Cleiton Nicareta
ÓLEOS ESSENCIAIS DE SOLANUM E A INTERAÇÃO COM MORCEGOS FRUGÍVOROS
Orientadora:
Profa. Dra. BEATRIZHELENAL.N.SALESMAIA
CURITIBA ABRIL/ 2006
Dissertação apresentada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Química.
Área de concentração: Química Orgânica.
Setor de Ciências Exatas, Departamento de Química, Universidade Federal do Paraná.
A luta de um cidadão no caminho da multidão, representa pouco para uma classe sem união. Uma união é uma multidão que faz destoar classes diminuindo lutas em vão.
AGRADECIMENTOS
A Deus, pela vida, força e inspiração.
À minha mãe Esther que tanto rezou para que eu chagasse até aqui.
Ao meu pai Adelino que lutou para proporcionar meu estudo mesmo quando havia adversidades.
A minha irmã Sheila que me apoiou na minha estadia em Curitiba.
A minha irmã Lílian que sua alegria sempre me deu força nesta caminhada e ao seu marido Eloizo, por ter doado o aparelho de Aeração utilizado na trabalho.
A minha irmã Samara e seu marido Antenógenes que sempre me demonstraram carinho quando os visitava.
Ao meu irmão Jean que me ajudou nas idas ao Rio de Janeiro e nas voltas para casa proporcionou abrigo.
A minha esposa Leandra que sempre me deu uma palavra de força mesmo quando pensei em parar e me consolou nos momentos difíceis, nem que fosse pelo telefone.
Às minhas filhas Elisa e Gabi pela doçura de suas vidas que muito me alegraram, mesmo quanto tinha que vê-las longe da janela do ônibus.
Ao meu Sogro Seu Luiz e minha Sogra dona Tere, pelo auxílio à minha família quando não podia estar presente.
À Ana e Marta pela retaguarda nos negócios da família, cuidando sempre de minhas filhas.
Às minhas cunhadas Leli e Lunara pela companhia quando estava longe da família.
A Profa. Dra. Beatriz Helena L.N. Sales Maia, pela orientação desde 2003, que confiou na minha pessoa, pelos conselhos, dicas e transmissão de conhecimentos proporcionados.
Aos Profs. Drs. Brás Heleno Oliveira (UFPR) e a Profa. Dra. Raquel M.
Braga (UNICAMP) por terem aceitado participar da banca avaliadora deste trabalho.
A Dra. Sandra B. Mikich – Embrapa Florestas, pelo fornecimento dos frutos Solanum aqui estudados.
Ao Gledson V. Bianconi pelo auxílio na fase de campo, em Fênix – PR.
À Sirlei pela ajuda na ida à campo me orientando na maneira correta da coleta dos frutos e a aeração.
Ao Prof. Dr. Trigo por ceder a aparelhagem na UNICAMP para análise dos óleos essenciais.
Ao funcionário Marcelino da Secretaria que muito colaborou com suas explicações e opiniões.
Aos colegas e amigos do LAPNEQ: Geibe, Emmanoel, Keller, Denise, Mayara, Andréia, Patrícia, Edison, Érica.
Aos amigos da diretoria dv.
À Diretoria e Coordenação da Unisep pela paciência e compreensão.
A todos os professores do departamento de química, que colaboraram para a minha formação e aos funcionários.
A Universidade Federal do Paraná.
Muito Obrigado.
DEDICATÓRIA
A minha família: Adelino, Esther, Sheila, Samara, Jean e Lílian, a
minha esposa Leandra e minhas Elisa e Gabriela razões de viver.
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS...iii
DEDICATÓRIA...v
SUMÁRIO...vi
LISTA DE TABELAS...viii
LISTA DE GRÁFICOS...ix
LISTA DE FIGURAS ...x
ABREVIAÇÕES...xii
RESUMO...xiv
ABSTRACT...xv
1. INTRODUÇÃO...01
1.1 O GÊNERO Solanum...04
1.2 METABÓLITOS SECUNDÁRIOS...06
1.3 ÓLEOS ESSENCIAIS...07
1.3.1 Composição dos óleos essenciais...08
1.4 BIOSSÍNTESE DE FENILPROPANÓIDES...08
1.5 BIOSSÍNTESE DE TERPENOS...10
1.5.1 Biossíntese de Mono e Sesquiterpenos...12
1.5.2 Classes mais comuns de Mono e Sesquiterpenos...13
1.6 USOS DOS ÓLEOS ESSENCIAIS...15
1.7 ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA GASOSA E POR CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS...16
1.7.1 Colunas Cromatográficas...17
1.8 ANÁLISE DE COMPONENTES PRINCIPAIS (PCA)...18
2. OBJETIVO GERAL...20
2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS...20
3. PARTE EXPERIMENTAL...21
3.1 COLETA DOS FRUTOS...21
3.2 ISOLAMENTO DOS ÓLEOS ESSENCIAIS...21
3.3 ANÁLISE DOS ÓLEOS ESSENCIAIS...23
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO...25
4.1. ESTUDO DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS ENVOLVIDOS NA
INTERAÇÃO MORCEGO-PLANTA...25
4.1.1 Hidrodestilação...26
4.1.1.1 Hidrodestilação - Solanum argenteum - FM x FI ...27
4.1.1.2 Hidrodestilação - Solanum australe - FM x FI...29
4.1.1.3 Hidrodestilação - Solanum caavurana - FM x FI...30
4.1.1.4 Hidrodestilação - Comparação dos óleos essenciais dos frutos das espécies estudadas...32
4.2 ANÁLISE EM PCA - HIDRODESTILAÇÃO...33
4.3 INFLUÊNCIA DA SAZONALIDADE NA COLETA DOS FRUTOS...38
4.3.1 Sazonalidade de Solanum australe...39
4.3.2 Sazonalidade de Solanum argenteum...40
4.3.3 Sazonalidade de Solanum caavurana...42
4.4. AERAÇÃO...44
4.4.1 Aeração Solanum caavurana - FI...44
4.4.2 Aeração - Solanum australe - FM x FI...47
4.4.3 Análise PCA - Aerações...47
4.5 AERAÇÃO X HIDRODESTILAÇÃO...50
5. CONSIDERAÇÕES FINAIS...52
6. ANEXO...53
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...71
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Classificação dos terpenos de acordo com o número de
carbono...11
Tabela 2: Plantas estudadas para o isolamento de óleo essencial por Hidrodestilação...22
Tabela 3: Plantas com isolamento de óleo essencial por Aeração...23
TABELA 4: Constituintes Químicos dos óleos essenciais dos FM e FI de S. argenteum ...53
Tabela 5: Constituintes Químicos dos óleos essenciais dos FM e FI de S. australe... 55
Tabela 6: Constituintes Químicos dos óleos essenciais dos FM e FI de S. caavurana... 57
Tabela 7: Principais constituintes químicos dos óleos essenciais dos FM e FI de S. argentum, S. australe e S. caavurana... 59
Tabela 8: Solanum australe - Sazonalidade... 62
Tabela 9: Sazonalidade - S. argenteum...64
Tabela 10: Sazonalidade - S. caavurana...66
Tabela 11: Principais constituintes químicos Aeração dos FM e FI de S. australe e FI de S. caavurana...69
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1: Constituintes Químicos dos óleos essenciais obtidos através de hidrodestilação dos FM e FI de S. argenteum...28 Gráfico 2: Constituintes Químicos dos óleos essenciais obtidos através de Hidrodestilação dos FI e FM .de Solanum australe...30 Gráfico 3: Constituintes Químicos do óleo essencial dos FM e FI de S.
