Gênero Campylobacter spp

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Gênero Campylobacter spp FAVET-UFRGS Prof. Marcos JP Gomes

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Gênero Campylobacter spp

Prof. Marcos JP Gomes

Campilobacteriose Genital Bovina (CGB), Doença venérea bovina

Aborto Ovino

ATUALIDADES

Atualmente (2013), na “List of Prokaryotic names with Standing in Nomenclature”, organizada pelo pesquisador J.P. Euzéby cita 32 espécies e de 13 subespécies. No momento há 25 diferentes espécies no gênero Campylobacter spp.

TAXONOMIA

O gênero Campylobacter foi proposto, em 1963, por Sebald e Véron para um grupo de espécies com características diferentes das bactérias conhecidas como do gênero Vibrio.

Em 1973, Véron e Chatelain incluíram no gênero Campylobacter novas espécies tendo como base suas características fenotípicas e estas foram didaticamente classificadas em três grupos: a) Campilos catalase positivos e H₂S negativos (Campylobacter fetus subsp. fetus e Campylobacter fetus subsp. venerealis); b) Campilos catalase positivos e H₂S positivos (Campylobacter coli e Campylobacter jejuni) e c) Campilos catalase negativos (Campylobacter sputorum subsp. bubulus e Campylobacter sputorum subsp. sputorum).

Em 1980, essas diferentes espécies foram listadas no “Approved Lists of Bacterial Names”. Depois disso, muitas mudanças ocorreram no gênero Campylobacter, incluindo: I) Descrição de novas espécies; II) Evidenciaram-se semelhanças e III) Transferenci de antigos campilos para outros gêneros Arcobacter ou Helicobacter.

O gênero Campylobacter constitui assim como os gêneros Arcobacter, Dehalospirillum e Sulfurospirillum, a família da Campylobacteraceae colocada na classe Epsilonproteobacteria (filo das "Proteobacteria", domínio ou império das "Bacteria" ou das "Eubacteria").

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Atualmente, esse gênero conta com 25 espécies: 1) Campylobacter avium; 2) Campylobacter canadensis; 3) Campylobacter coli; 4) Campylobacter concisus; 5) Campylobacter cuniculorum; 6) Campylobacter curvus; 7) Campylobacter fetus;

(Campylobacter fetus subsp fetus, Campylobacter fetus subsp venerealis), 8) Campylobacter gracilis; 9) Campylobacter helveticus; 10) Campylobacter hominis; 11) Campylobacter hyoilei 12)Campylobacter hyointestinalis; (Campylobacter hyointestinalis subsp. hyointestinalis, Campylobacter hyointestinalis subsp. lawsonii), 13) Campylobacter insulaenigrae; 14) Campylobacter jejuni; (Campylobacter jejuni subsp. doylei, Campylobacter jejuni subsp. jejuni), 15) Campylobacter lanienae; 16) Campylobacter lari;

17) Campylobacter mucosalis; 18) Campylobacter peloridis; 19) Campylobacter rectus;

20) Campylobacter showae; 21) Campylobacter sputorum; (Campylobacter sputorum subsp bubulus, Campylobacter sputorum subsp sputorum) 22) Campylobacter subantarcticus; 23) Campylobacter upsaliensis; 24) Campylobacter ureolyticus; 25) Campylobacter volucris.

Os resultados das homologias de ADN-ADN mostraram que a divisão do Campylobacter sputorum em duas subespécies não se justifica mais, mas ao contrário, esta espécie comporta três biovares: Campylobacter sputorum biovar Sputorum, Campylobacter sputorum biovar Fecalis ("Campylobacter fecalis") e Campylobacter sputorum biovar Paraureolyticus.

Segundo On e colaboradores em 1998, as linhagens da subespécie Campylobacter sputorum subsp bubulus devem ser consideradas como pertencentes ao Campylobacter sputorum biovar Sputorum.

O reconhecimento de certas espécies do gênero Campylobacter como patógenos para o homem, nestes últimos 40 anos, reforçou a importância deste gênero em medicina veterinária. Algumas espécies são consideradas zoonoses importantes tais como o C. jejuni, o C. coli e o C. fetus subsp fetus, os quais resultaram em estudos dirigidos para a taxonomia, epidemiologia, biologia molecular e patogenia. Estudos em modelos animais

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têm ajudado a elucidar, os mecanismos patogênicos desses agentes, especialmente quanto aos fatores de virulência.

Vandamme et al. (1991), utilizando sondas de hibridização DNA-rRNA,

“immunotyping” e testes fenotípicos, sugeriram a revisão dos gêneros Campylobacter, Helicobacter, Wollinella, propondo a criação do gênero Arcobacter. Assim, o gênero Campylobacter foi reclassificado dentro da superfamília VI de rRNA (subdivisão epsilon da Proteobacteria) e, que é distinta das outras superfamílias de rRNA dentro do grupo das bactérias Gram negativas.

A maioria é habitante do trato reprodutor, intestinal e oral. Outros membros (C.

cryaerophilus; C. pylori) que foram associados com infecções humanas e animais foram transferidos para novos gêneros (Arcobacter spp e Helicobacter spp).

CARACTERÍSTICAS GERAIS

O Gênero Campylobacter é constituído de bactérias Gram negativas, encurvadas ou em forma de S; espiralada, não esporulada; possuem tamanho de 0,2 a 0,5 m de diâmetro de largura e 0,5 a 5,0 m de comprimento; podem apresentar forma filamentosa ou cocóide nos cultivos velhos; geralmente móveis (movimento de cambalhotas) graças a um flagelo localizado em uma ou nas duas extremidades da célula; quimiorganotróficos; metabolismo respiratório; incapazes de utilizar açúcares (nem oxidação nem fermentação); oxidase positiva, catalase variáveis; não hidrolisam a gelatina nem a ureia (com exceção as linhagens atípicas do C. lari e linhagens do C. sputorum biovar Paraureolyticus);

desprovidos de lipase.

No cultivo, não requerem nem soro nem sangue; pode crescer a 25°C; 37°C e 42°C, mas não a 15°C. A maioria das espécies é microaerófila (necessitam de 3 a 15% de oxigênio). O C. rectus e C. curvus são capazes de crescer na presença de 1 a 5% de oxigênio, entretanto essas espécies devem ser cultivadas em anaerobiose.

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As colônias do gênero Campylobacter não são pigmentadas com exceção do C.

mucosalis e do C. hyointestinalis que produzem um pigmento amarelado. C. gracilis é a espécie imóvel e desprovida de flagelos. O C. hominis, espécie descrita em março de 2001, apresenta características bacteriológicas originais. As linhagens dessa espécie são constituídas de bastonetes retos, imóveis (desprovidos de flagelo) e que se cultivam em

*: As duas subsp de Campylobacter lari se diferenciam por sua capacidade de crescer na presença de 0,05 % de safranina.

A resposta é positiva para o Campylobacter lari subsp lari e negativa para o Campylobacter lari subsp concheus.

**: Crescimento.

***: Resistente. +: 90 a 100 % das cepas dão resposta positiva.

-: 0 a 10 % das cepas dão resposta positiva.

(+): 75 a 89 % das cepas dão resposta positiva.

(-) : 11 a 25 % das cepas dão resposta positiva.

d: 26 a 74 % das cepas dão resposta positiva.

f: Resposta fraca positiva.

CCDA: Charcoal Cefoperazone Deoxycholate Agar (Oxoid).

TTC : Cloreto de tri-fenil-tetrazólio.

