UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS
INSTITUTO DE BIOLOGIA
GABRIEL LORENCINI FIORIN
CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DE UMA QUITINASE
DO FUNGO MONILIOPHTHORA PERNICIOSA COM
POSSÍVEL PAPEL NA PATOGENICIDADE SOBRE O
CACAUEIRO DURANTE A DOENÇA VASSOURA DE
BRUXA
CAMPINAS 2016
GABRIEL LORENCINI FIORIN
CARACTERIZAÇÃO FUNCIONAL DE UMA QUITINASE DO
FUNGO MONILIOPHTHORA PERNICIOSA COM POSSÍVEL
PAPEL NA PATOGENICIDADE SOBRE O CACAUEIRO
DURANTE A DOENÇA VASSOURA DE BRUXA
Dissertação apresentada ao Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do Título de Mestre em Genética e Biologia Molecular, na área de Genética de Micro-organismos.
Orientador: GONÇALO AMARANTE GUIMARÃES PEREIRA Co-Orientador: PAULO JOSÉ PEREIRA LIMA TEIXEIRA
CAMPINAS
2016
ESTE ARQUIVO DIGITAL CORRESPONDE À VERSÂO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA PELO ALUNO GABRIEL LORENCINI FIORIN E ORIENTADA PELO PROF. DR. GONÇALO AMARANTE GUIMARÃES PEREIRA.
Agência(s) de fomento e nº(s) de processo(s): FAPESP, 2014/06181-0
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas Biblioteca do Instituto de Biologia Mara Janaina de Oliveira - CRB 8/6972
Fiorin, Gabriel Lorencini,
F513c FioCaracterização funcional de uma quitinase do fungo Moniliophthora
perniciosa com possível papel na patogenicidade sobre o cacaueiro durante a
doença vassoura de bruxa / Gabriel Lorencini Fiorin. – Campinas, SP : [s.n.], 2016.
FioOrientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira. FioCoorientador: Paulo José Pereira Lima Teixeira.
FioDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia.
Fio1. Fungos – Patogenicidade. 2. Quitinase. 3. Sistema CRISPR/Cas9. I. Pereira, Gonçalo Amarante Guimarães,1964-. II. Teixeira, Paulo José Pereira Lima,1986-. III. Universidade Estadual de Campinas. Instituto de Biologia. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Functional characterization of a chitinase-like protein of
Moniliophthora perniciosa with a potential role in fungal pathogenicity during the
development of the witches' broom disease of cacao Palavras-chave em inglês:
Fungi – Pathogenicity Chitinase
CRISPR/Cas9 system
Área de concentração: Genética de Microorganismos Titulação: Mestre em Genética e Biologia Molecular Banca examinadora:
Gonçalo Amarante Guimarães Pereira [Orientador] Fabio Papes
Antonio Vargas de Oliveira Figueira Data de defesa: 25-08-2016
Programa de Pós-Graduação: Genética e Biologia Molecular
Campinas, 25 de Agosto de 2016
COMISSÃO EXAMINADORA
Prof. Dr. Gonçalo Amarante Guimarães Pereira Prof. Dr. Fabio Papes
Prof. Dr. Antonio Vargas de Oliveira Figueira
Os membros da Comissão Examinadora acima assinaram a Ata de Defesa, que se encontra no processo de vida acadêmica do aluno.
Dedico
esta
dissertação
aos
cientistas
que,
direta
ou
indiretamente, forneceram as bases
de conhecimento para que este
trabalho fosse possível.
AGRADECIMENTOS
Agradeço aos meus pais (Roberto e Claudete) e avós (Roberto e Luiza) pelo carinho e apoio.
Agradeço ao Prof. Dr. Gonçalo Pereira pela oportunidade de trabalhar em seu grupo de pesquisa.
Agradeço ao Dr. Paulo Teixeira pela constante presença e profundo envolvimento com o trabalho desde o início, em 2011. Seu exemplo de dedicação e excelência na condução deste e de outros trabalhos do grupo serviram de inspiração para seguir em frente nesta empreitada e, com certeza, persistirá comigo nas próximas etapas da carreira acadêmica.
Agradeço à Ms. Paula Prado por sua participação indispensável tanto no trabalho experimental como nas análises e discussões de resultados. Foi um privilégio enorme poder contar com a sua contribuição acadêmica, amizade e ensinamentos ao longo dos últimos anos.
Agradeço à Dra. Daniela Thomazella pela contribuição na análise crítica dos resultados e conclusões deste trabalho. Obrigado pela disponibilidade, amizade e aconselhamentos.
Agradeço às Ms. Ludimila Almeida, Beatriz Temer e Karina Yanagui pela amizade. Agradeço aos Profs. Drs. Fabio Papes, Jorge Mondego, Ronaldo Dalio, Celso Benedetti e Paulo Arruda, pelas suas respectivas contribuições ao trabalho nas ocasiões do Exame de Qualificação e Pré-Banca.
Agradeço à FAPESP pelo financiamento (processo nº 2014/06181-0, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)).
RESUMO
O cacaueiro (Theobroma cacao) é uma cultura perene de notável importância econômica mundial, sendo historicamente responsável pela geração de riquezas para o país. A produtividade da cacauicultura brasileira foi drasticamente reduzida ao longo dos anos 90, quando a doença vassoura de bruxa, causada pelo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa, se espalhou pela principal região produtora do Brasil, o sul da Bahia. O impacto desta grave fitopatologia vem trazendo problemas de ordem econômica, social e ambiental para o país, o que torna imperativo o desenvolvimento de estratégias eficientes para o seu controle. Importantes avanços na compreensão das estratégias de patogenicidade do fungo vêm sendo alcançados com o estudo do seu genoma e investigação de dados transcriptômicos da interação M. perniciosa – cacaueiro. Notavelmente, a inspeção dos dados de expressão gênica revelou que uma quitinase de M. perniciosa (Mp-chi) figura entre os genes alta e exclusivamente expressos durante a fase biotrófica da infecção do cacaueiro. Surpreendentemente, no entanto, esta proteína apresenta duas substituições de aminoácidos que presumivelmente levam à ausência de atividade quitinolítica. Tais propriedades sugeriam que a quitinase Mp-Chi não participasse do catabolismo de quitina e que, em vez disso, poderia estar envolvida em alguma função de patogenicidade. Uma vez que a proteína possui os resíduos de interação com o seu substrato (quitina) conservados, o seu papel na interação poderia estar relacionado com a ligação à quitina. A fim de esclarecer o papel funcional da Mp-Chi durante a vassoura de bruxa, a quitinase de M. perniciosa foi expressa em sistema heterólogo e submetida a testes funcionais in vitro. Os resultados obtidos indicaram que, de fato, a Mp-Chi é cataliticamente inativa. A capacidade quitinolítica da proteína é restabelecida a partir da restauração de ambos os resíduos conservados do seu domínio catalítico, o que demonstra que a ausência de atividade se deve pelo menos a essas duas substituições. Testes de afinidade a carboidratos confirmaram que a Mp-Chi é capaz de se ligar à quitina e quito-oligômeros, o que a capacitaria para agir como um fator de patogenicidade de
M. perniciosa, atuando na proteção da parede celular do fungo contra enzimas
hidrolíticas da planta ou na supressão da imunidade vegetal desencadeada por quitina. Utilizando plataformas experimentais modelo, os potenciais papeis da proteína no contexto da doença foram avaliados. A quitinase de M. perniciosa não
exibiu capacidade protetora, mas preveniu a ativação da imunidade vegetal elicitada por quitina. Notavelmente, esta função foi abolida em uma versão mutante da proteína com afinidade reduzida à quitina, demonstrando que, de fato, a capacidade de ligação à quitina é a propriedade funcional chave para que a Mp-Chi exerça sua função de patogenicidade. Conjuntamente, os resultados obtidos confirmam que a Mp-Chi se constitui em um potencial efetor de M. perniciosa envolvido na prevenção do reconhecimento do fungo pela planta, contribuindo para o sucesso da colonização do cacaueiro por M. perniciosa. A caracterização funcional desta quitinase na doença vassoura de bruxa representa um importante passo na compreensão das estratégias de evasão de M. perniciosa contra as defesas da planta, assim como compreende uma novidade relevante para a fitopatologia.
