Hidranencefalia e hipoplasia cerebelar congênita em búfalos Murrah / Letícia Fiss. - Pelotas, 2009.

HIDRANENCEFALIA E HIPOPLASIA CEREBELAR CONGÊNITA EM BÚFALOS MURRAH

LETÍCIA FISS

Dissertação apresentada à Universidade Federal de Pelotas, sob a orientação da Dra. Ana Lucia Schild, como parte das exigências do Programa de Pós- Graduação em Veterinária, para a obtenção do título de Mestre em Ciências (M.Sc.).

PELOTAS

Rio Grande do Sul - Brasil Março de 2009

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS LABORATÓRIO REGIONAL DE DIAGNÓSTICO

LETÍCIA FISS

HIDRANENCEFALIA E HIPOPLASIA CEREBELAR CONGÊNITA EM BÚFALOS MURRAH

Dissertação apresentada à Universidade Federal de Pelotas, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Veterinária, para a obtenção do título de Mestre em Ciências (M.Sc.).

Orientadora: Dra. Ana Lucia Schild

PELOTAS

Rio Grande do Sul – Brasil Março de 2009

Dados de catalogação na fonte:

( Marlene Cravo Castillo – CRB-10/744 )

F543h Fiss, Letícia

Hidranencefalia e hipoplasia cerebelar congênita em búfalos Murrah / Letícia Fiss. - Pelotas, 2009.

59f. : il.

Dissertação ( Mestrado ) –Programa de Pós-Graduação em Veterinária.

Faculdade de Veterinária. Universidade Federal de Pelotas. - Pelotas, 2009, Ana Lucia Schild, Orientador.

LETÍCIA FISS

HIDRANENCEFALIA E HIPOPLASIA CEREBELAR CONGÊNITA EM BÚFALOS MURRAH

Dissertação apresentada à Universidade Federal de Pelotas, sob a orientação da Dra Ana Lucia Schild, como parte das exigências do Programa de Pós- Graduação em Patologia Animal, para a obtenção do título de Mestre em Ciências (M.Sc.).

APROVADA EM 03 DE MARÇO DE 2009.

--- --- Prof. Dr. Claudio S.L. Barros Prof. Dr. David Driemeier

--- --- Dra. Ana Lucia Schild

(Orientadora)

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pelas oportunidades colocadas em minha vida, proteção e cuidado todos os dias.

Agradeço ao meu pai Darcy por sempre incentivar a continuidade da complementação da formação acadêmica e pelo maior exemplo deixado para nós que é o amor, além de sempre demonstrar seu carinho e dedicação com toda a família.

Agradeço a minha mãe Eliana por ser essa mulher forte e perseverante, um exemplo de dedicação a família, e a pessoa na qual eu me espelho e que amo.

Agradeço aos meus irmãos Felipe e Guilherme por estarem sempre ao meu lado, mesmo com nossas diferenças e brigas, mas também por todos os momentos de diversão que passamos juntos.

Ao meu vô Edmundo pela garra de viver, exemplo de vida e dedicação ao trabalho, mesmo explodindo a casa toda!

Agradeço a minha orientadora Ana Lucia pelo exemplo de profissional, pela sua dedicação infinita ao Laboratório Regional de Diagnóstico da Universidade Federal de Pelotas e por tudo que aprendi durante esse período de convívio.

As professoras do Departamento de Patologia Animal Margarida, Simone, Josi e Cris pelos ensinamentos e apoio durante o período em que convivemos juntas, além de uma grande amizade estabelecida durante o mesmo.

Ao Mauro pelo auxílio com a microscopia eletrônica, por me ensinar a realizar

“necropsias limpas”, pelo exemplo de profissional e pela amizade.

A Cecília e aos funcionários da Embrapa Clima Temperado por toda a colaboração na confecção da dissertação.

Aos funcionários do Laboratório Cauê, Toni, Daiane, Daiana, Graça e Simone por todo o auxílio para a conclusão deste trabalho, mostrando imensa dedicação.

Agradeço aos meus amigos Fabi e Clairton por serem mais do que colegas de trabalho, por serem meus grandes amigos e pessoas que moram no meu coração de uma maneira muito especial, além de todo auxílio e aprendizagem que juntos obtivemos.

Agradeço a Melissa, Tainã, Fefa, Thomas, Milton pelo auxílio na obtenção de conhecimento e por tornarem nosso local de trabalho mais divertido.

Aos estagiários e bolsistas do Laboratório Pedro, Nathalia, Sérgio e Luciano pelo auxílio na conclusão deste trabalho, pela consciência profissional e pela amizade que estabelecemos.

Aos mestres Pacco Uzal, Eduardo Flores e Schuch pelo auxílio para a conclusão deste trabalho.

Aos meus amigos Camila T., Camila L., Nininha, Lauren, Míriam, André, Márcio, Fernanda, Guisepe, Bia por serem ótimos ouvintes e pessoas que posso contar sempre, pois sei que mesmo distantes estamos sempre juntos.

A todos meus familiares e amigos que contribuíram nessa conquista.

Muito Obrigada!

RESUMO

FISS, Letícia. Hidranencefalia e hipoplasia cerebelar congênita em búfalos Murrah. 2009. 59f. Dissertação (Mestrado em Veterinária) – Laboratório Regional de Diagnóstico, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal de Pelotas.

Descreve-se a ocorrência de hidranencefalia e hipoplasia cerebelar congênita em búfalos da raça Murrah. Foram afetados seis bezerros, 5 fêmeas e 1 macho de um total de 128 nascidos entre 2004 e 2008 em uma propriedade no município de Capão do Leão, Rio Grande do Sul. Todos os búfalos afetados eram filhos do mesmo touro. A enfermidade não foi observada nos búfalos filhos de outros três touros utilizados na propriedade. Os sinais clínicos caracterizaram-se por depressão profunda, cegueira, estação em base larga, dificuldade ou impossibilidade de andar e tremores. O crânio apresentava forma de cúpula. Os encéfalos estavam diminuídos de tamanho e os hemisférios telencefálicos estavam quase que totalmente ausentes apresentando-se como sacos membranosos preenchidos por líquido. Havia resquícios de giros e sulcos no córtex occipital. Ao corte do encéfalo no córtex telencefálico remanescente observavam-se cavidades císticas bilaterais e simétricas na substância branca subcortical e nos núcleos basais que também continham líquido em seu interior (porencefalia). Os ventrículos laterais estavam dilatados (hidrocefalia ex-vacuo). O cerebelo e o tronco encefálico estavam diminuídos de tamanho em comparação ao cerebelo e ao tronco encefálico de um búfalo controle. Histologicamente em todos os búfalos afetados havia cavidades delimitadas por tecido nervoso de aspecto normal. Nestas cavidades havia eventualmente a presença de resquícios de substância branca, algumas vezes delimitadas por células ependimárias. O córtex estava delgado. Ocasionalmente, nestas áreas havia a presença de substância branca rarefeita com células gitter, esferóide axonais e gliose. No cerebelo observou-se desorganização celular e hipomielinogênese características de hipoplasia cerebelar. A imuno-histoquímica do tecido nervoso dos búfalos afetados e a sorologia do rebanho de búfalos realizados para os vírus da diarréia viral bovina e da língua azul foram negativos. Ess resultados associados a epidemiologia sugerem que a enfermidade é hereditária e causada por um gene recessivo autossômico.

Palavras chave: hidranencefalia, hipoplasia cerebelar, enfermidades congênitas, enfermidades do sistema nervoso central, búfalos Murrah.

v

ABSTRACT

FISS, Letícia. Congenital hidranencephaly and cerebellar hypoplasia in water buffaloes. Dissertação (Mestrado em Veterinária) – Laboratório Regional de Diagnóstico, Faculdade de Veterinária, Universidade Federal de Pelotas.

Hereditary hydrancephaly and cerebellar hypolasia are reported in Murrah buffalos.

Six calves, one female and 5 male out of 128 born between 2004 and 2008 in a farm in southern Brazil were affected. All affected calves were offspring from the same bull. No affected buffaloes were observed in the descendants of other three bulls used in the farm. Main clinical signs were depression, blindness, difficulty or impossibility to standing up, wide-based stance, and intention tremors. There is mild doming of the skull. The brain was smaller than normal. The cerebral cortex was almost complete absent leaving only membranous sacs fluid filled. The gyri were absent or narrower than normal in the occipital cortex. On the cut of the telencephalic cortex cavities were observed in the subcortical white matter. Smaller bilateral and symmetric cavities, containing fluid (porencephaly), were also observed in the basal nuclei. The lateral ventricles were dilated (hydrocephalum ex-vacuo). The cerebellum was smaller than normal. The brain stem appears normal, except by a side reduction in relation with the brain of a control calf. Upon histologic examination, in all buffalos, cavities of the subcortical white matter were limited by normal nervous tissue. Within cavities, residues of white matter sometimes bordered by ependymal cells were observed. The cortex was thin. Gitter cells, axonal spheroids, and gliosis were occasionally observed. Cerebellar disorganization, characteristic of cerebellar hypoplasia, and hypomyelinogenesis were observed in the cerebellum. Imuno- histochemistry and serologic tests were negative for bovine virus diarrhea and blue tongue viruses. These results associated with epidemiologic data suggest that the disease is a hereditary hydrancephaly and cerebellar hypoplasia, probably transmitted by a recessive autossomic gen.

