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RICHARD MURDOCH MONTGOMERY
ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO DA EXPRESSÃO DE EGFR, p53,
IDH-1 E MDM2 EM GLIOBLASTOMAS E SUA RELAÇÃO COM
PROGNÓSTICO E RESPOSTA TERAPÊUTICA
CAMPINAS
2014
UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS Faculdade de Ciências Médicas
RICHARD MURDOCH MONTGOMERY
ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO DA EXPRESSÃO DE EGFR, p53, IDH-1 E MDM2 EM GLIOBLASTOMAS E SUA RELAÇÃO COM PROGNÓSTICO E
RESPOSTA TERAPÊUTICA
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Médicas da
Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestre em Ciências.
ORIENTADOR: PROF DR. FABIO ROGERIO
COORIENTADOR: PROF. DR. ROGER FRIGÉRIO CASTILHO
ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE À VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO
ALUNO RICHARD MURDOCH MONTGOMERY,
E ORIENTADO PELO PROF. DR. FABIO ROGERIO.
CAMPINAS
RESUMO
Glioblastoma multiforme (GBM) é o tumor cerebral primário mais frequente. Cerca de 90% dos GBMs são classificados como primários. Tais lesões acometem principalmente idosos, têm rápida evolução e não apresentam evidências de lesão precursora. Por outro lado, GBMs secundários acometem indivíduos mais jovens e progridem lentamente a partir de astrocitoma difuso de menor grau. As alterações moleculares apresentadas pelos tumores astrocitários são várias e seu conhecimento é importante para o melhor entendimento da fisiopatogênese e possível aferição prognóstica. Neste trabalho, investigamos a prevalência de casos de GBM tratados no Hospital de Clínicas da Faculdade de Ciências Médicas da Universidade Estadual de Campinas, entre janeiro de 2008 e dezembro de 2012, com informações clínico-radiológicas completas disponíveis (n=36), e descrevemos as características clínicas e histológicas. Ainda, classificamos a distribuição tecidual dos seguintes marcadores biológicos através de imunoistoquímica: forma selvagem do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), formas mutantes da proteína p53 e isocitrato desidrogenase 1 (IDH-1) e a proteína murina 2 (MDM2). Correlacionamos achados morfológicos e imunoistoquímicos com dados da evolução clínica e resposta ao tratamento com cirurgia, quimioterapia com Temozolamida e radioterapia. Observamos que a localização predominante do tumor foi o lobo frontal, sendo cerca de 97% dos casos primários. Em média, o tempo livre de doença clinica ou sintomática foi de 7,56 meses e, o tempo livre de doença radiológica (TLDR), de 7,14 meses. A média do número de figuras de mitose / 10 campos de grande aumento foi 3,9. A correlação entre a sobrevida total e as classes de imunomarcação para p53, IDH-1, EGFR e MDM2 não foi significativa para nenhum dos marcadores. Observou-se relação estatisticamente significativa entre p53 e MDM-2 (p-valor=0,00) e entre EGFR e MDM2 (p-valor=0,04). Por outro lado, não foi detectada relação estatisticamente significativa entre p53 e EGFR (p-valor=0,09). Quanto a correlação entre classes de imunomarcação para p53, MDM2 e EGFR com a sobrevida clínica e com a radiológica, a única relação estatisticamente significativa foi entre p53 e sobrevida clínica (p-valor=0,02), sendo observado que quanto maior a classe de p53, menor a sobrevida clínica. Não houve relação significativa entre imunomarcação para IDH-1, EGFR, MDM2 e a sobrevida total clínica e radiológica. A correlação entre a expressão de
MDM2 e do EGFR selvagem também foi positiva (p-valor=0,04). As correlações entre as sobrevidas clínica, radiológica e total foram significativas (p-valor < 0,0001) e positivas, ou seja, o aumento de uma sobrevida implica aumento de outra. As correlações do gênero com as sobrevidas clínica, radiológica e total não foram significativas, assim como a relação da marcação da p53, MDM2 e EGFR com número de mitose e extensão de ressecção tumoral. Quanto à correlação das sobrevidas clínica, radiológica e total com a localização do tumor e a idade, não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas em nenhuma das sobrevidas. Nossos resultados clínicos e morfológicos refletem parcialmente alguns dados da literatura. Especificamente, o fato de termos detectado correlação significativa apenas entre a marcação para p53 e sobrevida clínica pode ser decorrente da limitada amostragem disponível para avaliação.
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ABSTRACT
Glioblastoma (GBM) is the most common primary brain tumor. About 90 % of GBMs are classified as primary. Such lesions occur mostly in the elderly, evolve rapidly and show no evidence of precursor lesions. However, secondary GBMs affect younger individuals and progress slowly from lower grade diffuse astrocytomas. Molecular alterations in astrocytic tumors are diverse and their knowledge is important to understand the pathophysiology and prognosis of patients with GBM. Here we investigated the prevalence of GBM treated at the Hospital of the Faculty of Medical Sciences, State University of Campinas, from January 2008 to December 2012, with complete radiological and outcome information available (n = 36), and described the clinical and histopathological findings. Furthermore, we immunohistochemically classified the tissue distribution of four biomarkers: wild form of the epidermal growth factor receptor (EGFR), mutated forms of p53 protein and isocitrate dehydrogenase 1 (IDH-1) and murine protein 2 (MDM2). Morphological and immunohistochemical findings were correlated with data from the clinical course and response to treatment with surgery, chemotherapy and radiotherapy. We observed that the most common location of the tumor was the frontal lobe and about 97 % of cases were primary. On average, time free from clinical or symptomatic disease was 7.56 months and the free time of radiological disease (TLDR) was 7.14 months. The average number of mitotic figures/10 high power fields was 3.9. The correlation between overall survival and classes of p53, IDH- 1, MDM2 and EGFR immunostaining was not significant for any of the markers. There was a statistically significant relationship between p53 and MDM2 (p-value = 0.01) and between EGFR and MDM2 (p-value = 0.04). On the other hand, no significant relationship was detected between p53 and EGFR (p=0.09). Concerning the correlations between classes of immunostaining for p53, MDM2 and EGFR with clinical and radiological survival, the only significant relation was between p53 and clinical survival (p-value = 0.02), with the higher class of p53, the poorer the clinical survival. There was no significant relationship between immunostaining for IDH-1, EGFR, MDM2 and the total clinical and radiological survival. The correlation between the expression of MDM2 and wild type EGFR was also positive (p-value = 0.04). The correlations between clinical, radiological and overall survival were significant (p-value <0.0001) and positive,
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ie, an increase in one implies an increase in mean survival of another. The correlations of gender with clinical, radiological and overall survival were not significant, as the ratio of labeling of p53, MDM2 and EGFR with number of mitosis and extent of tumor resection. The correlations of clinical, radiological, and total survival with tumor location and age were not statistically significant. Our clinical and morphological results partially corroborate previous data by other authors. Specifically, we detected a significant correlation between staining for p53 and clinical survival only. The other correlations, expected to be positive but detected as negative, may be due to the limited sample available for analyses.