caavurana obtidos através de hidrodestilação...32 Gráfico 4: Hidrodestilação: Amostras de Solanum X Classes de terpeno...33 Gráfico 5: Constituintes Químicos de S. australe coletado em janeiro e julho...39 Gráfico 6: Constituintes químicos de Solanum argenteum coletado em outubro e julho...41 Gráfico 7: Constituintes Químicos de S. caavurana coletado janeiro e julho....43 Gráfico 8: Constituintes Químicos obtidos, por aeração dos FI de S.
caavurana,...46 Gráfico 9: Constituintes Químicos dos óleos essenciais dos FM e FI de S.
australe...47 Gráfico 10: Comparação dos Constituintes químicos dos óleos essenciais obtidos através de Aeração e hidrodestilação...50
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Mapa com a localização do PEVR em Fênix –PR...02
Figura 2: Morcego Sturnira lilium...03
Figura 3: 3A. Solanum caavurana. Folhas e FI. Figura 3 B. Solanum australe, FM (vermelhos) e FI...05
Figura 4: Ciclo biossintético dos metabólitos secundários...07
Figura 5: Ácido Chiquímico...08
Figura 6: Biossíntese do ácido cinâmico...09
Figura 7: Exemplos de Fenilpropanóides...10
Figura 8: Formação dos Terpenos...11
Figura 9: Exemplos de Monoterpenos...12
Figura 10: Exemplos de Sesquiterpenos...12
Figura 11: Biossíntese de terpenos - Formação do Pirofosfato de geranila...13
Figura 12: Monoterpenos: Núcleos básicos da esquerda para direita tipo: p- mentano, pinano, canfeno, isocanfeno, fencheno, carano e tujano...14
Figura 13: Tipos de Sesquiterpenos...14
Figura 14: Cromatograma de uma amostra de Maleleuca alternifólia. Determinado com uma coluna comercial quiral, J&W CiclodexB, 30mX0,25 mm I.D., 0,25ìm filme da fase estacionária...18
Figura 15: Aparelho Clevenger modificado...21
Figura 16: Equipamento utilizado para a Aeração...23
Figura 17: Cromatograma do óleo essencial dos FM de S. caavurana ...26
Figura 18: Cromatograma do óleo essencial dos FI de S. argenteum obtido por hidrodestilação ...27
Figura 19. Cromatograma do óleo essencial dos FM de S. argenteum obtido por hidrodestilação ...27
Figura 20: Cromatograma do óleo essencial dos FI de S. australe obtido através de hidrodestilação...29
Figura 21: Cromatograma do óleo essencial dos FM de S. australe obtido através de Hidrodestilação ...29
Figura 22: Cromatograma do óleo essencial dos FI de S. caavurana obtido através de Hidrodestilação...31
Figura 23: Cromatograma do óleo essencial dos FM de S. caavurana obtido
através de Hidrodestilação ...31
Figura 24: Gráfico de Scores e Loadings, respectivamente, de S. argenteum 34 Figura 25: Gráficos PCA, de Scores e Loadings, respectivamente, para S. australe...35
Figura 26: Gráfico PCA, de Scores e Loadings, respectivamente, para S. caavurana FM e FI...35
Figura 27: Gráfico de Scores em três dimensões de seis hidrodestilações do Gênero Solanum...37
Figura 28: Gráfico de Loadings - compostos Solanum - hidrodestilação...38
Figura 29: Gráfico PCA. Scores e Loadings, óleos essenciais dos FM de S. australe, através de hidrodestilações em função da sazonalidade...40
Figura 30: Gráfico PCA. Scores e Loadings, óleos essenciais dos FM de S. argenteum, através de hidrodestilações em função da sazonalidade...42
Figura 31: Gráfico PCA. Scores e Loadings, óleos essenciais dos FM de S. caavurana, através de hidrodestilações em função da sazonalidade...44
Figura 32 Cromatograma do óleo essencial dos FI de Solanum caavurana obtido através de aeraçã, solvente hexano...44
Figura 33: Ampliação do Cromatograma da figura 32...45
Figura 34: Cromatograma do óleo essencial dos FI de Solanum caavurana obtido através de aeração , solvente éter etílico...45
Figura 35: Ampliação do Cromatograma da fig. 34...45
Figura 36: Gráfico de Scores - Aerações...48
Figura 37: Gráfico de Loadings das Aerações...49
Figura 38: Gráfico de Scores e Loadings das Aerações de S. australe...50
ABREVIAÇÕES
C. = Gênero Carollia
CG = Cromatografia Gasosa
CG/EM = Cromatografia Gasosa Acoplada à Espectrometria de Massas DMAPP = Pirofosfato de dimetilalila
HP-5-MS = Coluna capilar 5% fenil - 95% dimetilpolisiloxana F.= Gênero Ficus
FI = Frutos imaturos FM = Frutos maduros
FPP = Pirofosfato de farnesila Fruto = Frutose
g = grama
GPP = Pirofosfato de geranila
GGPP = Pirofosfato de Geranilgeranila IK = Índice de Kovatz
IPP = Pirofosfato de isopentenila IRC = Índice de Retenção Calculado IRL = Índice de Retenção Literatura MEP = Metileritritol
Min = minuto mL = Mililitro MVA = Mevalonato OPP = Pirofosfato
OV-1 = Coluna capilar fase apolar polimetilsiloxana P. =Gênero Piper.
PEP = fosfoenolpiruvato
PEVR = Parque Estadual Vila Rica do Espírito Santo
PCA = Método estatístico de Análises de Componentes Principais PC1 = Primeira Componente Principal
PC2 = Segunda Componente Principal PC3 = Terceira Componente Principal PC’s= Componentes Principais
PR = Paraná
S. = Gênero Solanum µL = Microlitro
RESUMO
A fragmentação dos habitats florestais é uma das maiores ameaças à biodiversidade e o Estado do Paraná, não está livre deste processo. O Parque Estadual de Vila Rica do Espírito Santo (PEVR), Fênix - PR, possui uma cobertura florestal original, hoje restrita a pequenos fragmentos que abrigam amostras da biodiversidade regional. A importância dos morcegos na dispersão de sementes é tão grande que eles podem influenciar a estrutura da vegetação através das espécies de frutos que consomem. Os morcegos destacam-se devido ao seu comportamento de defecar em vôo e deslocar-se em áreas mais abertas, criando uma chuva de sementes diferenciada o que possibilita a regeneração de clareiras naturais e de áreas desmatadas. Já se têm relatos que morcegos da espécie Sturnira lilium tem preferência alimentar por frutos maduros de Solanum, mas nenhuma avaliação dos óleos essenciais destes frutos é encontrada na literatura. Neste trabalho foi realizado o isolamento dos óleos essenciais dos frutos maduros e imaturos de Solanum argenteum, S.
australe e S. caavurana, através de hidrodestilação e aeração, colaborando no entendimento da preferência alimentar do morcego S. lilium pelos frutos maduros das espécies. Observou-se diferenças entre os óleos dos FM e FI de uma mesma espécie, mas quando comparou-se os óleos de todas as espécies, não foi possível observar semelhanças entre os FM. Mesmo considerando apenas os compostos exclusivos destes frutos, não existe um componente que seja comum às três espécies estudadas. Quando comparou-se os óleos dos FM e FI obtidos por hidrodestilação das três espécies estudadas através do método estatístico PCA, observou-se similaridade entre os frutos de diferente maturidade de uma mesma espécie, não destacando nenhum composto que agrupasse os FM. Os óleos essenciais obtidos através da aeração apresentaram diferenças entre os FM e FI de uma mesma espécie. Esta técnica demonstrou ser mais eficaz para o isolamento de monoterpenos hidrocarbonetos enquanto que a hidrodestilação para monoterpenos oxigenados. Testes de campo de atratividade dos morcegos utilizando estes óleos essenciais é fundamental para o entendimento da interação entre frutos maduros e morcegos frugívoros.
