Carlos Henrique Camargo
Perfil clonal e fatores de patogenicidade de
Staphylococcus
spp. no prognóstico das
peritonites em diálise peritoneal
Orientador: Prof. Dr. Pasqual Barretti
Coorientadora: Profa. Dra. Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha
Botucatu, SP
2012
Tese apresentada à Universidade
Estadual
Paulista
“Júlio
de
Mesquita Filho”, Faculdade de
Medicina de Botucatu, para
obtenção do título de Doutor em
Fisiopatologia em Clínica Médica.
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE Camargo, Carlos Henrique.
Perfil clonal e fatores de patogenicidade de Staphylococcus spp. no
prognóstico das peritonites em diálise peritoneal / Carlos Henrique Camargo. – Botucatu : [s.n.], 2012
Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina de Botucatu
Orientador: Pasqual Barretti
Coorientador: Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha Capes: 40101002
1. Peritonite – Prognóstico. 2. Diálise peritoneal. 3. Estafilococos.
La science ne sert guère qu'à nous donner une idée de l'étendue de notre ignorance.
1 DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho aos meus pais, Claudio Henrique Camargo e Maria Silvia Rogani Camargo, modelos de ética, caráter e luta, pelo apoio, carinho e compreensão
incondicionais e incontestáveis.
Este trabalho é dedicado, ainda, a dois professores que me iniciaram na carreira científica aos quais serei eternamente grato: Prof. Emérito Augusto César Montelli e Profa. Dra. Terue Sadatsune.
2 AGRADECIMENTOS
A Deus, onipresente em todos os momentos de minha vida.
A meu orientador, Prof. Dr. Pasqual Barretti, pela confiança, aprendizado e conquistas.
A minha coorientadora, Profa. Dra. Maria de Lourdes Ribeiro de Souza da Cunha, pela disponibilidade e atenção.
À Prof. Dra. Jacqueline Costa Teixeira Caramori, ao Prof. Dr. Luis Cuadrado Martin, ao Prof. Dr. Alessandro Lia Mondelli, à Dra. Patrícia Yoshida
Faccioli-Martins, ao Prof. Dr. Roberto Jorge da Silva Franco, à Prof. Dra. Daniela Ponce pelas
valiosas sugestões no Exame Geral de Qualificação.
Aos professores e funcionários do Departamento de Clínica Médica que muito contribuíram para minha formação.
À Prof. Dra. Vera Lúcia Mores Rall e à Profa. Dra. Maria Fátima Sugizaki, pela indiscutível contribuição a meu crescimento pessoal e profissional.
Aos demais professores e funcionários do Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências de Botucatu, UNESP, que me acolheram durante todos estes anos.
Aos colegas, companheiros e amigos do Departamento de Microbiologia e Imunologia, pela convivência amigável e inesquecível, Valéria Cataneli Pereira, Danilo Flávio Moraes Riboli, Mariana Fávero Bonesso, Patrícia Yoshida
Faccioli-Martins, Lígia Maria Abraão, Fabiana Venegas Pires, Raquel Cordeiro Theodoro,
Tâmara Heloísa Rocha Prandini, Thales Domingos Arantes, Severino Assis da Graça
3 Aos colegas e amigos do Departamento de Clínica Médica, com os quais cursei disciplinas e compartilhei alegrias, frustações e desabafos, em especial Priscila Lucélia Moreira e Mariana de Souza Dorna.
Aos integrantes das comissões organizadoras das edições VI e VII do Encontro de Pós-Graduação da Faculdade de Medicina de Botucatu, pelo aprendizado e companheirismo.
Aos colegas e amigos XLIª Turma de Ciências Biológicas, Licenciatura, Noturno, Instituto de Biociências de Botucatu, que me acompanharam no início da formação e que muito contribuíram para escolhas que repercutem até hoje, em especial ao saudoso quinteto que integrei juntamente com Elisa Mari Kawamoto, Mariana de Almeida Barbosa, Samara Camaçarí de Carvalho e Tassiani Nunes Yamashita.
Aos queridos amigos Ariane Bruder-Nascimento, Sarah Hwa In Lee, Thiago Bruder do Nascimento, Talita Cristina Pimentel, Virgínia Bodelão Richini Pereira:
sempre presentes, nos momentos mais necessários.
Aos antigos e bons amigos que entenderam a minha “negligência social” em diversos momentos e que sempre me incentivaram, Andréia Soares Gonçalves, Bruna Carolina Trovão, Felipe Blanco Pozatto, Frederico Luiz Camillo Junior, Joice Helena
Fratoni Rice, Raquel Camalionte Castilho, Tálita Carvalho de Oliveira, Tiago de
Oliveira Soares e Vanessa de Fátima Cunha.
Aos meus irmãos Luciane Camargo e Guilherme Camargo, e a minha família, por compreenderem os momentos de afastamento e de exclusão, compartilharem os momentos de alegria e me apoiarem nas diversificadas dificuldades.
Aos funcionários da Seção de Pós-Graduação da Faculdade de Medicina de Botucatu, pela solicitude e paciência, em especial a Regina Célia Spadin por estar sempre pronta frente a qualquer solicitação.
4 Aos funcionários da Biblioteca do Campus de Botucatu, Grupo de Apoio a Pesquisa (GAP) e Fundação para o Desenvolvimento Médico e Hospitalar (FAMESP), pela disponibilidade e prestação de serviços.
Aos funcionários do Serviço de Diálise do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu.
Aos funcionários e amigos do Laboratório de Microbiologia da Seção Técnica Laboratorial de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu: Adriano Martison Ferreira, Ana Lúcia da Silva Rosa, Carina de Fátima de Síbia, Eneida Benato Seabra Spinelli, Jackson Eliezer Neves Batalha, Manoel Roque
Tomaz, Marcos Antonio Bronzato, Reonice Claudete Paniguel Barriquello e Virginia
Helena Gonçalves de Lima.
Aos novos colegas e amigos do Instituto Adolfo Lutz, Laboratório Central, pelo acolhimento e apoio.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pelo apoio financeiro que subsidiou a realização deste estudo (Processos 2009/12052-0 e 2009/15727-8).
5 SUMÁRIO RESUMO ... 6 ABSTRACT ... 8 INTRODUÇÃO ... 10 OBJETIVO GERAL ... 17 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 17 CASUÍSTICA E MÉTODOS ... 18 Métodos microbiológicos ... 19
Dados clínicos e demográficos ... 24
Associações clínico-microbiológicas ... 24 Métodos estatísticos ... 24 Aspectos Éticos ... 25 RESULTADOS ... 26 DISCUSSÃO ... 42 CONCLUSÕES ... 57 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 58 ANEXOS ... 67
6 RESUMO
1
As peritonites bacterianas se mantêm como a principal complicação do método de diálise 2
peritoneal, sendo as espécies de Staphylococcus os agentes mais frequentes destas infecções. As 3
infecções peritoneais devidas à espécie S. aureus apresentam pior evolução clínica, contrastando 4
com a maior resistência antimicrobiana apresentada pelos estafilococos coagulase negativa. As 5
características do agente, associadas às condições do hospedeiro, devem, portanto, estar 6
relacionadas à evolução de um episódio. Assim, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influência 7
do perfil clonal, dos fatores de virulência e da resistência antimicrobiana de Staphylococcus, 8
juntamente com fatores do hospedeiro, no quadro clínico e evolução de peritonites em pacientes 9
em diálise peritoneal, ocorridas na Unidade de Diálise do Hospital das Clínicas da Faculdade de 10
Medicina de Botucatu nos últimos 17 anos. Entre 1994 e 2011, 192 episódios, que ocorreram 11
em 118 pacientes, foram analisados. Os dados clínicos foram obtidos dos prontuários e fichas 12
médicas específicas. Nas amostras de Staphylococcus foram realizados testes específicos, 13
fenotípicos e/ou genotípicos, para detecção de fatores de patogenicidade e de susceptibilidade à 14
oxacilina e vancomicina; o perfil clonal foi determinado pela técnica de pulsed-field gel 15
electrophoresis. Modelo de regressão logística foi utilizado para avaliar a influência dos fatores
16
clínicos e microbiológicos no desfecho das peritonites. Além de S. aureus, outras espécies de 17
Staphylococcus foram identificadas (S. epidermidis, S. haemolyticus, S. warneri, S. hominis, S.