SUMÁRIO
RESUMO ...vii
ABSTRACT ...ix
AGRADECIMENTOS ...xiii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ...xv
1. INTRODUÇÃO ...01
1.1. Definições e epidemiologia ...01
1.2. Alterações moleculares em gliomas ...03
1.2.1. Fator de crescimento epidérmico (EGFR) ...04
1.2.2. Proteína p53 ...05
1.2.3. Enzimas isocitrato desidrogenase-1 (IDH-1) ...06
1.2.4. Proteína dupla murina 2 (MDM2) ...07
2. OBJETIVOS ...09 2.1. Geral ...09 2.2. Específicos ...09 3. MATERIAL E MÉTODOS ...11 3.1. Dados clínicos ...11 3.2. Análises histopatológicas ...12
3.2.1. Coloração com Hematoxilina e Eosina (HE) e Critérios Histopatológicos ...12
3.2.2.1. Análise das imunomarcações ...15 3.3. Análise Estatística ...15 4. RESULTADOS ...17 4.1 Dados clínicos ...17 4.2. Avaliação histológica ...20 4.3. Imunomarcações...23
4.4 Correlações entre dados clínicos e morfológicos...33
5. DISCUSSÃO ...57
6. CONCLUSÕES ...67
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...69
AGRADECIMENTOS
À minha esposa, amiga, companheira e futura colega, mãe das pessoas mais importantes para mim.
Ao meu orientador Prof. Dr. Fabio Rogerio pela imensa paciência, capacidade didática e generosidade em compartilhar conhecimento.
Ao Prof. Dr. Luciano de Souza Queiroz, pela construção, ao meu ver, do mais importante arquivo em neuropatologia de nosso país.
Ao meu pai, pois não me esqueço de quando me arrancou a gravata e me atirou numa antiga escola de medicina.
Ao Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica, e ao meu co-orientador, Prof. Dr. Roger Frigério Castilho, pela oportunidade.
Às técnicas do Laboratório de Pesquisa do Departamento de Anatomia Patológica da Faculdade de Ciências Médicas da Unicamp, Ana Claudia Sparapani Piaza, Arethuza de Souza e Luzia Aparecida Magalhães, pela dedicação.
À Regina, secretária do Programa de Pós-Graduação em Fisiopatologia Médica, pela prontidão em esclarecer todas as dúvidas.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
EGFR: receptor do fator de crescimento epidérmico (do inglês, epidermal growth factor
receptor).
GBM: glioblastoma multiforme.
IDH-1: isocitrato desidrogenase-1 (do inglês, isocitrate dehydrogenase-1).
IDH-2: isocitrato desidrogenase-2 (do inglês, isocitrate dehydrogenase-2).
MDM2: proteína dupla murina 2 (do inglês, murine double protein 2).
NAD+: nicotinamida adenina dinucleotídeo.
NADH: forma reduzida do nicotinamida adenina dinucleotídeo.
NADP+: nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato.
NADPH: forma reduzida do nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato.
OMS: Organização Mundial de Saúde.
p53: proteína 53.
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1. INTRODUÇÃO
1.1. Definições e Epidemiologia
Gliomas são os tumores cerebrais mais comuns em adultos, correspondendo a cerca
de 70% das neoplasias primárias do sistema nervoso central (SNC). Estes tumores surgem a
partir de células gliais e apresentam ampla variedade de tipos histológicos, os quais podem
exibir características que remetem às células de origem, isto é, astrócitos, oligodendrócitos
e epêndima. Particularmente, as neoplasias derivadas dos astrócitos são definidas como
astrocitomas.
De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS) (1), os astrocitomas podem
ser classificados em quatro graus histológicos (I – IV), os quais guardam relação estreita
com o comportamento biológico da lesão, tempo de sobrevida do paciente e resposta à
abordagem terapêutica. O astrocitoma pilocítico, ao qual é atribuído grau I, é bem
delimitado, de crescimento lento e acomete predominantemente crianças e adultos jovens.
Seu padrão histológico bifásico é característico: áreas compactas, constituídas por células
bipolares associadas a fibras de Rosenthal, que se misturam, em proporções variadas, com
áreas frouxas contendo células multipolares e estruturas microcísticas ou arredondadas
granulares eosinofílicas. Via de regra, a conduta é cirúrgica e o prognóstico, favorável (2).
Por sua vez, os astrocitomas graus II, III e IV ocorrem principalmente em adultos e
são considerados gliomas difusos, pois se infiltram de forma irrestrita na substância branca
tornando impossível sua delimitação precisa. A classificação destes tumores baseia-se nos
necrose. O astrocitoma grau II (astrocitoma difuso de baixo grau) apresenta apenas um dos
achados, sendo o mais comum atipia nuclear (1). O tumor grau III (astrocitoma anaplásico)
exibe dois dos achados microscópicos listados, sendo atipia nuclear e mitoses os mais
frequentes. No astrocitoma grau IV (glioblastoma multiforme; GBM), são observados ao
menos três dos achados histológicos. Além desta classificação, os astrocitomas difusos
podem ser categorizados em baixo (II) ou alto (III e IV) graus, em função do
comprometimento lento ou rápido do parênquima cerebral vizinho, respectivamente. A
excisão cirúrgica apenas, ainda que não permita a retirada completa da lesão, é a
abordagem proposta para os tumores grau II. Os tumores graus III e IV recebem ainda
radioterapia e/ou quimioterapia adjuvante. O tempo de sobrevida dos pacientes é
inversamente proporcional ao grau histológico dos astrocitomas (3).
GBM é o tumor cerebral primário mais frequente, correspondendo a
aproximadamente 70% dos astrocitomas e 15% de todas as neoplasias intra-cranianas.
Cerca de 90% dos GBMs são classificados como primários. Tais lesões acometem
principalmente idosos (média de 62 anos), tem rápida evolução (menos de 3 meses) e não
apresentam evidências clínicas ou histopatológicas de lesão precursora. Por outro lado,
GBMs secundários acometem indivíduos mais jovens (média de 45 anos) e progridem de
forma lenta a partir de astrocitoma difuso de menor grau. Histologicamente indistinguíveis
entre si, as duas formas de GBM apresentam prognóstico sombrio. Pacientes com GBM
primário apresentam sobrevida mediana aproximada de 5 meses e aqueles com a forma
3
A análise histológica tem importância inquestionável para a definição do tipo de
uma neoplasia astrocitária. Porém, dificuldades diagnósticas podem surgir em função da
heterogeneidade do tumor, sobreposição com aspectos morfológicos de outros gliomas ou
amostragem parcial da lesão. Em função disso, nas últimas décadas, foram conduzidos
diversos estudos empregando prioritariamente técnicas moleculares objetivando-se
encontrar marcadores biológicos com relevância diagnóstica e/ou prognóstica. Tais estudos
permitiram não só a identificação de tais marcadores, mas também propiciaram aumento
significativo do conhecimento sobre a fisiopatogênese dos gliomas e o encontro de
potenciais alvos para novas abordagens terapêuticas (4-9).
1.2. Alterações Moleculares em Gliomas
Dentre as numerosas alterações moleculares verificadas em gliomas, destacam-se:
(1) superexpressão de fatores de crescimento e/ou mutação dos respectivos receptores
estimulando o crescimento e proliferação celular, (2) perda da regulação de cascatas de
transdução de sinais extracelulares favorecendo a proliferação e inibindo a diferenciação e
morte celular por apoptose e (3) perda do controle do ciclo celular permitindo a
proliferação desordenada (5-10). Particularmente, nos últimos anos, alterações moleculares
que se sobressaíram como importantes marcadores biológicos da evolução clínica e/ou da
resposta terapêutica de pacientes com glioblastomas são: a superexpressão do fator de
crescimento epidérmico (do inglês, epidermal growth factor receptor; EGFR), a alteração
da expressão do gene TP53 e da sua proteína correspondente p53, a mutação das enzimas
respectivamente) e a alteração da expressão da proteína dupla murina 2 (do inglês, murine
double protein 2; MDM2).
