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2. OBJETIVOS

3.2.2. Reações de imunoistoquímica

3.2.2.1. Análise das imunomarcações

Os padrões de imunomarcação para p53, EGFR e MDM2 foram avaliados

considerando tanto a distribuição celular (citoplasma e/ou núcleo) quanto a tecidual. Com

relação a esta última, adaptamos as classificações semi-quantitativas propostas por

Giordana(47) e Korkolopoulou (48). Especificamente, a presente avaliação semi-quantitativa

modificada foi feita em 10 campos de grande aumento (40x) aleatoriamente escolhidos em

regiões viáveis (não-necróticas) de um corte histológico do tumor. Para cada campo, uma

classe (1, 2, 3 ou 4) foi atribuída de acordo com a porcentagem estimada de células

imunopositivas (1: 0-25%; 2: 25-50%; 3: 50-75%; e 4: 75 - 100%). O valor médio dos 10

valores estimados para um corte foi apresentado como o percentual de imunopositividade

atribuído para a amostra tumoral. Este percentual foi indicado como uma classe (1: 0-25%;

2: 25-50%; 3: 50-75%; e 4: 75 - 100%). Por sua vez, para a marcação para IDH-1 foi

utilizada a classificação binomial de “positiva” ou “negativa”, de acordo com a presença ou

ausência de células neoplásicas com marcação citoplasmática (32,33).

3.3. Análise Estatística

Para responder aos objetivos do estudo, além de técnicas básicas de análise

exploratória de dados como média, frequência absoluta e relativa, foram utilizados os testes

de Kruskal-Wallis e Qui-Quadrado, além do Coeficiente de Correlação de Pearson.

O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para avaliar a diferença entre as médias de

variáveis quantitativas em diferentes categorias (amostras) de variáveis categóricas. Por sua

de duas variáveis categóricas. Por fim, o Coeficiente de Correlação de Pearson foi utilizado

para avaliar a correlação entre duas variáveis quantitativas. Essas três metodologias

possuem, nesse trabalho, o mesmo objetivo: avaliar estatisticamente a relação entre as

variáveis de interesse.

Todos os testes de hipóteses desenvolvidos nesse trabalho consideraram 5% de

significância, isto é, a hipótese nula foi rejeitada quando p-valor foi menor que 0,05.

4. RESULTADOS

4.1. Dados Clínicos

Foram estudados 36 casos de glioblastoma multiforme do arquivo do

Departamento de Anatomia Patológica da FCM - UNICAMP. Os casos ocorreram entre

2008 e 2012. Todos com óbito confirmado (Tabela 3).

4.1.1. Idade

Foram avaliados pacientes com idades entre 22 e 88 anos. A média de idade foi de

57,22 anos, com uma mediana de 58,5 anos. Em 8 dentre os 36 casos, o diagnostico foi

realizado aos 67 anos.

4.1.2. Gênero

Dos 36 casos estudados, 16 (45%) foram do sexo masculino e 20 (55%), do sexo

feminino.

4.1.3. Localização

Dos 36 casos analisados, 2 estavam localizados no diencéfalo, 12 no lobo

4.1.4. Glioblastoma Primário (de novo) ou Secundário

Dos 36 casos analisados, 35 tumores foram diagnosticados como primários e

apenas 1 caso como secundário.

4.1.5. Tratamento

O tratamento dos 36 casos estudados foi padronizado em cirurgia com ressecção

subtotal ou total, quimioterapia inicial com temozolamida (Temodal®) 200 mg/m2 e

radioterapia com 60 Gy. O seguimento com novos ciclos de temozolamida ocorreu de

acordo com a evolução de cada caso. Nestes 36 casos não foram usados outros

quimioterápicos.

4.1.6. Tempo de Livre de Doença Clínica ou Sintomática

Nos 36 casos estudados a média do tempo livre de doença clínica foi de 7,56

meses, com uma mediana de 7 meses. O mínimo foi de 4 meses e o máximo de 11 meses.