Keywords: Hydranecephaly, cerebellar hypoplasia, congenital diseases, central nervous diseases, water buffaloes.

vi

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Genealogia dos búfalos afetados por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar. Observa-se a consangüinidade no rebanho afetado...

32 Figura 2. Búfalo 1 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar em

estação com os membros abertos e o pescoço esticado... 33 Figura 3. Búfalo 2 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar em

estação com os membros abertos para manter o equilíbrio e depressão... 33 Figura 4. Búfalo 3 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar em

decúbito lateral... 33 Figura 5. Búfalo 4 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar em

queda para a frente com o pescoço esticado... 33 Figura 6. Búfalo 5 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar em

posição de cão sentado evidenciando o movimento lateral das orelhas... 33 Figura 7. Búfalo 6 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar

apresentando depressão profunda... 33 Figura 8. Encéfalo dos seis búfalos afetados por hidranencefalia/hipoplasia

cerebelar. Observa-se o córtex telencefálico reduzido a sacos membranosos e o menor tamanho do cerebelo quando comparados ao do búfalo controle... 34 Figura 9. Corte do encéfalo do Búfalo 1 afetado por

hidranencefalia/hipoplasia cerebelar na altura dos núcleos da base. Observam-se cavidades bilaterais simétricas no córtex telencefálico. O tecido remanescente apresenta-se como delicadas membranas ou cordões que atravessam as cavidades.

A parede cortical lateral das cavidades é estreita (1,5-2,5mm). A região cortical dorsal tem 1,5cm de espessura e a substância branca subcortical apresenta pequenas cavidades (porencefalia).

A columna fornicis está achatada e arredondada, o septum pellucidum está bífido e alongado e o corpus calosum pouco desenvolvido... 35 Figura 10. Cortes seriados do encéfalo do Búfalo 4 afetado por

hidranencefalia/hipoplasia cerebelar. Observa-se a ausência do tecido que forma os hemisférios cerebrais, o qual se apresenta como uma fina capa formando um saco. Na altura do córtex occipital há preservação da estrutura de giros e sulcos embora atenuados. Em alguns cortes observam-se finos cordões que atravessam as cavidades formadas... 36 Figura 11. Corte do encéfalo do búfalo controle e dos 6 búfalos afetados por

hidranencefalia/hipoplasia cerebelar, na altura dos núcleos da base. Observa-se acahatamento desses núcleos e da columna fornicis que está, também, arredondada; o septum pellucidum está bífido e alongado e o corpo calosum pouco desenvolvido... 37

viii

Figura 12. Corte do encéfalo do búfalo controle e dos 6 búfalos afetados por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar, na altura do tálamo.

Observa-se o hipocampo estreito... 38 Figura 13. Corte do encéfalo do búfalo controle e do Búfalo 4 afetado por

hidranencefalia/hipoplasia cerebelar na altura do tálamo. Observa- se nos resquícios do córtex temporal pequena cavidade cística (porencefalia), (seta) e o achatamento do hipocampo (asterisco).... 39 Figura 14. Córtex occipital do búfalo controle comparado ao do Búfalo 1

afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar. Observa-se o córtex com cavidades e resquícios de substância branca formando finos cordões atravessando as cavidades... 39 Figura 15. Córtex frontal do Búfalo 1 afetado por hidranencefalia/hipoplasia

cerebelar. Submacroscopicamente observa-se o tecido cortical mais estreito e cavidades com resquícios de substância branca em forma de delicados cordões (A). Histologicamente os cordões de substância branca apresentam-se por um lado delimitados por células ependimárias e pelo outro sem delimitação (B). (HE, obj.

20x)... 40 Figura 16. Córtex temporal do Búfalo 1 afetado por

hidranencefalia/hipoplasia cerebelar, mostrando cavidade na substância branca sem delimitação (HE, obj. 20x)... 40 Figura 17. Córtex temporal do Búfalo 2 afetado por

hidranencefalia/hipoplasia cerebelar mostrando rarefação do tecido neural e presença de esferóide axonais e algumas células gitter (A). Acúmulo acentuado de células gitter no córtex temporal do Búfalo 2 (B). (HE, obj. 20x)... 41 Figura 18. Córtex occipital do Búfalo 6 (A) e do Búfalo 4 (B) afetados por

hidranencefalia/hipoplasia cerebelar. Observa-se aumento dos espaços perivasculares. (HE, obj. 10x em A e 20x em B)... 41 Figura 19. Córtex frontal do Búfalo 6 afetado por hidranencefalia/hipoplasia

cerebelar. Observa-se discreto manguito perivascular de células mononucleares e foco de gliose no tecido nervoso. (HE, obj. 40x).. 42 Figura 20. Folha cerebelar do búfalo controle (A) e do Búfalo 5 (B) afetado

por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar. Observa-se baixa densidade celular da capa granular e menor quantidade de mielina. (LFB, obj. 10x)... 43 Figura 21. Folha cerebelar do búfalo controle (A) e do Búfalo 3 (B) afetado

por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar. Observa-se capa molecular estreita e escassas células de Purkinje. (HE, obj. 10x).... 43 Figura 22. Búfalo 3 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar.

Fotomicrografia eletrônica mostrando no cortéx parietal o neurópilo comprimido evidenciado pela proximidade dos neurônios (N). Presença de processos astrocitários e mitocôndrias tumefeitos... 44 Figura 23. Búfalo 3 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar.

Fotomicrografia eletrônica do córtex parietal mostrando tumefação da matriz mitocondrial (setas). (N=neurônio, n=núcleo). 44

ix

SUMÁRIO

RESUMO... v

ABSTRACT... vi

LISTA DE FIGURAS... vii

1. INTRODUÇÃO... 11

2. REVISÃO DE LITERATURA... 13

2.1.Malformações congênitas... 13

2.2. Malformações no sistema nervoso central... 14

2.2.1. Disrafia (defeito no fechamento do tubo neural)... 14

2.2.2. Desordens na migração neuronal... 16

2.2.3. Hidranencefalia e Porencefalia... 16

2.2.4. Hidrocefalia... 18

2.2.5. Malformações do cerebelo... 18

2.2.5.1. Hipoplasia cerebelar ... 19

2.2.6. Causas virais de malformação no sistema nervoso central... 19

2.2.7. Outras causas de malformação no sistema nervoso central... 22

3. MATERIAL E MÉTODOS... 24

3.1. Epidemiologia e estudo genealógico do rebanho... 24

3.2. Sinais clínicos... 24

3.3. Patologia... 24

3.4. Sorologia... 26

4. RESULTADOS... 27

4.1. Epidemiologia e estudo genealógico do rebanho... 27

4.2. Sinais clínicos... 28

4.3 Patologia... 29

4.3.1. Lesões macroscópicas... 29

4.3.2. Lesões Histológicas... 30

4.3.3. Lesões ultra-estruturais... 31

4.3.4. Imuno-histoquímica... 31

4.4. Sorologia... 31

x

5. DISCUSSÃO... 45 6. CONCLUSÃO... 52 7. REFERÊNCIAS... 53

xi

1. INTRODUÇÃO

A ocorrência de defeitos congênitos em bovinos e ovinos está estimada entre 0,5% e 3% em todo o mundo e seu conhecimento depende da freqüência com que esses defeitos são estudados e descritos (LEIPOLD & DENNIS, 1980; RADOSTITIS et al., 2000).

Na área de influência do Laboratório Regional de Diagnóstico da Faculdade de Veterinária da UFPel (LRD) em um levantamento de diagnósticos realizados em bubalinos de 1982 a 2007 observou-se uma prevalência de 3,59% de defeitos congênitos, o que demonstra a importância dessas enfermidades nesta espécie animal na região. Em búfalos da raça Murrah diversos defeitos congênitos têm sido diagnosticados principalmente no Pará (BARBOSA et al., 1999) e no Rio Grande do Sul (SCHILD, 2007), sendo a maioria deles de etiologia hereditária e transmitidos por genes recessivos.