1.2.1. Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR)
Sobre a participação de fatores de crescimento e seus receptores na gênese de
gliomas, evidenciou-se que o gene do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR)
é o mais frequentemente amplificado e superexpresso em GBMs primários, afetando
40-60% destes tumores (11,12). Além disso, níveis protéicos elevados de EGFR ocorrem em
cerca de 90% das neoplasias astrocitárias, sugerindo que alterações na transcrição e
tradução deste gene também possam participar da gênese tumoral. Em condições
fisiológicas, o fator de crescimento epidérmico (do inglês, epidermal growth factor – EGF)
liga-se ao domínio extra-celular do EGFR em precursores glioneuronais induzindo
dimerização do receptor e alterações conformacionais em seu domínio citoplasmático.
Estas últimas desencadeiam a atividade tirosina-quinase deste receptor, levando a
fosforilação e ativação de resíduos de tirosina na sua porção citoplasmática e de moléculas
de vias de sinalização envolvidas em diferenciação, proliferação e migração celular.(13-15)
Por sua vez, células de glioma são capazes de sintetizar suas próprias moléculas de
EGF e aumentar o número de EGFR em sua superfície. Assim, devido ao estabelecimento
de uma alça de retroalimentação autócrina positiva, o efeito estimulatório do EGF se
intensifica e as células proliferam independentemente de ligantes exógenos (16,17). Além da
amplificação da forma selvagem do EGFR, rearranjos gênicos levando a expressão de
variantes mutantes ativas deste receptor também são comuns em gliomas. A variante gênica
5
exons 2-7 e leva a remoção de parte do domínio de ligação extra-celular. Como
consequência, o receptor permanece constitutivamente ativo, independentemente da
presença do ligante, e se torna resistente ao processo de degradação da forma selvagem do
EGFR (13).
Amplificações e rearranjos do EGFR são altamente indicativos de glioma de alto
grau, com prognóstico pior que o estimado a partir da graduação histopatológica (18,19). Tal
fato tem estimulado a investigação de inibidores da via do EGFR com o objetivo de
favorecer a apoptose das células neoplásicas, aumentado a sensibilidade do tumor a
eventuais terapias adjuvantes. Nesse sentido, têm sido investigados marcadores biológicos
que poderiam predizer melhor resposta a uma abordagem terapêutica, em especial a
presença da mutação EGFRvIII (20) e superexpressão do EGFR(21).
1.2.2. Proteína p53
A oncogênese de glioblastomas também envolve a perda da regulação de vias de
supressão tumoral, como a que envolve a proteína p53 (2). Esta proteína atua como fator de
transcrição de genes inibidores da proliferação celular após dano ao DNA, visando a
manutenção da estabilidade genômica. Assim, impede-se a progressão do ciclo celular para
que seja efetuado o reparo do material genético, evitando-se a propagação de mutações.
Caso o reparo não seja possível, a célula entra em processo de morte por apoptose (22,23,34).
Além disso, tem sido considerado que a expressão aumentada do próprio gene TP53 seja
uma resposta a agressão ao DNA celular (2).
Células com função prejudicada da proteína p53 podem se tornar capazes de
Especificamente, o descontrole do ciclo celular decorrente da perda desta proteína é
verificado em aproximadamente 30% dos GBMs, mais comumente na forma secundária
(cerca de 67% dos casos) (2). O valor prognóstico da alteração da expressão gênica do TP53
permanece indefinido em GBMs e sua relação com resposta a terapia e sobrevivência
parece variar com a idade (2,27,28).
1.2.3. Enzima Isocitrato Desidrogenase-1 (IDH-1)
Além das anormalidades descritas envolvendo as vias celulares do EGFR e TP53,
outras alterações gênicas e epigenéticas que participam da gênese de gliomas difusos foram
identificadas recentemente. Tais alterações, conforme estudos experimentais e clínicos, têm
valor prognóstico e/ou preditivo com relação a resposta a tratamento quimioterápico.
Especificamente, mutações no gene da isoforma 1 da isocitrato desidrogenase (IDH1)
foram identificadas em gliomas de baixo e alto grau, inclusive GBM (29,20,31). Neste último,
verificou-se que tais mutações ocorrem predominantemente em indivíduos mais jovens,
com a forma secundária da neoplasia e sobrevida maior. Por sua vez, mutações no gene da
isoforma 2 da IDH (IDH2) foram detectadas em menor freqüência, também associadas com
maior tempo de sobrevida (32,33,34).
Os genes IDH1 e IDH2 codificam, respectivamente, as isoformas citosólica e
mitocondrial da IDH, ambas participantes da respiração celular. Em condições fisiológicas,
estas enzimas catalisam a conversão de isocitrato a α-cetoglutarato, processo em que há
síntese de nicotinamida adenina dinucleotídio fosfato (NADPH) a partir da redução de
NADP+. Tanto o α-cetoglutarato quanto o NADPH produzidos são substâncias
7
IDH2 conhecidas até o presente são somáticas e heterozigóticas. As mutações do IDH1 ocorrem no códon correspondente ao aminoácido da posição 132, o qual se localiza no sítio
de ligação do isocitrato. Neste caso, a alteração mais comum determina a substituição do
aminoácido arginina por histidina. As mutações do IDH2 são identificadas em códon
correspondente a posição análoga àquela afetada no IDH1 (172). A alteração mais
freqüente determina a mudança do aminoácido arginina por lisina (38,39,40).
Tais mutações alteram a atividade enzimática normal reduzindo a capacidade de
síntese de α-cetoglutarato e NADPH, o que torna a célula mais suscetível ao estresse
oxidativo. A IDH mutada também apresenta um ganho de função que corresponde à
redução do α-cetoglutarato a D-2-hidroxiglutarato (2HG) (39). Essa nova atividade
enzimática leva ao consumo de α-cetoglutarato e NADPH, prejudicando ainda mais a
proteção contra o estresse oxidativo realizada por estas moléculas. O 2HG produzido em
excesso é considerado metabólito oncogênico, pois induz alterações epigenéticas que levam
a regulação aberrante da expressão gênica. Este composto também induz elevação dos
níveis do HIF-1α (do inglês, hypoxia-inducible factor-1 α), fator de transcrição que
favorece angiogênese ao aumentar a expressão do fator de crescimento do endotélio
vascular (VEGF) (36,38,39)
1.2.4. Proteína Dupla Murina 2 (MDM2)
A proteína MDM2 do inglês Murine Double Protein 2 inibe a função da proteína
p53 (supressor oncogênico) de ativar genes responsáveis pela reparação celular ou
apoptose. Atua degradando a proteína p53 e seu papel no ciclo celular está, portanto,
pRb, o que, por sua vez, estimula a síntese de DNA na fase S da mitose (40,41). Assim,
alterações nos níveis de MDM2 podem causar distúrbio no controle do ciclo celular e
contribuir para a oncogênese (41,42). Normalmente associa-se com mutação da proteína p53
com relação direta e proporcional ao grau da neoplasia e índices de proliferação,
especificamente o número de mitoses por campo (2,42,43). O gene MDM2 encontra-se
possivelmente amplificado e com aumento de sua expressão em uma importante proporção
dos glioblastomas primários e secundários. Sua relação com o prognóstico e terapêutica
deve ainda ser melhor elucidada.