18
capitis, S. cohnii, S. saprophyticus, S. lugdunensis, S. simulans e S. xylosus). As peritonites por
19
S. aureus apresentaram maiores taxas de ocorrência hipotensão comparadas aos episódios por
20
estafilococos coagulase negativa (p<0,05), embora estes últimos tenham apresentado maior 21
proporção de amostras resistentes à oxacilina (p<0,001). Todas as amostras foram sensíveis à 22
vancomicina. A espécie S. aureus também apresentou maior proporção de isolados produtores 23
de enzimas e carreadores de genes de toxinas que os estafilococos coagulase negativa (p≤0,06), 24
exceto para os genes sec e sed (p>0,10). A análise do perfil clonal revelou diversidade genética, 25
a despeito da detecção de alguns clones de S. aureus e de S. epidermidis. Em modelo de 26
regressão logística, a espécie S. aureus apresentou menor chance de resolução de um episódio 27
(OR=0,343; IC 95% 0,126-0934; p=0,0525), e, entre os episódios causados por esta espécie, a 28
7 produção de beta-hemolisina (OR=0,135, IC 95% 0,026-0,686, p=0,0158) e a presença de 1
diabetes (OR=0,085, IC 95% 0,015-0475, p=0,005) se associaram à menor chance de cura. 2
Entre os estafilococos coagulase negativa, sensibilidade à oxacilina foi um preditivo 3
independente do melhor prognóstico (OR=2,627, IC 95% 1,040-6,634, p=0,041). Estes 4
resultados indicam que o desfecho da peritonite por S. aureus é fortemente influenciado pela 5
produção de beta-hemolisina e presença de diabetes mellitus, enquanto a resistência a oxacilina 6
é um preditivo de não-resolução das peritonites por ECN. 7
8 ABSTRACT
1
Bacterial peritonitis remains as the main cause of technique failure of peritoneal dialysis (PD) 2
and Gram-positive cocci, namely Staphylococcus spp., are the main etiological agents of such 3
infections. Peritonitis caused by Staphylococcus aureus presents poorer prognostic than 4
infections due to coagulase negative staphylococci (CoNS), even the antimicrobial resistance is 5
more pronounced in the last agents. Host and bacterial factors may influence, therefore, 6
peritonitis outcome. The objective of this study was to evaluate the influence of host and 7
bacterial factors (clonal profile, virulence and antimicrobial resistance determinants in strains of 8
staphylococci) on peritonitis clinical findings and outcome in patients from dialysis unit of 9
Botucatu Medical School, Brazil, from 1994 until 2011. A hundred ninety-two episodes due to 10
Staphylococcus were assessed. Genotypic or phenotypic tests were carried out to evaluate
11
virulence factors and antimicrobial susceptibility for oxacillin and vancomycin; clonal profile 12
was determined by pulsed-field gel electrophoresis. Logistic regression was used for the 13
analysis of demographic, clinical, and microbiological factors influencing peritonitis outcome. 14
Several species besides S. aureus were identified: S. epidermidis, S. haemolyticus, S. warneri, S. 15
hominis, S. capitis, S. cohnii, S. saprophyticus, S. lugdunensis, S. simulans, and S. xylosus.
16
Patients with S. aureus related peritonitis presented higher hypotension rate compared to the 17
episodes due to CoNS (p<0.05). Oxacillin resistance was more frequent among CoNS (p<0.05) 18
strains and vancomycin resistance was not detected, neither on S. aureus nor CoNS. S. aureus 19
strains also presented higher enzymes and virulence genes than the others species (p<0.05), 20
except for sec and sed genes (p>0.10). Clonal profile analyses showed high diversity of strains 21
causing peritonitis, although some clones of S. aureus and S. epidermidis could be identified. 22
The logistic regression model showed that peritonitis due to S. aureus presented worst outcomes 23
(OR=0.343; IC 95% 0.126-0.934; p=0.0525) and that beta-hemolysis production (OR=0.135, IC 24
95% 0.026-0.686; p=0.0158) and diabetes mellitus (OR=0.085, IC 95% 0.015-0475; p=0.005) 25
were independent predictors of non-resolution of S. aureus infections. Among CoNS related 26
infections, oxacillin resistance (OR=2.627, IC 95% 1.040-6.634; p=0.041) was independent 27
predictor of non-resolution of peritonitis. These results indicate that outcome of PD-related 28
9
Staphylococcus aureus peritontis is strongly influenced by beta-hemolysin production and
1
diabetes mellitus, while oxacillin-resistance is an independent predictor of non-resolution 2
among episodes caused by CoNS. 3
10 INTRODUÇÃO
1
A doença renal crônica é importante causa de procura por serviços de saúde, 2
apresentando taxas relevantes de morbidade e mortalidade (1). Em 2011, cerca de 3
91.000 pacientes estavam em tratamento dialítico no Brasil (2). O transplante renal é o 4
método substitutivo da função renal mais eficiente e com melhores resultados, mas tem 5
as limitações relacionadas à idade avançada dos pacientes e suas comorbidades, 6
condições altamente prevalentes nos dias atuais. A hemodiálise e a diálise peritoneal 7
(DP) surgem, então, neste cenário, como métodos alternativos ao transplante renal, com 8
validade e resultados bastante satisfatórios como observado nas últimas décadas. A DP 9
apresenta potenciais vantagens sobre a hemodiálise no que diz respeito à mobilidade e 10
qualidade de vida do paciente (3). Por outro lado, a perda da capacidade de ultrafiltração 11
da membrana peritoneal e as infecções figuram como as principais complicações desse 12
método. 13
As peritonites são consideradas a complicação mais grave da DP (4-6) por 14
apresentar reflexos nas taxas de morbidade, mortalidade e transferência de método 15
dialítico (7). As principais vias de acesso do micro-organismo ao peritônio nas 16
peritonites bacterianas são a intraluminal, a extraluminal e a transmural (8-10). As 17
infecções intraluminal e extraluminal (infecção do túnel, por exemplo) estão mais 18
associadas a agentes ambientais e colonizantes da pele, como Staphylococcus e 19
bastonetes Gram-positivos diversos, enquanto a peritonite transmural tem como 20
principais agentes etiológicos bactérias da família Enterobacteriaceae, enterococos e 21
leveduras do gênero Candida, que são colonizantes intestinais (9). O carreamento de 22
bactérias, portanto, é um fator de risco para aquisição de peritonite. Já está bem 23
caracterizada a relevância da colonização nasal por S. aureus para manifestação de 24
peritonites (11-13). Em relação às demais espécies de Staphylococcus, Eisenberg et al 25
11 (14) também encontraram amostras de estafilococos coagulase negativa colonizadoras e 1
causadoras de peritonites em pacientes submetidos à DP. Apesar do pior prognóstico 2
das peritonites por leveduras, bacilos negativos e micobactérias, os cocos Gram-3
positivos são os agentes mais incidentes das infecções peritoneais (4, 15), sendo os 4
estafilococos os mais frequentes dessa complicação (4, 15-19). 5
O gênero Staphylococcus compreende 47 espécies, sendo importantes para 6
infecções em humanos o S. aureus e certas espécies de estafilococos coagulase negativa 7
(ECN), como S. epidermidis, S. haemolyticus, S. warneri entre outras (20). Os ECN são 8
os agentes mais frequentes das peritonites, embora as infecções causadas por S. aureus 9
apresentem pior evolução e maior taxa de mortalidade (21). Peritonites por ECN 10
evoluem para cura, sem outras complicações, na maior parte dos casos (21), com cerca 11
de 0,5% de mortalidade. Entretanto, pelo menos metade dos episódios por S. aureus 12
cursam com infecção persistente e reduzida taxa de resolução (22, 23), sendo que 13
mortalidade de 15,2% foi relatada por Pérez Fontan et al (7). Comparações entre 14
peritonites causadas por S. aureus com aquelas por ECN, invariavelmente mostraram 15
menor taxa de resolução entre os primeiros (18, 22-24). 16
Contrastante com o pior prognóstico verificado pelas peritonites ocasionadas por 17