ABSTRACT
The fragmentation of the forest habitats is one of the greatest threats to biodiversity, and the state of Parana is not free from this process. The State Park of Vila Rica do Espírito Santo (PEVR), in the city of Fênix – PR, has an original forest covering, today restricted to little fragments that shelter samples of the biodiversity of the region. The importance of bats in the dispersion of seeds is so big that they can influence the structure of the vegetation through the species of fruits that they consume. Bats are distinguishing in this process due to their behavior of defecating during its flights and moving around in more opened areas, creating a differentiated rain of seeds, which is what enables the regeneration of natural clearing in the woods and of deforested areas. There has already been reports that bats of the Sturnira lilium have the preference on feeding ripe fruits of Solanum, but no evaluation on the essential oils of these fruits is found within the literature. In this work it was done the isolation of the essential oils of this ripe and unripe fruits of Solanum argenteum, S. australe and S. caavurana, through hydrodistillation and aeration, which was paramount for understanding the feeding preference of the bat S. lilium for the ripe fruits of the species. It was observed differences between the oils of the FM and FI of the same species, but when the oils of all species were compared, it was not possible to observe similarities among the FM. Even considering only the exclusive compounds of these fruits, there isn’t one common component to the three studied species. When it was compared the hydrodistillation-obtained FM and FI oils of the three species through the statistic method PCA, similarities were observed among fruits of different ripeness of the same species, not being detached any compound that would group the FM. The essential oils obtained through aeration have presented differences between the FM and FI of the same species. This technique has demonstrated itself as being more efficient for the isolation of monoterpene hydrocarbons while hydrodistillation was more efficient for oxygenated monoterpenes. Field tests of attracting bats using these essential oils is fundamental for the understanding of the interaction between ripe fruits and frugivorous bats.
1 INTRODUÇÃO
A destruição dos ecossistemas florestais é um dos principais problemas ambientais do mundo moderno. Evidências apontam que nas áreas que perderam sua cobertura florestal, mais que estão próximas a fragmentos de florestas ou reservas maiores, podem ter seu banco de sementes reabastecido pelas sementes provenientes de refúgios vizinhos, pela denominada chuva de sementes. Elas podem ser trazidas pelo vento, por animais ou outras formas de dispersão. O método mais barato de restauração florestal é a regeneração natural destas áreas, mas também o mais lento. Artifícios podem ser utilizados para acelerar a regeneração natural, por exemplo, através de poleiros para aves que trazem as sementes em seus bicos ou no trato digestivo (FERRETI, 2002).
O Parque Estadual de Vila Rica do Espírito Santo (PEVR) (Figura 1), Fênix – PR, correspondeu à área de atuação da pesquisa, onde foram coletadas amostras de plantas do gênero Solanum, bem como a referência com a espécie de morcego Sturnira lilium (Figura 2) e as evidências de sua dispersão de sementes. Não só os morcegos, mas as aves de pequeno porte possuem um papel importante na recomposição de ambientes através da dispersão de plantas pioneiras (FLEMING, 1988). Porém, os morcegos destacam-se devido ao seu comportamento de defecar em vôo e deslocar-se em áreas mais abertas, criando uma chuva de sementes diferenciadas (THOMAS et al., 1988) e possibilitando a regeneração de clareiras naturais e de áreas desmatadas (MULLER et al., 1992, EMMONS 1997, GORCHOW et al., 1993).
Figura 1: Mapa com a localização do PEVR em Fênix – PR
Das 80 áreas indicadas pelo Ministério do Meio Ambiente (2000) como prioritárias para ações de conservação na Mata Atlântica, 14 tiveram propostas para o estabelecimento de corredores ecológicos e manejo de áreas entre as unidades de conservação, entre elas está a área de estudo (Figura 1) aqui proposta (Parque Estadual de Vila Rica do Espírito Santo / PEVR, Fênix – PR).
A escolha desta região de estudo, porém, não está relacionada apenas à situação da sua cobertura florestal, mas também à ampla base de dados disponível para a mesma, obtida por pesquisas ali desenvolvidas desde 1990 (MIKICH, 2001).
Figura 2: Morcego Sturnira lilium
Algumas espécies de morcegos frugívoros, como Sturnira lillium (figura 2), exercem um papel importante na dispersão de plantas pioneiras dos gêneros Cecropia, Piper, Solanum e Ficus (CHARLES-DOMINIQUE, 1986, FLEMING, 1986, MIKICH, 2002). Porém, segundo Howe (1984), o papel dos morcegos na recomposição de ecossistemas tropicais tem recebido pouca atenção, apesar de existirem claras evidências de sua importância como dispersores de sementes (FLEMING & HEITHAUS 1981, KALKO 1997), como por exemplo, na regeneração de trechos da Floresta Amazônica (GORCHOW et al., 1993) e na recomposição da vegetação da ilha Krakatoa – Indonésia, destruída por uma erupção vulcânica (WHITTAKER et al., 1994).
Diante destes relatos, nossa proposta de trabalho é dentro da área de ecologia química com o objetivo de colaborar no entendimento da interação química existente entre os morcegos e os frutos consumidos por eles, com futura aplicação em recuperação de áreas degradadas.
A área de ecologia química estuda as interações animal-animal, planta- planta e animal-planta. Qualquer substância química que liberada por um
determinado organismo provoque uma mudança fisiológica e/ou comportamental em um outro organismo é denominada de semioquímico.
Semioquímicos são divididos em cairomônios, alomônios, apneumônios e sinomônios, de acordo com o organismo que é benefiado pela emissão do sinal. Este trabalho envolve os sinomônios, sinais químicos presentes na planta e envolvidos na comunicação planta-morcego frugívoro, que beneficia ambas as espécies envolvidas (FRANCKE & SCHULTZ, 1999).
De acordo com estudos anteriores (FLEMING 1985, BONACCORSO 1979, GILBERT 1980, PALMEIRIM et al., 1989, HANDLEY et al., 1991, MARINHO-FILHO, 1991, IUDICA & BONACCORSO 1997) o morcego Artibeus spp. apresenta preferência por frutos de Ficus spp., o morcego Carollia perspicillata por aqueles de Piper spp. O morcego Sturnira lilium por frutos de Solanum ssp. Esta preferência foi confirmada em um estudo conduzido no PEVR (MIKICH 2001, 2002).
A disponibilidade de frutos do gênero Solanum em uma determinada região é uma característica importante para o estabelecimento de uma relação estreita com seus consumidores. Este gênero possui várias espécies simpátricas que frutificam de forma seqüencial, cobrindo todos os meses do ano (FLEMING 1985, MARINHO-FILHO 1991).
Os morcegos frugívoros possuem o olfato bastante desenvolvido e alguns estudos (Palmeirim & Etheridge 1985, Rieger & Jakob 1988,) sugerem que este sentido seja fundamental para a localização dos frutos e a avaliação do seu grau de maturação. Três testes-piloto realizados pela nossa equipe no PEVR até o momento mostraram que existe uma resposta específica positiva na captura do morcego Carollia perspicillata quando as redes de neblina são tratadas com os óleos essenciais de frutos maduros de Piper gaudichaudianum (Mikich et al. 2003).