Conforme exposto, as alterações moleculares apresentadas pelos tumores
astrocitários são várias. Especificamente, o conhecimento destas alterações e de suas
repercussões imunofenotípicas em células de glioblastoma é interessante para o melhor
entendimento da fisiopatogênese destas neoplasias (2,44,45). Além disto, a análise de achados
imunoistoquímicos de diferentes marcadores biológicos associada a dados de evolução
clínica e resposta às abordagens terapêuticas protocolares atuais poderia contribuir para
melhor manejo clínico dos indivíduos portadores de glioblastoma (43). Sua compreensão
torna-se essencial tendo em vista o desenvolvimento de drogas que tenham como alvo
marcadores celulares que participam ativamente do ciclo celular e capacidade de
9
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
Investigar a prevalência de casos de glioblastoma tratados no Hospital de Clínicas
da Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da Universidade Estadual de Campinas
(Unicamp) entre janeiro de 2008 e dezembro de 2012, bem como a expressão tecidual de
marcadores biológicos, correlacionando-os com achados morfológicos, dados de evolução
clínica e resposta terapêutica.
2.2. Específicos
2.2.1. Realizar descrição clínica e morfológica dos casos de glioblastoma tratados no
Hospital de Clínicas da FCM/Unicamp entre janeiro 2008 e dezembro de 2012.
2.2.2. Avaliar a distribuição tecidual, através de técnica imunoistoquímica, de marcadores
biológicos como o fator de crescimento epidérmico (EGFR), proteína p53, forma mutante
da isocitrato desidrogenase 1 e proteína murina 2 (MDM2) - nos casos de glioblastoma
tratados no Hospital de Clínicas da FCM/Unicamp entre janeiro 2008 e dezembro de 2012.
2.2.3. Correlacionar os achados morfológicos e imunoistoquímicos com dados da evolução
e radioterapia nos casos de glioblastoma tratados no Hospital de Clínicas da FCM/Unicamp
11
3. MATERIAL E MÉTODOS
O presente estudo se baseou em análise retrospectiva de pacientes que
desenvolveram glioblastoma primário ou secundário entre o período de janeiro de 2008 a
dezembro de 2012. O material analisado foi proveniente do arquivo do Departamento de
Anatomia Patológica da Faculdade de Ciências Médicas (FCM) da Unicamp. A faixa etária
considerada foi de 18 a 81 anos, excluindo-se assim neoplasias na faixa etária pediátrica
com comportamento biológico geralmente diverso daquele apresentado pelas lesões em
adultos. Foram excluídas amostras cujo tratamento não tenha sido o protocolar existente
(ou seja, cirurgia com ressecção total ou subtotal, radioterapia com 60 Gy e quimioterapia
com Temozolamida). O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
FCM – Unicamp (Parecer # 25144; vide Apêndice 3).
3.1. Dados Clínicos
Foram analisados os seguintes dados clínicos: idade, gênero, sobrevida total,
sobrevida radiológica, sobrevida com tempo livre de doença clínica, ressecção total ou
3.2. Análises Histopatológicas
Após a recuperação dos blocos de parafina do arquivo do Departamento de
Anatomia Patológica da FCM/Unicamp, cortes de 4 µm foram obtidos para a coloração
com Hematoxilina e Eosina e para as marcações imunoistoquímicas.
3.2.1. Coloração com Hematoxilina e Eosina (HE) e Critérios Histopatológicos
Os cortes de tumores foram corados com HE de acordo com o protocolo padrão do
Serviço de Anatomia Patológica do Hospital de Clínicas da Unicamp, analisados à
microscopia óptica. Os astrocitomas foram classificados segundo as características
morfológicas propostas na última classificação de tumores do SNC publicada pela OMS em
2007: atipias celulares, figuras de mitose, hiperplasia endotelial e necrose.
3.2.2. Reações de Imunoistoquímica
As reações imunoistoquímicas foram realizadas com os anticorpos listados: anti-
p53, EGFR, IDH-1 e MDM2 (Tabela 1). Esses dados foram correlacionados com os dados
clínicos e histopatológicos.
Especificamente, os cortes histológicos foram coletados em lâminas previamente
tratadas com 3-aminopropil-trietoxi-silano (Sigma Chemical Company, EUA).
Inicialmente, os cortes foram desparafinizados com três sequências de xilol por 10 minutos
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etanol (100%, 80% e 50%) e lavados em água destilada. A atividade da peroxidase
endógena foi inibida utilizando peróxido de hidrogênio a 10% em três incubações de cinco
minutos cada, e posteriormente os cortes foram lavados em água destilada. Após
recuperação antigênica (Tabela 2), os cortes foram lavados em água destilada, e colocados
em solução salina tamponada com fosfato (PBS) a 10mM (pH 7,2-7,6). Os cortes foram
então incubados com os anticorpos primários diluídos (Tabela 1) em albumina sérica
bovina (BSA) 1% diluída em PBS. Após, dilui-se o anticorpo nesta solução, incubando a
lâmina a 37oC por 30 minutos. Depois as lâminas foram mantidas a 4oC.
Após incubação com os anticorpos primários, os cortes foram lavados em PBS (3x 5
minutos). Em seguida, o sistema de detecção contendo o anticorpo secundário e peroxidase
(EnvisionTM+Dual Link System-HRP® - Dako, cat# K4061 ou AdvanceTMHRP® - Dako,
cat# K4068; Tabela 2) foi adicionado por 30 minutos a 37°. A revelação foi feita com o
substrato cromogênico 3,3 diaminobenzidina (DAB). Terminada esta etapa, as lâminas
foram novamente lavadas com agua destilada e contra-coradas com Hematoxilina de Mayer
durante 5 minutos, desidratadas através de dois banhos em solução de etanol a 100%,
diafanizadas em xilol com duas trocas e montadas em resina (Enthellan®). Controles
Tabela 1. Anticorpos primários, clones, diluições e fabricantes que foram utilizados no
estudo imunoistoquímico.
Anticorpo Primário Clone Diluição Fabricante
EGFR EGFR1(1005) 1:500 Santa Cruz®
MDM2 1B10 1:50 Abnova®
p53 DO-7 1:200 Dako®
IDH-1 HMab-1 1:50 Millipore®
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Tabela 2. Protocolos de recuperação antigênica e revelação para cada anticorpo.
Anticorpo Tampão pH Revelação
EGFR Tris-EDTA 9,0 Envision®
MDM2 Tris-EDTA 9,0 Envision®
p53 Tris-EDTA 9,0 Advance®
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3.2.2.1. Análise das Imunomarcações
Os padrões de imunomarcação para p53, EGFR e MDM2 foram avaliados
considerando tanto a distribuição celular (citoplasma e/ou núcleo) quanto a tecidual. Com
relação a esta última, adaptamos as classificações semi-quantitativas propostas por
Giordana(47) e Korkolopoulou (48). Especificamente, a presente avaliação semi-quantitativa
modificada foi feita em 10 campos de grande aumento (40x) aleatoriamente escolhidos em
regiões viáveis (não-necróticas) de um corte histológico do tumor. Para cada campo, uma
classe (1, 2, 3 ou 4) foi atribuída de acordo com a porcentagem estimada de células
imunopositivas (1: 0-25%; 2: 25-50%; 3: 50-75%; e 4: 75 - 100%). O valor médio dos 10
valores estimados para um corte foi apresentado como o percentual de imunopositividade
atribuído para a amostra tumoral. Este percentual foi indicado como uma classe (1: 0-25%;
2: 25-50%; 3: 50-75%; e 4: 75 - 100%). Por sua vez, para a marcação para IDH-1 foi
utilizada a classificação binomial de “positiva” ou “negativa”, de acordo com a presença ou
ausência de células neoplásicas com marcação citoplasmática (32,33).