A consangüinidade no rebanho bubalino brasileiro é muito grande, principalmente em animais da raça Murrah. Os mais de 3.000.000 de cabeças existentes hoje no Brasil são originários de aproximadamente 200 animais importados na sua grande maioria da Índia na década de 60. A última importação oficial de bubalinos do Continente Asiático ocorreu em 1962, pela concessão de uma lei de 1921 que proibia a importação de material genético daquele continente devido a problemas sanitários (MIRANDA, 1986). Essa consangüinidade certamente tem contribuído para a ocorrência de diversas enfermidades hereditárias diagnosticadas em rebanhos da raça no Brasil.

Dentre as enfermidades congênitas hereditárias observadas em búfalos da raça Murrah em função dessa consangüinidade destacam-se dermatose mecânico- bolhosa (RIET-CORREA et al., 1994) e artrogripose (SCHILD et al., 2003). Essas enfermidades foram diagnosticadas no Rio Grande do Sul e no Pará e levaram a consideráveis prejuízos econômicos devido a necessidade de eliminação da reprodução de progenitores de alto valor zootécnico. Outras doenças congênitas observadas em bubalinos dessa raça não têm, ainda, a comprovação de serem hereditárias, como a hiperplasia muscular (BARBOSA et al., 1999) e megaesôfago (SCHILD et al., 1997), porém existem fortes evidências epidemiológicas de que sejam causadas por genes recessivos autossômicos.

Os objetivos desse trabalho foram estudar a epidemiologia, a patologia e sugerir as possíveis causas de uma doença congênita observada em um rebanho de búfalos da raça Murrah, bem como propor formas de controle da mesma.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Malformações congênitas

As malformações congênitas são definidas como anormalidades na estrutura e/ou função de órgãos, sistemas completos ou parte destes. Os defeitos congênitos se caracterizam por estarem presentes ao nascimento e ocorrem em conseqüência de fatores ambientais, genéticos ou pela interação de ambos. Durante a fase de organogênese o embrião é altamente sensível aos agentes teratogênicos e após este período torna-se gradativamente resistente (LEIPOLD & DENNIS, 1980).

As malformações congênitas mais freqüentemente diagnosticadas são classificadas em: 1) malformações de ocorrência esporádica, que se caracterizam por alterações múltiplas afetando principalmente o sistema músculo-esquelético e nervoso, nesses casos a prevalência é baixa e a etiologia não é determinada; 2) doenças hereditárias, que podem ser transmitidas por genes recessivos ou dominantes; 3) enfermidades carenciais como o caso da deficiência de cobre em bovinos e ovinos; 4) infecções virais em períodos específicos da gestação como a infecção pelo vírus da diarréia viral bovina (BVDV), vírus da língua azul (BTV); e 5) outras causas ambientais como a aplicação de medicamentos e ingestão de plantas tóxicas (Veratrum californicum, Lupinus spp., Astragalus spp., Mimosa tenuiflora) também em períodos específicos da gestação (LEIPOLD & DENNIS, 1980; SCHILD, 2007). Aparentemente, para cada malformação congênita hereditária existe um agente ambiental capaz de produzir um defeito similar (LEIPOLD & DENNIS, 1980).

A patogenia da maioria dos defeitos congênitos não é bem compreendida, porém, um defeito produzido por um agente teratogênico específico ou por um gene no caso de doenças hereditárias, têm patogenia específica.

2.2 Malformações do sistema nervoso central

As malformações do sistema nervoso central (SNC) são comuns nos animais domésticos, ocorrendo uma variedade de defeitos bem maior que em outros sistemas ou tecidos. Tem sido demonstrado que os agentes teratogênicos levam a defeitos congênitos com muito maior frequência no SNC, provavelmente em função do alto grau de diferenciação e complexidade desse órgão que aumenta sua susceptibilidade ao desenvolvimento desses distúrbios (MAXIE & YOUSSEF, 2007).

2.2.1 Disrafia (defeito no fechamento do tubo neural)

Disrafia é uma anomalia que resulta de um defeito na interação do neuroepitélio, que origina os neurônios e astrócitos, oligodendrócitos e células ependimárias, com a notocorda e células mesenquimais durante o fechamento do tubo neural nos estágios iniciais de desenvolvimento, ou seja, ocorre o fechamento defeituoso do tubo neural durante o desenvolvimento embrionário (ZACHARY, 2007). Estudos experimentais têm demonstrado que o fechamento do tubo neural ocorre em quatro localizações distintas, chamadas de “sítios de incício do fechamento” e uma alteração neste processo leva a anomalias disráficas sítio- específicas. O fechamento do sítio I está relacionado ao neuroporo posterior (abertura posterior da porção final canal embrionário) e o fechamento nos sítios II-IV relacionados ao neuroporo anterior (abertura anterior da porção inicial do canal embrionário), (ZACHARY, 2007, SUMMERS et al. 1995).

O defeito disráficos podem ser exemplificados por anencefalia, quando o defeito no fechamento ocorre no sítio II ou IV, hipoplasia prosencefálica, crânio bífido, espinha bífida, quando o defeito ocorre nos sítio I, e exencefalia (ZACHARY, 2007; SUMMERS et al., 1995).

A anencefalia se caracteriza por ausência completa do encéfalo sendo uma malformação rara, de caráter esporádico e sem causa determinada descrita em bovinos. O termo anencefalia tem sido erroneamente aplicado aos casos de aplasia cerebral ou hipoplasia cerebral em que os hemisférios cerebrais estão ausentes ou hipoplásicos porém os demais componentes do cérebro como o tronco encefálico e o cerebelo estão presentes (MAXIE & YOUSSEF, 2007). Terneiros afetados podem sobreviver por alguns dias se assistidos, e podem permanecer em pé ou andar se o tronco encefálico caudal não está significativamente envolvido. Os animais apresentam letargia profunda, cegueira de origem central e apresentam alguma resposta a estímulos externos em função da percepção originada no tálamo (SUMMERS et al. 1995). Hipoplasia prosencefálica se caracteriza por ausência de algumas partes dos hemisférios cerebrais na porção rostral, que podem estar rudimentares, porém o tronco encefálico está preservado. Essa anomalia resulta do desenvolvimento anormal da porção rostral do tubo neural (ZACHARY, 2007).

Crânio bífido é uma malformação caracterizada por defeito na linha média do crânio, através do qual a meninge e o tecido neural se projetam e o tecido projetado, que forma um saco (cele), pode ser revestido por meninges (meningocele) ou por meninges acompanhadas de tecido nervoso (meningoencefalocele), recobertos por pele (ZACHARY, 2007; SUMMERS et al. 1995). Excenfalia ocorre quando há protusão do tecido neural não coberto por meninges ou pele. Esta é uma malformação rara, em geral acompanhada por outras malformações do crânio e do encéfalo. Este defeito foi associado ao excesso de vitamina A administrada a camundongos (SUMMERS et al. 1995).

Espinha bífida é similar ao crânio bífido. Afeta preferencialmente a medula na porção caudal, aparecendo como um defeito na porção dorsal da coluna vertebral podendo haver herniação das meninges (meningocele) e das meninges junto com a medula (meningomielocele) para um saco coberto por pele (ZACHARY, 2007;

SUMMERS et al. 1995).

Menigocele e encefalocele são defeitos hereditários em suínos. Encefalocele é hereditário em gatos da raça Bernese e está associado, também, a administração

de griseofulvin a animais gestantes em um período específico da gestação (SUMMERS et al. 1995).

Hidromielia congênita é uma dilatação anormal do canal central da medula espinhal por aumento da produção do líquor ocorrendo um engrossamento da duramáter e perda da substância branca e cinzenta da medula espinhal (ZACHARY, 2007).

2.2.2 Desordens na migração neuronal

Lisencefalia (agiria) e paquigiria são anormalidades do desenvolvimento que resultam na perda dos giros e sulcos dos hemisférios cerebrais (total ou parcial). O mecanismo normal responsável pela formação dos giros que nesta malformação está alterado é desconhecido. Ao corte o córtex é mais espesso que o normal e há perda do padrão laminar dos neurônios. Aparentemente a lesão tem uma base genética e resulta de um defeito na migração neuronal durante o desenvolvimento (McGAVIN & ZACHARY 2007). Em algumas espécies de laboratório como coelhos, ratos, camundongos e aves a ausência de giros e sulcus é normal (SUMMERS et al., 1995).