CCDA** - + + (-) (+) (+) + + d + + + + + + + - + (+) + Agar

MacConkey**

- + d - - (+) (+) d (+) - - d d - - + - (+) - + d (-) - Bile (1%)** d (+) - d - + + - + + (+) + + + + - - d + + Glicina (1%)** - d + (-) - + + - + d + + d + (-) + - + d + + d + (+) + NaCl (2%)** - - (-) - d - - d - + - - - - - - (+) + (+) d + + + - Safranina

(0,05 %)**

+ (-) + + (+) + - - + + - d - d + - - - (+) - + Exigência em

hidrogênio

d - - + - + - - + - + d d - - - - + + + - - - Ácido nalidíxico

(32 mg/L)***

- d - (+) d + + d d - d + + + - - + d (+) (+) (+) - (+) + - Carbenicilina

(32 mg/L)***

(+) - - - - - d - - - + d d + + - - - - - - - Cefalotina (32

mg/L)***

+ - + - (+) - - - - - - (-) - + - + + + - (-) - - - - (-) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 1) C. avium; 2) C. canadensis; 3) C. coli; 4) C. concisus; 5) C. cuniculorum; 6) C. curvus; 7) C. fetus subsp fetus; 8) C.

fetus subsp venerealis; 9) C. gracilis; 10) C. helveticus; 11) C. hominis; 12) C. hyointestilis subsp hyointestilis; 13) C.

hyointestilis subsp lawsonii; 14) C. insulaenigrae; 15) C. jejuni subsp doylei; 16) C. jejuni subsp jejuni; 17) C. lanienae;

18) C. lari*; 19) C. mucosalis; 20) C. peloridis; 21) C. rectus; 22) C. showae; 23) C. sputorum; 24) C. subantarcticus; 25) C. upsaliensis.

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2013 Tabela 3 Origem das espécies Isoladas

Espécies Fonte(s) Patogenicidade eventual para

o Homem

Patogenicidade eventual para os Animais

C. canadensis Ave (Grus americana) ? ?

C. coli Suínos, Aves, bovinos,

ovinos

Gastrenterites, septicemias, abortos

Gastrenterites suínos e macacos;

abortos nos roedores

C. concisus Homem Periodontites, gastrenterites ?

C. curvus Homem Periodontites, gastrenterites ?

C. fetus subsp. fetus Bovinos, ovinos Septicemias, gastrenterites,

abortos, meningites Abortos em ovinos e bovinos

C. fetus subsp. venerealis Bovinos Septicemias Esterilidade enzoótica dos bovinos, abortos nos bovinos

C. gracilis Homem Periodontites, empiemas,

abscessos. ?

C. helveticus Cães e gatos ? Gastrenterite dos cães e gatos

C. hominis Homem Espécie comensal do intestino ?

C. hyointestinalis subsp.

hyointestinalis

Suínos, bovinos, hamsters,

veados, homem Gastrenterites Enterites nos suínos e bovinos

C. hyointestinalis subsp. lawsonii Suínos (estômago) ? ?

C. insulaenigrae Mamíferos marinhos ? ?

C. jejuni subsp. doylei Homem Gastrenterites, gastrites,

septicemias. ?

C. jejuni subsp. jejuni

Aves, suínos, ruminantes, cães gatos, água, visons,

coelhos, insetos.

Gastrenterites, septicemias, meningites, abortos, rectites,

síndrome de Guillain-Barré

Abortos (ovinos, caprinos, bovinos), gastrenterites, hepatite aviária.

C. lanienae Homem ? ?

Espécies Fonte(s) Patog. eventual Homem Patog. eventual Animais

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C. lari

Aves, água doce, água de mar, cães, gatos, macacos,

equinos, focas

Gastrenterites, septicemias Gastrenterites nas aves

C. mucosalis Suínos ? Enterite necrótica e ileíte nos suínos

C. rectus Homem Periodontites ?

C. showae Homem Periodontites ?

C. sputorum biovar. Fecalis Ovinos, bovinos ? ?

C. sputorum biovar

Paraureolyticus Bovinos, homem Enterites ?

C. sputorum biovar Sputorum (compreendem as cepas do C.

sputorum subsp. bubulus)

Homem, bovinos, ovinos,

suínos. Abscessos, gastrenterites ?

C. upsaliensis Cães, gatos, homem. Gastrenterites, septicemias,

abscessos, abortos Gastrenterites nos cães e gatos

C. jejuni, C. coli, C. lari

As espécies C. jejuni, C. coli e C. lari são denominadas de campilos termofílicos. O C. jejuni possui duas subespécies: o C. jejuni subsp. jejuni e C. jejuni subsp. doylei.

A subsp. jejuni é comensal, no trato intestinal de aves e mamíferos, incluindo animais domésticos (produção e companhia). As aves domésticas são fontes de C. jejuni subsp. jejuni. O C. jejuni subsp. doylei tem sido isolado em fezes de crianças com diarréia e, em biópsia gástrica.

O C. coli é isolado do intestino de suínos, mas de outras espécies (bovinos, aves, homem etc.).

O C. lari foi isolado inicialmente de gaivotas, mas também isolado de bovinos, cães, galinhas e outras espécies.

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O C. jejuni é importante causa de aborto em ovinos, mostrando semelhança com o aborto causado pelo C. fetus subsp fetus. O C. jejuni causa, esporadicamente aborto em cães, caprinos e outros animais. É causa de enterite, em animais jovens, incluindo bovinos, aves, suínos, gatos cães, furões e primatas, especialmente animais jovens. O agente tem sido associado com mastite bovina, com hepatite vibriônica das aves e aborto em martas. É a principal causa de enterite no homem e a principal causa de diarreia de origem bacteriana, no mundo.

O C. coli e C. lari somam aproximadamente 5% das amostras isoladas dos casos de enterite humana.

A enterite causada pelo C. jejuni nos animais está associada com fezes amolecidas ou aquosas, acompanhadas de muco e raias de sangue. A maioria dos animais adquire o agente quando jovem (imunidade passiva presente) em condições naturais. A doença pode ser subclínica. A doença clínica é frequente, em animais de companhia e outras espécies, mantidas em boas condições de higiene, tornando-as infectadas na ausência da imunidade passiva ou adquiridas.

FATORES DE VIRULÊNCIA

Estudos experimentais, em camundongos e pintos, indicaram que C. jejuni localizam-se nas criptas, contendo muco e parecendo colonizar o muco, sem aderência às células epiteliais das microvilosidades. A grande motilidade e a forma espiralada facilitam a colonização do muco. O C. jejuni é atraído quimiotaxicamente pela mucina, podendo utilizá-la como substrato para crescimento. Experimentalmente a colonização das criptas cecais pelo C. jejuni é diminuída ou impedida pela colonização pela E. coli, K. pneumoniae e Citrobacter diversus que ocupam os mesmo nichos ecológicos, produzindo metabólitos antagonistas do C. jejuni.

Cepas com habilidade de colonização do trato intestinal de pintos foram desenvolvidas. Um dos componentes, com 69 kDa, está presente na colonização de cepas,

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mas não presentes em cepas não colonizantes, podendo estar envolvido na colonização. A habilidade do C. jejuni em invadir as células epiteliais intestinais tem sido confirmada em estudos em embriões de galinha, camundongos, hamster e linhagem celular de mamíferos.