Adicionalmente à caracterização funcional da Mp-Chi, no sentido de viabilizar a realização de estudos funcionais in vivo, foi iniciado o desenvolvimento de uma metodologia para manipulação genética de M. perniciosa utilizando a tecnologia CRISPR/Cas9. O vetor contendo todos os elementos necessários para a edição do genoma do fungo foi construído e permitirá a transformação do fungo. Uma vez estabelecido, o procedimento poderá ser utilizado para produção de linhagens deficientes no gene Mp-chi e inúmeros outros genes de interesse, constituindo-se em uma poderosa ferramenta para o estudo dos fatores envolvidos na patogenicidade de M. perniciosa.
ABSTRACT
Cacao (Theobroma cacao) is a perrenial crop of remarkable economic importance worldwide, historically accounting for wealth to Brazil. The productivity of brazilian cacao farming suffered a drastic decrease over the 90’s, when the witches’s broom disease (WBD), caused by the basidiomycete Moniliophthora perniciosa, spread widely throughout the major brazilian producing region, southern Bahia. The impact of this severe disease is bringing economic, social and environmental issues to the country, which makes the development of efficient management strategies a clear priority. Important progress has been achieved in understanding the pathogenicity mechanisms deployed by M. perniciosa during plant colonization through genomic and transcriptomic approaches. Remarkably, a first inspection of gene expression data revealed a fungal chitinase (Mp-chi) among the genes highly and exclusively expressed during the biotrophic stage of cacao infection. Surprisingly, though, the predicted amino acid sequence of such chitinase exhibited two substitutions (E167→Q and M238→L) in key conserved residues for enzymatic
catalysis, which presumably would lead to complete absence of chitinolytic activity. Taken together, these properties suggested that the chitinase Mp-Chi, instead of participating in chitin catabolism, could be playing a role in fungal pathogenicity. Given that the residues involved in chitin binding are conserved in the protein sequence, its role in the interaction could be related to chitin binding. In order to investigate the functional role performed by Mp-Chi during WBD, the protein was expressed in heterologous system and subjected to in vitro functional assays. The results showed that Mp-Chi is indeed catalytically inactive. The enzymatic function of Mp-Chi was regained upon restoration of both conserved catalytic residues, demonstrating that the absence of chitinolytic activity is a direct consequence of these two substitutions, at least. Carbohydrate binding assays demonstrated that Mp-Chi binds chitin and chito-oligomers (GlcNAc6), which would enable the protein to act
as a fungal pathogenicity tool, either protecting the fungal cell wall from hydrolytic enzymes secreted by the host plant or suppressing Chitin-Triggered Immunity. Using model experimental platforms, it was demonstrated that, although Mp-Chi does not provide protection against hydrolytic enzymes, the protein prevents the activation of Chitin-Triggered Immunity. Remarkably, the ability to circumvent Chitin-Triggered Immunity was abolished in a mutated version of the protein impaired in chitin binding,
indicating that the ability to bind chitin is the key functional property for Mp-Chi to play its role in fungal pathogenicity. Collectively, the results support the role of Mp-Chi as a potential effector protein deployed by M. perniciosa to avoid recognition by the host plant, therefore contributing for successful colonization of T. cacao. The functional characterization of Mp-Chi represents an important step towards a better understanding of the evasion strategies against the host plant exploited by M.
perniciosa during WBD. Also, given that a chitinase has never been implicated in
such function, our findings represent a relevant novelty in modern plant pathology. In addition to the functional characterization of Mp-Chi, we started the development of a methodology for M. pernciosa genetic manipulation using the novel CRISPR/Cas9 technology. The vector containing all the elements required for genome editing has been built and will allow fungal transformation. Once established, the procedure will allow for the production of Mp-chi deficient strains and several other strains of interest, providing a powerful tool for understanding the mechanisms involved in M. perniciosa pathogenicity in vivo.
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL... 15
1. Cacaueiro e a doença vassoura de bruxa ... 15
2. Projeto genoma e Atlas Transcriptômico da vassoura de bruxa ... 17
3. Interação planta-patógeno e efetores de fungos ... 18
3.1 Interação planta-patógeno ... 18
3.2 Efetores de fungos ... 20
4. Identificação de efetores em M. perniciosa ... 21
CAPÍTULO 1: Identificação e caracterização funcional in vitro da quitinase inativa Mp-Chi ... 23
INTRODUÇÃO ... 23
1. Quitinases e a maquinaria quitinolítica de fungos ... 23
1.1 Quitinases ... 23
1.2 Maquinaria quitinolítica de fungos ... 25
2. Hipóteses para a função da quitinase Mp-Chi na patogenicidade de M. perniciosa ... 27
3. Identificação de quitinases potencialmente relacionadas à patogenicidade em outros fungos fitopatogênicos ... 29
4. Toolkit para caracterização funcional da Mp-Chi ... 33
OBJETIVOS ... 35
Objetivo geral ... 35
Objetivos específicos ... 35
MATERIAIS E MÉTODOS ... 35
1. Material biológico ... 35
2. Isolamento e clonagem dos genes ... 36
4. Expressão e purificação das proteínas recombinantes ... 38
4.1 Expressão em pequena escala ... 38
4.2 Expressão em larga escala e purificação ... 39
5. Análise de dicroísmo circular (CD) ... 40
6. Quantificação da atividade quitinolítica ... 40
7. Ensaios de ligação à quitina ... 41
8. Calorimetria de titulação isotérmica (ITC) ... 41
9. Teste de proteção de hifas contra a ação de quitinases ... 42
10. Teste de proteção de esporos ... 42
11. Alcalinização de suspensão de células vegetais ... 43
12. Teste de germinação de esporos ... 43
RESULTADOS ... 44
1. Análise de expressão do gene Mp-chi ... 44
2. Isolamento e clonagem dos genes ... 46
3. Mutações sítio-dirigidas ... 48
4. Expressão e purificação das proteínas recombinantes ... 48
4.1 Expressão em pequena escala ... 48
4.2 Expressão em larga escala e purificação ... 49
5. Análise de dicroísmo circular (CD) ... 53
6. Quantificação da atividade quitinolítica ... 56
7. Ensaios de ligação à quitina ... 58
8. Calorimetria de titulação isotérmica (ITC) ... 59
9. Teste de proteção de hifas contra a ação de quitinases ... 60
10. Teste de proteção de esporos ... 62
11. Alcalinização de suspensão de células vegetais ... 63
DISCUSSÃO ... 71
CONCLUSÕES ... 76
CONSIDERAÇÕES FINAIS ... 77
CAPÍTULO 2: Estabelecimento de uma metodologia baseada na tecnologia CRISPR/Cas9 para manipulação genética de M. perniciosa ... 79
INTRODUÇÃO ... 79
1. Identificação e estudo de fatores de patogenicidade de M. perniciosa ... 79
2. Genética reversa: a edição de genomas revela as funções gênicas ... 80
3. Sistema CRISPR/Cas ... 84
3.1 Identificação e caracterização dos sistemas CRISPR/Cas ... 84
3.2 CRISPR/Cas como ferramenta para o estudo funcional de genes ... 87
4. Knockout gênico em M. perniciosa: histórico e estratégia para estabelecimento da metodologia de inativação gênica utilizando o sistema CRISPR/Cas9 ... 88 OBJETIVOS ... 91 Objetivo geral ... 91 Objetivos específicos ... 92 MATERIAIS E MÉTODOS ... 92 1. Material biológico ... 92
2. Planejamento e síntese dos cassetes de expressão Cas9, gRNA e Hph ... 92
3. Construção do vetor de destino mpDestCRISPR/Cas9 ... 93
4. Teste de sensibilidade à higromicina ... 95
4.1 Preparação de protoplastos de M. perniciosa ... 96 4.2 Avaliação da sensibilidade dos protoplastos de M. perniciosa à higromicina96
RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 97
1. Planejamento e síntese dos cassetes de expressão Cas9, Hph e gRNA ... 97
2. Preparação do vetor de destino mpDestCRISPR/Cas9 ... 98
3. Teste de sensibilidade à higromicina ... 105
CONCLUSÕES ... 106
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INTRODUÇÃO GERAL
1. Cacaueiro e a doença vassoura de bruxa
O cacaueiro (Theobroma cacao L.) é uma planta tropical de sub-bosque (Gesteira et al. 2007) pertencente à família Malvaceae sensu lato (Baum et al. 2004) e originária da região da Bacia Amazônica (Purdy & Schmidt 1996). Domesticada pelos maias na mesoamérica pré-colombiana, esta espécie hoje é cultivada em diversos países com o clima quente e úmido apropriado para o seu plantio, incluindo Costa do Marfim, Gana, e Indonésia, os atuais maiores produtores mundiais de cacau (ICCO, 2014). No Brasil, o cacaueiro é plantado comercialmente nos estados do Amazonas, Pará, Rondônia, Mato Grosso, Espírito Santo e no sul da Bahia, região que se configura na principal área produtora brasileira. O cultivo do cacaueiro é realizado primariamente para prover manteiga e pó de cacau para a indústria chocolateira (CEPLAC, 2009) e também para a indústria de cosméticos (Queiroz et al. 2003). Além destes produtos, que são derivados da amêndoa do cacau, geleia, vinho, vinagre e suco podem ser fabricados a partir da polpa do fruto do cacaueiro (SUFRAMA, 2003). A grande importância econômica do cacau entre as culturas perenes é claramente evidenciada pelo fato de este movimentar bilhões de dólares anualmente no mercado mundial.