S. aureus, maiores proporções de resistência à meticilina (ou à oxacilina) são 18
observadas entre isolados de ECN (25-27). Ainda que somente a resistência 19
antimicrobiana não possa explicar a pior evolução das peritonites por S. aureus, há que 20
se considerar que os métodos fenotípicos, em alguns casos, podem fornecer resultados 21
questionáveis, uma vez que isolados com heterorresistência à oxacilina, mediada pelo 22
gene mecA, podem não ser detectados nos testes in vitro (28). Os métodos mais 23
sensíveis e específicos para detecção da resistência à oxacilina em Staphylococcus são 24
os testes moleculares, como a pesquisa do produto do gene mecA, a PBP2-a, uma 25
12 transpeptidade envolvida na síntese do peptideoglicano bacteriano, ou do próprio gene, 1
pela técnica da reação da polimerase em cadeia (PCR) (29). 2
Em isolados com resistência à oxacilina, a droga de escolha para o tratamento de 3
peritonites por Staphylococcus é a vancomicina (6). Até o momento, foram descritos 4
apenas relatos esporádicos de resistência à vancomicina em S. aureus (30), na maioria 5
deles com tratamento prolongado do paciente com esta droga. A detecção acurada da 6
resistência à oxacilina é importante, portanto, para prevenir a utilização desnecessária 7
da vancomicina e a emergência de amostras não sensíveis (seja resistente, com 8
susceptibilidade intermediária e/ou heterorresistência) a este antimicrobiano (6, 30). 9
A presença do gene mecA resulta em resistência a todos os antimicrobianos 10
betalactâmicos em Staphylococcus, com exceção das novas cefalosporinas ceftobripol e 11
ceftarolina, ativas contra S. aureus resistentes à meticilina (MRSA), mas ainda não 12
disponíveis no Brasil (29). Esse gene é carreado em um cassete cromossômico 13
estafilocócico (SCCmec), de estruturação variável, e que pode ser tipado, com 14
finalidade epidemiológica mas que pode ter utilidade clínica (28, 31, 32). Atualmente 15
11 tipos de SCCmec estão descritos (33), dos quais são mais frequentes os tipos I a V. 16
Os tipos I, II e III são, historicamente, os cassetes mais encontrados no ambiente 17
hospitalar, associados a maiores taxas de multirresistência aos antimicrobianos, 18
enquanto os cassetes IV e V são aqueles encontrados em amostras isoladas de pacientes 19
comunitários, com menores taxas de resistência a antimicrobianos, mas, com maior 20
potencial de carrear genes de virulência (28, 32). Esta divisão, contudo, não está mais 21
tão evidente, conforme observado há alguns anos: diversos casos de infecções 22
relacionadas à assistência à saúde, em hospitais, foram associadas a Staphylococcus 23
com SCCmec tipo IV, enquanto infecções tipicamente comunitárias foram causadas por 24
cepas com SCCmec dos tipos I, II ou III (34-36). Estudos unicêntricos do perfil de 25
13 sensibilidade dos micro-organismos aos antimicrobianos são desejáveis para eventuais 1
adequações da terapia antimicrobiana empregada (35). 2
Além da resistência antimicrobiana, outros fatores do micro-organismo podem 3
estar associados ao pior prognóstico das peritonites causadas por S. aureus (27). A 4
produção de biofilme, por exemplo, é apontada como um fator associado às recidivas 5
(37). O biofilme é uma estrutura complexa, constituída de células do micro-organismo e 6
uma substância amorfa, que proporciona à bactéria capacidade de adesão a superfícies 7
plásticas e lisas, dificultando a ação de células fagocitárias e de componentes do sistema 8
complemento, e o acesso de antimicrobianos (38). 9
A produção bacteriana de exoproteínas, como enzimas hidrolíticas e toxinas, é 10
bastante conhecida (39): proteases, lipases, nucleases, colagenases, leucocidina e outras 11
enzimas produzidas pela maior parte das linhagens de S. aureus podem converter 12
componentes teciduais em nutrientes, facilitando o crescimento bacteriano e sua 13
capacidade invasora. Significativo número de linhagens estafilocócicas produz toxinas, 14
como a toxina do choque tóxico (TSST-1), as enterotoxinas (A, B, C, D, E, G, H, I,) e 15
outras. A TSST-1 e as enterotoxinas são conhecidas por suas propriedades pirogênicas, 16
tóxicas e de superantigenicidade, além de efeitos biológicos como a potente atividade 17
emética das enterotoxinas, a capacidade de romper barreiras mucosas da TSST-1 e a 18
agressão direta das células endoteliais, descrita para TSST-1 e enterotoxina B, que 19
resulta em hipotensão e aumento da permeabilidade capilar (39, 40). 20
A influência dessas toxinas e enzimas na patogênese das peritonites em diálise 21
peritoneal é pouco estudada. Al-Wali et al (41) encontraram maior proporção de 22
amostras produtoras de enterotoxina B em cepas de S. aureus causadoras de peritonites 23
do que aquelas isoladas de narinas de indivíduos hígidos. Haslinger-Löffler et al (42) 24
14 mostraram que a hemolisina alfa, produzida por S. aureus, induziu morte celular 1
caspase-independente em células mesoteliais de peritônio humano. 2
Recentemente, Barrettiet al (27) analisando 86 novos episódios de peritonites 3
estafilocócicas observaram que a etiologia S. aureus e a produção de biofilme foram 4
fatores independentes associados a não resolução do episódio. Marcante produção de 5
toxinas e enzimas pelas linhagens de S. aureus foi detectada, fato raramente observado 6
entre os ECN, o que pode ter contribuído para a menor taxa de resolução dos episódios 7
por S. aureus. 8
A detecção dos fatores de virulência pode ser dificultada se pequena quantidade 9
estiver sendo produzida. Como alternativa, pode-se pesquisar o gene que codifica 10
determinado fator; neste sentido, a reação da polimerase em cadeia (PCR) tem como 11
vantagens as altas sensibilidade e especificidade (43). Uma limitação deste método, no 12
entanto, diz respeito à incapacidade da técnica verificar a expressão do gene encontrado. 13
Outras técnicas, como a PCR com transcrição-reversa (RT-PCR), a PCR quantitativa 14
(qRT-PCR) ou o Western Blot são empregadas para esta finalidade (44). 15
Aspecto também pouco estudado no âmbito das peritonites em DP diz respeito 16
ao polimorfismo encontrado no genoma bacteriano. Métodos convencionais, como a 17
tipagem por provas metabólicas e perfil de susceptibilidade antimicrobiana, são 18
ferramentas pouco precisas para tipagem de micro-organismos, pois refletem apenas um 19
pequeno fragmento do genoma. A maioria desses métodos fenotípicos agrupa isolados 20
dentro de poucos grupos com base em características físicas ou químicas que podem ser 21
inadequadas para a distinção das linhagens bacterianas. Métodos genômicos 22
moleculares oferecem maior discriminação e detalhamento que métodos fenotípicos, e 23
podem distinguir um organismo. Bactérias provenientes de um ancestral comum 24
15 (clones) apresentam em seu genoma sequências que podem ser acessadas pela clivagem 1
ou amplificação do material genético. Esses processos determinam segmentos de 2
tamanho variável, interpretáveis em corridas eletroforéticas (45, 46). A Pulsed-field gel 3
electrophoresis (PFGE) é atualmente o método de escolha para estudos de tipagem 4
molecular de uma grande variedade de bactérias, incluindo S. aureus e ECN (47-49). 5
É possível que alguns clones de S. aureus sejam mais propensos que outros a 6
determinar doença invasiva, o que pode ser devido à presença de fatores de virulência, 7
como os relacionados à secreção de exotoxinas, hemolisinas, leucocidinas e produção 8
de biofilme (50). Embora fatores de virulência tenham sido identificados no genoma de 9
clones de S. aureus (51), o potencial patogênico e invasivo dos mesmos ainda é pouco 10
conhecido. 11
Com o uso de tipagem molecular, Monsen et al (52) verificaram a disseminação 12
clonal de S. aureus e S. epidermidis isolados de líquido peritoneal de pacientes com 13