Os campilos são ativamente móveis por um único flagelo polar em uma ou nas duas extremidades da célula, parecendo que a motilidade, tem importância fundamental na colonização. Variantes do C. jejuni, imóveis, com flagelo incompleto ou com ausência de flagelo não conseguem colonizar ou requerem grandes quantidades de inoculo, em relação às cepas móveis (flagelo completo). Algumas cepas de C. jejuni possuem uma transição bidirecional chamada variação de fase, entre fenótipos flagelados e não flagelados. Quando as variantes não flageladas são utilizadas para infectar coelhos, somente células flageladas são recuperadas de amostras fecais. Outras cepas de campilo expressam reversivelmente dois tipos de flagelos, podendo ser diferenciados antigenicamente por sua mobilidade relativa (Mr), (subunidades de flagelina) na eletroforese em SDS (Sodium dodecyl Sulfate) de poliacrilamida. O C. coli produz uma fase antigênica 1 (P1) de flagelina com 61,5 kDa e uma fase dois (P2) de flagelina de 59,5 k Da. Coelhos infectados, experimentalmente com a P2 eliminam predominantemente P2 durante toda infecção, enquanto que em coelhos infectados com P1, inicialmente eliminam P1, mais tarde, (no 7º dia) eliminam, exclusivamente P2 (Logan et al., 1989).

A variação flagelar antigênica do C. coli é acompanhado pelo rearranjo reversível do DNA, envolvendo dois genes de flagelina (Guerry et al., 1991). Dois genes de flagelina (flaA e flaB) estão também presentes nas cepas do C. jejuni e, organizados, de maneira semelhante, ao C. coli (Nuijten et al., 1992).

Lipopolissacarídio (LPS)

Todas as cepas-padrão do C. coli, segundo o esquema de sorotipagem baseado nos antígenos termoestáveis, têm o tipo liso de LPS, com alta Mr da cadeia lateral O, além de componentes com baixa Mr. Em contrate, aproximadamente 2/3 das amostras de referência

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do C. jejuni, possuem somente componentes com baixa M_r, enquanto que 1/3, possui o tipo liso de LPS. Uma porção do lipídio A do LPS é semelhante quimicamente e antigenicamente aos de outras bactérias Gram negativas. Mudanças nas especificidades antigênicas do LPS foram observadas, em 2 cepas de C. coli, após contínuos subcultivos em laboratório e, atribuído ao rearranjo genômico (Mills et al., 1991). O LPS, de algumas cepas do C. jejuni, possuem ácido N-acetilneuramina (AcNeu), um componente, raramente encontrado em células procarióticas, mas comum em glicolipídios e glicoproteínas de mamíferos. LPS que possui AcNeu pode ser pouco ou não imunogênico para o hospedeiro, mas sua presença, pode conferir soro-resistência.

Toxinas

O C. jejuni, C. coli e C. lari produz fator citotônico, o qual é semelhante às enterotoxinas ativadoras da adenilatociclase e, termolábeis do Vibrio cholerae (toxina cólera, CT) e da E. coli (enterotoxina termolábil, LT) (Ruiz-Palacios et al., 1983). Tem massa molecular entre 60-70 kDa, sendo completamente inativada, no pH 2 e 8. Há divergências, entre as condições necessárias, para produzir inativação, pelo calor desta toxina. A toxina produz resposta citotônica, nas células de tumor adrenal de camundongo (Y-1) e nas células de ovário de hamster chinês (CHO), aumentando os níveis de AMP_c nas CHO e Vero, produzindo secreção fluida em ligadura de alça intestinal de coelhos e ratos, aumentando a permeabilidade, no teste dérmico em coelhos. O nível de produção de enterotoxinas nas cepas de campilo está, entre 20 e 2000 vezes, mais baixo do que para a LT ou CT (Johnson & Lior, 1986).

A enterotoxina é parcialmente neutralizada, pelo anticorpo para CT ou LT e, a pre- incubação com antissoro para CT, suspende o efeito citotônico, em cultura de tecidos e alça intestinal de ratos. Como a subunidade B da CT e LT, as enterotoxinas se aderem ao GM1, receptor tecidual ao gangliosídio, reage ao ELISA com GM1 na fase sólida, podendo ser purificado por métodos baseados na afinidade aos componentes de galactose do

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gangliosídio GM₁; pre-incubação com GM₁ inibe a resposta citotônica, no ensaio celular (cultivo).

C. jejuni, C. coli, e C. lari também produzem citotoxina, sensível à tripsina, e tóxica para células de rim bovino, Vero, HeLa. A citotoxina é lábil a 70ºC, por 30 min; estável a 60ºC, por 30 min e não é neutralizada pelo antissoro para Shiga toxin (Shigella dysenteriae), Clostridium difficile toxina ou verotoxina (E. coli). Tanto enterotoxina ou citotoxina é produzida por estes campilos termofílicos. Alem das enterotoxinas e citotoxinas, outra toxina termolábil, sensível à tripsina, não dialisável, chamada “Cytolethal distending toxin” (CLDT), com massa molecular acima de 30 kDa está presente em filtrados de cultura de muitas cepas do C. jejuni, C. coli e C. lari. Ela (CLDT) é citoletal para células CHO, Vero, HeLa e Hep-2 e negativa em células Y-1. Ela é negativa na ligadura de alça intestinal (íleo) de coelho adulto, camundongos lactentes e, no teste intradérmico, em coelhos. A CLDT é neutralizada pela antitoxina produzida em coelho.

Uma quantidade de ferro utilizável pode ser importante na expressão dessas toxinas.

Imunidade do Hospedeiro e Interações

Os flagelos facilitam a aderência do C. jejuni às células epiteliais humanas (INT 407) e a ligação não é reduzida pela presença de fucose. O LPS também intermedia a aderência do C. jejuni às células INT 407. Entretanto a ligação às células, com LPS purificado, é reduzida na presença de fucose. O LPS se liga ao muco intestinal, mas não o flagelo. Parece que uma proteína da membrana externa, com 27 kDa, está envolvida, na aderência dos campilos entéricos às células epiteliais. Estes estudos sugerem que as células do hospedeiro podem possuir receptores para vários componentes dos campilos. A resistência à fagocitose tem sido demonstrada em cepas de C. jejuni e C. coli, podendo contribuir na permanência do agente no hospedeiro infectado.

A vacinação experimental (camundongo) das fêmeas preveniu a colonização em 85% dos camundongos lactentes, quando desafiados com a mesma cepa; preveniu ainda a

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colonização em 57% dos camundongos quando desafiados com diferentes cepas.

Entretanto, a vacinação falhou em impedir a colonização quando foi utilizada cepa de diferentes sorogrupos de Lior. A proteção foi associada com alta concentração de anticorpos IgG no colostro de mães vacinadas, podendo ter sido envolvida a resposta ao flagelo ou outros antígenos termolábeis. Não houve proteção com as cepas, possuindo os mesmos antígenos termoestáveis do esquema de sorotipagem de Penner, mas pertencentes a diferentes sorogrupos de Lior (Abimiku & Dolby, 1988). Estudos com outros modelos mostraram que os animais desenvolvem resposta imune tanto sistêmica quanto local, após o desafio com C. jejuni. Parece que a IgA persistiu mais do que IgG, sendo induzida pelo flagelo ou outros antígenos de superfície, aparecendo ser importante no estabelecimento do C. jejuni, no intestino.

PERSPECTIVAS

Apesar de um grande número de fatores potenciais de virulência ter sido identificado nos campilos termofílicos, o seu papel na patogenia da doença, não está suficientemente compreendido. Enterotoxinas não têm sido demonstradas nas amostras isoladas do homem com diarreia e há discrepância na identificação de cepas enterotoxigênicas. Estudos futuros serão necessários, no estabelecimento da importância das enterotoxinas, citotoxinas, adesinas, invasinas e outros fatores importantes na biologia destes organismos para definir a imunidade ao C. jejuni. Tais estudos estarão associados, certamente à genética molecular dos campilos.