O cacau é um produto nobre e tradicional da agricultura brasileira, que gerou uma importante quantidade de divisas para o país desde a implantação das lavouras cacaueiras comerciais para exportação, no século XIX. As exportações nacionais tiveram o seu auge em 1979, quando foram exportados US$ 922 milhões. Devido a sua enorme capacidade produtiva, o Brasil se manteve na destacada posição de 2º maior país exportador de cacau até 1994, sendo a Bahia líder da produção nacional (CEPLAC, 2009). A partir deste ano, entretanto, a conjugação de uma conjuntura externa desfavorável (redução dos preços internacionais devido a um aumento eufórico da produção mundial e dos estoques nos países produtores) e, principalmente, de uma conjuntura interna de devastação causada pela doença vassoura de bruxa, que surgiu nos cacauais da Bahia em 1989 (SUFRAMA, 2003), levou o Brasil a despencar progressivamente no ranking mundial da produção até a quinta posição em 2011 (ICCO, 2014). A produção de cacau brasileira caiu de 360 mil toneladas/ano na década de 1980 para menos de 100 mil toneladas na safra
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1999/2000, levando o país da condição de exportador para a de importador de cacau. Assistiu-se também ao mais alto nível de desemprego na região sul baiana, afetando cerca de 250 mil trabalhadores rurais e o faturamento médio dos cacauicultores, que era de US$ 600 milhões/ano, caiu para menos de US$ 200 milhões (CEPLAC, 2009).
A vassoura de bruxa é considerada um dos principais problemas fitopatológicos que afligem o hemisfério sul (Griffith et al., 2003) e foi responsável pela perda de 95% do potencial produtivo de cacau da Bahia desde a sua introdução na região, em 1989 (Aime & Phillips-Mora 2005). O agente etiológico desta doença é o fungo hemibiotrófico Moniliophthora perniciosa (Stahel) Aime & Phillips-Mora, basidiomiceto pertencente à ordem Agaricales e à família Marasmiaceae (Meinhardt et al., 2008). O ciclo de vida deste patógeno (Figura 1) se inicia quando basidiósporos produzidos previamente em tecidos mortos de plantas infectadas são transportados no período noturno pelo vento ou chuva e atingem tecidos meristemáticos do cacaueiro (como gemas vegetativas, gemas florais em desenvolvimento e frutos jovens), onde germinam e penetram através dos estômatos, ferimentos ou mesmo diretamente (Ceita et al., 2007). O micélio monocariótico característico da fase biotrófica de M. perniciosa então cresce em baixa densidade no espaço intercelular dos tecidos vivos do hospedeiro (Penman et al., 2000). Durante esta fase, é observada hipertrofia e hiperplasia dos tecidos infectados, assim como perda da dominância apical, com intensa brotação lateral, o que leva à formação de ramos anormais semelhantes a vassouras designados “vassouras verdes” (Meinhardt et al., 2008).
De oito a vinte semanas após a infecção inicial, os tecidos começam a senescer e são colonizados inter e intracelularmente pelo micélio necrotrófico de M.
perniciosa, caracterizado pela dicariose e presença de grampos de conexão. É nesta
fase que o fungo causa necrose e morte tecidual, o que resulta na formação das vassouras secas (Garcia et al. 2007). Apesar dos fatores responsáveis por desencadear a transição da fase biotrófica para a necrotrófica em fungos hemibiotróficos serem ainda pouco conhecidos, Thomazella e colaboradores (2012) demonstraram que as vias respiratórias mitocondriais e a condição energética celular podem desempenhar funções nesta transição e no desenvolvimento de M.
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são produzidos nos tecidos necróticos e liberam os basidiósporos no ar, reiniciando-se o ciclo da doença (Evans 1980).
Figura 1. Representação do ciclo de vida de M. perniciosa. Basidiósporos germinam sobre tecido meristemático do cacaueiro resultando na formação da vassoura verde, que é colonizada por micélio biotrófico. A morte do tecido infectado é acompanhada pela mudança para a fase necrotrófica do fungo. Este tecido morto é denominado vassoura seca. Neste estágio da doença são produzidos os basidiomas, que liberam os basidiósporos, reiniciando-se o ciclo de vida do patógeno. Figura: Dr. Paulo José P. L. Teixeira.
A complexidade da interação T. cacao - M. perniciosa e a epidemiologia associada a ela dificultam o desenvolvimento de recomendações padrão para o controle da vassoura de bruxa e impõem que as estratégias de manejo sejam elaboradas em nível regional ou mesmo em nível de plantação (Purdy & Schmidt 1996). Entretanto, quatro métodos principais são amplamente adotados em lavouras acometidas pela doença: (I) a poda fitossanitária, que envolve a remoção e destruição de partes infectadas das plantas doentes; (II) controle químico, com a aplicação de fungicidas; (III) seleção de linhagens de cacaueiro resistentes à doença; e (IV) controle biológico, em que microrganismos micoparasitas ou produtores de antibióticos (com destaque para fungos do gênero Trichoderma) são empregados na inibição do crescimento de M. perniciosa. Estas estratégias, no entanto, se mostram pouco eficientes e dispendiosas, aumentando largamente o custo da produção.
2. Projeto genoma e Atlas Transcriptômico da vassoura de bruxa
Diante da importância dos prejuízos gerados pela doença, em 2000 foi iniciado o Projeto Genoma vassoura de bruxa (www.lge.ibi.unicamp.br/vassoura), coordenado pelo Professor Gonçalo Amarante Guimarães Pereira, com o objetivo de aumentar o conhecimento existente sobre M. perniciosa e encontrar soluções para a fitopatologia causada por ele. O projeto permitiu a obtenção de dados genômicos básicos como tamanho do genoma, conteúdo gênico, polimorfismos e variabilidade
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genética de M. perniciosa, além de possibilitar a identificação de genes de potenciais fatores de virulência, proteínas indutoras de necrose e efetores. Ademais, mapas metabólicos foram construídos, elucidando-se diversos mecanismos moleculares centrais envolvidos na doença vassoura de bruxa do cacaueiro (Garcia et al. 2007; Mondego et al. 2008; Rincones et al. 2008). As primeiras análises do genoma de M.
perniciosa foram disponibilizadas por nosso grupo em 2008 (Mondego et al. 2008).
Nesse contexto de busca pelo entendimento da doença, em 2009 o Dr. Paulo José Pereira Lima Teixeira, então aluno do Curso de Doutorado Direto em Genética e Biologia Molecular da UNICAMP, iniciou seu projeto intitulado “Construção de um atlas transcriptômico para o estudo da doença vassoura de bruxa do cacaueiro”. Este projeto envolveu o sequenciamento com o uso da metodologia de RNA-seq de 61 transcriptomas das mais variadas condições de crescimento e desenvolvimento do patógeno M. perniciosa, objetivando-se obter informações relevantes a respeito do perfil transcricional tanto do fungo quanto do seu hospedeiro. Os dados obtidos, apresentados por Teixeira e colaboradores (2014), permitiram constatar que o cacaueiro infectado passa por importantes alterações fisiológicas e metabólicas ao longo da doença, as quais culminam no estabelecimento de um processo similar à senescência. Ademais, foi caracterizado o status metabólico de M. perniciosa durante a infecção e foram identificados numerosos possíveis fatores de patogenicidade do fungo. A identificação de tais fatores de virulência/efetores de M. perniciosa contribui sobremaneira para o detalhamento da nossa compreensão a respeito dos mecanismos moleculares subjacentes à interação deste patógeno com o seu hospedeiro e, por isso, a prospecção deles nos dados transcriptômicos tem sido o foco do trabalho do nosso grupo.