2.2.3 Hidranencefalia e porencefalia

A formação de cavidades contendo líquido no cérebro é denominada porencefalia (pequenas cavidades) e hidranencefalia (grandes cavidades), as quais ocorrem no feto durante a gestação. A cavidade craniana se apresenta completa e com a conformação normal, embora, ocasionalmente o crânio apresente leve forma de cúpula e os ossos possam estar levemente reduzidos de espessura. A porção dorsal e, frequentemente, a parte caudal dos hemisférios cerebrais são as mais severamente afetadas (MAXIE & YOUSSEF, 2007; ZACHARY, 2007).

Porencefalia se caracteriza por fendas ou cistos na parede dos hemisférios cerebrais. Essas cavitações resultam da destruição dos neuroblastos imaturos que não tem o desenvolvimento normal como resultado na falha na migração ou na

migração aberrante. Os cistos podem ser únicos ou múltiplos e a porção temporal dos hemisférios cerebrais é a área de predileção, embora possam ser encontrados através dos hemisférios cerebrais e núcleos basais. Ocasionalmente, as lesões podem ser encontradas no tronco encefálico e cerebelo. Os cistos são usualmente distribuídos ao acaso, mas simetria bilateral é muitas vezes aparente. Raramente, os cistos se comunicam com os ventrículos laterais ou com o espaço subaracnóide.

Hidranencefalia é considerada uma forma mais severa de porencefalia (MAXIE &

YOUSSEF, 2007; ZACHARY, 2007).

Porencefalia pode ser categorizada em dois tipos: o tipo 1 resulta da injúria vascular ou vasculite, que levam ao infarto da matriz germinantiva subependimária onde ocorreu a lesão resultando na formação de cistos dentro do foco de células mortas; o tipo 2 é causado pela injúria de neuroblastos na matriz germinativa e falha desses neuroblastos em migrar dentro da matriz para formar os hemisférios telencefálicos. Aparentemente o tipo 2 de porencefalia é o que ocorre nos animais domésticos (ZACHARY, 2007).

Hidranencefalia é a lesão residual de necrose acentuada do tecido neural dos hemisférios cerebrais. Nos animais a lesão se desenvolve nos estágios iniciais da vida fetal e antes da organização completa do córtex estar presente. O tecido residual cortical é liso e pode ser delimitado por células ependimárias atenuadas, mas frequentemente o tecido cortical termina sem uma delimitação, exceto por uma astrocitose discreta (MAXIE & YOUSSEF, 2007). Hidranencefalia representa diferentes graus da destruição e falha no desenvolvimento do telencéfalo, principalmente do neopalium (giros e sulcos cerebrais). Ocorre a quase completa destruição e perda do desenvolvimento do neocórtex, podendo atingir o paleopallium (componentes olfatórios) e arqchipallium (hipocampo, córtex do lobo piriforme) (DeLAHUNTA, 1983).

Hidranencefalia ocorre em todas as espécies, sendo mais comum em bovinos, nos quais se apresenta esporadicamente ou como pequenas epizootias. A doença está associada à infecção do feto por certos vírus em um estágio crítico da gestação e nesses casos ocorre um conjunto de lesões neurais, cuja expressão depende da idade do feto no momento da infecção (MAXIE & YOUSSEF, 2007).

A patogenia da hidranencefalia tem sido elucidada através de estudos da lesão causada por infecção viral, particularmente pelo BTV e pelo vírus da doença da fronteira. Essa infecção ocorre num período crítico da gestação e produz zonas de necrose nos hemisférios cerebrais em desenvolvimento. Essas áreas envolvem os neuroblastos e sua migração e resulta na cavitação pela ausência de neurônios no córtex. Fatores mecânicos também contribuem para o desenvolvimento de hidranencefalia. Ocorre expansão compensatória dos ventrículos laterais (hidrocefalia ex-vacuo) secundária a perda do tecido cerebral (MAXIE & YOUSSEF, 2007).

Ambos os defeitos microscopicamente não apresentam alterações significativas, sendo que os cistos porencefálicos podem estar delimitados por uma camada de células da glia achatadas e astrocitose. Há pouca evidência de alterações inflamatórias. Em alguns casos pode haver acúmulo de células gitter contendo hemossiderina nas margens dos cistos ou dentro das cavidades (MAXIE &

YOUSSEF, 2007).

2.2.4 Hidrocefalia

Hidrocefalia caracteriza-se por aumento de líquido cefalorraquidiano (LCR) no sistema ventricular (forma não comunicante) ou no sistema ventricular e espaço aracnóide (forma comunicante), devido à obstrução. Uma área vulnerável à obstrução é o terceiro ventrículo (aqueduto mesencefálico). Quando este tipo de anomalia é congênito está associado ao aumento de volume do crânio que apresenta forma de cúpula. Nos casos de hidrocefalia não-comunicante, que causa separação das suturas ósseas antes de suas fusões, a obstrução ocorre no quarto ventrículo, aqueduto ou forâmen ventricular (ZACHARY, 2007). Hidrocefalia comunicante é a menos comum e resulta da obstrução do aqueduto mesencefálico que impede o fluxo do LCR para o sistema venoso, interferindo no escoamento do mesmo pelas vilosidades aracnóides (ZACHARY, 2007).

Outra forma é a hidrocefalia compensatória ou hidrocefalia ex-vácuo, na qual o LCR aumenta apara ocupar o espaço onde o tecido neural foi destruído, não se desenvolveu ou ambos (SUMMERS et al. 1995; ZACHARY, 2007).

2.2.5 Malformações do cerebelo

Anormalidades cerebelares congênitas são comuns em animais domésticos e as principais causas são defeitos primários no desenvolvimento e hipoplasia e atrofia secundárias a infecções intra-uterinas por determinados vírus. As infecções virais são comuns em felinos domésticos e bovinos, mas tem sido descritas também em suínos, ovinos e caninos (SUMMERS et al. 1995).

2.2.5.1 Hipoplasia cerebelar

Hipoplasia cerebelar é o defeito congênito mais frequentemente observado nas espécies domésticas, existindo algumas evidências de ser geneticamente determinado em algumas raças bovinas (O’SULLIVAN & McPHEE, 1975), eqüinos e em caninos (MAXIE & YOUSSEF, 2007). A forma mais freqüente de ocorrência da enfermidade é a causada pela infecção por certos vírus no feto em desenvolvimento como o parvovírus felino, o BVDV e o vírus da peste suína clássica (MAXIE &

YOUSSEF, 2007). Hipoplasia cerebelar foi descrita no Rio Grande do Sul em bovinos da raça Charolês e atribuída à infecção das fêmeas prenhes pelo BVDV, embora a etiologia não tenha sido confirmada (SCHILD et al., 2001b).

Casos de hipoplasia cerebelar associados à infecção pelo BVDV foram descritos na raça Holandesa sendo observadas malformação e redução do tamanho do cerebelo e lesões histológicas caracterizadas por cavitação da substância branca, redução das células de Purkinje e células da capa granular e desorganização do córtex cerebelar, alternando-se com folhas cerebelares de aspecto normal e área de redução da mielina (WILSON et al., 1983). Na raça Shorthorn foi descrita hipoplasia cerebelar de provável origem hereditária com baixa densidade celular na capa granular de algumas folhas, número reduzido de células

de Purkinje e capa molecular mais estreita quando comparada com um controle (SWAN & TAYLOR, 1982).

2.2.6 Causas virais de malformações no sistema nervoso central

Diversos vírus têm sido descritos como causa de malformações no sistema nervoso central de ruminantes. Certos vírus como o BVDV (YERUHAM et al., 2001;

MAXIE & YOUSSEF, 2007), o vírus de Akabane (AKAV) (NARAYAN &JOHNSON, 1972; GREENE, 1978), o vírus da febre do Vale do Rift, o vírus do Vale de Cache (CVV) (CRANDELL et al., 1989; EDWARDS et al., 1989), o BTV (VERCAUTEREN et al., 2008), o vírus Aino (AINOV) (TSUDA et al., 2004), o vírus Chuzan (MIURA et al., 1990) e o da doença da fronteira infectam os fetos em desenvolvimento, em momento crítico da gestação, causando necrose dos neuroblastos e das células da neuroglia levando às lesões no sistema nervoso central (ZACHARY, 2007).

BVDV pertence à família Flaviridae, gênero pestivirus. Tem distribuição mundial sendo considerado um dos principais patógenos dos bovinos. No Brasil vários relatos clínicos e levantamentos sorológicos demonstram a presença da infecção desde o final dos anos 60, sendo que no Rio Grande do Sul foram relatados três surtos de doenças com quadro clinico compatível com a infecção por BVDV (FLORES & SCHUCH, 2007).

