Análise de expressão do gene Mp-chi

O gene da quitinase de M. perniciosa tem expressão elevada in planta, principalmente nos estágios iniciais da doença, nos quais a planta hospedeira responde intensamente à infecção (Figura 8).

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Figura 8: Expressão do gene Mp-chi (MP09537), dada em RPKM (Reads Per Kilobase of transcript per Million mapped reads), em 35 bibliotecas do Atlas Transcriptômico da

vassoura de bruxa (Teixeira et al. 2014) utilizadas na análise de expressão gênica. Nota-se que o gene da quitinase de M. perniciosa é altamente expresso in planta, destacadamente no estágio biotrófico da doença (vassoura verde). Com a progressão da doença e necrose da planta infectada, há redução da expressão do gene Mp-chi.

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2. Isolamento e clonagem dos genes

O gene Mp-chi, de 1588 pb (transcrito de 1317 pb), foi amplificado com sucesso a partir de cDNA de vassoura verde (Figura 9), conforme esperado devido a sua elevada expressão durante este estágio da doença. O gene Tc-gh18 (903 pb) foi satisfatoriamente amplificado a partir de DNA genômico de T. cacao, mas não a partir de cDNA de vassoura verde (Figura 5). Uma vez que o modelo gênico predito para Tc-gh18 indica a ausência de íntrons interpostos a sua sequência codante, foi possível empregar os amplicons gerados usando DNA genômico na etapa de clonagem subsequente. Diferentemente, o gene Tc-gh19 (966 pb) foi amplificado com sucesso tanto a partir do cDNA quanto do DNA genômico. Os genes MR05413 (1238 pb), Cr-chi1 (1232 pb) e Cf-avr4 (366 pb) foram amplificados de forma bem- sucedida a partir de seus respectivos vetores de origem. As digestões dos vetores contendo os genes Mp-chi-MBS (1317 pb), MR04303 (1164 pb) e Mellp1-104278 (1494 pb) também foram realizadas com sucesso. A integridade das sequências dos genes clonados nos vetores pGEM T-Easy e pET-SUMO foi confirmada através de sequenciamento de DNA.

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Figura 9: Isolamento dos genes através de amplificação por PCR ou digestão. As setas vermelhas presentes nas lanes contendo múltiplas bandas indicam aquelas utilizadas para clonagem. Os marcadores de peso molecular utilizados foram o 1 kb DNA ladder (Invitrogen) e o GeneRuler 1 Kb (Thermo Scientific). Os números à esquerda das lanes dos marcadores indicam as massas moleculares das bandas, em pares de base. CTRL- = controle negativo das reações.

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3. Mutações sítio-dirigidas

As mutações sítio-dirigidas Q167_{→E e L}238_{→M, realizadas para a}

restauração dos resíduos conservados do domínio GH18 na Mp-Chi, envolveram substituições de dois nucleotídeos na sequência nativa do gene, gerando-se um códon de glutamato em lugar de glutamina e metionina em lugar de leucina, respectivamente. A inserção das mutações foi confirmada através de sequenciamento de DNA (Figura 10). Nenhuma outra região do gene foi alterada (dados não mostrados).

Figura 10: Apresentação esquemática dos cromatogramas gerados pelo sequenciamento do gene Mp- chi e cada uma das suas versões mutadas, ilustrando a introdução bem-sucedida das mutações Q167_{→E e} L238_→M.

4. Expressão e purificação das proteínas recombinantes

4.1 Expressão em pequena escala

Buscando obter proteínas expressas em forma solúvel e em quantidades suficientes para a realização dos ensaios funcionais, foram testadas variações na temperatura de indução, concentração de indutor (IPTG), tempo de indução e cepa de E. coli utilizada para expressão. Os resultados obtidos estão sumarizados na Tabela 5. As proteínas Mellp1-104278, Cr-Chi1 e Tc-GH18 não foram expressas em

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forma solúvel em nenhuma das condições experimentais avaliadas, o que impossibilitou a inclusão delas nos testes funcionais. Diferentemente, as demais proteínas foram obtidas em forma solúvel e puderam ser expressas em larga escala para purificação e uso nos ensaios funcionais.

Tabela 5: Sumário dos resultados obtidos nos testes de expressão das proteínas heterólogas. À direita estão indicadas as condições mais apropriadas para expressão de cada uma das proteínas em forma solúvel. Tais condições foram utilizadas nos experimentos de expressão em larga escala.