3. Interação planta-patógeno e efetores de fungos
3.1 Interação planta-patógeno
Plantas estão contínua e permanentemente expostas a uma ampla gama de inimigos naturais, incluindo predadores, parasitas e patógenos, que causam injúrias aos seus tecidos e prejudicam o seu desenvolvimento e reprodução (Gómez-Gómez 2004). Desta maneira, ao longo da evolução as plantas foram pressionadas a desenvolver defesas estruturais e bioquímicas contra estresses causados por
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esses organismos (Pritchard & Birch 2011). Tais defesas incluem ceras, componentes da parede celular e metabólitos secundários, que representam barreiras constitutivas aos agentes agressores, e mecanismos de proteção induzíveis por patógenos como a resposta de hipersensibilidade (HR), que consiste em morte celular localizada no sítio de infecção, o burst oxidativo, aumento da expressão de genes relacionados à defesa (como os de proteínas relacionadas à patogênese - PRs), produção de compostos antimicrobianos e formação de lignina (Gómez-Gómez 2004; Conrath et al. 2002; van den Burg et al. 2006). As respostas de defesa induzida ocorrem não apenas no sítio de infecção, mas também nas outras partes da planta, o que caracteriza a resistência sistêmica adquirida (SAR) (Conrath et al. 2002).
Os mecanismos de defesa das plantas contra o ataque de patógenos estão organizados em pelo menos duas linhas de defesa ativa. A primeira linha provê proteção basal contra todos os patógenos potenciais e é baseada no reconhecimento de padrões moleculares conservados associados à patógenos ou a micróbios (PAMPs ou MAMPs) através dos receptores de reconhecimento de padrões (PRRs), os quais ativam a imunidade desencadeada por PAMP (PTI) e, dessa forma, previnem a acentuada colonização do hospedeiro (De Wit et al. 2009). As moléculas derivadas dos patógenos que contém tais padrões são designadas elicitores (van den Burg et al. 2006) e geralmente se mostram essenciais para o patógeno, de forma que não podem ser modificadas sem perda de viabilidade. Entre elas estão proteínas bacterianas abundantes, como a flagelina, e um dos componentes estruturais da parede celular de fungos, a quitina (Zipfel 2009).
Frente a essa linha primária de proteção, os fitopatógenos, sob pressão de seleção, desenvolveram formas de manipular a fisiologia dos hospedeiros de maneira a evitar o seu reconhecimento por eles ou neutralizar as respostas de defesa das plantas. As proteínas secretadas pelos patógenos que medeiam tal manipulação do hospedeiro são ditas efetores (Pritchard & Birch 2011; van den Burg et al. 2006). Estas proteínas são tipicamente pequenas, secretadas, ricas em resíduos de cisteína e atuam no apoplasto, na superfície externa das células vegetais ou podem ser introduzidas nas células vivas do hospedeiro (Pritchard & Birch 2011; de Jonge et al. 2011). Alguns efetores apresentam como alvos os PRRs ou seus componentes de sinalização e, portanto, interferem na transdução de sinais
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de defesa (Hann et al. 2010; Göhre & Robatzek 2008); outros inibem enzimas importantes nas respostas de defesa da planta infectada, como as proteases, impedindo que estas atuem ofensivamente sobre o patógeno (van den Burg et al. 2006).
Uma vez que o sistema basal de defesa das plantas foi superado pelos fitopatógenos, durante a evolução elas responderam com um segundo sistema de defesa baseado na percepção de efetores por proteínas específicas, denominadas proteínas R, e subsequente ativação da imunidade desencadeada por efetor (ETI). A ETI leva a uma rápida e acentuada resposta de defesa geralmente mais severa que a produzida pela PTI, incluindo resposta de hipersensibilidade (HR). Isto, por sua vez, dispara a segunda onda da corrida co-evolucionária entre patógenos e plantas, ao longo da qual os patógenos respondem com mutações em efetores ou desenvolvimento de novos efetores que podem evitar ou suprimir a ETI, enquanto as plantas desenvolvem novas proteínas R que medeiem o reconhecimento destes novos efetores (De Wit et al. 2009; Jones & Dangl 2006; Koeck et al. 2011).
3.2 Efetores de fungos
Até recentemente, os mecanismos utilizados por fungos biotróficos e hemibiotróficos para lidar com o sistema imune do hospedeiro e manipular as suas células eram muito pouco conhecidos. No entanto, nos últimos anos tornou-se aparente que, como os patógenos bacterianos de plantas e animais, fungos fitopatogênicos produzem e secretam proteínas efetoras que interagem com o hospedeiro e desempenham importantes papéis na patogênese (Kamoun 2009; Dodds et al. 2009). Entre estes papéis estão a proteção das hifas contra as enzimas hidrolíticas produzidas pelo hospedeiro em resposta à infecção, inativação destas enzimas e o sequestro de potenciais elicitores que podem disparar adicionais respostas de defesa da planta (de Jonge et al. 2011).
As proteínas efetoras de patógenos filamentosos (fungos e oomicetos), produzidas no Retículo Endoplasmático e secretadas através de vesículas derivadas do Complexo de Golgi, podem ser liberadas no apoplasto do hospedeiro ou introduzidas nas células deste (de Jonge et al. 2011). Os efetores extracelulares, como proteínas com atividade de enzimas de degradação de parede celular (CWDE), proteínas indutoras de necrose e um grande grupo de pequenas proteínas ricas em cisteínas de função desconhecida, uma vez no apoplasto, exercem os seus
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papéis na colonização do hospedeiro e na neutralização de suas respostas de defesa (de Jonge et al. 2011). Já os efetores intracitoplasmáticos, que predominam numericamente, são translocados para o interior das células do hospedeiro através de um mecanismo ainda não conhecido para fungos (Koeck et al. 2011), atuando sobre alvos intracelulares e assim interferindo em processos relacionados com a defesa do hospedeiro (de Jonge et al. 2011).
A identificação e caracterização de efetores de fungos situam-se em uma área de fronteira da fitopatologia e os mecanismos de neutralização de defesas de plantas por estas proteínas começaram a ser melhor compreendidos apenas recentemente. Um exemplo de estratégia de patogenicidade de fungos envolvendo efetores já elucidada é a da proteína AvrPiz-t, secretada pelo ascomiceto
Magnaporthe oryzae durante a infecção no arroz. Tal proteína efetora pode suprimir
a morte celular programada do hospedeiro (Li et al. 2009), possivelmente bloqueando a resposta de hipersensibilidade e favorecendo o estabelecimento do patógeno. Em 2006, van den Burg e colaboradores demonstraram que a proteína Avr4, produzida pelo ascomiceto biotrófico Cladosporium fulvum, liga-se à parede celular deste fungo durante a infecção do tomateiro e protege o patógeno do efeito deletério das quitinases secretadas pela planta, constituindo-se em um fator de virulência/efetor fundamental para o sucesso da colonização do tomateiro por C.
fulvum. Outro mecanismo notável de evasão da imunidade vegetal envolve a
proteína Ecp6 desse mesmo fungo. Foi demonstrado que tal proteína é capaz de se ligar a fragmentos de quitina (quito-oligômeros) e impedir a percepção deles pelos receptores do tomateiro, prevenindo a ativação da PTI induzida por quitina (de Jonge et al. 2010). Efetores desempenhando esta mesma função de patogenicidade foram caracterizados em outros fungos hemibiotróficos (Marshall et al. 2011; Mentlak et al. 2012).