1.1 O GÊNERO Solanum
A família Solanaceae é representada por diversos tipos de vegetais, predominando a forma de arbustos. Uma comunidade local pode conter até 50
espécies, a maioria do gênero Solanum. São plantas que dependem de seus dispersores para a sua presença contínua nos microhabitats sucessionais aos quais estão restritas (GILBERT 1980). No PEVR podem ser encontradas aproximadamente 16 espécies, sendo as de maior ocorrência: S. argenteum, S.
caavurana e S. australe. A maioria dos frutos são verdes, mas os frutos maduros são vermelhos, laranja ou amarelos (figura 3).
Figura 3 A Figura 3 B Figura 3: 3A. Solanum caavurana. Folhas e frutos imaturos. Figura 3B. Solanum australe, frutos madudos (vermelhos) e imaturos.
O gênero Solanum possui frutos tipicamente zoocóricos, frutos disciminados por animais na polinização e com porção comestível macia quando maduros, frutos de tamanho variado repletos de pequenas sementes que passam facilmente intactas pelo tubo digestivo dos seus consumidores, coloração geralmente verde e exposição externa da folhagem.
O gênero Solanum é largamente estudado devido suas raízes (batatas) serem comestíveis. Vários estudos químicos são relacionados ao armazenamento do material vegetal, modificações genéticas, influência do solo e do clima. São encontrados neste gênero, além dos glicoalcalóides (CIPOLLINI, 1997), alcalóides esteroidais (OSMAN et. Al., 1991), alcalóides do tipo pirrol (SAYED et. Al. 2000), flavonóides (SCHILLING, 1984; SILVA, et. al., 2003) e esteróides (SAEZ et. al., 1998). É relatado em S. aethiopicum o
isolamento do primeiro glicosídeo esteroidal de ocorrência natural (TAGAWA et. al., 2003). Os esteróides e glicoalcalóides possuem respectivamente atividade antimalárica (SAEZ et. al., 1998) e moluscocida, antimicrobiana (WANYONYI et. al. 2003). Trabalhos já descritos na área de ecologia química tratam do seqüestro de alcalóides pirrolizidínicos em folhas de Solanum pelas borboletas (TRIGO et. Al., 1996). Não se têm relatos na literatura de estudos de óleos essenciais neste gênero.
1.2 METABÓLITOS SECUNDÁRIOS
Metabólitos secundários já foram considerados como produtos de excreção do vegetal e, algumas vezes com propriedades biológicas interessantes. Atualmente sabe-se que estão envolvidos nos mecanismos que permitem a adequação do produtor a seu meio. Outra característica dos vegetais em relação ao metabolismo secundário é a elevada capacidade biossintética, tanto em relação ao número de substâncias produzidas como a sua diversidade numa mesma espécie. Muitos despertaram interesse da indústria tanto farmacêutica como alimentar e agronômica, além da indústria de perfumarias. Do ponto de vista farmacêutico, o maior interesse vêm do grande número de substâncias farmacologicamente importantes.
A origem de todos os metabólitos secundários pode ser resumida a partir do metabolismo da glicose formada através da fotossíntese, (figura 4) via dois intermediários principais, o ácido chiquímico e o acetato. O ácido chiquímico origina os aminoácidos aromáticos, precursores da maioria dos metabólitos secundários aromáticos (SIMÕES, 2003, DEWICK, 2002) e o acetato é precursor de alguns alcalóides, isoprenóides e ácidos graxos.
Alguns metabólitos secundários derivam não apenas de um desses intermediários, mas são resultantes da combinação de uma unidade de ácido chiquímico e uma ou mais unidades de acetato ou derivados deste, como é o caso das antraquinonas, dos flavonóides e dos taninos condensados (SIMÕES 2003).
Glicose
Polissacarídeos HeterosídeosÁcido Chiquímico Acetil CoA
Triptofano Ácido Gálico Fenilalanina/
tirosina Alcalóides indólicos e quinolínicos
Taninos hidrolisáveis
Protoalcalóides alcalóides
isoquinolínicos e benzilisoquinolínicos
Ácido cinâmico Fenilpropanóides
Lignanas e Ligninas Cumarinas
Antraquinonas flavonóides taninos condensados
Ciclo do ácido cítrico
Ornitina lisina
Alcalóides pirrolidínicos,
tropânicos, pirrolizidínicos,
piperidínicos e quinozidínicos
Via mevalonato
Isoprenóides Terpenóides
e esteróis
Condensação
Ácidos graxos acetogeninas
Figura 4: Ciclo biossintético dos metabólitos secundários. (Simões, 2003)
1.3 ÓLEOS ESSENCIAIS
Óleos essenciais são misturas de substâncias orgânicas voláteis, de consistência semelhante ao óleo, definíveis por um conjunto de propriedades, entre as quais se destacam: cheiro, sabor, elevada concentração. Estes elementos voláteis estão contidos em vários órgãos das plantas e assim são denominados devido à composição lipofílica que apresentam, quimicamente diferentes da composição glicerídica dos verdadeiros óleos e gorduras. Estão associados a várias funções necessárias à sobrevivência do vegetal em seu ecossistema, exercendo papel fundamental na defesa contra microrganismos e predadores, e também na atração de insetos e outros agentes fecundadores.
Na prática médica popular, os óleos essenciais possuem uma larga tradição de uso.
1.3.1 Composição dos óleos essenciais
Quimicamente, em sua maioria, são constituídos de substâncias terpênicas e eventualmente de fenilpropanóides, acrescidos de moléculas menores, como álcoois, ésteres, aldeídos e cetonas de cadeia curta. O perfil terpênico apresenta normalmente substâncias constituídas de moléculas de dez e de quinze átomos de carbono (mono e sesquiterpenos), mas, dependendo do método de extração e da composição da planta, terpenos menos voláteis podem aparecer na composição do óleo essencial.
1.4 BIOSSÍNTESE DE FENILPROPANÓIDES
Os fenilpropanóides são formados a partir do ácido chiquímico (figura 5), o qual é formado pela condensação aldólica de uma molécula de fosfoenolpiruvato (PEP) com uma molécula de eritrose 4-fosfato.
Figura 5: Ácido Chiquímico
Após a formação do ácido chiquímico, acontece uma condensação com mais uma molécula de fosfoenolpiruvato (PEP), dando origem ao corismato.
Um rearranjo sigmatrópico ocorre, formando o prefenato. Etapas posteriores de descarboxilação, aminação e posterior desaminação vão formar o ácido cinâmico (Figura 6).
O H
O H C O
2H
O
H
C o r is m a t o c h iqu i m a t o + P E P
P r e fe n a to a m i n aç ã o
T iro s ina , fen ila la n ina D e sa m i n .
Á c i d o c in âm ic o
*
Figura 6: Biossíntese do ácido cinâmico. (Costa, 2003).
Muitos fenilpropanóides são derivados do ácido cinâmico (DEWICK, 2001), através de reações de hidroxilação e metilação (figura 7), (COSTA, 2003).
Figura 7: Exemplos de Fenilpropanóides (Costa, 2003)
1.5 BIOSSÍNTESE DE TERPENOS
Os terpenóides apresentam grande variabilidade estrutural (figura 8) e são derivados de unidades de 5 átomos de carbono (tipo isopreno). A biossíntese dos terpenos acontece por dois caminhos diferentes: O caminho do mevalonato (MVA) no citoplasma das células e o caminho do metil eritritol (MEP) nos plastídios das células (DEWICK, 2001). Os precursores formados nestes caminhos são dois isômeros, o pirofosfato de isopentenila (IPP) e
Ácido cinâmico
Ácido p-cumárico Ácido caffeico
Ácido 5-hidroxiferrúlico
Ácido sinápico Ácido ferrúlico
pirofosfato de dimetilalila (DMAPP) que por condensações tipo Claisen e aldólica formam os terpenos.