C. mucosalis, C. hyointestinalis

C. mucosalis e o C. hyointestinalis têm sido isolados de suínos com enterite proliferativa, doença complexa, do intestino delgado e, ocasionalmente do ceco e colo.

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A Enterite proliferativa dos Suínos (EPS) compreende quatro enfermidades entéricas: 1) Adenomatose intestinal, 2) Enterite necrótica, 3) Ileíte regional e 4) Enteropatia hemorrágica proliferativa.

EPS possui distribuição mundial, causando prejuízos econômicos, especialmente em leitões desmamados. A fase inicial é caracterizada, por hiperplasia das criptas do epitélio intestinal, pela presença de bactérias espiraladas intracelulares estão entre os achados patológicos mais consistentes do EPS. A microscopia eletrônica revelou que as bactérias intracelulares não estão ligadas por membrana, permanecendo livres no citoplasma da célula do hospedeiro.

O C. mucosalis foi, inicialmente isolado da adenomatose intestinal dos suínos; um adenoma benigno da mucosa intestinal de leitões desmamados. Mais tarde, o organismo foi isolado de outras condições de EPS e da cavidade oral de suínos saudáveis, onde ocorria adenomatose intestinal.

C. hyointestinalis tem sido isolado de lesões de EPS, assim como do intestino de bovinos hígidos e, mais recentemente, das fezes do homem com distúrbios gastrintestinais.

Tanto o C. mucosalis e o C. hyointestinalis, podem ser, consistentemente isolados, das lesões de EPS. A tentativa de reprodução experimental, em suínos gnobióticos ou convencional, não tem tido sucesso.

Em 1995, este grupo foi denominado pelo Comitê de Bacteriologia como Campylobacter hyoilei. Mais tarde, em 1997, o C. hyoilei foi incluído como parte do C.

coli. Mais recentemente, esta bactéria intracelular foi denominada de Lawsonia intracellularis, agente etiológico da ileíte suína.

C. sputorum e C. upsaliensis

Os três biovares do C. sputorum tem sido implicado nas infecções humanas e animais. O biovar sputorum tem sido isolado da cavidade oral humana. O biovar fecalis é considerado como não patogênico, embora experimentalmente, possa causar infecções

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entéricas em bezerros. O biovar bubulus é saprófito e, frequentemente presente no prepúcio do touro (Garcia et al., 1983). Tanto o biovar sputorum quanto o biovar bubulus tem sido isolados de abscessos humanos.

O C. upsaliensis causa diarreia / bacteremia, tanto em pessoas saudáveis ou imunocomprometidas. A maioria das amostras foi isolada das fezes de crianças, com doença diarreica autolimitante. Este organismo foi relatado, pela primeira vez, em cães, com e sem diarreia, suspeitos de transmitirem o patógeno ao Homem. A presença de plasmídios idênticos nas amostras de C. upsaliensis isolados de cães e do homem sugere que essas infecções são zoonoses.

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Campylobacter fetus subsp fetus e Campylobacter fetus subsp venerealis

Prof. Marcos JP Gomes

Campilobacteriose enzoótica Ovina Campilobacteriose Genital Bovina HISTÓRICO

Os primeiros estudos sobre as campilobacterioses animais foram realizados, no início deste século, na Inglaterra, por McFadyean e Stockman (1909, 1913); nos Estados Unidos, por (Smith e Taylor, 1919; Smith, 1923), e avançaram, especialmente com os trabalhos de Plastridge (1941), na Austrália, e, prosseguindo nas décadas subsequentes, entre os anos 40 e 70.

Os dados da pesquisa brasileira sobre a campilobacteriose tiveram início, principalmente, no final da década de 50, com os trabalhos desenvolvidos em São Paulo.

Mais tarde, outros grupos se destacaram, especialmente nos Estados do Rio de Janeiro, Paraná, Minas Gerais, Bahia, Goiás e Rio Grande do Sul.

INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA

A produtividade do rebanho leiteiro ou o rebanho de corte está associado a 5 variáveis principais: alimentação, manejo, genética, controle sanitário e administração. A produção de leite e de carne exige efetivamente altos níveis de fertilidade de fêmeas e de machos. Gameta fértil e ambiente livre de doenças são pré-requisitos para um produto saudável. A adoção de tecnologias na área reprodutiva, a globalização dos mercados (Mercado Econômico Europeu, Mercosul), o aumento de competitividade produtiva dos produtos de origem animal, atrelados à crescente alta dos custos (alimentação, genética, manejo), todos juntos, justificam a aplicação de medidas sanitárias preventivas, tomadas

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para manter e assegurar, o desempenho reprodutivo reprodutores bovinos, especialmente na campilobacteriose bovina e ovina (Fernandes & Gomes, 1992, Gomes, 1998)

Definição

Campilobacteriose bovina é o termo genérico utilizado para designar doenças causadas por espécies do gênero Campylobacter spp, incluindo o C. fetus subsp fetus e o C.

fetus subsp venerealis.

O C. fetus subespécie fetus tem como habitat o tubo gastrintestinal, podendo causar abortamentos esporádicos, em bovinos. Entretanto, uma cepa intermediária, desta subespécie, pode causar infertilidade e persistência, no trato genital de novilhas, experimentalmente inoculadas, conforme Maclaren & Agumbah (1988). No homem, o C.

fetus subsp fetus pode causar infecções intestinais e sistêmicas.

A ocorrência de infecções, no homem, pelo C. fetus subsp fetus, é rara e até, recentemente não havia sido registrada.

Em 1987, na Suécia, foi relatado o isolamento de amostras semelhantes ao C. fetus subsp venerealis por Holst e colaboradores. Na Austrália, foi relatado em homossexuais com diarreia. As amostras suecas foram confirmadas como C. fetus subsp venerealis, através de testes bioquímicos e experimentais realizados em novilhas.

As duas subespécies do C. fetus são geneticamente muito semelhantes, embora, com manifestações clínicas, bem distintas. A subespécie venerealis e seu biovar intermedius são responsáveis pela campilobacteriose genital bovina (CGB), caracterizada por infertilidade e abortamentos. Estas duas subespécies desenvolveram uma relação parasitária com o trato reprodutor bovino. O biovar intermedius pode ocorrer no trato intestinal.

Recentemente, a análise sequencial da região hipervariável do 16S rRNA das duas subespécies, indicaram uma homologia de 99,9% e, somente uma única base diferente entre 1400 bases sequenciadas. Há relatos ocasionais em que o C. fetus subsp fetus foi isolado e

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associado com infertilidade bovina, colocando em questão, a confiança dos testes atuais, especialmente os testes de tolerância à glicina e apresentação doença.

LOCALIZAÇÃO

O C. fetus subsp venerealis e o seu biótipo intermedius são os agentes responsáveis pela campilobacteriose genital bovina (CGB); doença venérea, exclusivamente dos bovinos, relacionada com infecção assintomática, no touro e, inflamação aguda ou crônica do aparelho genital feminino.

O habitat natural deste organismo é o trato reprodutor bovino, não se multiplicando no trato intestinal. Cepas intermediárias pertencentes ao biótipo intermedius podem causar a mesma infecção tanto do trato reprodutor quanto do trato intestinal, conforme Elazhary (1968). No touro, o agente está confinado à mucosa da glande peniana, prepúcio e porção distal da uretra. Em novilhas e vacas, os locais de infecção são: lúmen vaginal, cérvice, útero e oviduto.

IMPACTO ECONÔMICO

O impacto econômico está direta e indiretamente associado à doença na fêmea, e infecção assintomática, no macho portador.