4. Identificação de efetores em M. perniciosa
A inspeção de transcriptomas da interação T. cacao - M. perniciosa tem permitido a detecção de inúmeros genes candidatos a codificadores de efetores em
M. perniciosa (Teixeira et al. 2014). Uma vez que estes têm por função garantir o
sucesso da infecção através do bloqueio ou neutralização da maquinaria de defesa do hospedeiro, características como alta ou exclusiva expressão durante a interação com o cacaueiro e codificação de proteínas com peptídeo sinal de secreção são
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indicadores de possíveis genes de efetores. Além disso, a codificação de proteínas pequenas, ricas em cisteínas e que não apresentam homologia com outras proteínas de fungos representa uma evidência importante para a identificação de tais genes. Alguns destes genes candidatos a efetores foram alvos de trabalhos do nosso grupo visando à caracterização estrutural e funcional das proteínas codificadas por eles (Garcia et al. 2007; Zaparoli et al. 2011; Teixeira et al. 2012; Thomazella et al. 2012; de O. Barsottini et al. 2013).
Neste contexto de reconhecimento de proteínas envolvidas com a patogenicidade de M. perniciosa, foi identificada uma quitinase (Mp-Chi) que poderia contribuir para a virulência do fungo sobre o cacaueiro. Tal proteína, cuja família será caracterizada a seguir, é o objeto central deste trabalho e pode representar um recurso inédito de evasão do patógeno das respostas de defesa do seu hospedeiro.
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CAPÍTULO 1: Identificação e caracterização funcional in vitro da quitinase inativa Mp-Chi
INTRODUÇÃO
1. Quitinases e a maquinaria quitinolítica de fungos
1.1 Quitinases
A quitina é um homopolímero linear insolúvel constituído de subunidades do açúcar N-acetilglicosamina unidas por ligações β-1,4. Na natureza, dois principais tipos de quitina ocorrem, os quais são caracterizados por um arranjo antiparalelo (α-quitina) ou paralelo (β-(α-quitina) das cadeias de N-acetilglicosamina (Seidl 2008). Depois da celulose, a quitina é o segundo polímero mais abundante encontrado na biosfera (Tharanathan & Kittur 2003) e é o principal componente do exoesqueleto de invertebrados e um componente estrutural essencial da parede celular dos fungos (Seidl 2008).
A degradação da quitina impacta significativamente no balanço dos ecossistemas naturais (Gooday 1990). Alguns organismos degradam este biopolímero utilizando arsenais de enzimas quitinolíticas (Mach et al. 1999), as quais são classificadas como N-acetilglicosaminidases e quitinases, que diferem entre si em relação aos seus padrões de clivagem da quitina (Seidl 2008), conforme ilustrado na Figura 2.
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Quitina (polímero de β-(1-4)-N-Acetil-D-glicosamina) Endoquitinases Exoquitinases
N-Acetilglicosaminidases
b a
Figura 2. Padrões de clivagem da quitina característicos das N-acetilglicosaminidases, endoquitinases e exoquitinases. Enquanto as N-acetilglicosaminidases catalisam a liberação do resíduo terminal da extremidade não-redutora da quitina, as endoquitinases clivam este biopolímero em qualquer ponto ao longo da sua cadeia polimérica, gerando produtos de tamanho variável. As exoquitinases hidrolisam a quitina a partir da sua extremidade não-redutora, assim como as N-acetilglicosaminidases, mas sempre produzem a quitobiose [(GlcNAc)2] como produto de degradação. (a) Representação da estrutura molecular da quitina, destacando os
pontos de clivagem de cada uma das enzimas quitinolíticas. (b) Representação esquemática da quitina, das enzimas quitinolíticas e de seus sítios de clivagem. (Adaptado de Seidl, 2008 e http://www.sigmaaldrich.com/life-science/metabolomics/enzyme-explorer/learning-center/carbohydrate-analysis/carbohydrate-analysis-ii.html.)
Quitinases (EC 3.2.1.14) são membros das famílias das glicosil hidrolases GH18 e GH19 (classificação CAZy - Carbohydrate Active Enzymes Database; http://www.cazy.org) e catalisam a hidrólise de ligações β-1,4 em quitina e quito-oligômeros, resultando na liberação de quito-oligômeros de cadeia curta. As enzimas das famílias GH18 e GH19 não compartilham similaridade de sequências de aminoácidos, apresentam estruturas tridimensionais diferentes e diferentes mecanismos catalíticos (Seidl 2008), o que sugere que estas enzimas não sejam derivadas de uma mesma proteína ancestral (Hamel et al. 1997). Além disso, de acordo com o seu padrão de clivagem, as quitinases podem ser divididas em endoquitinases e exoquitinases. Endoquitinases degradam a quitina a partir de qualquer ponto ao longo da cadeia polimérica formando produtos de tamanho aleatório, enquanto exoquitinases clivam a partir da extremidade não-redutora e o produto liberado é a quitobiose [(GlcNAc)2] (Seidl 2008) (Figura 2).
Os papéis desempenhados pelas quitinases nos organismos que as produzem são diversos (Duo-Chuan 2006). Em bactérias, as quitinases permitem a digestão da quitina para a sua utilização como fonte de carbono e energia e ciclagem de quitina na natureza (Park et al. 1997). Em insetos, quitinases estão associadas ao desenvolvimento pós-embrionário e a degradação de exoesqueleto
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velho (Merzendorfer & Zimoch 2003). Em plantas, a produção de quitinases é um dos mecanismos de defesa disparados em resposta ao ataque de fitopatógenos (Sahai & Manocha 1993). Quitinases codificadas por vírus de insetos exercem papéis na patogênese sobre os seus hospedeiros (Patil et al. 2000) e as sintetizadas por humanos podem atuar na defesa contra patógenos quitinosos (Boot et al. 2001; Boot et al. 2005). Em fungos, as quitinases apresentam papéis autolítico, nutricional, morfogenético e parasitário (Duo-Chuan 2006), conforme será tratado mais detalhadamente na seção seguinte.
1.2 Maquinaria quitinolítica de fungos
Tipicamente, fungos filamentosos contêm entre 10 e 25 quitinases que pertencem exclusivamente à família GH18 (Seidl 2008). A estrutura básica destas quitinases inclui cinco domínios (Figura 3): a região do peptídeo sinal de secreção N-terminal, o domínio catalítico, uma região rica em resíduos de serina/treonina, o domínio de ligação à quitina e uma extensão C-terminal (Kuranda & Robbins 1991). Vale ressaltar, no entanto, que os três últimos domínios não estão presentes em todas as quitinases de fungos.
Figura 3: Representação esquemática da estrutura básica das quitinases de fungos, pertencentes à família GH18, destacando os cinco domínios que tipicamente as constituem. É importante salientar que a figura ilustra o plano básico das quitinases de fungos e que os três últimos domínios não estão necessariamente presentes em todas as enzimas.
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No domínio catalítico, responsável pela hidrólise do substrato, são observadas duas regiões altamente conservadas cujas sequências consenso são SxGG e DxxDxDxE (Henrissat 1991). Yang e colaboradores (2010) demonstraram que os resíduos de aminoácidos dessas regiões são essenciais para o mecanismo catalítico das quitinases da família GH18, envolvendo-se diretamente na catálise ou atuando no posicionamento do substrato. A região rica em serina/treonina está usualmente glicosilada nas proteínas maduras, e tal modificação pós-traducional pode ser necessária para a secreção e manutenção da estabilidade das quitinases (Kuranda & Robbins 1991). O domínio de ligação à quitina (ChBD) é responsável pelo ancoramento das quitinases ao seu substrato ou à parede celular dos fungos e determina a especificidade destas enzimas pela quitina (Kuranda & Robbins 1991). É importante esclarecer que tal domínio representa um módulo adicional de interação das quitinases com o substrato e, portanto, enzimas nas quais ele está ausente também são capazes de se ligar à quitina. Esta ligação se faz por meio de resíduos aromáticos conservados presentes no domínio GH18, os quais margeiam a fenda catalítica e medeiam a interação com o substrato (Zakariassen et al. 2009; Papanikolau et al. 2001; Watanabe et al. 2003; Fusetti et al. 2002). A função da região C-terminal das quitinases de fungos ainda não está clara (Duo-Chuan 2006).