Figura 8: Formação dos Terpenos (Dewick, 2001, Hampel et all, 2005).
As classes dos terpenos mais estudadas são os monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos e triterpenos. A tabela 1 representa esta classificação.
Tabela 1: Classificação dos terpenos de acordo com o número de carbono
Os compostos terpênicos mais freqüentes nos óleos voláteis são os monoterpenos e os sesquiterpenos.
Caminho MVA (citoplasma)
GPP
FPP GGPP
Monoterpenos
Sesquiterpenos Triterpenos Diterpenos
Tetraterpenos
DMAPP IPP
Caminho do Metileritritol (MEP)
(plastídios)
Sesquiterpenos Triterpenos
Caminho MVA (citoplasma)
GPP
FPP GGPP
Monoterpenos
Sesquiterpenos Triterpenos Diterpenos
Tetraterpenos
DMAPP IPP
Caminho do Metileritritol (MEP)
(plastídios)
Sesquiterpenos Triterpenos
Classes Numero de átomos de carbono
Monoterpenos 10
Sesquiterpenos 15
Diterpenos 20
Sesterterpenos 25
Triterpenos 30
Tetraterpenos 40
Os monoterpenos são formados pela condensação do tipo “cabeça- cauda” de uma unidade de pirofosfato de dimetilalila (DMAPP) com uma unidade de pirofosfato de isopentenila (IPP).
Como exemplo de monoterpenos encontrados em óleos essenciais têm- se o -felandreno no eucalipto, o mentol na menta e o citral na cidreira (Figura 9).
Figura 9: Exemplos de Monoterpenos.
Como exemplo de sesquiterpenos, pode-se citar o (-) -bisaboleno e o (-) –zingibereno (Figura 10)
Figura 10: Exemplos de Sesquiterpenos
.
1.5.1 Biossíntese de Mono e Sesquiterpenos
A biossíntese dos terpenos começa com a formação da ligação carbono- carbono que envolve a ionização do DMAPP (pirofosfato de dimetilalila)
-Phellandreno (eucalipto)
Mentol (Menta)
Citral (Cidreira)
O H OH
-felandreno (eucalipto)
-bisaboleno (-) - zingibereno
transformando-o em cátion alílico que é adicionado sobre a ligação dupla do IPP (pirofosfato de isopentenila). Forma-se um carbocátion terciário que perde um próton e forma uma dupla ligação. Neste caso o composto formado que é precursor de vários monoterpenos é o pirofosfato de geranila (GPP), (figura 11).
Figura 11: biossíntese de terpenos - Formação do Pirofosfato de geranila.
O pirofosfato de geranila (GPP) ao sofrer nova condensação com o pirofosfato de isopentenila (GPP) forma o pirofosfato de farnesila (FPP) que é o precursor dos sesquiterpenos, compostos que apresentam 15 átomos de carbono. Nos óleos essenciais são encontradas quantidades significativas tanto de monoterpenos como sesquiterpenos.
1.5.2 Classes mais comuns de Mono e Sesquiterpenos
Segundo Dewick, 2001, os monoterpenos podem ser agrupados em diversos tipos, de acordo com sua estrutura química. Para os monoterpenos monocíclicos podem ser encontrados os do tipo: p-mentano, pinano, canfeno (Bornano), isocanfeno, fencheno, careno e tujano (figura 12). Destes ciclos básicos vários outros monoterpenos derivados serão encontrados. O estudo de
IPP
–
fragmentação destes compostos na Espectrometria de Massas é uma importante ferramenta na identificação de compostos.
Figura 12: Monoterpenos: Núcleos básicos da esquerda para direita tipo: p- mentano, pinano, canfeno, isocanfeno, fencheno, carano e tujano.
O estudo de sesquiterpenos é muito mais complexo em relação aos monoterpenos, fato este relacionado a maior variabilidade de núcleos básicos (figura 13). Em muitos casos apenas o Índice de retenção (VAN DEN DOOL &
KRATZ, 1964) e comparação de seus espectros de massas mostram-se insuficientes para identificação do composto, sendo necessário outra técnica de identificação (MARRIOTT, 2001).
Figura 13: Tipos de Sesquiterpenos.
1.6 USOS DOS ÓLEOS ESSENCIAIS
O uso dos óleos essenciais como agentes medicinais é conhecido desde a remota antigüidade. Há registros de seis mil anos atrás, entre os egípcios, de práticas religiosas associadas à cura de males, às unções da realeza e à busca de bem estar físico, através dos aromas obtidos de partes específicas de certos vegetais, como resinas, folhas, flores e sementes.
O uso de óleos essenciais como essências na Indústria de Cosméticos é muito grande. Além das propriedades químicas, muitos experimentos são realizados estudando as substâncias de sua composição e os efeitos causadores sobre o sistema olfativo e pulmonar. Testes são principalmente efetuados no Japão, Estados Unidos e Europa. A maior parte da pesquisa realizada com óleos essenciais ingeridos é executada pelas indústrias de alimentos e bebidas e não visam exatamente seus aspectos farmacológicos (BUCKLE, 1993).
Os óleos essenciais são muito utilizados como remédios humanos ou para animais. O óleo essencial das folhas de Psidium guyanensis e Psidium pohlianum (araçazeiros que ocorrem no Nordeste do Brasil) apresentam ações anticonvulsivante, analgésica e antiinflamatória em animais (SANTOS et al., 1996; SANTOS et al., 1998; TEIXEIRA et al., 1994).
Os decoctos de Eugenia jambos (jambo) e de E. uniflora (pitanga) demonstraram atividade antibacteriana (OGUNWANDE et al., 2005). Mais recentemente, testes farmacológicos em animais com o extrato dessa planta confirmaram seu uso folclórico em determinadas regiões como agente anti- hipertensivo (CONSOLINI et al., 1999). O extrato de folha de E. uniflora ainda é recomendado popularmente contra a gota (SCHMEDA-HIRCHMANN et al., 1987) e possui efeito como antioxidante (THEODOLUZ et al., 1998).
Além das funções anteriormente descritas as essências e os extratos de plantas têm sido utilizados para melhorar as propriedades organolépticas dos alimentos.
1.7 ANÁLISE POR CROMATOGRAFIA GASOSA E POR CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA À ESPECTROMETRIA DE MASSAS
A cromatografia gasosa é o método de escolha de separação e quantificação dos componentes dos óleos voláteis e corresponde a um método simples de usar. Conforme o tipo de coluna, obtém-se picos referentes aos tempos de retenção dos constituintes da amostra e, a região onde cada constituinte se encontra no cromatograma é um indicativo da classe de composto terpênico (figura 14, MARRIOTT,2001).
Para identificação dos compostos, compara-se o tempo de retenção relativo da amostra com padrões. Foi introduzido o índice de Kovats (IK) que relaciona o tempo de retenção dos compostos ao tempo de retenção de uma série homóloga de hidrocarbonetos. Os valores encontram-se entre 900 (compostos mais voláteis) e 1900 (menos voláteis). É recomendável usar pelo menos duas colunas de polaridades diferentes. São exemplos de colunas usadas: OV-1 (uma fase apolar de polimetilsiloxana) e Carbowax-20 M (uma fase polar de polietilenoglicol).
Para ter mais segurança na identificação dos picos individuais e controlar a pureza do pico cromatográfico, recomenda-se à análise de um óleo volátil por cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas. Esta técnica hifenada, permite a separação dos compostos e fornece ainda um espectro de massas para cada pico. O espectro de massas geralmente indica a massa molar e o padrão de fragmentação. A massa molar já caracteriza a classe de substância (p.ex m/z 136 para monoterpenos com C10H16). O padrão de fragmentação pode ser comparado com uma biblioteca de espectros de massas, que normalmente está instalada no computador, acoplado ao aparelho. O computador faz propostas quanto à identidade da substância analisada e caberá ao analisador decidir.