peritonites. A tipagem possibilitou ainda verificar a persistência de um clone de S. 14
epidermidis em um único paciente, ao longo de 4 meses, a despeito das variações 15
observadas em seu perfil de susceptibilidade antimicrobiana. Em outro estudo com 16
menor casuística, a disseminação clonal de S. aureus não foi observada (53), mas maior 17
poder discriminatório do PFGE também foi verificado quando comparado à 18
antibiotipagem. 19
É necessário lembrar também que fatores relacionados ao hospedeiro podem 20
influir no prognóstico das peritonites. Analisando os dados de 20 anos de diálise 21
peritoneal da Unidade de Diálise do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de 22
Botucatu, UNESP, Caramori (54) verificou a influência da idade na sobrevida dos 23
pacientes na primeira década, e da escolaridade na segunda. Esta autora ainda encontrou 24
16 correlação entre o analfabetismo, a cor da pele e a presença de diabetes, influenciando o 1
risco de óbito. Apesar da possível influência dos fatores relacionados ao hospedeiro, 2
demográficos, clínicos e laboratoriais na evolução das infecções peritoneais, descrições 3
a esse respeito são raramente relatadas (18, 21), o que motivou a realização deste 4
estudo, avaliando os fatores do agente e do hospedeiro que podem influenciar o 5
prognóstico das peritonites por Staphylococcus em pacientes submetidos à diálise 6
peritoneal. 7
17 OBJETIVO GERAL
1
Avaliar a influência dos fatores microbiológicos e do hospedeiro, no quadro 2
clínico e evolução de peritonites causadas por Staphylococcus spp., em pacientes em 3
diálise peritoneal, ocorridas em um único centro universitário nos últimos 17 anos 4 (1994-2011). 5 6 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 7
Nas amostras de S. aureus e ECN isoladas de pacientes em diálise peritoneal e 8
com quadro de peritonite: 9
analisar o perfil clonal pela técnica de eletroforese em campo pulsado (PFGE); 10
determinar a susceptibilidade in vitro à oxacilina e vancomicina, e pesquisar a 11
presença do gene mecA de resistência à oxacilina; 12
determinar fenotipicamente a produção de hemolisinas e de enzimas; 13
detectar os genes dos fatores de patogenicidade (para produção de biofilme e 14
toxinas) e determinar o tipo de SCCmec; 15
estabelecer associações entre as características microbiológicas do agente causal 16
com a evolução clínica e as complicações dos episódios de peritonite. 17
18 CASUÍSTICA E MÉTODOS
1
Foram estudados, retrospectivamente, os dados microbiológicos e clínicos dos 2
episódios de peritonite bacteriana ocorridos de 1994 a 2011, em pacientes portadores de 3
insuficiência renal crônica, tratados por DP, na Unidade de Diálise do Hospital das 4
Clínicas da Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP, Brasil, que tiveram 5
identificação de S. aureus e ECN, em cultura de efluente peritoneal. Foram incluídos no 6
estudo os casos com amostras viáveis para realização dos testes laboratoriais e que 7
apresentaram dados clínicos consistentes nos registros de prontuários. Foram excluídos: 8
os casos que apresentaram amostras microbiológicas inviáveis e/ou dados incompletos 9
nos registros de prontuários; casos associados à infecção do local de saída do cateter 10
peritoneal ou infecção do túnel (quando constatado o mesmo agente da peritonite ativa); 11
casos tratados com protocolos diferentes dos preconizados pela Sociedade Internacional 12
de Diálise Peritoneal (ISPD) (4, 6). De acordo com a literatura atual, as seguintes 13
definições serão utilizadas no decorrer do trabalho: 14
Peritonite: ocorrência de efluente peritoneal turvo e acompanhado de elevação da 15
celularidade peritoneal no efluente da diálise, com mais de 100 células/mm3 e 16
predomínio de polimorfonucleares (4, 6). 17
Nova Infecção: corresponde ao primeiro episódio de peritonite do paciente ou episódio 18
diagnosticado após 28 dias, depois do término do tratamento de um surto anterior, que 19
teve como causa um agente distinto (22, 23). 20
Recidiva: episódio de reaparecimento dos sinais e sintomas de peritonite, no decorrer 21
dos primeiros 28 dias depois de cessado o tratamento antimicrobiano, com crescimento 22
em cultura do mesmo agente microbiano isolado anteriormente (4, 6). 23
19 Repetição: episódio de peritonite ocorrido após 28 dias do término do tratamento 1
antimicrobiano, com crescimento em cultura do mesmo agente microbiano identificado 2
anteriormente(4, 6). 3
Recorrência: episódio de peritonite ocorrido dentre os primeiros 28 dias do término do 4
tratamento antimicrobiano, com crescimento em cultura de agente microbiano diferente 5
do identificado anteriormente (4). 6
Cura: o desaparecimento dos sinais e sintomas de peritonite, associado à cultura 7
negativa do efluente da diálise, realizada pelo menos 28 dias após o término do 8
tratamento antimicrobiano (4). 9
Refratariedade: ausência de melhora clínica e redução da celularidade após 5 dias de 10
tratamento guiado pelo teste de susceptibilidade antimicrobiana (4). 11
Óbito relacionado à peritonite: aquele que ocorre em um paciente com peritonite ativa 12
ou internado com peritonite, ou ocorrido dentro de duas semanas após o início do 13
episódio (4). 14
Métodos microbiológicos 15
Cultura e armazenagem: após o diagnóstico clínico de peritonite, conforme as 16
recomendações da ISPD (4, 6), 50mL de efluente peritoneal da última bolsa trocada 17
pelo paciente foram assepticamente coletados e imediatamente encaminhados para o 18
Laboratório de Análises Clínicas – Setor de Microbiologia, Hospital das Clínicas da 19
Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP. O efluente foi centrifugado por 15 20
minutos, a 3000rpm, sendo o precipitado ressuspenso em 10mL de solução salina 21
estéril, e injetado em frascos para processamento automatizado (BACTEC, BD). Após a 22
identificação dos micro-organismos isolados do líquido peritoneal, os mesmos foram 23
encaminhados para armazenamento a -70°C na Coleção de Culturas do Departamento 24
20 de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biociências de Botucatu, UNESP. Para o 1
presente estudo, as amostras estocadas de Staphylococcus foram isoladas em placas 2
contendo ágar-sangue (Oxoid) de carneiro a 5%, para confirmação da pureza e 3
viabilidade. 4
Identificação: os isolados foram analisados à microscopia para caracterização 5
morfotintorial pelo método de Gram, e submetidos às provas de catalase e coagulase em 6
tubo. Os isolados de ECN foram identificados pelo método simplificado proposto por 7
Cunha et al (55). 8
Avaliação da sensibilidade in vitro aos antimicrobianos: a sensibilidade in vitro das 9
amostras de S. aureus e ECN foi avaliada para os antimicrobianos oxacilina e 10
vancomicina. A concentração inibitória mínima (MIC) dessas drogas foi determinada 11
através do E-test, conforme orientações do fabricante. Os resultados da MIC foram 12
categorizados em sensível, intermediário ou resistente, de acordo com as definições do 13
Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (29) (Anexo 1). 14
Caracterização da virulência 15
Determinação da produção de lipase e lecitinase: a atividade lipolítica foi 16
evidenciada em placas contendo Blood Agar Base (Oxoid) enriquecido com 0,01% de 17
CaCl2.2H2O e 1% de Tween 80 (Inlab). As linhagens foram inoculadas em spot e, após 18
incubação a 37ºC por 18h e por mais 24h à temperatura ambiente, foram analisadas 19
quanto ao aparecimento de opacidade ao redor do crescimento, o que caracterizou 20
resultado positivo. Já a produção de lecitinase foi avaliada em meio de Baird-Parker 21
(Oxoid), adicionado de 5,0% de solução de gema de ovo a 50% e 1,0% de telurito de 22
potássio (K2TeO3). Resultado positivo foi indicado pela formação de halo transparente 23
ao redor do crescimento (56). 24
21 Determinação da produção de DNAse e TNAse: para pesquisa de 1