3.3. Análise Estatística
Para responder aos objetivos do estudo, além de técnicas básicas de análise
exploratória de dados como média, frequência absoluta e relativa, foram utilizados os testes
de Kruskal-Wallis e Qui-Quadrado, além do Coeficiente de Correlação de Pearson.
O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para avaliar a diferença entre as médias de
variáveis quantitativas em diferentes categorias (amostras) de variáveis categóricas. Por sua
de duas variáveis categóricas. Por fim, o Coeficiente de Correlação de Pearson foi utilizado
para avaliar a correlação entre duas variáveis quantitativas. Essas três metodologias
possuem, nesse trabalho, o mesmo objetivo: avaliar estatisticamente a relação entre as
variáveis de interesse.
Todos os testes de hipóteses desenvolvidos nesse trabalho consideraram 5% de
significância, isto é, a hipótese nula foi rejeitada quando p-valor foi menor que 0,05.
4. RESULTADOS
4.1. Dados Clínicos
Foram estudados 36 casos de glioblastoma multiforme do arquivo do
Departamento de Anatomia Patológica da FCM - UNICAMP. Os casos ocorreram entre
2008 e 2012. Todos com óbito confirmado (Tabela 3).
4.1.1. Idade
Foram avaliados pacientes com idades entre 22 e 88 anos. A média de idade foi de
57,22 anos, com uma mediana de 58,5 anos. Em 8 dentre os 36 casos, o diagnostico foi
realizado aos 67 anos.
4.1.2. Gênero
Dos 36 casos estudados, 16 (45%) foram do sexo masculino e 20 (55%), do sexo
feminino.
4.1.3. Localização
Dos 36 casos analisados, 2 estavam localizados no diencéfalo, 12 no lobo
4.1.4. Glioblastoma Primário (de novo) ou Secundário
Dos 36 casos analisados, 35 tumores foram diagnosticados como primários e
apenas 1 caso como secundário.
4.1.5. Tratamento
O tratamento dos 36 casos estudados foi padronizado em cirurgia com ressecção
subtotal ou total, quimioterapia inicial com temozolamida (Temodal®) 200 mg/m2 e
radioterapia com 60 Gy. O seguimento com novos ciclos de temozolamida ocorreu de
acordo com a evolução de cada caso. Nestes 36 casos não foram usados outros
quimioterápicos.
4.1.6. Tempo de Livre de Doença Clínica ou Sintomática
Nos 36 casos estudados a média do tempo livre de doença clínica foi de 7,56
meses, com uma mediana de 7 meses. O mínimo foi de 4 meses e o máximo de 11 meses.
4.1.7. Tempo Livre de Doença Radiológica Avaliado por Ressonância Nuclear
Magnética do Crânio (com ou sem contraste) e/ou Tomografia Computadorizada do
Crânio (com ou sem contraste)
O tempo livre de doença radiológica médio foi de 7,14 meses, com uma mediana
Tabela 3: Informações clínicas dos 36 casos de glioblastoma multiforme. O tempo de
sobrevida está indicado em meses. RT: ressecção total; TLDC: tempo livre de doença clinica (meses); TLDR: tempo livre de doença radiológica (meses).
4.2. Avaliação Histológica
Em todos os casos analisados foram observados os achados histológicos clássicos
de glioblastoma: atipias, figuras de mitose, hiperplasia endotelial (proliferação vascular) e
necrose. Campos microscópicos representativos são apresentados nas Figuras 1 a 4.
4.2.1. Contagem de Figuras de Mitose / 10 Campos de Grande Aumento (CGA)
Em todos os casos avaliados, a média do número de figuras de mitose / 10 CGA
foi de 3,9, com uma mediana de 4,1.
4.2.2. Hiperplasia Endotelial
No presente estudo, a hiperplasia endotelial foi classificada como: leve,
moderada, moderada-acentuada e acentuada. Três casos tiveram a hiperplasia endotelial
classificada como moderada, 10 casos como moderada-acentuada e 23 casos como
acentuada.
4.2.3. Necrose
A extensão de necrose foi classificada como 0 a 100% da superfície de corte
tumoral amostrada na lâmina analisada. A média da extensão estimada de necrose foi
Figura 1. Atipias celulares em corte histológico de glioblastoma (hematoxilina e eosina). Notar pleomorfismo, irregularidade e hipercromasia nucleares. Objetiva 40x.!!
Figura 2. Figura de mitose em corte histológico de glioblastoma (hematoxilina e eosina). Notar, no centro do campo, figura de mitose atípica em célula neoplásica.
Figura 3. Proliferação endotelial em corte histológico de glioblastoma (hematoxilina e eosina). Notar múltiplos vasos neoplásicos com formato e arquitetura irregulares.
Detalhe: vaso anômalo exibindo hiperplasia de células endoteliais, com arranjo em pseudoglomérulo. Objetivas: 4x (panorâmica) e 40x (detalhe).
Figura 4. Área de necrose em corte histológico de glioblastoma (hematoxilina e eosina). Notar, no centro do campo, aspecto em pseudopaliçada da área de necrose
4.3. Imunomarcações
4.3.1 Imunomarcação para EGFR
Com relação à imunomarcação para EGFR, notou-se positividade citoplasmática
com distribuição irregular no tecido e intensidade variando de fraca a forte. Nos casos
analisados neste estudo, a positividade para EGFR foi apresentada em 4 classes com as
seguintes percentagens de células positivas correspondentes: classe 1 (0 a 25%), classe 2
(26 a 50%), classe 3 de (51 a 75%) e classe 4 (76 a 100%). Dentro do total de 36
pacientes, 4 apresentaram classe 1, 12 apresentaram classe 2, 17 apresentaram classe 3 e
3 apresentaram classe 4 (Figuras 5 a 9).
Figura 5. Imunomarcação para EGFR em corte histológico de glioblastoma. Notar
Figura 6. Imunomarcação para EGFR em corte histológico de glioblastoma. Campo
representativo de área classificada como 1. Objetiva 20x.
Figura 7. Imunomarcação para EGFR em corte histológico de glioblastoma. Campo
Figura 8. Imunomarcação para EGFR em corte histológico de glioblastoma. Campo
representativo de área classificada como 3. Objetiva 20x.
Figura 9. Imunomarcação para EGFR em corte histológico de glioblastoma. Campo
4.3.2. Imunomarcação para Proteína p53
O padrão de marcação para a proteína p53 foi nuclear, com distribuição irregular
no tecido e intensidade forte. Nos casos analisados neste estudo, a positividade para p53
foi apresentada em 4 classes com as seguintes percentagens de células positivas
correspondentes: classe 1 (0 a 25%), classe 2 (26 a 50%), classe 3 (51 a 75%) e classe 4
(76 a 100%).
Dentro do total de 36 pacientes , nenhum foi alocado na classe 1 (0-25%), 5
apresentaram classe 2 (26-50%), 17 apresentaram classe 3 (51-75%) e 14 apresentaram
classe 4 (75-100%) de positividade (Figuras 10 a 13).
Figura 10. Imunomarcação para proteína p53 em corte histológico de glioblastoma.