1.7.1 Colunas Cromatográficas
A escolha da coluna cromatográfica corresponde a um importante fator da análise, onde se deve levar em consideração a composição da coluna e da amostra. A composição química da fase estacionária interfere na separação e identificação dos compostos de uma amostra (COLLINS, 1997).
A escolha de uma coluna capilar para análise de óleos essenciais deve ocorrer levando-se em conta que estes correspondem a amostras complexas, com uma grande variabilidade de compostos químicos e temperatura de análise elevada. Neste caso uma coluna de fase estacionária de baixa polaridade, como aquela composta por 5% de difenilpolissiloxano e 95% de dimetilpolissiloxano, acaba sendo uma excelente opção. Mas, dependendo dos objetivos da análise, pode-se ainda trabalhar com colunas com fase estacionária quiral, onde os isômeros eluem em tempos de retenção diferentes.
A figura 14 demonstra alguns aspectos desta separação.
Compostos de polaridade mais baixa, como os monoterpenos hidrocarbonetos (figura 14-A), eluem em tempos de retenção menores, já os de polaridade maior (figura 14-B), eluem em tempos de retenção maiores, demonstrando uma maior interação com a fase estacionária.
Interação dos compostos com uma coluna quiral também está relacionada com os estereoisômeros. Devido a uma perfeita interação com os sítios da fase estacionária, o isômero que se liga de maneira mais intensa elue
num tempo de retenção
maior.
Figura 14: Cromatograma de uma amostra de Maleleuca alternifólia.
Determinado com uma coluna comercial quiral, J&W CiclodexB, 30mX0,25 mm I.D., 0,25ìm filme da fase estacionária.
Fonte: Marriott, 2001.
1.8 ANÁLISE DE COMPONENTES PRINCIPAIS (PCA)
A análise de componentes principais (PCA) é um método de análise multivariada utilizado para projetar dados n-dimensionais em um espaço de baixa dimensão, normalmente duas ou três. Isso é feito através do cálculo de
Tempo de retenção (min)
Tempo de retenção (min)
componentes principais obtidas, fazendo-se combinações lineares das variáveis originais.
PCA é um método exploratório porque auxilia na elaboração de hipóteses gerais a partir dos dados coletados, contrastando com estudos direcionados nos quais hipóteses prévias são testadas. É também capaz de separar a informação importante da redundante e aleatória.
Em uma análise de componentes principais, o agrupamento das amostras define a estrutura dos dados através de gráficos de scores e loadings, cujos eixos são componentes principais (PCs) nos quais os dados são projetados.
Os scores fornecem a composição das PCs em relação às amostras, enquanto os loadings fornecem essa mesma composição em relação às variáveis. Como as PCs são ortogonais, é possível examinar as relações entre amostras e variáveis através dos gráficos dos scores e dos loadings. O estudo conjunto de scores e loadings ainda permite estimar a influência de cada variável em cada amostra.
Para a análise de óleos essenciais, devido a grande quantidade de compostos que podem estar presentes, o PCA corresponde a uma ferramenta que pode ser utilizada para se determinar importantes características. Por exemplo, a variabilidade dos teores dos constituintes químicos em função das estações do ano (CAVALEIRO, 2002), de locais geográficos diferentes (KAROUSOU et al., 2005, GRAMBONE-GRUARATINI et al., 2005) e de diferentes partes da planta como flores e folhas (RANDRIANALIJAOANA et al., 2005), podem ser melhores demonstrados utilizando o PCA.
2. OBJETIVO GERAL
Verificar qual a relação entre a composição química dos óleos essenciais dos frutos de Solanum spp. (Solanaceae) e o seu consumo preferencial por Sturnira lilium (Phyllostomidae). Apesar dos morcegos consumirem apenas frutos maduros, a presente proposta avaliará os frutos imaturos como forma de comparação aos frutos maduros colaborando no entendimento da preferência alimentar dos morcegos.
2.1 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Isolamento dos óleos essenciais dos frutos maduros (FM) e imaturos (FI) de 3 espécies de Solanum (S. caavurana, S. australe e S. argenteum) pela técnica de hidrodestilação e headspace (aeração).
Identificação dos constituintes dos óleos essenciais por CG e CG/EM e relacioná-los a preferência alimentar dos morcegos.
3. PARTE EXPERIMENTAL
3.1 COLETA DOS FRUTOS
Os FM e FI do gênero selecionado (Solanum) foram coletados a medida em que estavam disponíveis no ambiente. Para aumentar a disponibilidade dos frutos de Solanum, que fornece poucos FM por dia e são rapidamente removidos por seus consumidores, os frutos de vários indivíduos, praticamente maduros foram ensacados e removidos quando atingiram a maturidade, técnica já empregada por Uieda & Vasconcellos-Neto (1985).
3.2 EXTRAÇÃO DOS ÓLEOS ESSENCIAIS
Os óleos essenciais foram extraídos através de hidrodestilação e aeração, em triplicata.
Hidrodestilação: O isolamento dos óleos essenciais foi realizado através de hidrodestilação com FM e FI inteiros de Solanum (Tabela 2) . Estes frutos coletados em campo foram armazenados em freezer até o início do trabalho em laboratório, quando a extração dos compostos voláteis foi realizada utilizando aparelho de Clevenger modificado (Figura 15).
Figura 15: Aparelho Clevenger modificado
As frutos inteiros foram previamente pesadas (aproximadamente 100 g), colocadas no balão e foi adicionado 1 litro de água. Após o início da destilação, o sistema permaneceu ligado pelo período de quatro horas.
O óleo essencial foi coletado com éter etílico e a água foi extraída três vezes com éter etílico num funil de separação. Os extratos etéreos foram agrupados, secos com sulfato de sódio anidro e armazenados em frasco de 2 mL no freezer até análise por CG e CG/EM.
Tabela 2: Plantas estudadas para o isolamento de óleo essencial por Hidrodestilação
Espécie Data de Coleta Maturidade do Fruto
Solanum argenteum Julho 2003 FI
S. argenteum Julho 2003 FM
S. argenteum Outubro 2003 FM
Solanum australe Julho 2003 FI
S. australe Janeiro 2004 FM
S. australe Julho 2003 FM
Solanum caavurana Julho 2003 FI
S. caavurana Julho 2003 FM
S. caavurana Janeiro 2004 FM
Fonte: Dados da pesquisa.
Aeração: Os frutos de Solanum disponíveis (S. australe FM e FI e S.
caavurana FI, Tabela 3) foram coletados e colocados nas câmaras de aeração (figura 16), com fluxo de ar de 500 mL/min durante 4 horas. Os componentes adsorvidos na resina super Q (80 mesh) foram dessorvidos com hexano e éter etílico e os extratos obtidos foram acondicionados em frascos de 2mL e levados ao freezer até a análise por CG/EM.
O sistema de aeração consistiu na passagem do ar por um filtro de carvão ativado, em seguida pelos frutos e finalmente por uma coluna contendo a resina adsorvente. A vazão do ar era controlada por um rotâmetro, localizado no final da aparelhagem. Na figura 16, representa-se a imagem do sistema de aeração de FI de S. caavurana, onde as três câmaras superiores estão os frutos e a última, abaixo, o branco.
