Expressão
Expressão gênica gênica diferencial no desenvolvimento diferencial no desenvolvimento
Ideias iniciais sobre expressão gênica diferencial....
Expressão gênica diferencial (um conhecimento essencial em Biologia do Desenvolvimento), uma mini introdução!
O desenvolvimento embrionário resulta na formação de muitas células de muitos tipos diferentes. Entretanto, se pensarmos com cuidado, todas as células de um organismo multicelular são derivadas de uma única célula inicial, o ovo fertilizado.
Aqui temos algumas possibilidades.
A primeira possibilidade é que os diferentes tipos celulares teriam DNAs diferentes e portanto a informação para um dado tipo celular estaria exclusivamente no genoma.
Entretanto, essa hipótese não está correta.
Na verdade, em um organismo multicelular todas as células têm o mesmo genoma* (genoma = toda Na verdade, em um organismo multicelular todas as células têm o mesmo genoma* (genoma = toda informação hereditária de um organismo que está codificada em seu DNA).
A palavra chave aqui é informação!
Então, se o genoma é idêntico, porque as células são diferentes (expressam proteínas diferentes, apresentam morfologias diferentes, têm funções distintas e assim vai)?
Como veremos de modo introdutório aqui e durante o curso em maior profundidade, somente parte da informação contida no DNA nuclear é decodificada (podemos pensar nisso como na produção de proteínas e RNAs que são específicos de um dado tipo celular), então é como se cada tipo celular utilizasse apenas a parte do código (informação contida no DNA) que é necessária para que ele exerça suas funções.
* Vocês conhecem exemplos de tipos celulares que têm alterações no DNA? Quais seriam? Algumas células especializadas (altamente diferenciadas) apresentam alterações no DNA.
Um exemplo de como o DNA de uma célula diferenciada ainda contém um genoma completo (leia-se, toda a informação ainda está presente)
Leiam na abertura do capítulo 3 do livro do Gilbert (11ª
edição) a história da
clonagem da Dolly. Hoje em dia é possível clonar
diferentes animais. Embora do ponto de vista experimental a clonagem humana é possível, clonagem humana é possível, esses experimentos são
proibidos na legislação brasileira.
O cromossomo 2 de Drosophila melanogaster (ou o que encontramos no DNA)
Aqui temos uma figura antiga que mostra o tipo de informação contida no genoma. Veja na legenda ao lado.
Você verá que um dado segmento de DNA de Drosophila (e isso é verdade para outros organismos também) contém sequências derivadas de transposons, regiões codificadoras (de proteínas e RNAs) e regiões não codificadoras (regiões assim denominadas pois aparentemente não carregam informação, mas o que não quer dizer que não tenham função).
Como fazer RNA a partir de DNA?
Transcrição, o processo que converte a informação contida no DNA em RNA
RNA polimerases, qual sua função?
RNA polimerases são complexos enzimáticos (conjuntos de proteínas) capazes de se
associar com o DNA nas regiões que devem ser copiadas (fazer cópias de RNA a partir do
molde de DNA) e fazer as cópias, ou seja, síntese de novas moléculas de RNA. Esses RNAs
carregam informação. Ou informação para a síntese de uma proteína. Ou informação para
um RNA (RNAs têm funções também).
Os produtos das RNA polimerases (vejam aqui uma lista incompleta dos
RNAs que podem ser produzidos nas células eucarióticas)
O processo de início da transcrição em eucariotos. Como a RNA polimerase identifica o sítio de início da transcrição?
A situação em eucariotos não é simples. Existem três RNA polimerases. Elas fazem a síntese de diferentes tipos de RNAs.
Além disso,
-a maquinaria de transcrição deve atuar no contexto da cromatina
-Vamos ver um pouco sobre cromatina a seguir.
Um pouco sobre a cromatina: no núcleo de células eucarióticas o DNA não está nu!
células eucarióticas o DNA não está nu!
Em eucariotos a RNA polimerase atua em um molde de cromatina
Na maioria dos organismos é possível observar os cromossomos mitóticos, que estão no grau máximo de condensação (à esquerda, metafásicos). Eles são visíveis ao microscópio. São os cromossomos observados quando se deseja construir o cariótipo de uma espécie.