As malformações congênitas causadas por este vírus ocorrem quando fêmeas prenhes são infectadas entre os 100-150 dias de gestação (FLORES &

SCHUCH, 2007). Alguns autores mencionam períodos maiores (MAXIE, 2008, YERUHAM et al., 2001). As alterações podem ser variadas e têm sido descritos casos de hidrocefalia, hidranenefalia e hipoplasia cerebelar, malformações oculares e outros defeitos que podem ocorrer conjuntamente (YERUHAM et al., 2001).

A infecção de fêmeas prenhes pelo BVDV no período de implantação do embrião até o final do 4º mês de gestação (40-125 dias) pode resultar em mortalidade fetal, aborto, nascimento de bezerros persistentemente infectados e um limitado grau de teratogênese (FRAY et al., 2000). Taxas de aborto de 40% foram observadas na infecção experimental em vacas com 100 dias de gestação (DONE et

al., 1980), embora em condições de campo essa taxa possa ser menor (FRAY et al., 2000).

No Rio Grande do Sul, o BVDV tem sido isolado de bezerros e de soros de neonatos coletados em matadouros, sendo estimado que cerca de 50%-70% do rebanho gaúcho já tiveram contato com o virus (RIET-CORREA et al., 1996).

Malformação caracterizada por hipoplasia cerebelar e porencefalia foi observada em bezerros da raça Charolês supostamente infectados durante a gestação pelo BVDV nesse estado (SCHILD et al., 2001b).

O virus da BVD foi detectado por imuno-histoquímica no sistema nervoso central de um bezerro com hipoplasia cerebelar naturalmente infectado pelo mesmo (TUNCA et al., 2006).

A infecção pelo AKAV tem sido descrita no Japão, Israel, Austrália causando surtos de aborto e malformações congênitas caracterizadas por artrogripose/hidranencefalia, que podem ocorrer juntas ou separadamente (HARTLEY et al., 1977). O vírus é transmitido por insetos, dentre eles Culicoides brevitaris na Austrália e tem sido isolado também em mosquitos no Japão (MAXIE &

YOUSSEF, 2007). A síndrome artrogripose/hidranencefalia foi reproduzida experimentalmente em bezerros nascidos de vacas inoculadas com AKAV entre os dias 92 e 96 da gestação (KUGORI et al., 1977) e em cordeiros de ovelhas inoculadas com o mesmo vírus, entre os dias 30 e 36 da gestação (PARSONSON et al., 1977). Este vírus não tem sido identificado no Brasil.

Língua azul é causada por um Orbivirus da família Reoviridae. A enfermidade afeta ovinos, bovinos e diversas espécies de ruminantes selvagens, sendo os ovinos e o veado de cauda branca os mais susceptíveis. O BTV é transmitido por insetos, principalmente por mosquitos do gênero Cullicoides, mas outros insetos como Aedes lineatopennis, Omithodorus coriaceus, Melophagus ovinus podem transmitir o vírus.

Em clima temperado a doença tem caráter sazonal, ocorendo nos meses de verão e outono (NARAYAN &JOHNSON, 1972; GOLTZ, 1978). A infecção fetal em bovinos causada pelo BTV tem sido descrita nos EUA e no sul da África. Essas infecções causam abortos, anormalidades cerebrais incluindo hidranencefalia (VERCAUTEREN et al., 2008). A utilização de vírus vivo atenuado em vacinas para

língua azul em ovelhas tem causado hidranencefalia em cordeiros (FUCCILLO &

SEVER, 1973). Em bovinos, BTV sorotipo 8 foi identificado por PCR em casos de aborto e hidranencefalia em bezerros na Holanda (WOUDA et al., 2008). Em um trabalho de infecção experimental pelo BTV a inoculação do vírus em fetos aos 106, 113 e 122 dias de gestação resultou em aborto aos 210, 178 e 231 dias de gestação e os fetos apresentavam lesões severas de hidranencefalia e hipoplasia cerebelar (THOMAS et al. 1986).

Anticorpos contra o BTV têm sido encontrados em percentual variável entre 0,15% e 0,61% em diversos estados brasileiros incluindo o Rio Grande do Sul, embora a doença clínica com isolamento viral tenha sido diagnosticada somente em ovinos uma única vez (RIET-CORREA, 2007). No Rio Grande do Sul um surto de aborto e malformações fetais, caracterizadas por escoliose, agnatia, prognatia, microcefalia, artrogripose e nanismo em bovinos, foi atribuído à infecção pelo BTV tendo em vista a observação de reações fortemente positivas para anticorpos contra o vírus (RIET-CORREA et al., 1996b).

Outros vírus como AINOV e CVV, ambos da família Bunyaviridae, foram identificados como causa de artrogripose/hidranencefalia, hidranencefalia e hipoplasia cerebelar em bovinos no Japão (TSUDA et al., 2004) e nos Estados Unidos (CRANDELL et al., 1989). O vírus Chuzan também é descrito no Japão como causa de hidranencefalia/hipoplasia cerebelar (MIURA et al., 1990). A presença destes vírus no Brasil não tem sido relatada.

2.2.7 Outras causas de malformações no sistema nervoso central

A deficiência de cobre (swayback) tem sido descrita em cordeiros e, menos freqüentemente, em cabritos recém nascidos causando lesões no cérebro, tronco encefálico e medula espinhal, similares às lesões de porencefalia/hidranencefalia.

Tem sido sugerido que as lesões cerebrais na deficiência de cobre resultam da perda das células embrionárias no mesmo estágio de desenvolvimento cerebral em que ocorre a infecção pelos vírus que causam essa malformação (ZACHARY, 2007;

SUMMERS et al. 1997). A deficiência de cobre foi diagnosticada em bovinos no Rio

Grande do Sul causando sinais neurológicos em animais recém nascidos, entretanto, lesões de porencefalia/hidranencefalia não foram observadas nestes casos (RIET-CORREA et al., 1993).

Diversas plantas tóxicas são descritas como causa de malformações congênitas, tais como Astragalus spp., Oxytropis spp., Veratrum californicum, Lupinus spp., Nicotiana tabacum, N. glauca e Conium maculatum. A maioria destas plantas causa malformações no sistema músculo esquelético. No Brasil Mimosa tenuiflora é descrita no Nordeste como causa de abortos e malformações ósseas em caprinos e ovinos (PIMENTEL et al., 2005).

Produtos químicos utilizados na agropecuária são também, algumas vezes causa de malformações congênitas tais como parbendazole, carbendazole, organofosforados e outras drogas como cortisona, estradiol, bismuto, selênio e sulfonamidas (LEIPOLD & DENNIS, 1980).

Severa hidranencefalia tem sido descrita na Escócia em ovinos caracterizando uma síndrome de gestação prolongada de causa não determinada (SUMMERS et al. 1995)

3. MATERIAL E MÉTODOS

Foi estudada uma doença neurológica observada em búfalos da raça Murrah em um estabelecimento localizado no município de Capão do Leão, RS.

3.1 Epidemiologia e estudo genealógico do rebanho

A epidemiologia foi estudada por meio de visitas ao estabelecimento e pela observação do rebanho afetado. Foram identificados os animais que deram origem aos búfalos doentes. Foi feito o estudo genealógico dos animais nascidos com o problema e do rebanho afetado e um retrocruzamento do touro pai dos búfalos afetados com duas de suas filhas e com as mães dos búfalos afetados.

3.2 Sinais clínicos

Os sinais clínicos foram estudados nos seis animais afetados nascidos entre 2004 e 2008.

3.3 Patologia

Para o estudo da patologia foram eutanasiados e necropsiados os seis búfalos nascidos com a malformação. Um búfalo que morreu logo após o nascimento por causas não identificadas foi utilizado como controle. Fragmentos dos órgãos foram fixados em formalina 10%, cortados com 5µm de espessura e corados com hematoxilina e eosina.

O sistema nervoso central dos animais afetados foi cortado transversalmente na altura do córtex frontal, parietal, temporal e occipital, núcleos da base, tálamo, colículo rostral, pedúnculos cerebelares, cerebelo, ponte e bulbo na altura do óbex e medula cervical. Nos três últimos animais afetados foram cortados, ainda, fragmentos da medula torácica e lombar. Os fragmentos foram incluídos em parafina, processados rotineiramente e corados pelas técnicas de hematoxilina e eosina e azul rápido de luxol para avaliação da mielina. As lesões observadas foram classificadas de acordo com sua natureza em inflamatórias ou degenerativas.

Para caracterizar a ultra-estrutura das lesões, fragmentos do sistema nervoso central de búfalos nascidos com a doença foram colhidos e fixados em solução de glutaraldeído 2% e paraformaldeído 2% em tampão cacodilato de sódio, desidratados em uma série crescente de etanóis e incluídos em Epon. Os cortes semi-finos foram corados por azul de metileno e nas áreas selecionadas dos blocos foram feitos cortes ultra-finos contrastados por acetato de uranila e citrato de chumbo e observados em microscópio eletrônico de transmissão.