Campo representativo de área classificada como 1. No entanto, após a análise completa de cada um dos cortes histológicos, nenhuma das lesões foi designada como classe 1. Objetiva 10x.
Figura 11. Imunomarcação para proteína p53 em corte histológico de glioblastoma.
Campo representativo de área classificada como 2. Objetiva 10x.
Figura 12. Imunomarcação para proteína p53 em corte histológico de glioblastoma.
Figura 13. Imunomarcação para proteína p53 em corte histológico de glioblastoma.
Campo representativo de área classificada como 4. Objetiva 10x.
4.3.3. Imunomarcação para a Forma Mutante da Enzima Isocitrato Desidrogenase-1
(IDH-1)
O padrão de marcação para a forma mutante da IDH-1 foi citoplasmático, com
distribuição irregular no tecido e intensidade variando de fraca (predominante) a
moderada. Foi observada positividade para a forma mutante da IDH-1 apenas em 1 tumor
dos 36 casos avaliados. Em paralelo às reações de imunoistoquímica realizadas para
investigar a proteína mutante nos espécimes de alto grau, foi investigada uma amostra de
astrocitoma difuso de baixo grau (OMS grau II) obtido a partir do arquivo do Serviço de
enzima mutante. Tal amostra serviu como controle externo positivo, validando os
resultados que obtivemos com as amostras de alto grau (Figuras 14 e 15).
Figura 14. Imunomarcação para forma mutante da IDH-1 em corte histológico de astrocitoma difuso de baixo grau. Notar positividade citoplasmática em astrócitos
neoplásicos. Objetivas: 20x (A) e 40x (B).
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Figura 15. Imunomarcação para forma mutante da IDH-1 em corte histológico de glioblastoma. Notar marcação citoplasmática das células neoplásicas com distribuição
semelhante àquela observada na lesão de menor grau. Porém, no presente espécime, a intensidade de marcação foi leve (predominantemente) a moderada.. Objetiva 20x.
4.3.4. Imunomarcação para Proteína Dupla Murina 2 (MDM2)
O padrão de imunomarcação para a MDM2 foi nuclear, com distribuição irregular
no tecido e intensidade forte. Nos casos analisados neste estudo a positividade para o
MDM2 foi apresentada em 4 classes com as seguintes percentagens de células positivas
correspondentes: classe 1 (0 a 25%), classe 2 (25 a 50%), classe 3 de (50 a 75%) e classe
4 (75 a 100%). Dentro do total de 36 pacientes , 2 casos apresentaram classe 1 (0-25%),
13 casos apresentaram classe 2 (26-50%), 15 casos apresentaram classe 3 (51-75%) e 6
Figura 16. Imunomarcação para MDM2 em corte histológico de glioblastoma. Notar
marcação nuclear na maior parte das células neoplásicas. Objetiva 40x.
Figura 17. Imunomarcação para MDM2 em corte histológico de glioblastoma.
Figura 18. Imunomarcação para MDM2 em corte histológico de glioblastoma.
Campo representativo de área classificada como 2. Objetiva 20x.
Figura 19. Imunomarcação para MDM2 em corte histológico de glioblastoma.
Figura 20. Imunomarcação para MDM2 em corte histológico de glioblastoma.
Campo representativo de área classificada como 4. Objetiva 20x.
4.4. Correlações entre Dados Clínicos e Morfológicos
4.4.1. Correlação entre Classes de Imunomarcação para Proteína p53, Forma Mutante da IDH-1, EGFR e MDM2 com a Sobrevida Total
A análise de correlação entre dados clínicos e morfológicos iniciou-se avaliando estatisticamente a relação das classes de imunopositividade para a proteína p53, forma mutante da IDH-1, EGFR e MDM2 com a sobrevida total. O teste estatístico utilizado foi o de Kruskall-Wallis, através do qual foram testadas as diferenças médias da sobrevida total entre as categorias (classes) de p53, IDH-1, EGFR e MDM2.
Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas, uma vez que o p-valor para p53 foi de 0,42, para IDH-1 foi de 0,26, para EGFR foi de 0,39 e para MDM2 foi de 0,06, ou seja, todos p-valores maiores que 0,05. Dessa forma, podemos concluir que as médias da sobrevida total entre as categorias de p53, IDH-1, EGFR e
MDM2 são estatisticamente iguais, ou ainda, em outras palavras, podemos concluir que não há relação estatisticamente significativa entre as classes de imunomarcação aqui testadas para p53, IDH-1, EGFR, MDM2 e a sobrevida total. As Figuras 21 a 24 apresentam a sobrevida total média para cada categoria de p53, IDH-1, EGFR e MDM2.
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Figura 21. Gráfico representativo da correlação entre as classes de imunopositividade para p53 e a sobrevida total média. No eixo X estão apresentadas
as classes de imunomarcação para p53. No eixo Y estão indicados o período de sobrevida média em meses (Teste de Kruskall-Wallis, p=0,42).
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Figura 22. Gráfico representativo da correlação entre a imunopositividade para IDH-1 e a sobrevida total média. No eixo X estão apresentadas as classes de
imunomarcação para IDH-1. No eixo Y estão indicados os períodos de sobrevida média em meses.(Teste de Kruskall-Wallis, p=0,26). !& !" !$#(& !$#* $ " % ' ( !$ !" !% $)"* "*)*$ *$)+* +*)!$$
Figura 23. Gráfico representativo da correlação entre as classes de imunopositividade para EGFR e a sobrevida total média. No eixo X estão
apresentadas as classes de imunomarcação para EGFR. No eixo Y estão indicados os períodos de sobrevida média em meses (Teste de Kruskall-Wallis, p=0,39).
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Figura 24. Gráfico representativo da correlação entre as classes de imunopositividade para MDM2 e a sobrevida total média. No eixo X estão
apresentadas as classes de imunomarcação para MDM2. No eixo Y estão indicados os períodos de sobrevida média em meses (Teste de Kruskall-Wallis, p=0,06).
4.4.2. Correlação entre Classes de Imunomarcação para p53 e MDM2, p53 e EGFR e EGFR e MDM2
Em seguida, foi avaliado, via teste Qui-Quadrado, a relação entre as classes de imunomarcção para p53 e MDM2, p53 e EGFR e EGFR e MDM2. Foi detectada dependência, isto é, uma relação estatisticamente significativa entre p53 e MDM2 (p-valor=0,00) e entre EGFR e MDM2 (p-valor=0,04). Não foi detectada relação estatisticamente significativa entre p53 e EGFR (p-valor=0,09). Esses resultados, bem como a frequência cruzada entre essas variáveis, são apresentados nas Tabelas 4 a 6.
Tabelas 4,5 e 6. Correlação entre classes de imunomarcação para p53 e MDM2, p53 e EGFR e EGFR e MDM2 respectivamente.
Tabelas 4,5 e 6 (continuação). Correlação entre classes de imunomarcação para p53 e MDM2, p53 e EGFR e EGFR e MDM2 respectivamente.
4.4.3. Correlação entre Classes de Imunomarcação para p53, MDM2 e EGFR com a Sobrevida Clínica e com a Sobrevida Radiológica
A análise seguiu avaliando estatisticamente, via teste de Kruskal-Wallis, a relação das classes de imunomarcação para p53, MDM2 e EGFR com a sobrevida clínica e com a sobrevida radiológica. A única relação estatisticamente significativa detectada, isto é, o único caso onde foram detectadas médias estatisticamente diferentes pelo teste de Kruskal-Wallis, foi entre p53 e sobrevida clínica (p-valor=0,02). Especificamente, quanto maior a classe de imunomarcação para p53, menor a sobrevida clínica (Figura 25).