desoxirribonuclease (DNase) e termonuclease (TNase) foi utilizada a técnica da difusão 2
metacromática em ágar azul de ortotoluidina-DNA (57). Para a detecção de DNAse, 3
foram utilizados os sobrenadantes obtidos a partir do cultivo de linhagens de S. aureus e 4
de ECN em caldo Brain Heart Infusion (BHI; Himedia), previamente incubadas a 37ºC 5
por 24h e centrifugadas por 10 minutos a 8.000g/4ºC. Os sobrenadantes foram 6
colocados em orifícios de 7mm de diâmetro perfurados no ágar e incubados a 50ºC por 7
4h. Para determinação da produção de TNAse, os sobrenadantes foram aquecidos em 8
banho-maria (100ºC) por 20 minutos e colocados nos orifícios. Para ambas as 9
determinações, o resultado da atividade nucleásica foi expresso medindo-se em 10
milímetros o diâmetro do halo róseo formado no meio de difusão. A interpretação dos 11
resultados positivos foi realizada por meio da comparação dos halos obtidos com 12
linhagem padrão de Staphylococcus aureus (ATCC 25923), DNAse e TNAse positivas. 13
Determinação da produção de hemolisinas: a determinação da produção de 14
hemolisinas alfa e beta foi realizada em placas de Petri contendo Blood Agar Base, uma 15
adicionada de 5% de sangue de coelho e outra de 5% de sangue de carneiro. As 16
linhagens, semeadas individualmente pela técnica de esgotamento, foram incubadas a 17
37ºC por 24h, objetivando-se a detecção da hemolisina alfa. Para a caracterização da 18
hemolisina beta, as placas foram mantidas a essa temperatura por 24h e posteriormente 19
incubadas em geladeira por mais 72h. Resultado positivo foi indicado pela formação de 20
zonas de hemólise ao redor do crescimento bacteriano isolado (56). 21
Extração do ácido nucléico para pesquisa genotípica: o ácido nucleico total foi 22
extraído a partir de linhagens de Staphylococcus spp. isoladas em ágar sangue, 23
inoculadas individualmente em caldo BHI e incubadas a 37ºC por 24h. Foi utilizado o 24
22 kit de extração Illustra Blood GenomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare), segundo as 1
recomendações do fabricante. O DNA extraído foi armazenado a -20ºC. 2
Amplificação e visualização do material nucléico: para amplificação dos genes, foi 3
utilizada a reação em cadeia da polimerase (PCR) em um volume de 25µL. A um 4
microtubo de centrífuga de 0,2mL foram adicionados: 15,8µL de água estéril, 2,5µL de 5
buffer 10X, 1,0µL de solução MgCl2 50mM; 1,0µL de cada um dos iniciadores 10µM; 6
0,5µL de mix dNTP 10mM; 0,2µL de Taq DNA polimerase (5U/µL) (Biotools) e 3µL 7
do DNA previamente extraído. A amplificação foi realizada em termociclador (Bioer), e 8
o produto da PCR foi visualizado através de eletroforese em gel de agarose a 2% em 9
tampão Tris-Borato-EDTA (TBE) 1X corado com Sybr Safe (Invitrogen). Os produtos 10
amplificados foram comparados com um marcador de peso molecular de 100pb 11
(Norgen Biotek) e fotografados sob exposição à luz ultravioleta. 12
Detecção do gene mecA e tipagem do cassete cromossômico estafilocócico 13
(SCCmec): para amplificação do gene mecA foram utilizadas as condições e os 14
iniciadores propostos por Murakami et al (58) (Anexo 2). Controles positivo (S. aureus 15
ATCC 33591) e negativo (S. aureus ATCC 25923) foram testados paralelamente nas 16
reações. Para a determinação do SCCmec de S. aureus, foi utilizado o protocolo de 17
Milheiriço et al (59) (Anexo 3). Já para a tipagem do SCCmec de ECN, o protocolo 18
empregado foi o de Machado et al (60) (Anexo 4). 19
Detecção dos genes das enterotoxinas A a D, TSST-1, PVL e genes associados à 20
produção de biofilme: os genes que codificam as enterotoxinas A, B, C e D (sea, seb, 21
sec e sed, respectivamente) e a Toxina 1 da Síndrome do Choque Tóxico TSST-1 (tst) 22
foram pesquisados utilizando os parâmetros descritos por Johnson et al (61), com as 23
modificações propostas por Cunha et al (62). A leucocidina de Panton-Valentine (PVL) 24
23 foi pesquisada por meio da detecção dos genes lukS e lukF (63). Os genes icaA e icaD, 1
associados à produção de biofilme foram pesquisados, conforme as condições propostas 2
por Arciola et al (64). Os iniciadores utilizados para as reações de PCR são 3
apresentados no Anexo 2. 4
Análise do DNA cromossômico por Pulsed-field Gel Electrophoresis (PFGE): a 5
tipagem por PFGE foi realizada utilizando a enzima de restrição SmaI, conforme 6
protocolo descrito por McDougal et al (65). Após 18-24 horas de incubação a 37°C da 7
amostra bacteriana inoculada em 4mL de caldo BHI, alíquota de 100µL (para S. aureus) 8
ou 200µL (para ECN) foi transferida para um microtubo de centrífuga de 1,5mL e 9
centrifugada por 2 minutos a 12.000.g. A seguir, o sobrenadante foi desprezado, as 10
células foram ressuspensas em 150µL de solução TE (Tris 10 mM; EDTA 1 mM; pH 11
8.0) e 2,5µL de lisostafina (100µg/mL). Após homogeneização, 150µL de agarose low 12
melting 1,8% em TBE 0,5X foram acrescentados ao tubo e o homogeneizado foi 13
distribuído em moldes para preparação dos plugues (Biorad). Após solidificar, os 14
plugues foram incubados em solução EC (Tris HCl 1M; NaCl 2M; EDTA tetrassódico 15
1M; desoxicolato de sódio 2%; sarcosil 5%, Brij 5%) por 18 horas, a 37ºC e lavados por 16
quatro vezes com solução TE 1X. Em seguida, um pedaço do plugue foi cortado, 17
digerido com a enzima de restrição SmaI (Fermentas) e submetido à eletroforese em 18
campo pulsado, por 21 horas, a 14ºC, a 6V/cm, com pulso inicial de 5s e pulso final de 19
40s, em gel de agarose a 1%. Após o término da eletroforese, o gel foi corado com o 20
intercalante GelRed por 50 minutos e fotografado sob luz ultravioleta para posterior 21
análise. Os perfis eletroforéticos foram analisados utilizando-se o software de 22
bioinformática BioNumerics versão 6.1 (Applied Maths). Foram analisados os 23
agrupamentos realizados pelo método de Unweighted Pair Group Method with 24
Arithmetic Mean (UPGMA) com pelo menos quatro amostras, que apresentaram 25
24 coeficiente de similaridade de Dice ≥80%, com otimização de 0,5% e tolerância de 1
1,25% (65). Os agrupamentos com estas condições foram identificados por letras 2
maiúsculas. 3
Dados clínicos e demográficos 4
A partir dos prontuários médicos e registros clínicos da Unidade de Diálise, 5
foram preenchidos protocolos com informações relativas a: (1) episódio de peritonite: 6
data, tipo de surto (nova infecção, recorrência, repetição), apresentação clínica, 7
tratamento, evolução (cura primária, recidiva, remoção do cateter peritoneal), 8
complicações (hipotensão, hospitalização e óbito); (2) presença de diabetes mellitus; (3) 9
dados demográficos: idade, sexo (masculino ou feminino), raça (branca ou não branca), 10
tempo de tratamento dialítico (em meses); (4) método de diálise [DP ambulatorial 11
contínua (CAPD) ou DP automática (DPA)]. 12
Associações clínico-microbiológicas 13
Influência das características microbiológicas na evolução e complicações das 14
peritonites por estafilococos: as características microbiológicas (espécie, produção dos 15
fatores de patogenicidade (enzimas); presença do gene mecA e genes de toxinas e 16
biofilme, e genotipagem por PFGE) das linhagens de S. aureus e ECN foram estudadas 17
quanto à associação com as variáveis de evolução clínica e manifestações dos episódios 18 de peritonite. 19 20 Métodos estatísticos 21
Para comparação entre frequências foi utilizado o teste de Qui Quadrado ou o 22
teste exato de Fisher, de acordo com as características da amostra. Para comparação de 23
métodos, foi utilizado o teste de concordância Kappa, e os resultados foram 24
classificados de acordo com a conclusão de replicabilidade proposto por Rosner (66). 25
25 Devido ao grande número de fatores que fazem parte do presente estudo e ao fato de 1
tratar-se de estudo observacional, foi adotado um modelo de regressão que incorporou o 2