Fragmentos da orelha de três búfalos afetados e cortes do sistema nervoso central dos seis búfalos doentes foram submetidos à técnica de imuno-histoquímica utilizando anticorpo monoclonal 15c5 antivírus da diarréia viral bovina (BVDV) (CORAPI et al. 1990) e anticorpo monoclonal anti-vírus da língua azul¹

1 Técnicas realizadas pelo Dr. David Driemeier do Setor de patologia Veterinária da Universidade federal do Rio Grande do Sul e pelo Dr. Francisco Uzal da Universidade de Califórnia em Davis, USA

. O estudo imuno-histoquímico foi realizado em lâminas silanizadas com secções histológicas de 3µm após a desparafinização e reidratação com banhos de xilóis e alcoóis em concentrações decrescentes até a água destilada. As secções foram submetidas a bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio e subseqüentemente submetidas à recuperação antigênica em solução de TRIS-EDTA (pH 9,0) no forno de microondas (800 W) em potência máxima por 10 minutos. Os anticorpos primários diluídos em PBST, sendo adicionados separadamente nos cortes histológicos incubados por 2 horas à 37º C em câmara úmida. Secções histológicas incubadas apenas com o diluente do anticorpo (PBST) foram utilizadas como controle negativo. O anticorpo (Ac) secundário biotinilado e o complexo

estreptavidina-peroxidase foram incubados consecutivamente à temperatura ambiente por 35 minutos e marcados através da adição do cromógeno de tetracloreto de 3-5’diaminobenzidina (DAB). As secções histológicas foram contra coradas com hematoxilina de Harris, desidratadas e montadas com resina sintética e lamínulas.

3.4 Sorologia

Foi realizada a sorologia para detecção de anticorpos contra BVDV e contra o vírus da língua azul (BTV) dos animais do rebanho cujas amostras de sangue foram centrifugadas para separação do coágulo, identificadas e armazenadas a -18º C para realização dos testes sorológicos. Para BTV foi utilizada a técnica de ELISA com kits comerciais. Para BVDV as amostras foram testadas em duplicata pela técnica de soro-neutralização (SN) contra amostras padrão de BVDV-1 (Singer) e BVDV-2 (VS-253)²

2 Técnica realizada pelo Dr. Eduardo Flores do CCR da Universidade Federal de Santa Maria

.

4. RESULTADOS

4.1 Epidemiologia e estudo genealógico do rebanho

O rebanho de búfalos no qual a doença foi diagnosticada é criado em uma propriedade localizada no município de Capão do Leão, RS. Na mesma área são criados bovinos da raça Charolês e há um rebanho de bovinos da raça Jersey criado em confinamento. Todos os animais do rebanho são dosificados com ivermectina aos três meses de idade e as fêmeas com um ano e meio recebem nova dosificação com o mesmo produto. Além disso, os animais são vacinados para clostridioses, leptospirose, brucelose e aftosa. O rebanho é constituído por 133 fêmeas divididas em quatro grupos. Em um grupo é realizada inseminação artificial e repasse com dois touros. Nos outros grupos é utilizada monta natural cada um com um touro diferente.

Foram afetados seis búfalos, um macho e cinco fêmeas, todos nascidos no mesmo grupo de fêmeas, sendo todos filhos do mesmo touro. O primeiro búfalo afetado nasceu em 2004 (Búfalo 1), um nasceu em 2006 (Búfalo 2) e o terceiro nasceu em 2007 (Búfalo 3), de um total de 102 nascidos no período. Os três restantes nasceram em 2008 de um total de 26 animais resultantes do cruzamento do mesmo touro com duas de suas filhas das quais uma teve uma cria afetada (Búfalo 4) e com 24 fêmeas das quais três eram mães dos Búfalos 1, 2 e 3. O Búfalo 6 era irmão do Búfalo 1. Na Figura 1 está apresentada a genealogia dos animais afetados. No grupo da inseminação artificial ocorreram dois abortos nos anos de 2007 e 2008 respectivamente.

Em levantamento realizado em rebanhos de búfalos da raça Murrah existentes no RS não foram detectados animais com a enfermidade.

4.2 Sinais clínicos

Os sinais clínicos em todos os búfalos afetados eram similares e variavam na intensidade. Os Búfalos 1 e 2 conseguiam manter-se em estação, porém permaneciam com os membros abertos (estação em base larga) para manter o equilíbrio (Figs. 2 e 3) e ao tentarem andar apresentavam incoordenação e caiam, em geral, para frente, permanecendo deitados em posições variadas, com os membros esticados, ou deitados em decúbito lateral (Fig. 4). Os Búfalos 3, 4, 5 e 6 não conseguiam manter-se em estação e se colocados em pé caiam principalmente para a frente, com o pescoço esticado (Fig. 5) e em algumas ocasiões rolavam sobre o próprio corpo. Todos os búfalos afetados apresentavam movimentos rítmicos (tremores/balanço) principalmente da cabeça e pescoço e movimentos laterais das orelhas, principalmente quando estimulados (Fig. 6). Nos Búfalos 1 e 2 esses movimentos eram, generalizados, acentuados e constantes a não ser quando os animais apoiavam a cabeça no chão. Nos búfalos 3 e 4 os movimentos eram constantes, principalmente na cabeça e no pescoço. Nos Búfalos 5 e 6 esses movimentos eram discretos e observados somente quando os animais eram estimulados. Os búfalos apresentavam depressão profunda (Fig. 7), perda do reflexo de ameaça por cegueira e nenhum deles mamou após o nascimento.

Os Búfalos 4 e 5 não apresentavam reflexos interdigital, anal e nasal. O reflexo espinhal estava diminuído e na região cervical os animais respondiam com movimentos laterais das orelhas. O reflexo interdigital no Búfalo 4 estava ausente e no Búfalo 5 estava diminuído sendo que nos membros anteriores o reflexo era maior do que nos membros posteriores. O Búfalo 6 quando estimulado tinha apenas reflexo espinhal na região cervical fazendo movimentos laterais com as orelhas. Os demais reflexos estavam ausentes.

4.3 Patologia

4.3.1 Lesões Macroscópicas

Todos os búfalos afetados apresentavam crânio em forma de cúpula (Fig. 2-7) e os ossos frontais e temporais eram mais estreitos que o normal. Os encéfalos estavam diminuídos de tamanho quando comparados ao encéfalo de um búfalo controle da mesma idade e raça (Fig. 8). Os hemisférios telencefálicos, principalmente dos Búfalos 2, 3, 4, 5 e 6 apresentavam-se como sacos membranosos e o cerebelo tinha, também, menor tamanho em comparação ao cerebelo do búfalo controle (Fig. 8). Em todos os búfalos afetados havia resquícios de giros e sulcos que eram observados no córtex occipital. No Búfalo 1 ao corte na altura dos núcleos da base o tecido nervoso telencefálico apresentava grandes cavidades bilaterais cujas paredes, nas porções mais estreitas, tinham aproximadamente 1,5-2,5mm de espessura, e continham líquido no seu interior (Fig.

9). Remanescentes do tecido neural atravessavam essas cavidades como uma delicada membrana ou finos cordões de tecido nervoso (Fig. 9). A região cortical dorsal tinha aproximadamente 1,5cm de espessura e a substância branca subcortical apresentava também, pequenas cavidades (Fig. 9). A columna fornicis estava achatada e arredondada, o septum pellucidum estava bífido e alongado e o corpus calosum pouco desenvolvido (Fig. 9). Na região da cápsula externa observavam-se cavidades císticas menores, bilaterais e simétricas que também continham líquido em seu interior (porenefalia) (Fig. 9). Os ventrículos laterais estavam dilatados (hidrocefalia ex-vacuo) (Fig. 9). As lesões estendiam-se do córtex frontal até o córtex occipital.

Nos Búfalos 2, 3, 4, 5 e 6 os hemisférios cerebrais reduziam-se a uma fina capa de tecido nervoso de 0,5-1,5 mm, 1,0-2,0 mm, 1,5-2,5 mm, 0,5-2,0 mm e 1,0-

1,5mm de espessura, respectivamente, desde a região frontal até a occipital, onde essas capas eram mais espessas, formando um saco que continha líquido (Fig. 10).

Finos cordões adjacentes à face interna dessa capa eram observados em toda a sua extensão (Figs. 10 e 11). Os núcleos da base apresentavam-se achatados e os ventrículos laterais dilatados. A columna fornicis estava, também achatada e arredondada e o corpus calosum estreito, reduzindo-se a uma membrana que delimitava os ventrículos laterais (Fig. 11).

