2. OBJETIVOS
3.2.2. Reações de imunoistoquímica
3.2.2.1. Análise das imunomarcações
Os padrões de imunomarcação para p53, EGFR e MDM2 foram avaliados
considerando tanto a distribuição celular (citoplasma e/ou núcleo) quanto a tecidual. Com
relação a esta última, adaptamos as classificações semi-quantitativas propostas por
Giordana(47) e Korkolopoulou (48). Especificamente, a presente avaliação semi-quantitativa
modificada foi feita em 10 campos de grande aumento (40x) aleatoriamente escolhidos em
regiões viáveis (não-necróticas) de um corte histológico do tumor. Para cada campo, uma
classe (1, 2, 3 ou 4) foi atribuída de acordo com a porcentagem estimada de células
imunopositivas (1: 0-25%; 2: 25-50%; 3: 50-75%; e 4: 75 - 100%). O valor médio dos 10
valores estimados para um corte foi apresentado como o percentual de imunopositividade
atribuído para a amostra tumoral. Este percentual foi indicado como uma classe (1: 0-25%;
2: 25-50%; 3: 50-75%; e 4: 75 - 100%). Por sua vez, para a marcação para IDH-1 foi
utilizada a classificação binomial de “positiva” ou “negativa”, de acordo com a presença ou
ausência de células neoplásicas com marcação citoplasmática (32,33).
3.3. Análise Estatística
Para responder aos objetivos do estudo, além de técnicas básicas de análise
exploratória de dados como média, frequência absoluta e relativa, foram utilizados os testes
de Kruskal-Wallis e Qui-Quadrado, além do Coeficiente de Correlação de Pearson.
O teste de Kruskal-Wallis foi utilizado para avaliar a diferença entre as médias de
variáveis quantitativas em diferentes categorias (amostras) de variáveis categóricas. Por sua
de duas variáveis categóricas. Por fim, o Coeficiente de Correlação de Pearson foi utilizado
para avaliar a correlação entre duas variáveis quantitativas. Essas três metodologias
possuem, nesse trabalho, o mesmo objetivo: avaliar estatisticamente a relação entre as
variáveis de interesse.
Todos os testes de hipóteses desenvolvidos nesse trabalho consideraram 5% de
significância, isto é, a hipótese nula foi rejeitada quando p-valor foi menor que 0,05.
4. RESULTADOS
4.1. Dados Clínicos
Foram estudados 36 casos de glioblastoma multiforme do arquivo do
Departamento de Anatomia Patológica da FCM - UNICAMP. Os casos ocorreram entre
2008 e 2012. Todos com óbito confirmado (Tabela 3).
4.1.1. Idade
Foram avaliados pacientes com idades entre 22 e 88 anos. A média de idade foi de
57,22 anos, com uma mediana de 58,5 anos. Em 8 dentre os 36 casos, o diagnostico foi
realizado aos 67 anos.
4.1.2. Gênero
Dos 36 casos estudados, 16 (45%) foram do sexo masculino e 20 (55%), do sexo
feminino.
4.1.3. Localização
Dos 36 casos analisados, 2 estavam localizados no diencéfalo, 12 no lobo
4.1.4. Glioblastoma Primário (de novo) ou Secundário
Dos 36 casos analisados, 35 tumores foram diagnosticados como primários e
apenas 1 caso como secundário.
4.1.5. Tratamento
O tratamento dos 36 casos estudados foi padronizado em cirurgia com ressecção
subtotal ou total, quimioterapia inicial com temozolamida (Temodal®) 200 mg/m2 e
radioterapia com 60 Gy. O seguimento com novos ciclos de temozolamida ocorreu de
acordo com a evolução de cada caso. Nestes 36 casos não foram usados outros
quimioterápicos.
4.1.6. Tempo de Livre de Doença Clínica ou Sintomática
Nos 36 casos estudados a média do tempo livre de doença clínica foi de 7,56
meses, com uma mediana de 7 meses. O mínimo foi de 4 meses e o máximo de 11 meses.