As funções biológicas e fisiológicas exercidas por quitinases em fungos incluem a participação na morfogênese da parede celular (Sahai & Manocha 1993), degradação de quitina exógena para obtenção de nutrientes (fungos micoparasitas e entomopatogênicos) e competição e defesa contra outros fungos e artrópodes nos ambientes naturais (Seidl 2008). A importância central das quitinases no desenvolvimento de fungos é ilustrada pelo fato da disrupção do gene da quitinase CTS1 de Saccharomyces cerevisiae resultar em falha na separação das células após a divisão mitótica (Kuranda & Robbins 1991). Em Aspergillus nidulans, a disrupção do gene da quitinase ChiA resulta em redução na frequência de germinação de esporos, bem como em comprometimento no crescimento das hifas (Takaya et al. 1998). Apesar das variadas funções atribuídas a quitinases, nunca foi descrita uma quitinase fúngica com função direta na patogenicidade de fungos fitopatógenos.
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2. Hipóteses para a função da quitinase Mp-Chi na patogenicidade de M. perniciosa Durante a análise do Atlas Transcriptômico da vassoura de bruxa, foram identificados vários genes expressos por M. perniciosa in planta, conforme descrito anteriormente, entre os quais está o da quitinase Mp-Chi (Teixeira et al. 2014). Este gene é alta e exclusivamente expresso na fase biotrófica da doença (Tabela 1) e a proteína codificada por ele apresenta no seu sítio ativo uma glutamina (Q167) em vez
do glutamato (E167) encontrado nas enzimas da família GH18 (Figura 4).
Notavelmente, tal alteração já foi artificialmente realizada em quitinases de diversos organismos (como tabaco, feijão, Bacillus circulans e Trichoderma harzianum), resultando em perda da atividade quitinolítica da enzima em todos os casos (Ohnuma et al. 2011; Hennig et al. 1995; Watanabe et al. 1993; Boer et al. 2007). Um segundo resíduo altamente conservado nas quitinases desta família (M238) está
substituído por uma leucina (L238) na sequência da Mp-Chi. Tal metionina está
indiretamente envolvida com o mecanismo catalítico destas enzimas (participa da estabilização de intermediários de reação), havendo redução de atividade hidrolítica de dez vezes quando da sua troca por alanina (Rao et al. 2005). Desta forma, é altamente provável que a quitinase identificada em M. perniciosa não apresente atividade quitinolítica. Contrariamente aos aminoácidos catalíticos, os resíduos aromáticos que medeiam a ligação à quitina encontram-se conservados na proteína Mp-Chi. Tais informações tornam plausível inferir que ela possa se ligar à quitina da parede celular de M. perniciosa e bloquear estericamente as quitinases secretadas pelo cacaueiro em resposta à infecção, constituindo-se em um fator de virulência com papel na colonização da planta por M. perniciosa. Alternativamente, é possível que a Mp-Chi atue dificultando a percepção do patógeno pela planta através da ligação e sequestro de quito-oligômeros elicitores. Apesar desses dois mecanismos mediados por efetores já terem sido reportados (de Jonge et al. 2010; Marshall et al. 2011; Mentlak et al. 2012), a execução destas funções por uma quitinase é inédita e ilustra a relevância da diversificação funcional das proteínas para a elaboração das estratégias de patogenicidade desses organismos.
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Tabela 1. Genes mais expressos por M. perniciosa durante a sua interação com o cacaueiro (fase biotrófica da vassoura de bruxa). Os valores de expressão gênica, dados em RPKM (Reads por Kilobase de modelo de exon por Milhão de reads mapeados), indicam que o gene Mp-chi (MP09537) é altamente expresso pelo micélio biotrófico do fungo, sugerindo a sua importância durante a infecção. Os dados apresentados na tabela foram obtidos a partir da metodologia de RNA-seq e são parte do Atlas Transcriptômico da vassoura de bruxa (Teixeira et al. 2014).
Figura 4: Alinhamento do domínio catalítico de quitinases da família GH18. É possível notar a existência de um resíduo de metionina altamente conservado, destacado em verde, similarmente aos aminoácidos da região catalítica, destacados em amarelo. Este elevado grau de conservação sugere que tal resíduo desempenha um papel crucial na hidrólise da quitina mediada por tais enzimas. A Mp-Chi possui substituições tanto do glutamato catalítico (E167→Q) quanto da metionina (M238→L), destacadas em vermelho e
rosa, respectivamente, as quais, em conjunto, podem ser determinantes para a ausência de atividade quitinolítica apresentada por ela. A sequência consenso mostrada na figura destaca apenas a metionina conservada e o motivo catalítico das quitinases da família GH18. Códigos de acesso no Uniprot: Aphanocladium album CHI1=P32470; Bacillus circulans CHIA1=P20533; Bos taurus CHIA=Q95M17; Brugia malayi CHIT=P29030;
Trichoderma harzianum CHIT42=P48827; Homo sapiens CHI1=13231; Streptomyces plicatus CHTA=P11220; B. circulans CHIC=P94289.
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3. Identificação de quitinases potencialmente relacionadas à patogenicidade em outros fungos fitopatogênicos
A manipulação dos mecanismos imunes de plantas dirigidos à quitina por fungos fitopatogênicos é conhecida em interações biotróficas e hemibiotróficas (de Jonge et al. 2010; Mentlak et al. 2012), representando uma estratégia de patogenicidade importante para o sucesso da infecção. O provável envolvimento da Mp-Chi nesta função durante a vassoura de bruxa nos levou a hipotetizar que quitinases de outros fitopatógenos fúngicos possam ter sofrido um redirecionamento funcional similar e desempenhar a mesma função em outros patossistemas. De fato, fungos filamentosos apresentam tipicamente mais de uma dezena de quitinases em seus genomas, o que pode favorecer o aparecimento de versões mutadas e neofuncionalização. Frente a isso, buscas em bancos de dados públicos e na literatura científica foram conduzidas visando identificar em outros fungos quitinases potencialmente inativas e com expressão induzida durante a interação deles com seus hospedeiros.
Notavelmente, a análise de dados de expressão gênica de Moniliophthora
roreri (espécie-irmã de M. perniciosa e também patógeno do cacaueiro) revelou a
existência de uma quitinase (MR04303) potencialmente inativa entre os genes diferencialmente induzidos pelo fungo durante a interação com o cacaueiro. Curiosamente, esta quitinase apresenta uma substituição no motivo catalítico diferente da observada na quitinase de M. perniciosa (DxxDxNxE) e não é ortóloga à Mp-Chi (Figura 5). A proteína homóloga à Mp-Chi de M. roreri (MR05413), no entanto, não exibe alterações nos resíduos envolvidos com a catálise enzimática. Este cenário sugere que as quitinases Mp-Chi e MR04303 sofreram inativação independentemente e que poderiam ter sido posteriormente convertidas em proteínas de patogenicidade com a mesma função, ilustrando um notório exemplo de convergência evolutiva. Dada a relevância deste tópico, ambas as quitinases de
M. roreri, MR04303 e MR05413, foram incluídas neste trabalho e estudadas
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Figura 5: M. roreri, espécie-irmã de M. perniciosa, também possui uma quitinase potencialmente inativa fortemente induzida durante a interação com seu hospedeiro. (a) Alinhamento do domínio catalítico de quitinases da família GH18. A quitinase MR04303, de M.roreri, apresenta uma substituição não conservativa (D135→N) no
motivo catalítico DxxDxDxE, destacada em vermelho, a qual potencialmente levaria à perda da atividade quitinolítica. A sequência da Mp-Chi, com os seus resíduos substituídos também destacados em vermelho, foi incluída neste alinhamento para comparação. Códigos de acesso no Uniprot: Homo sapiens CHIT1 = Q13231;
Serratia marcescens CHIA = P07254; Neosartorya fumigata CHIB1 = Q873X9; Bionectria ochroleuca CrChi1 =
A9LI60; Serratia marcescens CHIB = P11797; Bacillus circulans CHIA1 = P20533; Bacillus circulans CHIC = P94289. (b) Agrupamento filogenético de quitinases preditas de M. perniciosa e M. roreri. As quitinases que apresentam substituições não conservativas no motivo catalítico DxxDxDxE (Mp-Chi e MR04303) estão destacadas em vermelho. O fato delas não estarem dispostas em ramos terminais adjacentes indica que estas proteínas não são ortólogas (derivadas de uma mesma proteína ancestral). Figura: Dr. Paulo José P. L. Teixeira. (c) Expressão do gene MR04303 em frutos de cacaueiro infectados por M. roreri (30 dias após inoculação [estágio biotrófico] e 60 dias após inoculação [estágio necrotrófico]). Similarmente à Mp-Chi, esta quitinase é altamente expressa durante a fase biotrófica da infecção. Os valores indicados no eixo vertical são dados em RPKM (Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads). A barra apresentada indica o erro padrão associado as medidas de expressão do gene MR04303 (três réplicas).