As demais relações não foram estatisticamente significativas, sendo a relação de p53 com sobrevivência radiológica com p-valor igual a 0,13, MDM2 com sobrevivência clínica com p-valor igual a 0,31, MDM2 com sobrevivência radiológica com p-valor igual a 0,37, EGFR com sobrevivência clínica com p-valor igual a 0,53 e, por fim, EGFR com sobrevivência radiológica com p-valor igual a 0,91. As Figuras 26 a 30 mostram as médias de sobrevivência clínica e/ou radiológica para as diferentes classes de imunomarcação para p53, MDM2 e EGFR.
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Figura 25. Gráfico representativo da correlação entre as classes de imunopositividade para proteína p53 e sobrevida clínica média. Os valores no eixo X
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Figura 26. Gráfico representativo da correlação entre as classes de imunopositividade para proteína p53 e sobrevida radiológica média. . Os valores no
eixo X representam a classificação usada para a p53 e, no eixo Y, a sobrevida em meses.
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Figura 27. Gráfico representativo da correlação entre as classes de imunopositividade para MDM2 e sobrevida clínica média. Os valores no eixo X
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Figura 28. Gráfico representativo da correlação entre as classes de imunopositividade para MDM2 e sobrevida radiológica média. Os valores no eixo X
representam a classificação usada para a MDM2 e, no eixo Y, a sobrevida em meses.
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Figura 29. Gráfico representativo da correlação entre as classes de imunopositividade para EGFR e sobrevida clínica média. Os valores no eixo X
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Figura 30. Gráfico representativo da correlação entre as classes de imunopositividade para EGFR e sobrevida radiológica média. Os valores no eixo X
representam a classificação usada para o EGFR e, no eixo Y, a sobrevida em meses.
4.4.4. Correlações entre as Sobrevidas Clínica, Radiológica e Total
Para avaliar estatisticamente as relações entre as sobrevidas clínica, radiológica e total foi utilizado o Coeficiente de Correlação de Pearson, seguido do p-valor resultante do teste de hipóteses, onde é testado se o coeficiente de correlação calculado é estatisticamente diferente de zero, ou seja, onde é testada a significância estatística da correlação. Todas as correlações calculadas foram estatisticamente significativas (todas com p-valor menor que 0,0001) e positivas, ou seja, o aumento de uma sobrevida implica aumento da outra sobrevida. A correlação mais forte foi entre sobrevida clínica e radiológica (0,79), seguida de radiológica e total (0,75) e clínica e total (0,69) (Tabela 7).
Tabela 7: Correlações entre as Sobrevidas Clínica, Radiológica e Total.
4.4.5. Correlação do Gênero com a Sobrevida Clínica, Sobrevida Radiológica e Sobrevida Total
Para avaliar a correlação do gênero com a sobrevida clínica, sobrevida radiológica e sobrevida total, foi utilizado também o teste de Kruskal-Wallis, onde foi testado se a média de cada uma das sobrevidas é estatisticamente diferente entre os sexos. Não foi encontrada relação estatisticamente significativa das sobrevidas clínica, radiológica e total com o gênero, uma vez que as médias são estatisticamente iguais pelo teste de Kruskal-Wallis, com p-valor igual a 0,36 para a sobrevida clínica, igual a 0,38 para a radiológica e 0,81 para a total. É possível observar nas Figuras 31 a 33 que, de fato, as sobrevidas médias são semelhantes entre os sexos.
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Figura 31. Gráfico representativo da correlação entre gênero e sobrevida clínica média. No eixo X está representado o gênero analisado e, no eixo Y, a sobrevida em
meses. +#&* '#(( $#$$ !#$$ "#$$ &#$$ %#$$ *#$$ '#$$ +#$$ (#$$ 45678789 :;<=>?789
Figura 32. Gráfico representativo da correlação entre gênero e sobrevida radiológica média. No eixo X está representado o gênero analisado e, no eixo Y, a
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Figura 33. Gráfico representativo da correlação entre gênero e sobrevida total média. No eixo X está representado o gênero analisado e, no eixo Y, a sobrevida em
meses.
4.4.6. Correlação das Classes de Imunomarcação para Proteína p53, MDM2 e EGFR com Número de Mitoses e Extensão de Ressecção Tumoral
Em seguida, foi avaliada pelo teste Qui-Quadrado a dependência, ou a relação das classes de imunopositividade para proteína p53, MDM2 e EGFR com número de figuras de mitose / 10 CGA e extensão de ressecção tumoral (total ou subtotal). Não foi encontrada relação estatisticamente significativa, uma vez que todos os p-valores dos testes Qui-Quadrado observados foram maiores que 0,05. As Tabelas 8 a 13 mostram a frequência cruzada entre essas variáveis, bem como os resultados dos testes de hipóteses.
Tabela 8. Correlação entre classes de imunomarcação para proteína p53 e número de figuras de mitose / 10 campos de grande aumento.
Tabela 9. Correlação entre classes de imunomarcação para proteína p53 e extensão de ressecção tumoral (total ou subtotal).
Tabela 10. Correlação entre classes de imunomarcação para MDM2 e número de figuras de mitose / 10 campos de grande aumento.
Tabela 11. Correlação entre classes de imunomarcação para MDM2 e extensão de ressecção tumoral (total ou subtotal).
Tabela 12. Correlação entre classes de imunomarcação para EGFR e número de figuras de mitose / 10 campos de grande aumento.
Tabela 13. Correlação entre classes de imunomarcação para EGFR e extensão de ressecção tumoral (total ou subtotal).
4.4.7. Frequências Cruzadas entre as Classes de Imunomarcação para Proteína p53, MDM2 e EGFR com a Localização do Tumor
As Tabelas 14, 15 e 16 apresentam, além das frequências cruzadas das classes de imunomarcação para proteína p53, MDM2 e EGFR com a localização do tumor, os testes Qui-Quadrado para avaliar estatisticamente a dependência entre essas variáveis. Pode-se observar que não há relação estatisticamente significativa, uma vez que o p-valor entre p53 e a localização do tumor foi de 0,59, do p-valor de MDM2 com localização do tumor foi de 0,93 e do p-valor de EGFR com localização do tumor foi de 0,88, ou seja, todos maiores que 0,05.
Tabela 14. Frequências cruzadas entre as classes de imunomarcação para proteína p53 e localização do tumor.
Tabela 15. Frequências cruzadas entre as classes de imunomarcação para MDM2 e localização do tumor.
Tabela 16. Frequências cruzadas entre as classes de imunomarcação para EGFR e localização do tumor.
4.4.8. Correlação das Sobrevidas Clínica, Radiológica e Total com a Localização do Tumor
Para avaliar estatisticamente a relação das sobrevidas clínica, radiológica e total com a localização do tumor, recorremos ao teste de Kruskal-Wallis, através do qual foi testada a diferença das médias de cada sobrevida entre cada uma das localizações. Não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas em nenhuma das sobrevidas, uma vez que o p-valor foi igual a 0,58 para a sobrevida clínica, 0,70 para a radiológica e 0,65 para a total. Dessa forma, podemos concluir que, no presente estudo, não houve relação estatisticamente significativa de nenhuma das sobrevidas com a localização do tumor (Figuras 34 a 36). ,#*$ +#'$ +#", +#$$ +#'+ (#'+ *#*$ +#&( $#$$ !#$$ "#$$ &#$$ %#$$ *#$$ '#$$ +#$$ (#$$ ,#$$ !$#$$
Figura 34. Gráfico representativo da correlação entre localização do tumor e sobrevida clínica. No eixo X encontra-se representada a localização do tumor e, no eixo
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Figura 35. Gráfico representativo da correlação entre localização do tumor e sobrevida radiológica. No eixo X encontra-se representada a localização do tumor e, no
eixo Y, a sobrevida em meses.