O tálamo em todos os búfalos afetados apresentava aspecto normal, entretanto o hipocampo estava pouco desenvolvido (Fig. 12). No que restava do córtex temporal e parietal observavam-se pequenas cavidades císticas (porencefalia) (Fig. 13). As demais regiões do tronco encefálico apresentavam, também, aspecto normal, a não ser pela redução do tamanho quando comparadas ao animal controle.

Em todos os Búfalos afetados apenas o córtex occipital mantinha estrutura de giros e sulcos embora atenuados. Ao corte observa-se os hemisférios telencefálicos estreitos delimitando cavidades e a substância branca adjacente resumia-se a finos cordões nos Búfalos 1, 4 e 6 (Fig. 14).

Nos órgãos das cavidades abdominal e torácica não foram observadas lesões com exceção dos fígados que estavam amarelados.

4.3.2 Lesões histológicas

Submacroscopicamente evidenciavam-se cavidades onde remanescentes de substância branca estavam reduzidos a delicados cordões (Fig. 15A).

Microscopicamente o tecido telencefálico estava estreito compreendendo as meninges justapostas a um manto de córtex residual. Ao corte dessas áreas esses cordões apresentavam-se por um lado delimitados por células ependimárias e por outro o tecido nervoso não apresentava revestimento (Fig. 15B). Microscopicamente em todos os búfalos afetados havia áreas com cavidades na substância branca subcortical, as quais não tinham estrutura de delimitação (Fig 16). Principalmente no córtex temporal de todos os búfalos afetados havia áreas no tecido nervoso

remanescente que se apresentavam rarefeitas, observando-se esferóides axonais (Fig. 17A), células gitter (Fig. 17B) e focos de gliose. Os espaços perivasculares apresentavam-se aumentados (Fig. 18 A e B). No Búfalo 1 a substância branca, em algumas áreas, apresentava-se como cordões delimitando os espaços preenchidos por líquido. No Búfalo 3 no córtex occipital havia uma área de hemorragia, manguitos perivasculares de células mononucleares e focos de gliose (Fig 19). Nos núcleos da base dos seis búfalos afetados observou-se espongiose multifocal discreta da substância branca e dilatação dos espaços perivasculares. No tálamo, ponte e pedúnculos cerebelares, óbex e medula cervical, torácica e lombar não foram observadas lesões.

O cerebelo de todos os búfalos afetados apresentava em algumas folhas o córtex desorganizado, a capa granular com menor densidade celular e arranjada em núcleos. Pela coloração de azul rápido de luxol (LFB) a substância branca apresentava nestas áreas menor quantidade de mielina quando comparadas à substância branca das folhas cerebelares do búfalo controle (Fig. 20). Em outras áreas as folhas cerebelares mantinham a morfologia normal, porém, as capas molecular e granular eram mais estreitas, esta última com menor densidade celular e com número normal de células de Purkinje. Em algumas folhas observava-se uma discreta diminuição da espessura das camadas molecular e granular com diminuição do número de células de Purkinje e substituição das mesmas por células da glia (Fig. 21). Em todos os cerebelos observava-se alternância de folhas hipoplásicas com folhas normais.

4.3.3 Lesões ultra-estruturais

O estudo da ultra-estrutura demonstrou que o neurópilo estava comprimido evidenciado pela proximidade dos neurônios e havia tumefação dos processos astrocitários e das mitocôndrias (Fig. 22). Os neurônios apresentavam tumefação da matriz mitocondrial (Fig. 23).

4.3.4 Imuno-histoquímica

Os resultados da imuno-histoquímica realizados para detecção de antígenos virais de BVD e língua azul no sistema nervoso central dos búfalos afetados foram negativos. A técnica de imuno-histoquímica realizada em tecido da orelha de três búfalos nascidos doentes também resultou negativa.

4.4 Sorologia

Os resultados da sorologia realizada para o BTV e para o BVDV foram todos negativos.

Figura 1. Genealogia dos búfalos afetados por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar. Observa-se a consangüinidade no rebanho afetado.

Fêmea afetada

Fêmea sadia

Macho afetado Macho sadio

Figura 2. Búfalo 1 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar em estação com os membros abertos e o

pescoço esticado.

Figura 3. Búfalo 2 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar em estação com os membros abertos para manter o equilíbrio e depressão.

Figura 4. Búfalo 3 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar em decúbito lateral.

Figura 5. Búfalo 4 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar em queda para a frente com o pescoço esticado.

Figura 6. Búfalo 5 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar em posição de cão sentado evidenciando o movimento lateral das orelhas.

Figura 7. Búfalo 6 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar apresentando depressão profunda.

Figura 8. Encéfalo dos seis búfalos afetados por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar (1-6). Observa-se o córtex telencefálico reduzido a sacos membranosos e o menor tamanho do cerebelo quando comparados ao do búfalo controle.

Figura 9. Corte do encéfalo do Búfalo 1 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar na altura dos núcleos da base. Observam-se cavidades bilaterais simétricas no córtex telencefálico. O tecido remanescente apresenta-se como delicadas membranas ou cordões que atravessam as cavidades. A parede cortical lateral das cavidades é estreita (1,5-2,5mm). A região cortical dorsal tem 1,5cm de espessura e a substância branca subcortical apresenta pequenas cavidades (porencefalia). A columna fornicis está achatada e arredondada, o septum pellucidum está alongado e bífido e o corpus calosum pouco desenvolvido.

Figura 10. Cortes seriados do encéfalo do Búfalo 4 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar. Observa-se a ausência do tecido que forma os hemisférios cerebrais, o qual se apresenta como uma fina capa formando um saco. Na altura do córtex occipital há preservação da estrutura de giros e sulcos embora atenuados. Em alguns cortes observam-se finos cordões que atravessam as cavidades formadas (seta).

Figura 11. Corte do encéfalo do búfalo controle e dos 6 búfalos afetados por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar (1-6), na altura dos núcleos da base. Observa-se achatamento desses núcleos e da columna fornicis que está, também, arredondada; o septum pellucidum está bífido e alongado e o corpo calosum pouco desenvolvido.

Control

Figura 12. Corte do encéfalo do búfalo controle e dos 6 búfalos afetados por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar, na altura do tálamo. Observa-se o hipocampo estreito.

Figura 13. Corte do encéfalo do búfalo controle e do Búfalo 4 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar na altura do tálamo. Observa-se nos resquícios do córtex temporal pequena cavidade cística (porencefalia), (seta) e o achatamento do hipocampo (asterisco).

Figura 14. Córtex occipital do búfalo controle comparado ao do Búfalo 1 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar. Observa-se o córtex com cavidades e resquícios de substância branca formando finos cordões atravessando as cavidades.

Control

*

Figura 15. Córtex frontal do Búfalo 1 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar. Submacroscopicamente observa-se o tecido cortical mais estreito e cavidades com resquícios de substância branca em forma de delicados cordões (A).

Histologicamente os cordões de substância branca apresentam-se por um lado delimitados por células ependimárias e pelo outro sem delimitação (B). (HE, obj. 20x).

Figura 16. Córtex temporal do Búfalo 1 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar, mostrando cavidade na substância branca sem delimitação. (HE, obj. 20x).

Figura 17. Córtex temporal do Búfalo 2 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar mostrando rarefação do tecido neural e presença de esferóide axonais e algumas células gitter (A). Acúmulo acentuado de células gitter no córtex temporal do Búfalo 2 (B). (HE, obj. 20x).

Figura 18. Córtex occipital do Búfalo 6 (A) e do Búfalo 4 (B) afetados por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar. Observa-se aumento dos espaços perivasculares. (HE, obj. 10x em A e 20x em B).

Figura 19. Córtex frontal do Búfalo 6 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar. Observa-se discreto manguito perivascular de células mononucleares e foco de gliose no tecido nervoso. (HE, ob.

40x).

A B

Figura 20. Folha cerebelar do búfalo controle (A) e do Búfalo 5 (B) afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar. Observa- se baixa densidade celular da capa granular e menor quantidade de mielina. (LFB, obj. 10xl).

Figura 21. Folha cerebelar do búfalo controle (A) e do Búfalo 3 (B) afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar. Observa- se capa molecular estreita e escassas células de Purkinje. (HE, obj 10x).

A B

Figura 22. Búfalo 3 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar. Fotomicrografia eletrônica mostrando no cortéx parietal o neurópilo comprimido evidenciado pela proximidade dos neurônios (N). Presença de processos astrocitários e mitocôndrias tumefeitos.