Outra quitinase possivelmente envolvida com patogenicidade foi identificada em Melampsora larici-populina, um basidiomiceto biotrófico que causa ferrugem foliar em álamos (Populus spp.). A quitinase deste patógeno (Mellp1-104278) apresenta três dos quatro resíduos do motivo catalítico substituídos (Figura 6), o que presumivelmente implica em ausência de capacidade hidrolítica. Além disso, o gene de tal proteína figura entre os mais fortemente induzidos em folhas infectadas de álamo (Duplessis et al. 2011), o que sugere o envolvimento da
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proteína em algum processo importante para a infecção. Diante dessas evidências, a quitinase Mellp1-104278 foi incluída no trabalho.
Figura 6: A quitinase Mellp1-104278 de M. larici-populina, similarmente à Mp-Chi, é presumivelmente inativa e é diferencialmente induzida in planta. (a) Alinhamento do domínio catalítico de quitinases da família GH18. A quitinase Mellp1-104278 apresenta três substituições no motivo catalítico DxxDxDxE, destacadas em vermelho, as quais potencialmente levariam à perda da atividade quitinolítica. A sequência da Mp-Chi, com os seus resíduos substituídos também destacados em vermelho, foi incluída neste alinhamento para comparação. Códigos de acesso no Uniprot: Bacillus circulans CHIC = P94289; Bacillus circulans CHIA1 = P20533; Serratia
marcescens CHIB = P11797; Bionectria ochroleuca CrChi1 = A9LI60; Neosartorya fumigata CHIB1 = Q873X9; Serratia marcescens CHIA = P07254; Homo sapiens CHIT1 = Q13231. (b) Expressão do gene Mellp1-104278
em folhas infectadas de Populus sp. e em esporos não germinados. A indução do gene é notável durante a interação do fungo com o seu hospedeiro. Os dados de expressão foram obtidos em Duplessis et al. 2011.
4. Toolkit para caracterização funcional da Mp-Chi
Com o intuito de disponibilizar controles e condições experimentais robustas para os diversos testes funcionais envolvidos neste trabalho, buscamos proteínas adicionais às que seriam objeto direto de caracterização (Mp-Chi, MR04303, MR05413 e Mellp1-104278).
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Para avaliar o possível efeito protetor da Mp-Chi em relação a enzimas hidrolíticas com maior solidez e contundência, decidimos utilizar quitinases de T.
cacao nos experimentos dedicados a verificar esta função. Para tanto, uma quitinase
da família GH18 (Tc-GH18) e uma da família GH19 (Tc-GH19), ambas fortemente induzidas pela planta durante a fase biotrófica da vassoura de bruxa, foram selecionadas para expressão heteróloga. Como controle para o procedimento de expressão e purificação, incluímos no trabalho a quitinase Cr-Chi1 de Clonostachys
rosea (fungo nematófago), a qual foi previamente expressa com sucesso em sistema
heterólogo bacteriano (Yang et al. 2010). Além disso, expressamos e purificamos as proteínas efetoras Cf-Avr4 e Cf-Ecp6 de C. fulvum, que exibem capacidade de proteção de parede celular e de bloqueio da ativação da imunidade vegetal desencadeada por quitina, respectivamente. O fato das funções dessas proteínas já estarem bem caracterizadas na literatura (van den Burg et al. 2006; de Jonge et al. 2010) tornam-nas controles positivos ideais para ensaios funcionais. Também, como uma ferramenta para caracterização minuciosa da quitinase de M. perniciosa, produzimos uma versão mutante da Mp-Chi na qual três dos dez resíduos de ligação à quitina estão substituídos por alaninas (Figura 7). É esperado que tal proteína, chamada Mp-Chi-MBS (Mutated Binding Site), apresente afinidade reduzida à quitina, permitindo avaliar a importância da ligação a este carboidrato para a função da Mp-Chi. Versões mutantes com os resíduos catalíticos restaurados (Q167→E,
L238→M e duplo-mutante) também foram geradas para auxiliar o estudo da função
catalítica da Mp-Chi.
Figura 7: Sequência de aminoácidos predita da quitinase Mp-Chi. O domínio GH18 está destacado em amarelo. Os resíduos mostrados em verde correspondem aos sabidamente envolvidos com a ligação à quitina. Os três triptofanos escritos em vermelho são os que foram substituídos por alanina na Mp-Chi-MBS.
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OBJETIVOS
Objetivo geral
Este trabalho teve como objetivo verificar se a quitinase Mp-Chi de M.
perniciosa representa uma ferramenta de evasão deste fungo fitopatogênico do
sistema imune do cacaueiro durante a fase biotrófica da vassoura de bruxa. Objetivos específicos
1. Clonagem, expressão heteróloga e purificação da Mp-Chi e demais proteínas incluídas no trabalho;
2. Realização de testes de atividade quitinolítica com as quitinases recombinantes;
3. Avaliação da capacidade de ligação das proteínas heterólogas à quitina;
4. Avaliação da capacidade da quitinase de M. perniciosa de proteger a parede celular fúngica contra a ação de enzimas hidrolíticas in vitro;
5. Avaliação da capacidade da quitinase Mp-Chi de prevenir a ativação da resposta de defesa vegetal desencadeada por quitina in vitro;
MATERIAIS E MÉTODOS
1. Material biológico
O isolado BP10 de M. perniciosa foi utilizado para o isolamento do gene
Mp-chi e a variedade Catongo de cacaueiro foi utilizada para isolamento dos genes Tc-gh18 e Tc-gh19. As cepas DH10b e DH5α de Escherichia coli foram utilizadas
nas etapas de clonagem dos genes codificadores das proteínas estudadas. Para expressão das proteínas recombinantes foram testadas as cepas de E. coli BL21(DE3) pT-groES, Rosetta 2 (DE3), Origami 2 (DE3), SHuffle T7 e C41 (DE3). A análise do perfil de expressão do gene Mp-chi foi realizada a partir da investigação de 35 bibliotecas do Atlas Transcriptômico da vassoura de bruxa (Teixeira et al. 2014), as quais caracterizam diversos estágios da doença, tecidos do fungo e condições de crescimento dele in vitro e in planta. Nos testes de alcalinização de suspensões celulares, foram usadas células de tabaco (Nicotiana tabacum) da variedade BY-2 (Bright-Yellow 2). Nos testes de proteção de esporos, testes de
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proteção de hifas e testes de germinação de esporos, foram usados esporos de
Trichoderma viride, Trichoderma sp. e Trichoderma reesei, respectivamente.
2. Isolamento e clonagem dos genes
Os genes Mp-chi e Tc-gh19 foram isolados a partir de cDNA de ramos infectados (“vassouras verdes”) de plantas jovens de cacaueiro, cultivadas em casa de vegetação (Teixeira et al. 2014). O gene Tc-gh18 foi obtido a partir de DNA genômico de M. perniciosa, enquanto MR05413, Cr-chi1 e Cf-avr4 foram obtidos a partir de vetores de clonagem contendo tais genes (pEX-K2, pEX-K e pENTR™, respectivamente). Para todos esses genes, a amplificação foi realizada através de reações de PCR (Polymerase Chain Reaction), nas quais foram utilizados a Pfu
DNA polymerase (Fermentas) e primers específicos (Tabela 2). Os produtos das
reações de PCR foram adenilados conforme protocolo padrão e então ligados no vetor pGEM T-Easy (Promega). Os constructos gene – pGEM foram utilizados para transformação de E. coli DH10b ou DH5α por eletroporação. Após plaqueamento em meio contendo o antibiótico ampicilina (100 µg/mL), seleção de colônias positivas para a presença dos genes (sistema de seleção azul-branco – α complementação) e inóculo destas em meio LB (10g/L de peptona, 5g/L de extrato de levedura e 5g/L de NaCl) para crescimento overnight, foi realizado o isolamento do DNA plasmideal através de minipreparação por lise alcalina (Sambrook et al. 1989). Em seguida, os vetores contendo os genes foram digeridos com enzimas de restrição (indicadas na Tabela 2). Os fragmentos liberados pelas digestões foram isolados a partir de eletroforese em gel de agarose e purificados para subclonagem em uma versão modificada do vetor de expressão pET-SUMO (Invitrogen), à qual foi adicionada uma cauda de histidina N-terminal para auxiliar o procedimento de purificação. Os genes
Mp-chi-MBS, MR04303 e Mellp1-104278 foram sintetizados (GenScript, EUA) com
sítios de restrição nos flancos e puderam ser diretamente digeridos e ligados em pET-SUMO. O clone Cf-ecp6_pET-SUMO utilizado neste trabalho foi gentilmente fornecido pelo grupo do Prof. Dr. Bart Thomma (Wageningen University, Holanda).