Lodish, 5th edition
A seta aponta para os nucleossomos. Os nucleossomos são o primeiro nível de organização da cromatina e são compostos por DNA e histonas. Vejam uma descrição mais detalhada acerca dos nucleossomos no capítulo 4 do livro do Gilbert.(11ª edição).
Mais sobre cromatina (DNA + proteínas)
O estado da cromatina não é o mesmo nem todas as regiões do genoma, nem em todos os tipos celulares, nem o tempo todo. A cromatina é dinâmica. Os cromossomos contêm regiões de cromatina altamente condensadas (empacotadas com o auxílio de proteínas), as regiões heterocromáticas (heterocromatina) e que em princípio não estão acessíveis à maquinaria de transcrição. Os cromossomos também contêm regiões eucromáticas (eucromatina) e que são as regiões que estão acessíveis à maquinaria de transcrição. Então, a cromatina pode ser vista como um regulador de expressão gênica, o seu estado (eucromático ou heterocromático) altera a capacidade do complexo RNA polimerase em se associar ao DNA e fazer transcrição. Aqui estamos pensando em acesso. Se a RNA polimerase não for capaz de se associar ao DNA a transcrição não ocorre e os genes não são expressos.
Hoje se sabe que as caudas das histonas podem ser modificadas quimicamente e seu Hoje se sabe que as caudas das histonas podem ser modificadas quimicamente e seu estado de modificação altera a associação entre o DNA e os nucleossomos. Algumas modificações levam ao “afrouxamento” dos nucleossomos e portanto o DNA fica mais acessível à RNA polimerase. Outras modificações levam a um maior empacotamento dos nucleossomos e portanto, o DNA fica menos acessível à RNA polimerase (veja figura 3.4 do livro do Gilbert, 11ª edição e texto correspondente para entender melhor).
Além de modificar as interações DNA-nucleossomo, essas modificações químicas em
histonas servem como plataforma para associação de outras proteínas ao DNA o que altera
ainda mais o estado da cromatina. O papel de duas dessas proteínas, Trithorax e Plycomb,
descobertas inicialmente em Drosophila, é explicado no tópico “mantendo a memória da
metilação”, no capítulo 3 do livro do Gilbert, 11ª edição.
Um cromossomo diferente...
Onde encontramos esses cromossomos?
Qual nome recebem?
Como esses cromossomos são formados?
O que eles nos contam?
O que eles nos contam?
Vocês conseguem ver as regiões eucromáticas e heterocromáticas?
Como são chamadas as regiões indicadas por setas?
O que acontece nessas regiões?
Até aqui pensamos em expressão gênica diferencial.
Vimos que o genoma contém genes.
Vimos que a RNA polimerase transcreve as regiões codificadoras (onde há genes codificadores de RNAs ou proteínas).
Vimos que o DNA de uma célula eucariótica encontra-se no núcleo na forma de cromatina o que torna alguns genes mais acessíveis e outros menos
acessíveis à maquinaria de transcrição (RNA polimerase e fatores acessíveis à maquinaria de transcrição (RNA polimerase e fatores associados).
Afinal, o que é um gene?
O conceito de gene
Unidade de DNA que contém a informação que especifica a síntese de uma única cadeia polipeptídica ou um RNA funcional (ex. RNAt)
Lodish et al, 5th edition, 2004
Segmento de DNA que corresponde a uma única proteína (ou a uma única molécula de RNA estrutural, no caso dos genes que codificam RNA e não proteínas)
Alberts et al, 4th edition, 2002 Alberts et al, 4th edition, 2002
Região do DNA que é transcrita como uma única’unidade e contém a informação referente a uma unidade hereditária que geralmente corresponde a (1) uma única proteína (ou um conjunto de proteínas similares geradas por processamento pós-transcricional), ou (2) um único RNA (ou um conjunto de RNAs similares)
Alberts et al, 5th edition, 2008 (6th edition, 2015)
A anatomia de um gene eucariótico* (transcrito por RNA polimerase II)
Conceitosimportantes a serem revisados ou aprendidos:
-éxons e íntrons;
-adição do quepe no 5´ do RNA (uma modificação química);
-cauda poli A;
-splicing/processamento;
* não vamos rever regulação da transcrição em procariotos que é diferente!