4.1.7. Tempo Livre de Doença Radiológica Avaliado por Ressonância Nuclear

Magnética do Crânio (com ou sem contraste) e/ou Tomografia Computadorizada do

Crânio (com ou sem contraste)

O tempo livre de doença radiológica médio foi de 7,14 meses, com uma mediana

Tabela 3: Informações clínicas dos 36 casos de glioblastoma multiforme. O tempo de

sobrevida está indicado em meses. RT: ressecção total; TLDC: tempo livre de doença clinica (meses); TLDR: tempo livre de doença radiológica (meses).

4.2. Avaliação Histológica

Em todos os casos analisados foram observados os achados histológicos clássicos

de glioblastoma: atipias, figuras de mitose, hiperplasia endotelial (proliferação vascular) e

necrose. Campos microscópicos representativos são apresentados nas Figuras 1 a 4.

4.2.1. Contagem de Figuras de Mitose / 10 Campos de Grande Aumento (CGA)

Em todos os casos avaliados, a média do número de figuras de mitose / 10 CGA

foi de 3,9, com uma mediana de 4,1.

4.2.2. Hiperplasia Endotelial

No presente estudo, a hiperplasia endotelial foi classificada como: leve,

moderada, moderada-acentuada e acentuada. Três casos tiveram a hiperplasia endotelial

classificada como moderada, 10 casos como moderada-acentuada e 23 casos como

acentuada.

4.2.3. Necrose

A extensão de necrose foi classificada como 0 a 100% da superfície de corte

tumoral amostrada na lâmina analisada. A média da extensão estimada de necrose foi

Figura 1. Atipias celulares em corte histológico de glioblastoma (hematoxilina e eosina). Notar pleomorfismo, irregularidade e hipercromasia nucleares. Objetiva 40x.!!

Figura 2. Figura de mitose em corte histológico de glioblastoma (hematoxilina e eosina). Notar, no centro do campo, figura de mitose atípica em célula neoplásica.

Figura 3. Proliferação endotelial em corte histológico de glioblastoma (hematoxilina e eosina). Notar múltiplos vasos neoplásicos com formato e arquitetura irregulares.

Detalhe: vaso anômalo exibindo hiperplasia de células endoteliais, com arranjo em pseudoglomérulo. Objetivas: 4x (panorâmica) e 40x (detalhe).

Figura 4. Área de necrose em corte histológico de glioblastoma (hematoxilina e eosina). Notar, no centro do campo, aspecto em pseudopaliçada da área de necrose

4.3. Imunomarcações

4.3.1 Imunomarcação para EGFR

Com relação à imunomarcação para EGFR, notou-se positividade citoplasmática

com distribuição irregular no tecido e intensidade variando de fraca a forte. Nos casos

analisados neste estudo, a positividade para EGFR foi apresentada em 4 classes com as

seguintes percentagens de células positivas correspondentes: classe 1 (0 a 25%), classe 2

(26 a 50%), classe 3 de (51 a 75%) e classe 4 (76 a 100%). Dentro do total de 36

pacientes, 4 apresentaram classe 1, 12 apresentaram classe 2, 17 apresentaram classe 3 e

3 apresentaram classe 4 (Figuras 5 a 9).

Figura 5. Imunomarcação para EGFR em corte histológico de glioblastoma. Notar

Figura 6. Imunomarcação para EGFR em corte histológico de glioblastoma. Campo

representativo de área classificada como 1. Objetiva 20x.

Figura 7. Imunomarcação para EGFR em corte histológico de glioblastoma. Campo

Figura 8. Imunomarcação para EGFR em corte histológico de glioblastoma. Campo

representativo de área classificada como 3. Objetiva 20x.