As fêmeas apresentam uma taxa de concepção mais tardia, ciclos estrais irregulares, aumento no número de coberturas por concepção; diminuição no número de terneiros;

mortes embrionárias; abortos; diminuição na produção de leite e carne. Indiretamente, temos despesas com serviços veterinários, medicamentos e na reposição precoce de animais improdutivos.

Nos machos, os prejuízos com a CGB estão associados, principalmente pelo fator de risco que provocam frente à população de fêmeas, sexualmente maturas e produtivas.

Somam-se ainda os custos na identificação do agente, no tratamento com antimicrobianos e no descarte de touros, geneticamente superiores e nos custos com a reposição dos machos.

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Os prejuízos econômicos causados pela CGB foram objetos de importantes trabalhos na Europa, Estados Unidos e Austrália. No Brasil, esses dados raros e podem ser examinados no trabalho de Leite (1977).

Leite em 1977, em Minas Gerais, trabalhou com 10 rebanhos leiteiros, distribuídos em nove municípios, avaliando o custo / benefício da vacinação contra a CGB. Nesse estudo, o cálculo total de perdas relativas a um dos rebanhos foi de C$ 2.128,02 por vaca e, retorno de C$ 47,68 por cruzeiro investido, no controle e prevenção da doença. Em outros dois rebanhos em que só foi computado, o prejuízo na produção leiteira, o cálculo das perdas, foi estimado em C$ 499,92 e C$ 823,70 e, retorno de C$ 11,09 e C$ 18,30, respectivamente. Confirmando, o retorno no investimento realizado, através da vacinação contra a CGB.

EPIDEMIOLOGIA

A CGB é, sem dúvida, causa de infertilidade de bovinos, especialmente onde não há plano sanitário ou ele é negligenciado.

Em países, como o nosso, a CGB é uma das principais causas de problemas reprodutivos. Na Argentina, Villar & Spina (1982), em um estudo de 15 anos compreendendo os anos de 1966 a 1981, detectaram a prevalência da infecção em 22%, onde foram testados 11.300 touros, através da técnica de imunofluorescência. Akhtar et al.

(1990), nos Estados Unidos, em estudo, compreendendo 400 fêmeas detectaram uma prevalência de 47% para o C. fetus, através da sorologia pela técnica de ELISA.

Os primeiros estudos sobre a CGB foram direcionados para o isolamento e identificação do agente, o qual comprometia seriamente a fertilidade de bovinos leiteiros.

Atualmente, o problema direcionou-se, especialmente para a pecuária de corte pelas dificuldades na aplicação de técnicas eficazes, na identificação, cultivo e produção de imunobiológicos que possam ser aplicados no combate da doença ou infecção.

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Os dados obtidos da pesquisa nacional sobre a CGB estão concentrados, após a metade do século 20, principalmente, nas décadas de 60 e 70. Atualmente, poucos são os trabalhos que estudam a presença desta doença ou analisam a evolução da enfermidade, no nosso país, existindo, segundo Pitombo (1993), pouca divulgação do problema; os dados estão desatualizados e, frequentemente sofrem descontinuidade.

HISTÓRICO NO BRASIL

Em 1956, D'Apice, em SP, isolou pela primeira vez, o C. fetus do abomaso de um feto bovino abortado.

Em 1963, Pestana de Castro e colaboradores, isolaram o agente da CGB de um touro e de um feto bovino abortado.

Em 1967, Pestana de Castro e colaboradores, isolaram novas amostras do C. fetus e testaram amostras de muco vaginal, através do teste de muco aglutinação, estimando em 8%, o percentual de amostras reagentes.

Em 1971, Pestana de Castro e colaboradores detectaram aglutininas contra o C.

fetus, no muco vaginal de bovinos, no Estado de São Paulo, Minas Gerais e Paraná, detectando reagentes em 14,4% das 1.068 amostras testadas.

Em 1971, Giorgi e colaboradores, tipificaram 10 amostras isoladas de bovinos, utilizando testes bioquímicos clássicos na diferenciação entre as variedades: intestinais, venerealis e a intermedius, do gênero Campylobacter spp. Das 10 amostras tipificadas, cinco amostras foram consideradas variante intermediária (subsp intermedius); três cepas foram consideradas como a variante intestinais (subsp fetus) e duas foram típicas da variedade venerealis (subsp venerealis). Os autores encontraram dificuldade em classificar as amostras isoladas do trato genital, considerando não existir diferenças significativas entre estas amostras e os sinais clínicos.

Em 1978, No Rio de Janeiro, Auvanir Ramos e Hélio Gustavo Guida, testaram 4.092 amostras de muco vaginal, através da mucoaglutinação de fêmeas provenientes de

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251 propriedades rurais, distribuídas em 39 municípios. Estimaram sua infecção em aproximadamente 13% com reações positivas com ponto de corte igual ou superior a 1:100.

Medeiros e Figueiredo, Cohn e Costa estudaram o comportamento desta enfermidade respectivamente em Minas Gerais em 1971; no Rio de Janeiro em 1976 e na Bahia em1976.

Em 1983, Auvanir Ramos e colaboradores publicaram o isolamento e identificação de 14 amostras de C. fetus, a partir de amostras de lavado prepucial, esmegma, sêmen, muco vaginal e fluido do abomaso de fetos abortados, de bovinos com problemas reprodutivos. Das 14 amostras isoladas e identificadas; 13 foram caracterizadas como C.

fetus subsp fetus (atualmente subsp venerealis) e apenas uma foi classificada como C. fetus subsp intestinais (atualmente subsp fetus).

Em 1960, no Rio Grande do Sul, Mies Filho, utilizando o teste de mucoaglutinação estimou a prevalência da CGB em 27%, dentre as 311 amostras de fêmeas pertencentes a 22 rebanhos leiteiros, provenientes de nove municípios do estado.

Em 1963, Mies Filho evidenciou os sinais clínicos da enfermidade aguda num rebanho leiteiro, no município de São Leopoldo. Das 36 fêmeas examinadas, somente 12 estavam fecundadas. As fêmeas infectadas apresentaram um quadro de cervicite e vaginite não purulenta. As fêmeas infectadas e não fecundadas, evidenciaram um intervalo médio entre cios de 35 dias; uma média de 6,8 inseminações por animal. A queda na produção de terneiros foi de 50%, em relação, ao ano anterior. O teste de mucoaglutinação detectou 83,3

% reagentes dentre as 24 fêmeas.

Em 1975, no Rio Grande do Sul S, Joaquim Fernandes e colaboradores, isolaram e identificaram o C. fetus subsp venerealis em dois touros de uma propriedade com CGB. As amostras foram tipificadas, conforme os critérios utilizados a época em Weybridge. As amostras foram testadas pela imunofluorescência, frente aos sorotipos conjugados A, B e C.

As duas amostras brasileiras foram classificadas como A.

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Em 1986, em Goiás, Andrade e colaboradores estimaram em 22,37% a prevalência da CGB, através da técnica de mucoaglutinação. Foram testadas 1.685 amostras bovinas provenientes de 72 rebanhos leiteiros situados em 21 municípios do estado.

Em 1986, em São Paulo, Genovez e colaboradores, testaram 46 touros: 26 provenientes da região do Vale do Paraíba e 20 reprodutores machos da região Centro- Leste do Estado, identificando o agente da CGB em 11 (23,9%) dos reprodutores bovinos testados.

Em 1998, no MS, Pellegrini e colaboradores, testando amostras de esmegma de 132 touros, detectaram 74 (56 %) animais infectados, através da técnica de imunofluorescência direta.

