforme procedimento descrito em Horn (2009). Resumidamente, o tendão foi cortado e lavado com solução de 0,9% de NaCl para remoção de contaminantes. Em seguida, passou pelo processo de hidrólise alcalina, permanecendo em uma solução contendo cloretos, hidróxidos e sulfatos de K+, Ca2+ e Na+ por
72 h a temperatura ambiente; com posterior remoção dessa solução alcalina e adição de solução aquosa com os mesmos sais. Após, os sais foram removidos através de banhos alternados em soluções de ácido bórico 3%, água desionizada e EDTA 0,3% pH 11. Por fim, o colágeno foi extraído com uma solução de ácido acético pH 3,5 e sua concentração foi determinada por liofilização.
2.2 Obtenção da elastina
A elastina foi extraída de cartilagem auricular bovina e após limpeza passou pelo processo hidrólise alcalina, permanecendo em uma solução contendo cloretos, hidróxidos e sulfatos de K+, Ca2+ e Na+ por 24 h a 50°C. Após, o material foi lavado com água desionizada para remoção de sais até aproximadamente pH 6,0. A membrana resultante foi moída e liofilizada para a obtenção de fibras.
2.3 Purificação da resina de Jatobá
A resina de jatobá foi obtida no município de Jataí-GO, extraída de árvores adultas da espécie Hymenaea courbaril. Para a purificação, a resina foi macerada e peneirada; com o pó obtido foi feita uma solução de resina em etanol na proporção de 1:20 (massa/massa). A mistura foi aquecida até 50°C sob agitação por 1h em frasco fechado. Após resfriamento, foi filtrada para determinação do teor do conteúdo insolúvel e obtenção da concentração de resina em solução etanólica.
2.4 Preparação dos scaffolds
Os scaffolds foram preparados com o gel de colágeno (SC) e pela mistura do colágeno com a elastina na proporção de 1:1 (SCE). A resina de jatobá foi adicionada tanto no gel de colágeno (SCJ) quanto na mistura colágeno/elastina (SCEJ), utilizando-se 3,2 mg de resina/g de gel. As misturas foram colocadas em formas de teflon®, congeladas e liofilizadas a peso constante. Os scaffolds foram neutralizados utilizando-se vapor de amônia.
2.5 Calorimetria exploratória diferencial (DSC)
Para as análises foi utilizado equipamento DSC Mod 2010 (TA Instruments). Para a obtenção da temperatura de desnaturação do colágeno (Td), aproximadamente 20 mg de amostra foram colocadas em um suporte de alumínio hermético, sob fluxo de N2 de
80 mL min-1, com razão de aquecimento de 10°C min-1, com variação de temperatura de 25 –
120°C.
2.6 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
Para análises da morfologia dos scaffolds, as amostras foram previamente recobertas com uma fina camada de ouro, sendo utilizado um feixe de elétrons entre 10 e 20 keV em um equipamento LEO 440 (LEO Electron Microscopy Ltda), com um detector Oxford (Oxford
Instruments Inc.). Foram obtidas fotomicrografias da superfície e da secção transversal das
amostras. A partir das fotomicrografias foi estimado o tamanho médio dos poros utilizando o software UTHSCSA Image Tool®, com medida de no mínimo 20 poros diferentes em cada amostra.
2.7 Cinética de absorção de tampão fosfato salino (PBS)
Os scaffolds foram previamente pesados e então colocados em recipientes contendo PBS, sendo pesados em intervalos de tempo específicos. Este procedimento foi feito em triplicata. A capacidade de absorção de PBS do scaffold foi calculada pela média dos resultados encontrados usando a Equação (1):
(1)
sendo, %sol = percentual de solução absorvida pelo scaffold; mu = massa úmida e ms = massa seca.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os scaffolds obtidos podem ser vistos na Figura 1. As amostras mostraram aspecto semelhante, sendo que aquelas sem a resina se apresentaram coloração mais clara (Fig. 1A e 1B).
Figura 1 – Fotografia digital de (A) SC, (B) SCE, (C) SCJ e (D) SCEJ.
A Tabela 1 traz as temperaturas de desnaturação (Td) obtidas pela análise de DSC para as amostras estudadas.
Tabela 1 – Temperaturas de desnaturação (°C) para as amostras SC, SCE, SCJ e SCEJ obtidas por DSC. Amostra Td (°C) SC 50,6 SCE 53,2 SCJ 46,5 SCEJ 50,9
Pelos valores obtidos pode-se dizer que a elastina leva a um pequeno aumento na Td (SCE – 53,2°C), enquanto que a resina diminui (SCJ – 46,5°C) quando comparado com a Td do colágeno (SC – 50,6°C). Já a associação de ambas com o colágeno não altera o valor de Td (SCEJ – 50,9°C). Em todos os casos a presença de Td indica que a hélice tripla do colágeno permanece íntegra, já que a degradação do colágeno não mostraria tal transição [Batista et al., 2009].