efeito de todos os fatores (de interesse ou de controle) na evolução da infecção. Para 3
tanto, a evolução foi classificada em dois resultados (desfechos): cura e não-cura 4
(refratariedade, retirada do cateter, óbito e recidiva), utilizando-se para análise o modelo 5
de regressão logística com procedimento de seleção de variáveis escalonada (stepwise). 6
Variáveis com colinearidade foram excluídas da análise. Significância estatística foi 7
definida como a ocorrência de um valor de p<0,05. 8
Aspectos Éticos 9
O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade 10
de Medicina de Botucatu, UNESP (OF.350/2009-CEP) (Anexo 5). 11
26 RESULTADOS
1
Durante os 17 anos de período de estudo (1994-2011), foram analisados 192 2
episódios de peritonites por Staphylococcus spp. que ocorreram em 118 pacientes. S. 3
aureus foi a espécie mais isolada de infecção peritoneal (38,0%), seguida de S. 4
epidermidis (34,4%), S. haemolyticus (9,9%), e uma diversidade de outras espécies de 5
estafilococos coagulase negativa em menor frequência (17,7%) (Figura 1). 6
7
Figura 1. Identificação das espécies de Staphylococcus isoladas de 192 episódios de peritonites. 8
9
Quarenta e um pacientes apresentaram mais de um episódio (de 2 a 6) de 10
peritonite. Em relação ao gênero, houve predomínio de mulheres (57,6%), e, em relação 11
à cor da pele, 82,2% dos indivíduos eram brancos. A maioria dos pacientes com 12
peritonite tinha escolaridade completa até o Ensino Fundamental (61,8%), enquanto 13
13,6% Ensino Médio e 10,9% Ensino Superior; 13,6% não frequentaram escola. A faixa 14
etária predominante foi a > 60 anos (42,4%), seguida por 40 a 60 anos (34,7%), 20 a 40 15
anos (17,8%) e menores de 20 anos (5,1%). Quase metade dos pacientes avaliados 16 S. aureus; 73 S. epidermidis; 66 S. haemolyticus; 19 S. warneri; 15 S. hominis; 4 S. capitis; 3 S. cohnii; 3 S. saprophyticus; 3 S. lugdunensis; 2 S. simulans; 2 S. xylosus; 2 Outras; 19
27 (44,9%) era diabética. As características demográficas dos 118 pacientes, no momento 1
da primeira infecção por Staphylococcus, estão sumarizadas na tabela 1, de acordo com 2
o agente etiológico da peritonite. 3
Tabela 1. Características demográficas dos 118 pacientes que apresentaram peritonite 4
por Staphylococcus spp., no momento da primeira infecção. 5
Característica (n avaliado)
S. aureus S. epidermidis Outros ECN
p n % n % n % Escolaridade (110) Fundamental 23 62,2 24 63,2 21 60,0 0,9609 Médio 4 10,8 9 23,7 2 5,7 0,0681 Superior 6 16,2 1 2,6 5 14,3 0,1248 Sem estudo 4 10,8 4 10,5 7 20,0 0,4135 Idade (média em anos)
(117) 48 55 53 0,3115 Faixa etária (118) <20 anos 3 7,1 2 5,0 1 2,8 0,6817 20 a 40 anos 11 26,2 4 10,0 6 16,7 0,156 41 a 60 anos 14 33,3 14 35,0 13 36,1 0,9667 >60 anos 14 33,3 20 50,0 16 44,4 0,2979 Gênero (118) Masculino 19 45,2 19 47,5 12 33,3 0,4114 Feminino 23 54,8 21 52,5 24 66,7 Cor da pele (117) Branca 35 83,3 28 71,8 34 94,4 <0,0001 Não branca 7 16,7 11 28,2 2 5,6 Diabetes (118) Sim 22 52,4 18 45,0 13 36,1 0,3545 Não 20 47,6 22 55,0 23 63,9
Tempo de diálise até episódio (média em meses) (107) 16,7a 27,3b 28,1b 0,0095 Modalidade de diálise (116) CAPD 33 35,1 31 33,0 30 31,9 0,9082 APD 8 36,4 8 36,4 6 27,3
a,b: letras iguais representam médias que não diferem entre si. Dados transformados em 6
logaritmo para utilização do modelo linear geral (ANOVA) e teste de Tukey para comparação 7
dos pares. 8
CAPD: diálise peritoneal ambulatorial contínua 9
APD: diálise peritoneal automatizada 10
11
Os 192 episódios ocorreram com maior frequência entre os anos de 1996 e 1999, 12
com pico de 32 episódios em 1998 (Figura 2). 13
28 1
Figura 2. Distribuição dos episódios de peritonites, por ano, e por agente. Barra: proporção das 2
amostras identificadas (escala esquerda); linha: número absoluto de isolados (escala direita). 3
4
Dos 192 episódios, 148 (77,1%) foram de novas infecções, 21 (10,9%) 5
repetições, 17 (8,9%) recidivas, e 6 (3,1%) infecções foram recorrentes. Houve 6
predomínio de infecções recidivas associadas a S. aureus (11/17). A distribuição dos 7
tipos de episódios, por espécies, é apresentada na tabela 2. 8
Tabela 2. Distribuição dos tipos de episódios de peritonites causadas por 9
Staphylococcus spp., de acordo com o agente. 10
Tipo de episódio S. aureus S. epidermidis Outros ECN p
n % n % n % Nova infecção 56 76,7 45 68,1 47 88,6 0,0302 Repetição 6 8,2 13 19,7 2 3,8 0,016 Recidiva 11 15,1 4 6,1 2 3,8 0,0542 Recorrente 0 0 4 6,1 2 3,8 0,1159 Total 73 100 66 100 53 100 11
As peritonites por S. aureus apresentaram maior gravidade que aquelas causadas 12
por S. epidermidis ou por outros ECN, com maior frequência de hipotensão e maiores 13
taxas de hospitalização e óbito. As manifestações clínicas e os desfechos, de acordo 14
com o agente etiológico das peritonites, são apresentados na tabela 3. 15 16 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 S. aureus 0 0 8 18 17 7 3 5 3 6 1 0 2 0 2 1 0 0 S. epidermidis 2 8 9 1 9 3 2 2 4 4 0 0 1 7 7 4 1 2 Outros ECN 2 4 8 4 6 7 1 4 4 0 3 1 1 3 4 1 0 0 Total 4 12 25 23 32 17 6 11 11 10 4 1 4 10 13 6 1 2 0 5 10 15 20 25 30 35 0% 25% 50% 75% 100%
29 Tabela 3. Manifestações clínicas e evolução dos episódios de peritonites causadas por 1
Staphylococcus spp., de acordo com o agente. 2
Manifestações ou desfechos
S. aureus S. epidermidis Outros ECN
p n % n % n % Febre 19 27,1 12 20,7 5 10,0 0,070 Hipotensão 14 20,3 10 16,9 2 4,1 0,041 Efluente Turvo 71 97,3 63 96,9 47 90,4 0,151 Dor abdominal 51 70,8 52 83,9 41 83,7 0,113
Náusea e/ou vômito 30 42,3 26 40,0 25 48,1 0,670
Cura 34 46,6 42 64,6 32 60,4 0,082
Retirada cateter 23 31,5 10 15,6 9 18,0 0,057
Hospitalização 25 35,2 11 18,3 7 13,7 0,011
Óbito 9 13,0 2 3,0 2 3,8 0,041
3
Com relação à caracterização da sensibilidade antimicrobiana dos isolados de 4
Staphylococcus spp., a taxa de sensibilidade à oxacilina, determinada pelo E-test, foi de 5
52,1%. Treze amostras (6,8%) mostraram-se com sensibilidade intermediária e a taxa de 6
resistência foi de 41,1%. Houve menor taxa de resistência à oxacilina entre os isolados 7
de S. aureus (Tabela 4). A evolução temporal da sensibilidade à oxacilina está 8
apresentada na figura 3. Foi possível observar uma tendência para diminuição da 9
sensibilidade à oxacilina nos três períodos verificados (p=0,088), com redução 10
significativa da sensibilidade no período mais recente (2006-2011) comparado ao 11
primeiro (1994-1999) (p=0,043). Em relação à vancomicina, nenhuma amostra 12
apresentou-se com sensibilidade intermediária ou resistência, embora cinco amostras 13
(2,6%), quatro de S. epidermidis e uma de S. aureus, tenham apresentado valores de 14
MIC de 3,0µg/mL, valor que não é categorizado pelo CLSI (Anexo 1). As 15
concentrações inibitórias mínimas que inibiram o crescimento de 50% e 90% dos 16
isolados (MIC50 e MIC90, respectivamente), e o intervalo de variação das MIC, foram, 17
respectivamente, 0,38µg/mL, 256µg/mL e 0,032 a >256µg/mL, para oxacilina, e 18
1,5µg/mL, 2,0µg/mL e 0,2 a 3,0µg/mL para vancomicina. Foram observados valores 19
30 mais baixos de MIC50 em S. aureus para oxacilina e vancomicina. As informações a 1
respeito da sensibilidade antimicrobiana, por agente, estão compiladas nas tabelas 5 e 6. 2
Tabela 4. Distribuição do perfil de susceptibilidade de Staphylococcus spp. à oxacilina, 3
por agente. 4
Oxacilina S. aureus S. epidermidis Outros ECN Total p
Frequência % Frequência % Frequência % Frequência %
Sensível 63 86,3 19 28,8 18 34,0 100 52,1 <0,0001 Intermediário 0 0 8 12,1 5 9,4 13 6,8 0,0112 Resistente 10 13,7 39 59,1 30 56,6 79 41,1 <0,0001 Total 73 100,0 66 100,0 53 100,0 192 100,0 5 6 7 8
Figura 3. Evolução da sensibilidade à oxacilina, determinada por E-test, para amostras de 9
Staphylococcus spp. isoladas de peritonites (p=0,088).