Tabela 3: Plantas com isolamento de óleo essencial por Aeração
Espécie Data de
coleta
Solvente Tipo de Fruto Hexano
Solanum australe Março 2005
Éter Etílico
FI Hexano
S. australe Março 2005
Éter Etílico
FM Hexano
S. caavurana Março 2005
Éter Etílico
FI Fonte: Dados da pesquisa.
Figura 16: Equipamento utilizado para a Aeração
3.3 ANÁLISE DOS ÓLEOS ESSENCIAIS
Os óleos foram analisados num aparelho Hewlett Packard-6890 GC com uma coluna capilar (30m X 0,25mm X 0,25 ìm, HP-5-MS, fase estacionária: 5% fenil - 95% dimetilpolisiloxana) acoplada a um detetor seletivo de massas Hewlett Packard 5973. As condições de injeção foram: Temperatura do injetor 240 ºC; rampa de aquecimento numa temperatura programada de 60-300ºC, 3 ºC/min; splitless durante 1,50 min; gás hélio como gás de arraste com fluxo de 1 mL/min; volume injetado de 1 ìL.
Os constituintes foram identificados pelos índices de retenção calculados através da injeção de uma mistura padrão de n-alcanos de nove a vinte e quatro carbonos (VAN DEN DOOL & KRATZ, 1964), pelos espectros de massas de todos os componentes presentes (ADAMS, 2001) e pelas bibliotecas Wiley 138 e Nist98.
Equação de Van den Dool e Kratz
Onde:
N = Cn - ( Cn-1)
Cn = número de carbonos do n-alcano que elui após a substância analisada.
Cn-1 = número de carbonos do n-alcano que elui antes da substância analisada.
tx = tempo de retenção da substância analisada.
tn = tempo de retenção do n-alcano que elui após a substância analisada.
tn-1 = tempo de retenção do n-alcano que elui antes da substância
O índice de retenção calculado neste caso era comparado aos índices de retenção da literatura (Adams, 2001). A indenficação ocorria segundo o seguinte procedimento: ao valor obtido pela equação através dos tempos de retenção dos contituíntes dos cromatogramas, verificava-se qual espectro de massas da literatura mais se assemelhava, neste caso por comparação chegava-se ao composto. A margem de erro aceitável para o índice de retenção era do valor de 10, por exemplo se o composto tinha um Índice de retenção calculado de 991, verificava-se na literatura os índices de retenção e os espectros de massas presentes de 981 a 1001.
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A interação planta – morcego frugívoro é bem conhecida sob o ponto de vista biológico, mas nada se encontra na literatura sobre a linguagem química envolvida nesta interação.
O estudo dos óleos essenciais de Solanum é inédito e são poucos os trabalhos em ecologia química envolvendo este gênero. Os frutos dessa família têm como principais consumidores os morcegos e estes se constituem dispersores de suas sementes. O estudo dos componentes voláteis e não voláteis, principalmente dos frutos, é um fator relevante para a interpretação de sua dieta. Os morcegos são animais que se alimentão de frutos pelo período noturno e com base nessas informações, nossa proposta envolve o estudo dos componentes voláteis – óleos essenciais – dos frutos maduros (FM) e imaturos (FI) com o objetivo de colaborar no entendimento da preferência alimentar do morcego.
O presente estudo teve seu início com a coleta dos frutos de Solanum, através de incursões no Parque Estadual de Vila Rica do Espírito Santo (PEVR), Fênix – PR. No local, procuraram-se as plantas específicas, sendo anotado, a data da coleta, o grau de maturação do fruto (imaturo ou maduro) e a espécie de Solanum. Estes foram acondicionados em sacos plásticos com os dados referidos, numa massa aproximada de 50 a 100 g.
4.1. ESTUDO DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS ENVOLVIDOS NA INTERAÇÃO MORCEGO-PLANTA
As análises dos óleos essenciais obtidos através de hidrodestilações e de aerações, foram realizadas utilizando a cromatografia gasosa acoplada a
espectrometria de massas (CG/EM). Sendo realizadas no Depto. de Zoologia da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP-SP).
Destas análises, iniciou-se a interpretação e identificação dos compostos presentes nos óleos essenciais através dos cromatogramas e seus respectivos espectros de massas. Foram analisadas nove amostras obtidas por hidrodestilação e seis por aeração. Entre as amostras obtidas por hidrodestilação abordou-se quando possível, o aspecto de sazonalidade.
A seguir, discute-se primeiramente os óleos essenciais obtidos por hidrodestilação, fazendo uma comparação entre FM e FI de cada espécie. Na seqüência, discute-se os óleos obtidos por aeração.
Como os morcegos consomem apenas os FM, considera-se duas hipóteses para a atração: 1. os compostos exclusivos dos FM são os responsáveis pela atração ou 2. compostos presentes em quantidades significativamente maiores nos FM em relação aos FI são os responsáveis pela atração. 3. Alguns compostos em grande quantidade nos frutos imaturos e ausente nos frutos maduros afasta os morcegos dos imaturos.
Por exemplo a presença de taninos. Nos frutos verdes (imaturos) a quantidade de taninos é alta para proteção do fruto até que esteja maduro, quando a quantidade de taninos diminui muito modificando o sabor do fruto.
4.1.1 Hidrodestilação
Por esta técnica, analisou-se 9 amostras sendo 6 de FM e 3 de FI (tabela 2, pág. 22) das espécies em estudo. A seguir está exemplificado o cromatograma do óleo essencial de FM de S. caavurana (figura 17) sendo que todas as outras amostras foram analisadas seguindo o mesmo critério. Neste cromatograma os picos numerados representam os constituintes químicos que eluem e os seus respectivos tempos de renteção. Por exemplo o composto majoritário 16 que elue no tempo de retenção de 19,8 minutos.
Figura 17: Cromatograma do óleo essencial dos frutos maduros (FM) de S.
caavurana (BN 018) Fonte: Dados da pesquisa.
4.1.1.1 Hidrodestilação - Solanum argenteum - FM x FI
Nos óleos essenciais dos FI de S. argenteum (figura 18), observou-se um menor teor de monoterpenos oxigenados (3,64%) e um maior teor de sesquiterpenos oxigenados (9,69%) em relação ao óleo essencial dos FM (figura 19), que apresentou um maior teor de monoterpenos oxigenados (22,09%) e menor teor de sesquiterpenos (3,80%). Isto pode ser visualizado no gráfico 1 e na tabela 4 (Anexo , pág 53).
Figura 18: Cromatograma do óleo essencial dos FI de S. argenteum obtido por hidrodestilação
Fonte: Dados da pesquisa.10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 0
3000000 6000000 9000000 1.2e+07 1.5e+07
Time ->
Abundance TIC: BN005.D
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00
0 3000000 6000000 9000000
Time ->
Abundance TIC: BN018.D
Figura 19. Cromatograma do óleo essencial dos FM de S. argenteum obtido por hidrodestilação. Fonte: Dados da Pesquisa.
Pela tabela 4, o componente majoritário nos FM é o salicilato de metila com um teor 3 vezes maior que nos FI. Compostos que só ocorrem nos FM, em concentração superior a 1,5% são óxido de linalool A, citronelol, eugenol, n- octanol e n-nonanal. Compostos em quantidades maiores significativas nos FM em relação aos FI são: óxido de linallol B (~5x maior nos FM), linalool (~3x), trans-verbenol (~4,5x), geraniol (~4,5x), 2-fenilacetaldeído (~6x) e 2E,4E- decadienal (~4x).
Gráfico 1: Constituintes Químicos dos óleos essenciais obtidos através de hidrodestilação dos FM e FI de S. argenteum. Fonte: Dados da Pesquisa.