Em 2001, no RS, Agueda Vargas e colaboradores, em 2001, reproduziram a infecção natural de reprodutores bovinos e demonstraram que as amostras do C. fetus subsp venerealis expressaram padrões diferenciados de proteínas de superfície, sendo a proteína de 100 kDa a mais prevalente.

SUSCEPTIBILIDADE E TRANSMISSÃO

Fêmeas não expostas à infecção são suscetíveis, mas as novilhas imaturas são refratárias. Os machos são suscetíveis, parecendo que alguns, possuem um grau diferenciado de suscetibilidade. A infecção pelo C. fetus subsp venerealis é geralmente venérea. Desse modo, a infecção pode propagar-se, tanto da vaca infectada para o touro suscetível, quanto do touro infectado para a vaca suscetível. O touro infectado possui maior importância, especialmente pela forma de transmissão da enfermidade. A utilização de touros infectados, pelo sistema de empréstimo entre as pequenas propriedades rurais representa um risco à difusão da doença. A infecção pode propaga-se, através da inseminação artificial, tanto com o sêmen infectado refrigerado quanto pelo sêmen infectado e congelado. A transmissão de fêmea para fêmeas é rara, entretanto entre machos, ela é mais bem mais frequente, especialmente quando criados em grandes lotes onde os

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animais podem apresentar sodomia. A infecção pode ocorrer nos centros de I.A., pela manipulação incorreta de material contaminado. O touro infectado pelo C. fetus subsp venerealis, permanece infectado por um longo período de tempo, muito embora seja possível, às vezes, ocorrer o restabelecimento espontâneo.

A transmissão pelo touro infectado pode alcançar 100% das fêmeas servidas. A infecção no trato feminino pode causar lesões que vão desde uma inflamação catarral leve, até abortamentos. A infertilidade está associada à repetição de cios (superiores a 20 - 21 dias), especialmente em novilhas e abortamentos (10%) nas vacas infectadas.

No começo da doença podem ocorrer casos de vaginite catarral. Alguns animais prenhes podem abortar especialmente as primíparas. Abortamentos, geralmente ocorrem durante o 5º e 6º mês de gestação. Outros sinais podem incluir: endometrites, salpingites e aumento dos ciclos estrais (acima de um mês). As fêmeas (novilhas e vacas) doentes, geralmente não permanecem inférteis, retornando a vida reprodutiva normal em 180 dias (6 meses). Algumas vezes, o campilo pode sobreviver, na cérvice e fundo de saco vaginal, durante todo o período de gestação e, infectar, touros susceptíveis, no período de monta subsequente.

Os touros infectados são assintomáticos, existindo uma ocorrência maior, de touros portadores com mais de 5 anos. O aumento e profundidade das criptas epiteliais do pênis favorecem as condições de persistência do C. fetus subsp venerealis.

O C. fetus subsp fetus causa aborto esporádico, em bovinos e aborto epizoótico em ovinos, alem de infecções entéricas e sistêmicas no homem. A infecção pode ser adquirida pela ingestão de material contaminado. Durante a gestação pode ocorrer uma bacteremia em que o organismo se difunde do intestino para o fígado e, deste, para o útero, placenta e feto; raramente encontrado no útero não grávido. O organismo se localiza nos placentomas, induzindo placentite necrótica e aborto, geralmente entre os dias 100º - 150º de gestação.

Nos ovinos, o abortamento, geralmente acontece à época dos partos.

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2013 FATORES DE VIRULÊNCIA

Proteínas de superfície (Camada S ou “S layer” )

As amostras de “campo” do C. fetus possuem subunidades proteicas, em arranjos regulares, como componente externo de seus envelopes celulares. A localização superficial dessas proteínas sugere fortemente que esta camada tem papel importante, nas interações entre agente-hospedeiro. A camada S representa menos de 10% do total das proteínas celulares, podendo ocorrer como formas múltiplas e de peso molecular entre 90 a 149 kDa.

Estas proteínas cristalinas são autoarranjáveis, podendo assumir padrões hexagonais, tetragonais ou padrões oblíquos. Estas formas específicas podem estar relacionadas ao tamanho molecular e antigenicidade.

Determinantes compartilhados podem estar presentes entre diferentes formas, sugerindo que essas cepas de C. fetus produzem uma família de proteínas de Camada S “S- layer”, com características estruturais e antigênicas comuns. Formas múltiplas de proteína S podem ser expressas, por uma única célula com uma forma predominante. Inicialmente, relatada com microcápsula de glicoproteina e, posteriormente como proteínas hidrofóbicas e, altamente ácidas com uma sequencia terminal de aminoácidos único para a espécie.

Alem do mais, não há evidências que confirmam a glicosilação ou presença de açúcares na camada S, do C. fetus. A ligação não covalente da camada S aos componentes da membrana externa subjacente facilita a extração de proteínas em estado quase puro. Isto implica que as proteínas da camada S podem ser facilmente perdidas ou rearranjadas aos componentes celulares específicos.

Em 1992, Yang e colaboradores demonstraram que a ligação da camada S envolve a metade da ligação N terminal à cadeia O do LPS que é sorotipo específico. Esta ligação é mediada por cátions bivalentes tais como Ca⁺⁺ que age como uma ponte, entre os grupos carregados negativamente, das cadeias laterais do LPS, produzindo um dímero e alinhamento da cadeia lateral em orientação própria e necessária a ligação à proteína da Camada S.

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Pouco é conhecido sobre os mecanismos regulatórios genéticos, envolvendo a capacidade do C. fetus em produzir múltiplas formas de Camada S, assim como o mecanismo de iniciação e suspensão na sua produção. Laser e Gotschlich (1990), clonaram o gene estrutural de 98kDa da Camada S, utilizando o bacteriófago Gt 11, como vetor. O clone continha uma inserção com abertura freio codificando um polipeptídio com 933aa que se aproxima muito da massa molecular da proteína da Camada S purificada. Um sítio de ligação ribossomal e a sequencia de terminação da transcrição têm sido também identificados. Uma observação significativa indicou que as proteínas da Camada S eram exportadas sem uma sequencia líder (um único segmento de nucleotídeos não traduzido, precedendo a iniciação do códon do mRNA). Entretanto, um segmento interno curto mostrou homologia a sequencia líder das proteínas fimbriais de várias bactérias, sendo interpretado como função alvo da Camada S para a superfície celular. Além disso, outra sequencia interna foi descoberta como correspondendo a sequencia de sinais para proteínas exportadoras em outras espécies.

A Habilidade de muitos patógenos, em produzir componentes de superfície, com diferentes especificidades antigênicas, interferindo na relação agente hospedeiro, possibilitando um mecanismo contrário e alternativo contra a resposta imune do hospedeiro.

Em 1975, McCoy e colaboradores foram os primeiros, a sugerir a importância da Camada S como fator de virulência, mostrando que, sua presença conferia propriedades antifagocíticas. Estudos “in vitro” realizados com camundongos demonstraram que a Camada S era o principal fator responsável pela habilidade do C. fetus em causar infecções intestinais e extraintestinais. A presença da Camada S do C. fetus inibiu a ligação do C3b (hospedeiro) do Complemento, evitando a formação de convertase C5, eficientemente. A ligação C3 imperfeita, mesmo na presença de soro imune, sugere que o anticorpo direcionado aos locais da superfície celular, não é importante para a resistência da cepa de C. fetus encapsulada.

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Embora, os estudos da Camada S tenham sido baseados, principalmente em cepas de C. fetus subsp fetus, eles podem ter associação com a patogenia da CGB. Estudos mais recentes indicam que cepas do C. fetus subsp venerealis produz, variações antigênicas da Camada S, nos animais infectados. A variação, na forma predominante da Camada S, pode explicar, as variações antigênicas observadas, em bovinos infectados pelo C. fetus. O mecanismo subjacente, pelo qual o C. fetus pode alterar, o produto do gene, durante o curso da infecção, está longe de ser clareado.