Figura 9. Imunomarcação para EGFR em corte histológico de glioblastoma. Campo

4.3.2. Imunomarcação para Proteína p53

O padrão de marcação para a proteína p53 foi nuclear, com distribuição irregular

no tecido e intensidade forte. Nos casos analisados neste estudo, a positividade para p53

foi apresentada em 4 classes com as seguintes percentagens de células positivas

correspondentes: classe 1 (0 a 25%), classe 2 (26 a 50%), classe 3 (51 a 75%) e classe 4

(76 a 100%).

Dentro do total de 36 pacientes , nenhum foi alocado na classe 1 (0-25%), 5

apresentaram classe 2 (26-50%), 17 apresentaram classe 3 (51-75%) e 14 apresentaram

classe 4 (75-100%) de positividade (Figuras 10 a 13).

Figura 10. Imunomarcação para proteína p53 em corte histológico de glioblastoma.

Campo representativo de área classificada como 1. No entanto, após a análise completa de cada um dos cortes histológicos, nenhuma das lesões foi designada como classe 1. Objetiva 10x.

Figura 11. Imunomarcação para proteína p53 em corte histológico de glioblastoma.

Campo representativo de área classificada como 2. Objetiva 10x.

Figura 12. Imunomarcação para proteína p53 em corte histológico de glioblastoma.

Figura 13. Imunomarcação para proteína p53 em corte histológico de glioblastoma.

Campo representativo de área classificada como 4. Objetiva 10x.

4.3.3. Imunomarcação para a Forma Mutante da Enzima Isocitrato Desidrogenase-1

(IDH-1)

O padrão de marcação para a forma mutante da IDH-1 foi citoplasmático, com

distribuição irregular no tecido e intensidade variando de fraca (predominante) a

moderada. Foi observada positividade para a forma mutante da IDH-1 apenas em 1 tumor

dos 36 casos avaliados. Em paralelo às reações de imunoistoquímica realizadas para

investigar a proteína mutante nos espécimes de alto grau, foi investigada uma amostra de

astrocitoma difuso de baixo grau (OMS grau II) obtido a partir do arquivo do Serviço de

enzima mutante. Tal amostra serviu como controle externo positivo, validando os

resultados que obtivemos com as amostras de alto grau (Figuras 14 e 15).

Figura 14. Imunomarcação para forma mutante da IDH-1 em corte histológico de astrocitoma difuso de baixo grau. Notar positividade citoplasmática em astrócitos

neoplásicos. Objetivas: 20x (A) e 40x (B).

!"

Figura 15. Imunomarcação para forma mutante da IDH-1 em corte histológico de glioblastoma. Notar marcação citoplasmática das células neoplásicas com distribuição

semelhante àquela observada na lesão de menor grau. Porém, no presente espécime, a intensidade de marcação foi leve (predominantemente) a moderada.. Objetiva 20x.

4.3.4. Imunomarcação para Proteína Dupla Murina 2 (MDM2)

O padrão de imunomarcação para a MDM2 foi nuclear, com distribuição irregular

no tecido e intensidade forte. Nos casos analisados neste estudo a positividade para o

MDM2 foi apresentada em 4 classes com as seguintes percentagens de células positivas

correspondentes: classe 1 (0 a 25%), classe 2 (25 a 50%), classe 3 de (50 a 75%) e classe

4 (75 a 100%). Dentro do total de 36 pacientes , 2 casos apresentaram classe 1 (0-25%),

13 casos apresentaram classe 2 (26-50%), 15 casos apresentaram classe 3 (51-75%) e 6

Figura 16. Imunomarcação para MDM2 em corte histológico de glioblastoma. Notar

marcação nuclear na maior parte das células neoplásicas. Objetiva 40x.

Figura 17. Imunomarcação para MDM2 em corte histológico de glioblastoma.

Figura 18. Imunomarcação para MDM2 em corte histológico de glioblastoma.

Campo representativo de área classificada como 2. Objetiva 20x.

Figura 19. Imunomarcação para MDM2 em corte histológico de glioblastoma.

Figura 20. Imunomarcação para MDM2 em corte histológico de glioblastoma.

Campo representativo de área classificada como 4. Objetiva 20x.

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