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00 65.00
0 3000000 6000000 9000000 1.2e+07 1.5e+07 1.8e+07
Time ->
Abundance TIC: BN017.D
Constituintes Químicos Identificados em Solanum argentum
22,09
3,64 3,80
9,69 58,59
38,79
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00
Fruto Maduro Fruto Imaturo
Teor na Amostra
Outros
Sesquiterpenos Oxigenados Monoterpenos Oxigenados
4.1.1.2 Hidrodestilação - Solanum australe - FM x FI
Os óleos essenciais dos FI de S.australe (figura 20) apresentaram maior teor de monoterpenos oxigenados (37,95%) em relação aos sesquiterpenos oxigenados (5,23%) enquanto que os óleos dos FM (figura 21) a diferença diminuiu, devido ao aumento do teor de sesquiterpenos oxigenados (28,12%).
O gráfico 2 mostra as diferenças dos óleos essenciais de FM e FI de S.
australe. Observou-se monoterpenos oxigenados comuns nos dois óleos, como o composto linalool (FM-5,61%,FI-20,50%), geraniol (FM-1,09%,FI-5,17%) e geranil acetona (FM-5,78%, FI-1,16%) (tabela 5, Anexo, pág. 55).
O salicilato de metila é o composto majoritário nos FM, mas ao contrário de S. argenteum, os FI de S. australe possuem 4 vezes mais que os FM.
Compostos exclusivos nos FM com teor maior de 1,5% são: cis-pinano, citronelol, butanoato de citronelila, Z-diidro-apofarnesol, 2Z,6Z-farnesol, 2E,6E acetato de farnesila, linoleato de metila e n-tricosano. Compostos com maiores teores nos FM em comparação aos FI, tem-se apenas o geranil acetona (~5x).
Figura 20: Cromatograma do óleo essencial dos FI de S. australe obtido através de hidrodestilação.
Fonte: Dados da pesquisa.
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00
0 3000000 6000000 9000000 1.2e+07 1.5e+07 1.8e+07
Time ->
Abundance TIC: BN007.D
Figura 21: Cromatograma do óleo essencial dos FM de S. australe obtido através de Hidrodestilação. Fonte: Dados da pesquisa.
Gráfico 2: Constituintes Químicos dos óleos essenciais obtidos através de Hidrodestilação dos FI e FM .de Solanum australe. Fonte: Dados da pesquisa.
4.1.1.3 - Hidrodestilação - Solanum caavurana - FM x FI
Nos óleos essenciais de S. caavurana encontrou-se uma variedade maior de classes de terpenos (figura 22 e 23). Os óleos dos FI apresentaram menor teor de monoterpenos oxigenados (5,85%) em relação aos óleos dos FM (9,53%). Com relação a sesquiterpenos oxigenados, os FM apresentaram
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00
0 1200000 2400000 3600000 4800000 6000000 7200000 8400000 9600000
Time ->
Abundance TIC: BN012.D
Constituintes Químicos Identificados em Solanum australe
5,6 12,34
37,95 28,12
5,23 53,93
39,34
0 20 40 60 80 100 120
Fruto Maduro Fruto Imaturo
Teor na Amostra
Outros
Sesquiterpenos Oxigenados Monoterpenos Oxigenados Monoterpenos Hidrocarbonetos
teores menores (17,41%), mas muito próximos aos encontrados nos FI (19,97%). O gráfico 3, representa os teores de terpenos e outros compostos dos FI e FM (tabela 6, Anexo, pág.57).
Figura 22: Cromatograma do óleo essencial dos FI de S. caavurana obtido através de Hidrodestilação. Fonte: Dados da pesquisa.
Figura 23: Cromatograma do óleo essencial dos FM de S. caavurana obtido através de Hidrodestilação. Fonte: Dados da pesquisa.
Vários compostos eram comuns aos dois óleos como o -gurjuneno, - chamigreno, widrol, 10-epi--eudesmol, â-eudesmol e 10-Nor-10- calamenenona. Salicilato de metila é o composto majoritário e exclusivo nos FM, juntamente com outros compostos exclusivos como geranial, acetato de bornila, E-jasmona, vulgarona B e 2-fenilacetaldeído. Como compostos em
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00
0 1200000 2400000 3600000 4800000
Time ->
Abundance TIC: BN010.D
10.00 15.00 20.00 25.00 30.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00
0 3000000 6000000 9000000
Time ->
Abundance TIC: BN018.D
maior teor nos FM em relação aos FI, tem-se apenas o drimemona (~2,5x). Os compostos podem ser visualizados na tabela 6 (Anexo, pág. 57).
Constituíntes Químicos Identificados em Solanum caavurana
9,53
5,85 3,06
6,47
17,41 19,97
0,6 0,39
31,96 28,82
0 10 20 30 40 50 60 70
Fruto Maduro Fruto Imaturo
% na Amostra Outros
Diterpenos Oxigenados Diterpenos Hidrocarbonetos Sesquiterpenos Oxigenados Sesquiterpenos Hidrocarbonetos Monoterpenos Oxigenados
Gráfico 3: Constituintes Químicos do óleo essencial dos FM e FI de S.
caavurana obtidos através de hidrodestilação.Fonte: Dados da Pesquisa.
4.1.1.4 Hidrodestilação - Comparação dos óleos essenciais dos frutos das espécies estudadas
O estudo demonstrou uma variedade muito grande de compostos nos óleos essenciais e considerando-se os terpenos pode-se destacar a presença em maior quantidade, independente da espécie de Solanum, de mono e sesquiterpenos oxigenados tanto em número como em teor. Este fato pode ser comprovado observando-se o gráfico 4 e a tabela 7 (Anexo, pág. 59). S.
argenteum e S. caavurana possuem um perfil semelhante em relação a maiores teores de monoterpenos oxigenados nos FM, enquanto que ocorre o inverso em S. australe. Para realmente atribuir diferenças e/ou semelhanças entre os óleos, considerando grau de maturidade dos frutos (FM e FI) e classe dos compostos presentes (mono, sesquiterpenos) utilizou-se a ferramenta PCA (Análise dos Componentes Principais).
Pela tabela 7 (Anexo, pág. 59), observa-se que não existe nenhum composto de ocorrência exclusiva nos FM e presente nas três espécies de Solanum estudadas. Segundo Grison-Pigé, 1999, 2001 e 2002, que trabalhou com o gênero Ficus, a alta especificidade que ocorre entre frutos do gênero e suas vespas polinizadoras se deve à ocorrência de compostos exclusivos nos frutos.
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
S arg FM S arg FI S aust FM S aust FI S caav FM S caav FI Constituintes Terpenóides de Solanum Obtidos por Hidrodestilação
Diterpenos Oxigenados Diterpenos Hidrocarbonetos Sesquiterpenos Oxigenados Sesquiterpenos Hidrocarbonetos Monoterpenos Oxigenados Monoterpenos Hidrocarbonetos
Gráfico 4: Hidrodestilação: Amostras de Solanum X Classes de terpeno Fonte:
Dados da pesquisa.
4.2 ANÁLISE EM PCA - HIDRODESTILAÇÃO
Devido à alta complexidade dos óleos essenciais de Solanum estudados, optou-se por um estudo estatístico das amostras utilizando PCA, com objetivo de elucidar características relacionadas com a preferência alimentar do morcego Sturnira lilium por FM, comparando os mesmo com os FI.
Primeiramente analisou-se as espécies separadamente, comparando FM e FI. Os teores dos constituintes dos óleos essenciais obtidos por hidrodestilação dos FM e FI de determinada espécie foram inseridos no programa MATLAB para gerar os gráficos de scores e loading. As amostras