Figura 23. Búfalo 3 afetado por hidranencefalia/hipoplasia cerebelar. Fotomicrografia eletrônica do cortéx parietal mostrando tumefação da matriz mitocondrial (setas). (N=neurônio, n=núcleo).

5. DISCUSSÃO

A doença diagnosticada em búfalos foi caracterizada como hidranencefalia e hipoplasia cerebelar congênita com base nas lesões macroscópicas observadas nos encéfalos dos animais afetados, caracterizadas pela presença de sacos membranosos preenchidos por líquido em substituição ao tecido nervoso que compõe o telencéfalo.

Os sinais clínicos apresentados pelos búfalos estudados neste trabalho estão relacionados ao conjunto de lesões observadas no sistema nervoso central dos animais e as pequenas variações devem-se, provavelmente, ao grau dessa lesão.

Foram observadas depressão, incoordenação motora e estação em base larga nos búfalos 1 e 2 que conseguiam manter-se em pé, ausência ou diminuição de reflexos, impossibilidade de mamar e cegueira. Esses sinais caracterizam, de modo geral, lesões no córtex cerebral (MAYHEW, 1989; RIET-CORREA et al., 2002).

Movimentos ritmados e tremores principalmente da cabeça e do pescoço observados em todos os búfalos afetados são característicos de lesões cerebelares.

Lesões, principalmente no pontocerebelo que inclui parte dos lobos rostrais, laterais e caudais e região mediana do vermis, causam tremores de intenção e dismetria (KING, 1994). Neste caso os búfalos tinham hipoplasia cerebelar evidenciada pelo menor tamanho dos lobos quando comparados com o búfalo controle. Tremores involuntários e perda do equilíbrio foram observados em casos de hipoplasia cerebelar associados à porencefalia descritos em bovinos Charolês (SCHILD et al., 2001b).

Nos surtos de hidranencefalia descritos na Bélgica e na Holanda os sinais clínicos eram similares embora não tenha sido relatada a presença de tremores (VERCAUTEREN et al., 2008; WOUDA et al., 2008). Outro surto descrito no Canadá menciona, também, sinais clínicos semelhantes aos descritos nos búfalos deste trabalho (GREENE, 1978).

As lesões macroscópicas foram similares em todos o seis búfalos afetados, embora com diferenças no grau. O crânio em forma de cúpula observado nos búfalos estudados foi descrito, também, em um surto de artrogripose/hidranencefalia em conseqüência da infecção pelo AKAV (HARTLEY et al., 1977), embora em outros surtos da doença essa lesão não tenha sido mencionada (GREENE, 1978;

VERCAUTEREN et al., 2008; WOUDA et al., 2008). Crânio em forma de cúpula não é freqüente em casos de hidranencefalia, embora possa, eventualmente, ser observado em bovinos afetados pela enfermidade (MAXIE & YOUSSEF, 2007).

Todos os búfalos afetados nasceram vivos apesar da quase ausência do tecido nervoso dos hemisférios cerebrais, sendo que dois deles conseguiam manter- se em pé sem auxílio. Isso provavelmente ocorre por que os centros nervosos dos neurônios motores superiores em animais, com exceção dos primatas, localizam-se no tronco encefálico (KING, 1994) que estava normal apesar do tamanho reduzido.

Em surtos ou caso isolados de hidranencefalia têm sido mencionado que os animais sobrevivem por algum tempo mesmo com lesões acentuadas no córtex telencefálico, podendo até mesmo andar (HARTLEY et al., 1977; GREENE, 1978;

VERCAUTEREN et al., 2008). Em outros relatos desta malformação causada por infecções virais tem sido observado que os bovinos podem sobreviver por alguns dias (HARTLEY et al., 1977). A viabilidade dos animais até 2-3 meses de idade foi mencionada em um surto de hidranencefalia, apesar das lesões acentuadas no encéfalo (VERCAUTEREN et al., 2008). Em outras malformações graves do sistema nervoso central como aplasia cerebral e hipoplasia prosencefálica em que há preservação do tronco encefálico os animais afetados também sobrevivem por algum período após o nascimento podendo inclusive permanecer em pé e andar (SUMMERS et al., 1995).

Nos seis búfalos havia atrofia do corpus calosum que se apresentava como uma fina membrana de tecido nervoso que fazia limite com a porção dorsal dos ventrículos laterais. O corpus calosum representa a principal conexão entre o córtex cerebral esquerdo e direito, entretanto dano nesta região produz pequenos distúrbios detectados somente por testes cuidadosos, tanto no homem como em animais de experimentação (KING, 1994). O hipocampo estava, também, atrofiado em maior ou menor grau em todos os búfalos doentes. Esta área do sistema nervoso central está aparentemente ligada ao instinto que exclui reflexos condicionados e o comportamento resultante do aprendizado (KING, 1994). Os búfalos afetados não mamaram, nem mesmo aqueles que conseguiam manter-se em estação. A primeira mamada de um animal está ligada ao instinto, o que poderia sugerir que estes búfalos não mamaram em função das severas lesões do encéfalo incluindo a atrofia desta porção do sistema nervoso central. É provável, também, que a cegueira tenha contribuído para este comportamento. Em outras enfermidades do sistema nervoso central que se manifestam ao nascimento, como por exemplo, hipoplasia cerebelar observada em bovinos Charoleses, apesar dos sinais clínicos de incoordenação motora e perda do equilíbrio, os animais que conseguiam manter- se em estação eram capazes de mamar (SCHILD et al. 2001b).

As lesões histológicas observadas nos búfalos afetados por hidranencefalia foram similares às observadas em outras descrições da doença (HARTLEY et al., 1978; GREENE, 1978; MIURA et al., 1990; TSUDA et al., 2004; VERCAUTEREN et al., 2008). Atrofia do parênquima neural e rarefação da substância branca com presença de células gitter com cavitações delimitadas por discreta astrogliose tem sido observada em todas as descrições da doença. Manguitos perivasculares e gliose no parênquima neural são eventualmente observados em casos de hidranencefalia de causa viral (HARTLEY et al. 1977; VERCAUTEREN et al., 2008).

Aparentemente, a presença de inflamação não é freqüente porque durante a infecção viral e a necrose das células germinativas há uma intensa reação inflamatória a qual, após a morte celular, diminui até o momento do nascimento do animal afetado quando é feito o exame histológico do sistema nervoso (MAXIE &

YOUSSEF, 2007). No presente estudo a presença de infiltrado inflamatório

mononuclear foi observado em um búfalo, o que poderia sugerir uma causa viral para a malformação. As lesões ultra-estruturais devem-se a entrada de água e solutos para o interior da organela e isto pode ser causado por numerosos agentes que produzem dano celular (GHADIALLY, 1997).

Hipoplasia cerebelar ficou evidenciada histologicamente pela presença de folhas com capa molecular estreita, rarefação da capa granular, diminuição do número de células de Purkinje, além de pouca mielinização na substância branca em algumas áreas. Estas lesões são similares às observadas em hipoplasia cerebelar e porencefalia diagnosticada em bovinos Charolês cuja etiologia foi atribuída a infecção pelo BVDV, embora isso não tenha sido comprovado (SCHILD et al., 2001b).

As lesões acentuadas e a pequena variação no grau da lesão do sistema nervoso central dos búfalos sugerem que qualquer que seja a etiologia da enfermidade os eventos ocorreram em um período crítico da gestação. Em bovinos a hidranencefalia causada por agentes virais ocorre quando a infecção fetal se dá antes dos 100-170 dias quando o feto não tem, ainda, o sistema imunológico completo (YERUHAM et al., 2001; MAXIE & YOUSSEF, 2007). Considerando que a gestação de búfalos é de aproximadamente 310 dias, estima-se que este período vá até os 110-190 dias nesta espécie animal e que se a doença aqui descrita é conseqüência de infecção viral, as fêmeas mães dos búfalos doentes se infectaram antes desse período.

Os vírus citados na literatura mundial que causam malformações no sistema nervoso central em bovinos e ovinos, incluindo hidranencefalia presentes no Brasil são BVDV (FLORES & SCHUCH, 2007) e BTV (RIET-CORREA, 2007).

BVDV tem sido identificado sorologicamente em diversos estados incluindo o Rio Grande do Sul e surtos de doença das mucosas e diarréia viral foram diagnosticados também neste estado (RIET-CORREA et al., 1983). Em bovinos Charolês hipoplasia cerebelar foi atribuída a esse vírus no Rio Grande do Sul (SCHILD et al. 2001). Malformações congênitas atribuídas e esse vírus, aparentemente são comuns em rebanhos infectados (FLORES & SCHUCH, 2007).