Lipopolissacarídio (LPS)

O aborto provocado pelo campilos pode ser admitido como uma resposta alérgica às endotoxinas termoestáveis. Choque anafilático tem sido demonstrado, quando animais são inoculados, com amostras de C. fetus subsp venerealis, recentemente isoladas ou inativadas pelo calor (fervidas).

A estrutura do LPS possui determinante antigênico comum, entretanto há diferenças, entre as especificidades antigênicas da cadeia lateral O do LPS, sendo a base para a sorotipagem (Perez-Perez et al. 1986).

PATOGENIA E SINAIS CLÍNICOS

O C. fetus subsp venerealis é um parasita obrigatório do aparelho genital bovino. A introdução da enfermidade em um rebanho suscetível é seguida de um período de infertilidade em todas as fêmeas suscetíveis por um período de aproximadamente 120 dias.

Em rebanhos cronicamente infectados são observados sinais de infertilidade nos animais recentemente introduzidos e suscetíveis.

O agente localiza-se na porção anterior da vagina e cérvice durante a fase ovulatória, mas não invade. Posteriormente, há invasão na fase progestacional do útero e oviduto. Inicialmente há o desenvolvimento de moderada endometrite e salpingite que pode

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durar semanas a poucos meses. O animal permanece infértil durante este período, tanto pela falha na implantação ou por causa do aborto precoce. Em raras ocasiões a gestação pode continuar até 5-7 meses antes de a lesão placentária causar a morte fetal e expulsão (aborto).

O agente na infecção natural, geralmente é introduzido no trato genital feminino, durante a fase ovulatória do ciclo estral, quando neutrófilos estão abundantemente presentes, nas secreções. Os campilos que escapam da fagocitose são capazes de multiplicar-se e invadir o útero, durante a fase lutea, quando a resposta de neutrófilos é menor. Este fato, permite a produção de anticorpos IgG no útero e, IgA na vagina.

A IgG possui atividade opsonizante na fagocitose do agente pelos neutrófilos e células mononucleares, mas não mediada pelo complemento.

A IgA (que não é muito opsonizante) imobiliza o microrganismo nas superfícies cérvico-vaginais, limitando sua entrada no útero e mucosas. Deste modo, facilitando o controle do C. fetus, especialmente no estro, ou, permitindo o estado de portador assintomático.

As imunoglobulinas contra o C. fetus, nos touros portadores, estão em baixos níveis, provavelmente pela localização superficial do agente no prepúcio e o pequeníssimo estímulo ao sistema imune do hospedeiro ou ainda pelo tratamento com antimicrobianos e vacinação.

A vacinação de novilhas está recomendada em propriedades onde a prevalência da CGB é alta, existindo boa correlação entre os títulos de anticorpos sorológicos e a proteção contra a CGB.

As alterações fisiológicas nos animais infectados são geralmente discretas ou inexistentes, permitindo que a infecção possa estar presente numa propriedade ou região, por meses ou mesmo anos, antes de ser reconhecida ou detectada.

O C. fetus subsp venerealis é transmitido pelo macho à fêmea, geralmente pela monta natural ou monta orientada.

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A doença na novilha é uma infecção aguda do trato genital feminino e caracterizado por uma endometrite leve. O microrganismo localiza-se na parte anterior da vagina; invade o útero e oviduto, produzindo endometrite e salpingite moderada. A infecção nas vacas pode ser aguda, mas nas novilhas ela é aguda, tornando-se gradativamente crônica.

Geralmente a infertilidade (parcial) está associada com a fase aguda, e o aborto associado à fase crônica, embora o aborto possa ocorrer, na fase aguda. A passagem da fase aguda para a crônica pode estar relacionada com a aquisição de resistência à infecção.

O exame vaginal inicialmente revela uma vaginite catarral com secreção mucosa abundante, podendo durar 3 a 4 meses. O muco é geralmente claro, mas pode ser ligeiramente turvo ou, em casos excepcionais, purulentos. A mucosa vaginal, às vezes, está avermelhada, principalmente na região do corpo uterino, que é característico de cervicite catarral. Ao mesmo tempo, acontece o processo de endometrite que nem sempre, pode ser detectado clinicamente.

A introdução da CGB em uma propriedade pode está associada a diversos e variados índices de fertilidade. Aproximadamente 15 a 45% das vacas tornam-se fecundadas, na primeira cobertura. O repasse de coberturas é realizado nos animais com retorno tardio ao cio e, deste modo, difundindo a infecção aos touros susceptíveis. Na maioria dos casos, ocorre aborto com placentite, entre o 4º e o 7º mês de gestação.

O organismo pode persistir no fundo de saco vaginal por longos períodos, semelhantemente ao comportamento deste agente, no touro, mas com menor duração. A maioria das fêmeas infectadas recupera-se espontaneamente após 3 a 6 ciclos estrais ou pelo descanso sexual de 120 a 180 dias, desde que não reinfectadas.

No macho, o Campylobacter fetus subsp venerealis se localiza na cavidade prepucial, principalmente nas criptas e porção distal da uretra. Não se observam alterações clínicas nos animais portadores. A qualidade do sêmen não é comprometida. Touros jovens infectados adquirem a infecção, por pouco tempo, recuperando-se em poucas semanas ou meses, espontaneamente desde que o agente não seja reintroduzido no prepúcio. Touros

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com idade superior a cinco anos, geralmente permanecem, cronicamente infectados, mesmo quando tratados. O touro parece não desenvolver imunidade permanente, nem de longa duração. A infecção tende a se cronificar, à medida que o touro torna-se mais velho, pela associação entre número, tamanho das criptas prepuciais e a idade.

DIAGNÓSTICO No laboratório

Na CGB o isolamento do C. fetus continua sendo o “gold standard” e o procedimento mais indicado no diagnóstico. Podemos utilizar ainda, na ausência de isolamento bacteriano, outros testes por meio de reações imunológicas, especialmente muco-aglutinação ou pelo teste de ELISA no lavado prepucial e muco vaginal, utilizando anticorpo monoclonal ao LPS do C. fetus pela IF, ELISA e PCR.

Inoculação das amostras e isolamento do C. fetus

Amostras de esmegma, placenta, secreção vaginal, tecido fetal são colhidas; diluída em salina estéril e inoculadas em meio de Clark e Dufty (1978). O meio de transporte e enriquecimento de Clark e Dufty (1978) ou meio de Lander ou Weybridge são produzidos pelo Laboratório de Bacteriologia da FAVET-UFRGS.

Meio de Clark e Dufty

O meio de Clark e Dufty é composto, basicamente de soro bovino (estéril) e antimicrobianos (300 g / mL de 5-fluoruracila, 100 UI / mL de sulfato de polimixina B, 50

g / mL de verde brilhante, 3 g / mL de ácido nalidíxico e 100 g / mL de ciclohexamida).

Amostras de materiais clínicos são diluídas em solução fisiológica; sedimentar por 15-20 minutos. Após esse tempo, um mL do sobrenadante é retirado e, inoculado no meio de transporte. A amostra é misturada e os frascos transportados ao laboratório na

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temperatura de 18-37ºC (não refrigerar). No Laboratório, os frascos são incubados a 37ºC por quatro dias. Então 2-3 mL de salina fisiológica é misturada vigorosamente a cada amostra e todo o fluido removido para um tubo estéril. O fluido deve ser examinado para a presença de C. fetus, através do exame direto ou imunofluorescência. Para o isolamento em cultivo, o fluido deve ser filtrado em membrana do tipo Millipore ( 0,65) e / ou inoculado, diretamente em placas de agar sangue (Mueller-Hinton, Brucella agar, Albimi agar ou Tryptose agar).