-splicing/processamento;
-tradução (o que é?) -códon de início da tradução e códon de término da tradução;
-modificações pós-
traducionais (o que são?).
Consultem o tópico a Anatomia de um Gene, capítulo 3, livro do Gilbert, 11ª edição.
Os slides seguintes tratam das etapas e processos gerais
associados à transcrição em eucariotos.
Em eucariotos a RNA polimerase não trabalha sozinha. O papel dos fatores gerais de transcrição.
Fatores gerais de transcrição (TFs) posicionam a RNA polimerase no promotor, auxiliam na abertura do molde de DNA e liberam a RNA polimerase para a etapa de elongação.
Essa é a etapa inicial da transcrição. A RNA polimerase não se associa sozinha ao DNA.
Desse processo participam os fatores gerais Desse processo participam os fatores gerais de transcrição, assim denominados porque atuam na transcrição da maior parte dos genes.
Notem o TATA box, sequência de DNA que serve para o correto posicionamento da RNA polimerase. O TATA box é reconhecido pelo TBP, um dos fatores gerais de transcrição.
Essa é a etapa inicial da montagem do
complexo.
Em eucariotos a RNA polimerase não trabalha sozinha. O papel dos ativadores e do complexo mediador.
-In vitro, as taxas de transcrição são baixas em moldes não cromatinizados, isso é, a associação da maquinaria basal de transcrição (slide anterior), embora resulte em transcrição basal não promove níveis altos e regulados de transcrição;
-Mais complexos proteicos são necessários para aumentar a frequência de início da transcrição;
-Fatores ativadores / Complexo mediador / Complexos remodeladores de cromatina* atuam em conjunto para que um dado gene seja expresso, em um tempo determinado, em um tecido específico e nas quantidades necessárias.
* Já vimos como a cromatina pode ter seu estado alterado e ser mais ou menos
permissiva à transcrição.
Após a montagem do complexo pré-transcricional...
-elongação
-modificações pós-transcricionais (capping, splicing e poliadenilação), notem que esses processos
ocorrem concomitantemente com a transcrição)
-término da transcrição
-término da transcrição
-exportação do RNA
-tradução no citoplasma
Os slides anteriores apresentaram uma visão geral sobre
transcrição entretanto não explicam porque a RNA polimerase (e os fatores gerais de transcrição) se associa à região promotora
de um dado gene. Em outras palavras, por que alguns genes são transcritos e outros não?
transcritos e outros não?
Elementos cis-reguladores (como a RNA polimerase encontra os genes a serem transcritos)
Lodish, 5th edition
Notem que no promotor de um gene de mamífero os elementos chamados estimuladores (enhancers, no livro texto), são elementos cis-reguladores que podem estar localizados à montante da sequência codificadora, à jusante da sequência codificadora , muito distantes da sequência codificadora e até mesmo dentro de íntrons. Os elementos proximais (no livro texto promotores) também são sequências cis- reguladoras. O TATA box é a região à qual se associa o TBP, que faz parte dos fatores gerais de transcrição e que auxilia no correto posicionamento da RNA polimerase (vejam slides anteriores). No genoma humano, ao invés do TATA box encontramos as ilhas CpG (sequências ricas em GC) e que desempenham a mesma função. Em geral as diferentes sequências cis-reguladoras atuam em conjunto, formando o que denominamos módulos cis-reguladores.
Elementos cis-reguladores são sequências específicas reconhecidas pelos
fatores trans-ativadores (ou fatores de transcrição)
Elementos cis-reguladores são sítios de ligação de fatores trans- ativadores
A ligação de fatores trans-ativadores pode alterar a conformação do DNA.
Lodish, 5th edition
As sequências cis-reguladoras sinalizam onde e quando um determinado gene deve ser
transcrito ou ser mantido silenciado. Os fatores de transcrição reconhecem essas sequências e a presença desses fatores no núcleo celular é determinante para que os genes regulados por um dado fator de transcrição sejam
transcritos.