10 11
O gene mecA, de resistência à oxacilina, foi detectado em 65 (33,9%) isolados, 12
com maior frequência em S. epidermidis (60,6%) do que em S. aureus (12,3%) e nos 13
outros ECN (30,2%) (p<0,001). Para as análises a seguir, as amostras categorizadas 14
como intermediárias foram consideradas resistentes. Em relação à detecção do gene 15 58,4 46,5 38,9 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 1994-1999 2000-2005 2006-2011 p=0,043 p=0,184 p=0,496 % de sensibilidade
31 mecA e a resistência à oxacilina determinada pelo E-test, a concordância entre os testes 1
foi boa, de 0,7552 (p<0,001). No geral, a sensibilidade e a especificidade do E-test 2
comparadas com a presença do gene mecA foram de 84,6 e 70,9%, respectivamente. O 3
E-test apresentou baixa sensibilidade para detecção da resistência mediada pelo gene 4
mecA entre os isolados de S. aureus, fato não observado com os ECN. A especificidade 5
do E-test, no entanto, foi baixa para os ECN não S. epidermidis. As sensibilidades e 6
especificidades, bem como a taxa de concordância, por agente, são apresentadas na 7
tabela 7. 8
Das 65 amostras com o gene mecA, o cassete cromossômico estafilococócico 9
mec (SCCmec) pode ser tipado em 56 (86,2%) isolados. O SCCmec tipo III foi 10
identificado em 28 isolados (43,1% do total de isolados mecA positivos), seguido pelo 11
SCCmec tipo IV (15 isolados, 23,1%), SCCmec tipo II (8 isolados, 12,3%), e, 12
finalmente, pelo SCCmec tipo I, em 5 isolados (7,7%). Nove isolados, correspondente a 13
13,8% das amostras carreadoras do gene mecA, não puderam ser tipados pelas 14
metodologias empregadas. A evolução anual dos SCCmec é apresentada na Figura 4. 15
Tabela 5. Distribuição dos isolados , de acordo com o intervalo de MIC para oxacilina. 16
Espécie Intervalo de variação da MIC MIC50% MIC90%
S. aureus 0,064 - >256 0,250 256
S. epidermidis 0,032 - 256 1,0 256
Outros ECN 0,047 - 256 0,5 192
17
Tabela 6. Distribuição dos isolados, de acordo com o intervalo de MIC para 18
vancomicina. 19
Espécie Intervalo de variação da MIC MIC50% MIC90%
S. aureus 0,250 - 3,0 1 2,0
S. epidermidis 0,2 - 3,0 1,5 2,0
Outros ECN 0,75 - 2,0 1,5 2,0
32 Tabela 7. Sensibilidade e especificidade (%) do E-test, comparadas com a detecção do 1
gene mecA, para detecção da resistência à oxacilina, por agente. 2
Agente Oxacilina (E-test)
Gene mecA
SN SP
Teste de concordância Kappa Positivo (n) Negativo (n) Concordância Conclusão de replicabilidade
S. aureus Resistente 2 8 22,2 87,5 0,7945 Fraca
Sensível 7 56
S. epidermidis Resistente 38 9 95,0 65,4 0,8333 Boa
Sensível 2 17
Outros ECN Resistente 15 20 93,8 45,9 0,6038 Fraca
Sensível 1 17
Total Resistente 55 37 84,6 70,9 0,7552 Boa
Sensível 10 90
SN: sensibilidade; SP: especificidade. 3
4
5
Figura 4. Evolução temporal da distribuição do SCCmec em Staphylococcus spp. (em número 6
de isolados). 7
Quanto à caracterização da virulência, foi observado um grande número de 8
fatores associados à espécie S. aureus (lipase, lecitinase, DNAse, TNAse, genes sea, 9
seb, tst e lukPV), enquanto a presença do gene icaA associou-se à espécie S. 10
epidermidis. O gene icaD foi detectado em alta frequência nos três grupos de 11
estafilococos (S. aureus, S. epidermidis, e outros), com destaque para S. aureus, com 12 1 2 2 1 1 1 1 3 2 1 1 1 1 3 3 1 2 5 2 1 4 3 4 2 3 1 1 2 1 1 3 1 1 2 1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 tipo I tipo II tipo III tipo IV NT
33 100% de positividade. Alfa hemolisina foi menos frequente em S. epidermidis; já beta-1
hemolisina, e os genes sec e sed apresentaram distribuição mais uniforme (Tabela 8). 2
Tabela 8. Caracterização da virulência de Staphylococcus spp., por agente. 3 Fator de virulência S. aureus N=73 S. epidermidis N=66 Outros ECN N=53 p
Frequência % Frequência % Frequência %
Alfa hemolisina 35 47,9 17 25,8 30 56,6 0,002 Beta-hemolisina 29 39,7 14 21,2 18 34,0 0,06 Lipase 63 86,3 23 34,8 13 24,5 <0,001 Lecitinase 68 93,2 12 18,2 12 22,6 <0,001 DNAse 69 94,5 4 6,1 7 13,2 <0,001 TNAse 67 91,8 1 1,5 7 13,2 <0,001 Gene sea 36 49,3 1 1,5 1 1,9 <0,001 Gene seb 22 30,1 2 3,0 2 3,8 <0,001 Gene sec 10 13,7 10 15,2 7 13,2 0,949 Gene sed 0 0 3 4,5 1 1,9 0,172 Gene tst 9 12,3 0 0 0 0 <0,001 Gene lukPV 12 16,4 0 0 0 0 <0,001 Gene icaA 2 2,7 34 51,5 7 13,2 <0,001 Gene icaD 73 100,0 40 60,6 23 43,4 <0,001 Genes icaAD 2 2,7 34 51,5 7 13,2 <0,001 Gene mecA 9 12,3 40 60,6 16 30,2 <0,001 4
Alguns fatores de virulência (sec, sed, icaA) apresentaram relação direta entre 5
sua presença (ou do gene) com a presença do gene mecA, enquanto outros (lipase, 6
lecitinase, DNAse, TNAse, seb, icaD) apresentam relação inversa (p<0,05) (Figura 5). 7
A análise da diversidade genética analisada pela clivagem cromossomal seguida 8
de eletroforese em campo pulsado (PFGE) permitiu a identificação de cinco 9
agrupamentos de isolados de S. aureus que, incluíram simultaneamente ≥4 amostras, 10
com similaridade ≥80% (Tabela 9, Figura 6). Em relação a S. epidermidis, outros cinco 11
agrupamentos puderam ser gerados, considerando os mesmos critérios (Tabela 9, Figura 12
7). As outras espécies de ECN não puderam ser agrupadas com esses critérios. Em 13
34 relação aos clones presentes no período estudado, foi possível verificar uma 1
heterogeneidade clonal entre os isolados (Figuras 6 e 7), com isolados persistentes ao 2
longo dos anos (Figuras 8 e 9). É interessante salientar a presença de amostras de S. 3
aureus (cluster C) com similaridade com o controle representante do Clone Epidêmico 4
Brasileiro (SA-CONT-HU-25), algumas delas também carreadores do SCCmec tipo III. 5
35 Tabela 9. Distribuição das amostras de Staphylococcus, de acordo com o padrão 1
eletroforético por PFGE. 2