A morfologia das amostras pode ser observada nas fotomicrografias por MEV (Fig. 3). Todas as amostras apresentaram poros em sua superfície, sendo que os scaffolds SC e SCJ apresentaram poros em grande quantidade, com tamanho médio de 84,6±14,3 µm e de 78,3±11,6 µm, respectivamente (Fig. 3A e 3C). SCEJ apresentou poros com tamanho médio de 64,3±13,6 µm (Fig. 3D). Já SCE mostrou poros em quantidade muito menor, com tamanho médio de 70,3±27,6 µm (Fig. 3B).
Figura 3 – Fotomicrografia da superfície no aumento de 500 x de (A) SC, (B) SCE, (C) SCJ e (D) SCEJ.
As fotomicrografias da secção transversal mostraram para todas as amostras mostraram poros interconectados (Fig. 4). Nota-se que os materiais utilizados influenciam no tamanho de poro, diminuindo-o, bem como na quantidade de poros, sendo que a resina leva ao aumento, enquanto que a elastina tende a diminuí-la. Como é necessário um tamanho ótimo de poro para a regeneração tecidual - que pode variar de 5 µm para neovascularização à 100-350 µm para regeneração óssea [Daskalova et al. 2014] - o uso de materiais que permitem um controle nas características dos scaffolds desenvolvidos é de grande interesse. Assim, com a associação de diferentes materiais - elastina e resina de jatobá - ao colágeno é possível modificar as características dos scaffolds.
Os scaffolds apresentam a seguinte ordem de capacidade de absorção: SCE≤SCEJ<SC<SCJ (Fig. 5). A presença de elastina leva a uma diminuição na capacidade de absorção, o que pode ocorrer devido à diminuição da porosidade das amostras. Já o uso da resina de jatobá aumenta a porosidade do scaffold, o que permite uma maior absorção de PBS. Essa capacidade de reter líquidos é uma importante característica, pois para que ocorra regeneração tecidual é necessário que tanto as células quanto os nutrientes permeiem pelo
scaffold. 0 25 50 75 100 125 0 1000 2000 3000 4000 5000 % Ab so rça o Tempo (min)
Figura 5 – Absorção de PBS para (○) SC, (Δ) SCE, (■) SCJ e () SCEJ.
4. CONCLUSÃO
O uso de materiais que permitem um controle das características durante a obtenção de
scaffolds é de grande valia, pois assim é possível estruturar matrizes apropriadas para cada
tipo celular. A associação de elastina e resina de jatobá ao colágeno permite a modificação da porosidade, do tamanho de poro e da capacidade de absorção, sem apresentar problemas na integridade das fibras de colágeno. Assim, esses materiais podem ser úteis no desenvolvimento de scaffolds visando a regeneração tecidual.
AGRADECIMENTOS
REFERÊNCIAS
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INSTRUCTIONS FOR SUBMISSION OF PAPERS TO THE
PROCEEDINGS OF COLAOB 2014
Lívia Contini Massimino1, Valcinir Aloisio Scalla Vulcani2, Virginia da Conceição Amaro Martins3, Ana Maria de Guzzi Plepis1,3
1Programa de Pós-Graduação Interunidades em Bioengenharia, Universidade de São Paulo, São Carlos (SP), Brasil
2Laboratório de Anatomia Animal, Universidade Federal de Goiás, Jataí (GO), Brasil 3Instituto de Química de São Carlos, Universidade de São Paulo, São Carlos (SP), Brasil
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Abstract. Collagen was extracted from the tendon and elastin from cattle auricular cartilage, both by alkaline hydrolysis. The jatoba resin was purified and solubilized in ethanolic solution in the proportion of 1:20 (mass/mass). Scaffolds of collagen (SC), collagen/elastin (SCE), collagen/resin (SCJ) and collagen/elastin/resin (SCEJ) were prepared and characterized by DSC, SEM and absorption kinetics in PBS. DSC curves showed
14.3 μm, 78.3 ± 11.6 μm and 64.3 ± 13.6 μm, respectively. SCE showed smaller pores, with an average size of 70.3 ± 27.56 μm. The scaffolds have the following order of absorption capacity: SCE≤SCEJ<SC<SCJ. Elastin influences both pore size and absorption capacity, decreasing them, while the resin enhances these characteristics. The control of these characteristics is of great value, as they are essential for cell growth and differentiation. Keywords: Tissue Regeneration, natural polymer, resin