Um pouco mais sobre fatores de transcrição... Eles são modulares!
Quais os domínios encontrados
no fator de transcrição MITF?
Os ativadores de transcrição são modulares e têm uma função muito importante
Os ativadores de transcrição servem para atrair, posicionar e modificar os fatores gerais de transcrição, mediador e RNA polimerase II para o promotor, o resultado é a ativação da
transcrição
O conceito de região reguladora do gene
Fatores gerais não variam muito
Promotores, onde a RNA polimerase II liga-se
Essas regiões são os módulos cis-
reguladores e podem atuar como regiões que estimulam a transcrição ou silenciam, dependendo das sequências que contêm e dos fatores que se ligam nessas regiões
Para montagem do
complexo de pré-início da transcrição precisamos
Fatores gerais não variam muito Fatores de transcrição são inúmeros
transcrição precisamos também do Mediador (um complexo proteico). Esse complexo promove a interação indireta entre os fatores de transcrição tecido-específicos e a maquinaria basal de transcrição, formando alças de cromatina e estabilizando o complexo de início da transcrição.
Uma vez montado algumas interações são rompidas para que a RNA polimerase possa se soltar do complexo e iniciar a transcrição propriamente dita.
Entendendo melhor, um gene hipotético
Afinal, como padrões de expressão gênica regulados são obtidos?
O gene Pax6, um caso real
O que é um gene repórter?
Proteínas reguladoras de expressão gênica formam complexos, o conceito de cooperatividade
-Uma dada proteína pode participar em mais de um complexo (repressor ou ativador);
-A função final do complexo depende do conjunto de proteínas associadas;
-A montagem final depende da sequência de associação do conjunto de proteínas
disponíveis.
Ativadores atuam sinergisticamente
Continuando a história de Pax6, sobre a atuação conjunta de fatores de transcrição
Além disso, Pax6 é capaz de se ligar à região reguladora de Pax6, qual a
consequência dessa ligação?
Um exemplo de silenciador, a sequência NRSE
A sequência NRSE (elemento silenciador restritivo neural) impede a ativação de um dado promotor em todos os tecidos, com exceção dos neurônios.
Onde são encontradas? (em quais genes?)
O NRSF (fator silenciados restritivo neural) liga-se ao NRSE.
Onde o NRSF é expresso?
Qual o efeito da deleção de NRSE em genes neurais?
Afinal, como genes específicos neurais Afinal, como genes específicos neurais são regulados?
Em resumo...
Os elementos cis-reguladores (estimuladores ou silenciadores) permitem que os genes utilizem diferentes combinações de fatores de transcrição para controlar sua expressão. A associação combinatória dos fatores de transcrição e os elementos estimuladores leva à expressão espaço-temporal de um dado gene.
estimuladores leva à expressão espaço-temporal de um dado gene.
Esse conhecimento é essencial para o entendimento de redes
reguladoras de expressão gênica, vejam um exemplo no próximo
slide.
Para pensar, a regulação da transcrição é apenas um uma das etapas
que atuam no controle da expressão gênica diferencial
Coda...
Redes regulatórias de genes em linhagens endodérmicas no embrião de ouriço-do-mar
Estudos em ouriço-do-mar começaram a demonstrar modos pelos quais o DNA pode ser regulado para especificar tipos celulares e direcionar a morfogênese do organismo em desenvolvimento. As primeiras informações são fornecidas pelos fatores de transcrição maternos, presentes no citoplasma do ovo. A seguir a rede se autoconstrói! Os fatores de transcrição maternos reconhecem elementos cis-reguladores de genes que regulam outros fatores de transcrição. Esses fatores de transcrição, por sua vez, são capazes de ativar vias de sinalização parácrinas que ativam ou inibem fatores de transcrição específicos em células vizinhas. Existe uma lógica que é estabelecida. Ao conjunto de interconexões entre genes especificando tipos celulares denomina-se uma rede regulatória de genes (GNR). Em princípio, cada linhagem celular, tipo celular e provavelmente cada célula individual pode ser definida pela GRN que ela possui naquele momento.