4.1.7. Tempo Livre de Doença Radiológica Avaliado por Ressonância Nuclear
Magnética do Crânio (com ou sem contraste) e/ou Tomografia Computadorizada do
Crânio (com ou sem contraste)
O tempo livre de doença radiológica médio foi de 7,14 meses, com uma mediana
Tabela 3: Informações clínicas dos 36 casos de glioblastoma multiforme. O tempo de
sobrevida está indicado em meses. RT: ressecção total; TLDC: tempo livre de doença clinica (meses); TLDR: tempo livre de doença radiológica (meses).
4.2. Avaliação Histológica
Em todos os casos analisados foram observados os achados histológicos clássicos
de glioblastoma: atipias, figuras de mitose, hiperplasia endotelial (proliferação vascular) e
necrose. Campos microscópicos representativos são apresentados nas Figuras 1 a 4.
4.2.1. Contagem de Figuras de Mitose / 10 Campos de Grande Aumento (CGA)
Em todos os casos avaliados, a média do número de figuras de mitose / 10 CGA
foi de 3,9, com uma mediana de 4,1.
4.2.2. Hiperplasia Endotelial
No presente estudo, a hiperplasia endotelial foi classificada como: leve,
moderada, moderada-acentuada e acentuada. Três casos tiveram a hiperplasia endotelial
classificada como moderada, 10 casos como moderada-acentuada e 23 casos como
acentuada.
4.2.3. Necrose
A extensão de necrose foi classificada como 0 a 100% da superfície de corte
tumoral amostrada na lâmina analisada. A média da extensão estimada de necrose foi
Figura 1. Atipias celulares em corte histológico de glioblastoma (hematoxilina e eosina). Notar pleomorfismo, irregularidade e hipercromasia nucleares. Objetiva 40x.!!
Figura 2. Figura de mitose em corte histológico de glioblastoma (hematoxilina e eosina). Notar, no centro do campo, figura de mitose atípica em célula neoplásica.
Figura 3. Proliferação endotelial em corte histológico de glioblastoma (hematoxilina e eosina). Notar múltiplos vasos neoplásicos com formato e arquitetura irregulares.
Detalhe: vaso anômalo exibindo hiperplasia de células endoteliais, com arranjo em pseudoglomérulo. Objetivas: 4x (panorâmica) e 40x (detalhe).
Figura 4. Área de necrose em corte histológico de glioblastoma (hematoxilina e eosina). Notar, no centro do campo, aspecto em pseudopaliçada da área de necrose
4.3. Imunomarcações
4.3.1 Imunomarcação para EGFR
Com relação à imunomarcação para EGFR, notou-se positividade citoplasmática
com distribuição irregular no tecido e intensidade variando de fraca a forte. Nos casos
analisados neste estudo, a positividade para EGFR foi apresentada em 4 classes com as
seguintes percentagens de células positivas correspondentes: classe 1 (0 a 25%), classe 2
(26 a 50%), classe 3 de (51 a 75%) e classe 4 (76 a 100%). Dentro do total de 36
pacientes, 4 apresentaram classe 1, 12 apresentaram classe 2, 17 apresentaram classe 3 e
3 apresentaram classe 4 (Figuras 5 a 9).
Figura 5. Imunomarcação para EGFR em corte histológico de glioblastoma. Notar
Figura 6. Imunomarcação para EGFR em corte histológico de glioblastoma. Campo
representativo de área classificada como 1. Objetiva 20x.
Figura 7. Imunomarcação para EGFR em corte histológico de glioblastoma. Campo
Figura 8. Imunomarcação para EGFR em corte histológico de glioblastoma. Campo
representativo de área classificada como 3. Objetiva 20x.