Recentemente, nosso laboratório vem utilizando meios mais complexos, no isolamento e identificação de C. fetus. O meio de Weybridge é um bom exemplo. O meio foi desenvolvido por Lander, em 1990.

Meio de Lander ou Weybridge

O meio de Lander ou Weybridge é composto de:

Caldo Mueller-Hinton Carvão bacteriológico (5 g);

Sangue hemolisado de equino (70 mL);

Antimicrobianos: Vancomicina (40g / mL);

Trimetoprima (20g / mL), 5-fluoruracila (500g / mL), Ciclohexamida (100g / mL), Polimixina B 10 UI / mL).

As amostras inoculadas, nesses meios (seletivos), devem ser colocadas em estufa bacteriológica à 30º C, permanecendo lá, durante 5-10 dias. Após esse período, as amostras, serão diluídas em salina; centrifugadas a 1.000 X G, durante 10-15 minutos; filtradas em membrana do tipo Millipore ( 0,65m); semeadas em Mueller-Hinton agar, com adição de 10% de sangue ovino. As placas são incubadas a 30º C, em ambiente de microaerofilia (10% de CO2; 5% de O2 e 85% de N2), durante sete dias.

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2013 Exame direto

O exame direto (conteúdo do abomaso, muco e fluidos amnióticos) pode ser realizado por três caminhos: o exame microscópico direto, imunofluorescência e / ou cultivo. Estes procedimentos devem ser realizados, concomitantemente, auxiliando o laboratorista ou pesquisador, no diagnóstico presuntivo da doença. Uma gota do fluido recém-colhido é colocada, entre lâmina e lamínula, e, examinada (aumento de 400 X) em microscópio de contraste de fase ou campo escuro.

A presença de bactérias com grande motilidade e, em especial, com movimento de saca-rolhas é indicativa do gênero Campylobacter.

Identificação bacteriana

As colônias com 1-3 mm de diâmetro; lisas, redondas, inteiras, elevadas, translúcidas, butirosas e não hemolíticas são suspeitas, devendo ser submetidas às provas tintoriais, através da coloração de Gram.

Motilidade

A motilidade pode ser checada, através da coloração de Bryner e Frank (1955) conforme composição abaixo.

Coloração de Bryner e Frank:

Cristal Violeta 0,1 g; Azul de Metileno 0,5 g;

Oxalato de Amônio 0,2 g; Álcool Etílico 95% 5 mL;

H2O Destilada 120 mL.

Procedimento:

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Dissolver os corantes no álcool 95% e na água destilada e posteriormente, adicionar 187 mL de solução salina estéril.

Uso: Colocar uma gota do corante a colônia de campilo misturar bem e olhar em entre lâmina/lamínula em imersão (campo escuro ou contraste de fase).

As bactérias móveis, Gram negativas, com forma de "S" ou de vírgula; com 0,3 m de diâmetro e 2-10 m de comprimento devem ser identificados, conforme as características culturais, bioquímicas e imunológicas, contidas no Manual Bergey, 1984;

Carter & Cole, 1990; On et al.,1998). Entretanto, a identificação mais precisa e completa do agente envolve análises fenotípicas (bioquímico, tolerância, etc.) e as análises genotípicas (hibridização DNA-DNA, amplificação pelo PCR, sequenciamento e análise do 16S rDNA).

Prova da Hidrólise do Hipurato

Objetivo: A utilização da enzima hipurato hidrolase de bactérias ao substrato hipurato de sódio resultando em ácido benzoico e glicina. Sua utilidade é importante para os gêneros Campylobacter spp, Actinobacillus spp e Streptococcus ssp

Composição:

Hipurato de sódio 10 g Caldo Simples 1 L

Uso:Inocular o microrganismo em caldo hipurato e incubar 4 dias. É prudente inocular um tubo controle. 1 mL do tubo controle é inoculada quantidades crescentes (o,2;0,3;0,4 e 0,5) mL de cloreto férrico,agitando atá que apareça coloração clara ao meio que é a quantidade minima que deve ser adicionada ao caldo inoculado. A hidrólise do hipurato para benzoato é obtida pela adição de cloreto ferrico

Prova da Hidrólise do acetato de Indoxil (Mills & Gherna, 1987)

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2013 Objetivo:

Adicionar 50 µL de uma solução de 10% de acetato de indoxil em acetona a um disco de papel absorvente com 6 mm de diâmetro e deixe secar ao ar

Uso: Aplicar colônias de Campylobacter diretamente ao(s) disco (s) e logo em seguida coloque gota de água destilada estéril sobre o disco.

O aparecimento de cor verde-azulada em 5-10 minutos indica um resultado positivo.

Nota: Os discos secos são estáveis por pelo menos 12 meses se estocados a 4 °C em garrafa com vidro escuro com silica gel.

Controle positivo: - Campylobacter jejuni Controle negativo: - Campylobacter fetus

Identificação bacteriana e Motilidade

As colônias com 1-3 mm de diâmetro; lisas, redondas, inteiras, elevadas, translúcidas, butirosas e não hemolíticas são suspeitas, devendo ser submetidas às provas tintoriais, através da coloração de Gram.

A motilidade pode ser checada, através da coloração de Bryner e Frank (1955) conforme composição abaixo.

Coloração de Bryner e Frank:

Cristal Violeta 0,1 g; Azul de Metileno 0,5 g; Oxalato de Amônio 0,2 g; Álcool Etílico 95%

5 mL; H₂O Destilada 120 mL.

Dissolver os corantes no álcool 95% e na água destilada e posteriormente, adicionar 187 mL de solução salina estéril. Uso Colocar uma gota do corante a colônia de campilo misturar bem e olhar em entre lâmina/lamínula em imersão (campo escuro ou contraste de fase).

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As bactérias móveis, Gram negativas, com forma de "S" ou de vírgula; com 0,3 m de diâmetro e 2-10 m de comprimento devem ser identificados, conforme as características culturais, bioquímicas e imunológicas, contidas no Manual Bergey, 1984;

Carter & Cole, 1990; On et al.,1998). Entretanto, a identificação mais precisa e completa do agente envolve análises fenotípicas (bioquímico, tolerância, etc.) e as análises genotípicas (hibridização DNA-DNA, amplificação pelo PCR, sequenciamento e análise do 16S rDNA).

CONTROLE E PREVENÇÃO

Inúmeras medidas que podem ser aplicadas no controle da CGB. Estas medidas podem incluir:

1) O tratamento dos touros infectados;

2) O tratamento do sêmen contaminado;

3) Tratamento das vacas com antimicrobianos;

4) A separação de rebanhos infectados e não infectados;

5) O uso da IA;

6) O uso de touros livres da infecção e 7) Imunização com bacterina.

A maioria dessas medidas, exceto a vacinação, não são práticas, são caras e não podem ser aplicadas às populações de bovinos de quase todo mundo e, especialmente na nossa região ou mesmo no nosso país.

A vacinação de bovinos é o método mais prático e rápido, no controle da CGB. O controle da CGB, no passado, foi direcionado para a produção de imunidade através da inoculação de C. fetus vivos ou bacterinas, as quais não obtiveram sucesso, ou ele foi pequeno.

A vacinação de fêmeas com bacterina teve início na década de 50, com o trabalho pioneiro, de Amell & Stockton, em 1956, e, citado, por Leite (1977). Hoerlein & Kramer,