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Figura 36. Gráfico representativo da correlação entre localização do tumor e sobrevida total. No eixo X encontra-se representada a localização do tumor e, no eixo Y,
4.4.9. Correlação das Sobrevidas Clínica, Radiológica e Total com a Idade
Em seguida, foi avaliada estatisticamente a relação das sobrevidas clínica, radiológica e total com a idade. Para tanto, recorremos ao Coeficiente de Correlação de Pearson seguido do p-valor resultante do teste de hipóteses, onde é testado se o coeficiente de correlação calculado é estatisticamente diferente de zero, ou seja, onde é testada a significância estatística da correlação. Não foi detectada correlação estatisticamente significativa, uma vez que p-valor é maior que 0,05 em todos os casos (Tabela 17).
4.4.10 Correlação das Sobrevidas Clínica, Radiológica e Total com a Extensão de Ressecção Tumoral
Por fim, foi avaliada, através do teste de Kruskal-Wallis, a relação das sobrevidas clínica, radiológica e total com a extensão da ressecção tumoral (total ou subtotal). Não foi detectada relação estatisticamente significativa, uma vez que não foram detectadas médias estatisticamente diferentes entre ressecção total e subtotal. Para a sobrevida clínica o p-valor foi de 0,98, para a radiológica foi de 0,87 e para a total foi de 0,57 (Figuras 37 a 39). +#%& +#*, $#$$ !#$$ "#$$ &#$$ %#$$ *#$$ '#$$ +#$$ (#$$ -@9 076
Figura 37. Gráfico representativo da correlação entre extensão de ressecção e sobrevida clínica. No eixo X encontra-se especificado se foi realizada ressecção total
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Figura 38. Gráfico representativo da correlação entre extensão de ressecção e sobrevida radiológica. No eixo X encontra-se especificado se foi realizada ressecção
total (sim) ou subtotal (não).
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Figura 39. Gráfico representativo da correlação entre extensão de ressecção e sobrevida total. No eixo X encontra-se especificado se foi realizada ressecção total (sim)
5. DISCUSSÃO
Em geral, o conjunto dos dados clínicos coletados a partir dos prontuários do
HC-UNICAMP aproxima-se dos dados obtidos na literatura (2,49).A média de idade encontrada
dos pacientes avaliados em nossa amostragem foi de 57,7 anos. Particularmente, oito casos
tiveram o diagnóstico anatomopatológico com a idade de 67 anos. Houve um predomínio
do sexo feminino (55%), o que distancia-se um pouco do encontrado em outros trabalhos (2,49)
. É possível que o fato de nossa amostra ser relativamente pequena e não multicêntrica
justifique a diferença entre os dados da literatura e aqueles obtidos em nosso estudo.
No presente estudo a localização predominante foi o lobo frontal, o que compara-se
ao descrito em outros trabalhos (49).É importante ressaltar-se que, muitas vezes, a
localização inicial apresenta-se obscura pois a neoplasia e altamente invasiva, ocupando
ordinariamente diversos lobos cerebrais, inclusive, como se sabe, de forma
inter-hemisférica. Isso torna a classificação topográfica, na melhor das hipóteses, apenas uma
estimativa da predominância do tumor em determinado lobo cerebral.
Dentre os 36 casos analisados, apenas 1 mostrou-se secundário, ou seja, ao redor de
3%. Tal percentagem encontra-se próxima ao valor observado por outros autores, em torno
de 5% (2,49).
A escolha do tratamento realizado em nossa instituição segue o que é encontrado em
diversos protocolos de serviços ao redor do mundo. Especificamente, alguns pacientes não
foram submetidos a este tratamento protocolar, seja por efeitos colaterais da radio e/ou
quimioterapia ou condições clínicas que inviabilizaram o tratamento padrão.Desta forma,
abordagem protocolar. Estas limitações reduziram o número de pacientes possíveis de
serem incluídos neste estudo. Porém tais limitações uniformizaram nossa amostra para
efeito de comparação de resultados, tornando as correlações mais confiáveis, ou seja, com
mínima interferência de variáveis externas.
O tempo livre de doença clínica ou sintomática caracteriza-se pelo intervalo de
tempo (em meses), após a cirurgia, a partir do qual manifestações clínicas direta ou
indiretamente relacionadas á neoplasia são verificadas, por exemplo, o aparecimento de
crises convulsivas, cefaleia, depressão, infecções secundárias e trombose venosa profunda .
Nesta investigação, a media foi de 7,56 meses. Até onde sabemos, este é um dado original
em uma casuística brasileira, visto que não encontramos tal informação em estudos prévios
para comparação.
O tempo livre de doença radiológica (TLDR) é o intervalo de tempo (em meses)
entre a ressecção cirúrgica e o reaparecimento ou aumento da lesão detectados por métodos
radiológicos, independentemente de manifestações clínicas. Em nosso trabalho tal
intervalo apresentou uma média de 7,14 meses, discretamente menor do que o tempo livre
de doença clínica. Esta diferença poderia ser explicada pelo fato de a lesão aumentar ou
reaparecer usualmente antes das manifestações clinicas. Um TLDR maior seria esperado
caso os pacientes somente realizassem exames radiológicos após manifestações clínicas.
Porém, não é o que acontece no Serviço de Neurocirurgia da Unicamp, no qual ocorrem
Com relação à análise morfológica, foram encontrados 3 ou 4 dos critérios
histopatológicos estabelecidos pela Organização Mundial de Saúde(OMS)em 2007, ou
seja: atipias, figuras de mitose, proliferação vascular (hiperplasia endotelial) e/ou necrose.
A contagem de figuras de mitose por 10 campos de maior aumento (CGA) foi feita
de forma aleatória em cada lâmina estudada. A média foi de 3,9 figuras de mitose/10 CGA.
Tal média encontra-se um pouco abaixo do valor habitualmente encontrado na literatura (2,49)
, o qual situa-se ao redor de 4 a 6 figuras de mitose/10CGA. No entanto, há grande
variação entre os valores encontrados nos trabalhos que relatam este dado
quantitativo.Especificamente, no nosso estudo, o número relativamente pequeno de
pacientes investigados e o fato de termos avaliado uma lâmina por caso pode ter
influenciado no resultado obtido.
Hiperplasia endotelial é um achado comum e exuberante na maioria dos
glioblastomas. Sua quantificação ou classificação não foi realizada neste trabalho pois
consideramos tratar-se de avaliação subjetiva e de difícil reprodutibilidade e correlação
com dados clínicos.
Por sua vez, a extensão de área necrótica em cada lâmina avaliada foi estimada
como percentual da área total do tumor presente no corte histológico. No entanto, ainda que
tal estimativa seja de mais fácil realização do aquela correspondente á hiperplasia
endotelial, a correlação da extensão da área necrótica com dados clínicos ou
imunoistoquímicos não foi realizada por ser informação altamente dependente da área
tumoral ressecada, tempo até a cirurgia e habilidade do cirurgião, fatores que consideramos