Espécie (n) Número de isolados Agrupamento Coeficiente de similaridade de Dice (%) S. aureus (73) 12 A 84,3 7 B 84,9 4 C 83,3 4 D 86,2 4 E 80,6 42 Outros NC S. epidermidis (66) 8 A 80,5 5 B 81,1 4 C 89,6 4 D 84,6 4 E 84,4 41 Outros NC NC: não calculado. 3 4 5
Figura 5. Relações entre a presença do gene mecA e os fatores de virulência em Staphylococcus 6
(em %). * indica relação estatisticamente significativa (p<0,05). 7 0,0 10,0 20,0 30,0 40,0 50,0 60,0 70,0 80,0 90,0 Gene mecA+ Gene mecA-* * * * * * * * *
36 1
2
Figura 6. Dendrograma criado a partir do padrão eletroforético por PFGE de amostras de S. 3
aureus (coeficiente de similaridade de Dice, otimização de 0,5%, tolerância de 1,25%; método
4
de clusterização: UPGMA) 5
37 1
Figura 7. Dendrograma criado a partir do padrão eletroforético por PFGE de amostras de S. 2
epidermidis (coeficiente de similaridade de Dice, otimização de 0,5%, tolerância de 1,25%;
3
método de clusterização: UPGMA). 4
38 1
Figura 8. Presença e persistência dos clones de S. aureus causando peritonites em pacientes 2
submetidos à diálise peritoneal. 3
4
5
Figura 9. Presença e persistência dos clones de S. epidermidis causando peritonites em pacientes 6
submetidos à diálise peritoneal. 7
8
A associação entre as variáveis microbiológicas e as manifestações clínicas dos 9
episódios de peritonites foi avaliada. A manifestação de febre associou-se à presença do 10
gene sea; a presença de efluente turvo foi associada ao carreamento do gene icaD; dor 11
abdominal foi inversamente associada à produção de beta-hemolisina; manifestação de 12
náusea e/ou vomito esteve associada à presença do gene sea. Ocorrência de 13 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 A B C D E Outros 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 A B C D E Outros
39 hospitalização associou-se à produção de beta-hemolisina, lipase, lecitinase, DNAse e 1
TNAse (p<0,05 no teste de Qui-Quadrado). 2
Três modelos de regressão logística binária, com desfecho cura ou não cura, 3
foram construídos para analisar as variáveis clínicas e microbiológicas como preditivos 4
do prognóstico das peritonites. No modelo 1 (Tabela 10), todos os 192 casos de 5
peritonites foram incluídos, assim como os fatores comuns a todos os agentes (fatores 6
demográficos e de resistência antimicrobiana). Os episódios de peritonites ocorridos em 7
pacientes com idade < 20 anos apresentaram maior chance de resolução (OR [IC95%]: 8
15,240 [2,072-112,114]) que aqueles ocorridos em pacientes com > 60 anos. Da mesma 9
maneira, os episódios de nova infecção (OR [IC95%]: 9,996 [2,048-48,797]) e de 10
recorrência (OR [IC95%]: 11,051 [1,803-67,724]) apresentaram maior chance de cura 11
que os episódios recidivos. Foi observada, ainda, tendência (p=0,0525) em diminuição 12
da chance de cura dos episódios ocasionados por S. aureus (OR [IC95%]: 0,527 [0,275-13
1,007]). Devido às peculiaridades apresentadas em relação à virulência e à resistência 14
antimicrobiana, no modelo 2 (Tabela 11) foram incluídos apenas os episódios causados 15
por S. aureus, e, no modelo 3, (Tabela 12) os episódios por ECN. 16
Em relação às peritonites por S. aureus, foram preditivos independentes do 17
desfecho a produção de beta-hemolisina, que reduziu a chance de cura em 86,5% (OR 18
[IC95%]: 0,135 [0,026-0,686]), a presença de diabetes, que influenciou negativamente a 19
chance de cura em 91,5% (OR [IC95%]: 0,085 [0,015-0,475]), e o tempo de diálise, 20
reduzindo em 6,8% a chance de cura (OR [IC95%]: 0,932 [0,888-0,979]). Já com 21
relação às peritonites causadas por ECN, pior prognóstico foi relacionado às amostras 22
que apresentaram resistência à oxacilina, independentemente dos demais fatores 23
avaliados. A sensibilidade à oxacilina nestes micro-organismos aumentou em 2,6 vezes 24
a chance da cura das peritonites (OR [IC95%]: 2,627 [1,040-6,634]). 25
40 Tabela 10. Análise multivariada para desfecho cura (modelo 1): todos os episódios. 1
Variáveis p Odds Ratio Intervalo de Confiança (95%)
Tempo de diálise (meses) NS MIC oxacilina (µg/mL) NS MIC vancomicina (µg/mL) NS Escolaridade NS Faixa etária1 < 20 anos 0,0322 15,240 2,072 112,114 21-40 anos 2,170 0,861 5,470 41-60 anos 1,513 0,759 3,015 Sexo masculino NS Cor da pele NS Diabetes NS Tipo de episódio2 Nova infecção 0,0320 9,996 2,048 48,797 Repetição 5,009 0,522 48,072 Recorrência 11,051 1,803 67,724
Modalidade de diálise CAPD NS Uso de vancomicina NS Sensibilidade à oxacilina NS Gene mecA NS Espécie S. aureus 0,0525 0,527 0,275 1,007 NS: não significativo 2
MIC: concentração inibitória mínima. 3
CAPD: diálise peritoneal ambulatorial contínua 4
1. Em relação à faixa etária > 60 anos. 5
2. Em relação ao tipo de episódio infecção recidiva. 6
41 Tabela 11. Análise multivariada para desfecho cura (modelo 2): S. aureus.
1
Variáveis p Odds Ratio Intervalo de Confiança (95%)
Tempo de diálise (meses) 0,0046 0,932 0,888 0,979
Escolaridade NS Faixa etária NS Sexo masculino NS Cor da pele NS Diabetes 0,005 0,085 0,015 0,475 Tipo de episódio NS Modalidade de Diálise CAPD NS Uso de vancomicina NS Beta-hemólise 0,0158 0,135 0,026 0,686 Lipase NS DNAse NS Sensibilidade à oxacilina NS Gene mecA NS Gene sea NS Gene seb NS Gene sec NS Gene sed NS Gene tst NS Genes icaAD NS NS: não significativo. 2
CAPD: diálise peritoneal ambulatorial contínua 3
4 5 6
Tabela 12. Análise multivariada para desfecho cura (modelo 3): ECN. 7
Variáveis p Odds Ratio Intervalo de Confiança (95%)
Tempo de diálise (meses) NS MIC oxacilina (µg/mL) NS MIC vancomicina (µg/mL) NS Escolaridade NS Faixa etária NS Sexo masculino NS Cor da pele NS Diabetes NS Tipo de episódio NS
Modalidade de diálise CAPD NS Uso de vancomicina NS Sensibilidade à oxacilina 0,0410 2,627 1,040 6,634 Gene mecA NS Espécie S. epidermidis NS NS: não significativo. 8
MIC: concentração inibitória mínima. 9
CAPD: diálise peritoneal ambulatorial contínua. 10