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Tabela 2: Primers utilizados para isolamento dos genes das proteínas utilizadas neste trabalho. Os genes Mp-chi-MBS, MR04303 e Mellp1-104278 foram sintetizados com sítios de restrição apropriados para clonagem no vetor SUMO e, portanto, não precisaram ser amplificados. O gene Cf-ecp6 clonado em pET-SUMO foi gentilmente fornecido pelo grupo do Prof. Dr. Bart Thomma (Wageningen University, Holanda) e também não foi alvo de amplificação.
3. Mutações sítio-dirigidas
Para a realização das mutações Q167→E e L238→M, que envolvem as
substituições de códons CAG-3’ → GAA-3’ (glutamina para glutamato) e 5’-CTA-3’ → 5’-ATG-3’ (leucina para metionina), foi utilizado o kit QuickChange®
Site-Directed Mutagenesis Kit (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante.
Os constructos Mp-chi – pGEM foram submetidos a uma reação de PCR utilizando a
Pfu DNA polymerase (Fermentas) e os primers para inserção das mutações
indicados na Tabela 3.
Tabela 3: Sequências dos primers utilizados para realização das mutações sítio-dirigidas Q167→E e
L238→M.
ID Primer Forward (5'-3') Primer Reverse (5'-3') Descrição
Mp-chi_SDM_Q167E CTGGACGTAGACTGGGAATCCCCTAATAAATTA TAATTTATTAGGGGATTCCCAGTCTACGTCCAG Substituição Q167→E no gene Mp-chi
Mp-chi_SDM_L238M GATCACGTCACCCCTATGCTCTACGACGTCTG CAGACGTCGTAGAGCATAGGGGTGACGTGATC Substituição L238→M no gene Mp-chi
Os produtos das reações de PCR foram tratados com a enzima de restrição DpnI, a qual cliva especificamente DNA metilado (sítio-alvo de restrição: 5’- Gm6ATC
-3’) e que, portanto, eliminou todo o DNA plasmideal não mutado utilizado (DNA molde, isolado de bactérias e, portanto, metilado), restando apenas construções contendo as mutações (moléculas de DNA geradas in vitro e, portanto, não metiladas). O procedimento gerou plasmídeos mutantes contendo nicks que
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impedem o seu fechamento circular. Os plasmídeos mutados foram então inseridos em E. coli DH5α por eletroporação para reparo dos nicks (circularização dos plasmídeos) e clonagem. As sequências de nucleotídeos dos produtos das mutações sítio-dirigidas foram verificadas através de sequenciamento Sanger. A versão duplo-mutante do gene Mp-chi (Mp-chi-Q167E_L238M) foi obtida a partir da inserção da substituição 5’-CTA-3’ → 5’-ATG-3’ (leucina para metionina) em um clone Mp-chi-Q167E.
4. Expressão e purificação das proteínas recombinantes
4.1 Expressão em pequena escala
A fim de determinar as condições ideais para a expressão heteróloga das proteínas recombinantes, foram realizados testes de expressão em pequena escala através dos quais foram avaliadas diversas combinações dos seguintes fatores: (1) cepa de E. coli utilizada na expressão; (2) temperatura; (3) tempo de indução; (4) concentração de indutor (IPTG). Foram testadas as cepas E. coli BL21(DE3) pT-groES, Rosetta 2 (DE3), Origami 2 (DE3); SHuffle T7 e C41 (DE3); as temperaturas de 15°C, 18°C, 30°C e 37°C; induções de 3 horas e overnight (~16 horas); e 1mM, 0.2mM e 0.05mM de IPTG.
Em cada teste, bactérias previamente transformadas por eletroporação com o vetor de expressão pET-SUMO contendo o gene de interesse foram inoculadas em meio de cultura LB (10g/L de peptona, 5g/L de extrato de levedura e 5g/L de NaCl) e mantidas a 37°C sob agitação de 250 rpm durante 16 horas. Parte desta cultura foi adicionada a 5mL de meio LB de maneira a ser atingida uma OD600
inicialde 0,1. Estas culturas foram então mantidas a 37°C sob agitação de 250 rpm. Quando a fase exponencial de crescimento foi alcançada (OD600 entre 0,6 e 1,0),
coletou-se uma alíquota de 1mL (amostra não-induzida) e adicionou-se IPTG aos 4 mL de meio restantes para se obter concentrações finais de 0.05mM, 0.2mM ou 1.0mM na cultura. Alíquotas da indução foram coletadas após 3 horas e cerca de 16 horas (overnight). As bactérias contidas em cada alíquota foram lisadas através de choque térmico (ressuspensão em solução de lise [ 3 mM KH2PO4, 47 mM K2HPO4, 400 mM NaCl, 100 mM KCl, 10 mM imidazol, 10% {v:v} glicerol e 0.5% {v:v} Triton X-100; pH 7.8] seguida de três ciclos de congelamento em nitrogênio líquido e descongelamento a 42°C) seguido de tratamento com lisozima (1 mg/mL
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por 30 min a 0°C). As frações proteicas solúvel e insolúvel foram analisadas por SDS-PAGE utilizando coloração com Coomassie-Brilliant Blue.
4.2 Expressão em larga escala e purificação
Para a expressão em larga escala das proteínas foram utilizadas as condições indicadas na Tabela 4. O procedimento de expressão foi realizado da mesma forma que nos testes de pequena escala, aumentando-se apenas o volume do inóculo de 5mL para 1L. As bactérias das culturas induzidas foram coletadas através de centrifugação a 5000 x g por 15min e seus pellets ressuspendidos em 20mL de tampão de lise (50 mM Tris-HCl pH 8.5, 300 mM NaCl, 10% glicerol[v/v], 6mg/mL lisozima, 2mg/mL desoxicolato de sódio, 20 µg/mL DNase, 1 mM PMSF) para cada litro de cultura. Após a centrifugação do produto da lise a 18000 x g por 45 min a 4°C, coletou-se o sobrenadante para realização da purificação das proteínas heterólogas e o pellet para aplicação no gel de poliacrilamida (fração insolúvel).
Inicialmente, a purificação das proteínas recombinantes foi realizada por cromatografia de afinidade a metal (CAM) utilizando 1mL da resina TALON® (Clontech Laboratories, Inc.) para cada litro de cultura induzida. Primeiramente, o sobrenadante foi carregado na coluna previamente equilibrada com dois volumes de resina (VR) de binding buffer (50 mM Tris-HCl pH 8,5 e 300 mM NaCl) e o flow
through foi coletado e armazenado a 4°C. Após a lavagem da coluna com 10 VR de binding buffer, foram passados volumes de 5 VR de tampão de eluição (50 mM
Tris-HCl pH 8,5 e 300 mM NaCl) com concentrações crescentes de imidazol (20 mM, 50 mM, 100 mM e 300 mM) e os eluatos foram coletados e armazenados a 4°C. Todas as frações eluídas foram analisadas por SDS-PAGE.
Uma vez identificadas as frações eluídas que contêm as proteínas recombinantes purificadas, fez-se a diálise delas em tampão Tris-HCl/NaCl (50 mM Tris-HCl pH 8,5 e 25 mM NaCl), para retirada do imidazol, e digestão das proteínas com a protease ULP-1 a 4°C durante cerca de 16 horas, a fim de se remover a His-Tag e a sequência SUMO (codificadas pelo vetor pET-SUMO) expressas fusionadas às suas extremidades N-terminais. Em seguida, os produtos das digestões foram submetidos à purificação na mesma coluna cromatográfica e através da mesma estratégia empregada anteriormente. A passagem do material digerido pela coluna permitiu a separação das proteínas recombinantes das sequências His-Tag +