Figura 9. Imunomarcação para EGFR em corte histológico de glioblastoma. Campo
4.3.2. Imunomarcação para Proteína p53
O padrão de marcação para a proteína p53 foi nuclear, com distribuição irregular
no tecido e intensidade forte. Nos casos analisados neste estudo, a positividade para p53
foi apresentada em 4 classes com as seguintes percentagens de células positivas
correspondentes: classe 1 (0 a 25%), classe 2 (26 a 50%), classe 3 (51 a 75%) e classe 4
(76 a 100%).
Dentro do total de 36 pacientes , nenhum foi alocado na classe 1 (0-25%), 5
apresentaram classe 2 (26-50%), 17 apresentaram classe 3 (51-75%) e 14 apresentaram
classe 4 (75-100%) de positividade (Figuras 10 a 13).
Figura 10. Imunomarcação para proteína p53 em corte histológico de glioblastoma.
Campo representativo de área classificada como 1. No entanto, após a análise completa de cada um dos cortes histológicos, nenhuma das lesões foi designada como classe 1. Objetiva 10x.
Figura 11. Imunomarcação para proteína p53 em corte histológico de glioblastoma.
Campo representativo de área classificada como 2. Objetiva 10x.
Figura 12. Imunomarcação para proteína p53 em corte histológico de glioblastoma.
Figura 13. Imunomarcação para proteína p53 em corte histológico de glioblastoma.
Campo representativo de área classificada como 4. Objetiva 10x.
4.3.3. Imunomarcação para a Forma Mutante da Enzima Isocitrato Desidrogenase-1
(IDH-1)
O padrão de marcação para a forma mutante da IDH-1 foi citoplasmático, com
distribuição irregular no tecido e intensidade variando de fraca (predominante) a
moderada. Foi observada positividade para a forma mutante da IDH-1 apenas em 1 tumor
dos 36 casos avaliados. Em paralelo às reações de imunoistoquímica realizadas para
investigar a proteína mutante nos espécimes de alto grau, foi investigada uma amostra de
astrocitoma difuso de baixo grau (OMS grau II) obtido a partir do arquivo do Serviço de
enzima mutante. Tal amostra serviu como controle externo positivo, validando os
resultados que obtivemos com as amostras de alto grau (Figuras 14 e 15).
Figura 14. Imunomarcação para forma mutante da IDH-1 em corte histológico de astrocitoma difuso de baixo grau. Notar positividade citoplasmática em astrócitos
neoplásicos. Objetivas: 20x (A) e 40x (B).
!"
Figura 15. Imunomarcação para forma mutante da IDH-1 em corte histológico de glioblastoma. Notar marcação citoplasmática das células neoplásicas com distribuição
semelhante àquela observada na lesão de menor grau. Porém, no presente espécime, a intensidade de marcação foi leve (predominantemente) a moderada.. Objetiva 20x.
4.3.4. Imunomarcação para Proteína Dupla Murina 2 (MDM2)
O padrão de imunomarcação para a MDM2 foi nuclear, com distribuição irregular
no tecido e intensidade forte. Nos casos analisados neste estudo a positividade para o
MDM2 foi apresentada em 4 classes com as seguintes percentagens de células positivas
correspondentes: classe 1 (0 a 25%), classe 2 (25 a 50%), classe 3 de (50 a 75%) e classe
4 (75 a 100%). Dentro do total de 36 pacientes , 2 casos apresentaram classe 1 (0-25%),
13 casos apresentaram classe 2 (26-50%), 15 casos apresentaram classe 3 (51-75%) e 6
Figura 16. Imunomarcação para MDM2 em corte histológico de glioblastoma. Notar
marcação nuclear na maior parte das células neoplásicas. Objetiva 40x.
Figura 17. Imunomarcação para MDM2 em corte histológico de glioblastoma.
Figura 18. Imunomarcação para MDM2 em corte histológico de glioblastoma.
Campo representativo de área classificada como 2. Objetiva 20x.
Figura 19. Imunomarcação para MDM2 em corte histológico de glioblastoma.
Figura 20. Imunomarcação para MDM2 em corte histológico de glioblastoma.
Campo representativo de área classificada como 4. Objetiva 20x.