Cepa Temperatura (°C) [] IPTG (mM) Tempo Indução

Mp-Chi 47 Solúvel Origami 2 18 0,05 Overnight

Mp-Chi-Q167E 47 Solúvel Origami 2 18 0,05 Overnight

Mp-Chi-L238M 47 Solúvel Origami 2 18 0,05 Overnight

Mp-Chi-Q167E_L238M 47 Solúvel Origami 2 18 0,05 Overnight

Mp-Chi-MBS 47 Solúvel Origami 2 18 0,05 Overnight

Mellp1-104278 58 Insolúvel - - - -

MR04303 45 Solúvel SHuffle T7 18 0,2 Overnight

MR05413 49 Solúvel SHuffle T7 18 0,05 Overnight

Cr-Chi1 48 Insolúvel - - - -

Cf-Avr4 16 Solúvel SHuffle T7 18 1 Overnight

Cf-Ecp6 24 Solúvel Origami 2 18 0,2 Overnight

32 - - - - 0,05 Overnight Tc-GH18 Solúvel/Insolúvel Solúvel Insolúvel Proteína Massa Molecular Predita (kDa)

Melhor condição de expressão testada

Tc-GH19 35 Origami 2 30

4.2 Expressão em larga escala e purificação

Ilustrativamente, serão apresentados nesta seção resultados da expressão em larga escala e purificação da Mp-Chi, que são representativos dos resultados obtidos para as demais proteínas.

A figura 11 mostra a composição proteica do extrato celular não induzido e do induzido utilizado em uma das purificações da Mp-Chi, além do conteúdo de proteínas das frações eluídas durante a purificação. Na cultura não induzida com IPTG (NI) é esperado que não haja proteína recombinante, conforme observado na figura. Já na cultura induzida (I), espera-se que exista grande quantidade da proteína recombinante. É desejável que ela esteja presente principalmente na fração

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solúvel (S), que é a carregada na coluna cromatográfica para purificação. Apesar da Mp-Chi ser encontrada na fração insolúvel em quantidades relativamente altas, a massa dela expressa de forma solúvel é suficientemente elevada para permitir a purificação da proteína necessária para os testes funcionais.

NI _{S P} I 70 100 55 40 35 25 57

Figura 11: Extratos celulares e frações eluídas durante a purificação da Mp-Chi. Grande parte da proteína recombinante (~57 KDa) foi eluída através da passagem das soluções de eluição com 150mM e 500mM de imidazol, conforme pode-se notar devido a intensidade das bandas nas duas últimas lanes. A fração solúvel da cultura induzida com IPTG corresponde à fração do extrato celular carregada na coluna cromatográfica. O marcador de peso molecular utilizado foi o Page Ruler™ Prestained Protein Ladder, da Fermentas. Os números à esquerda da lane do marcador indicam as massas moleculares das bandas, em kDa. NI= não induzido; I= induzido; S= sobrenadante (fração solúvel); P= pellet (fração insolúvel).

O flow through corresponde à fração que contém as proteínas com baixa afinidade pela matriz cromatográfica, as quais atravessam a coluna de purificação sem aderir a ela. A absoluta maioria dos componentes do proteoma de E. coli estão incluídos nesta fração. Espera-se que as proteínas recombinantes, que apresentam uma cauda de histidina (His-Tag) pela qual a matriz cromatográfica tem grande afinidade, permaneçam retidas na coluna e não estejam presentes nesta fração. Na lavagem são observadas as proteínas que se ligaram de forma inespecífica à matriz. Como tal fração contém apenas proteínas que interagem muito fracamente com a coluna, também não é esperada a presença da quitinase neste volume.

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Os eluatos, que apresentam concentrações crescentes de imidazol, consistem nas frações que incluem proteínas capazes de se ligar com afinidade intermediária e alta à matriz de cobalto. Quanto maior é a concentração de imidazol necessária para eluir um dado ligante da coluna, maior é a afinidade dele por ela. Isto se deve ao fato da eluição ser resultado da competição entre o ligante e o imidazol pelos sítios de ligação da matriz cromatográfica. É possível notar que a Mp- Chi, nesta purificação, foi eluída a partir da aplicação de 150mM e de 500mM de imidazol, conforme é esperado devido a elevada afinidade da matriz cromatográfica pela His-Tag da proteína recombinante.

Após cada purificação, foi realizada a diálise e digestão da proteína recombinante com a protease ULP-1, liberando-se o peptídeo His-Tag + SUMO (~10 KDa) da cadeia polipeptídica da proteína (~47 KDa). A fim de separar os fragmentos gerados por esta digestão, foi empregada novamente a coluna de cromatografia de afinidade. A eficiência da separação do material digerido foi verificada por SDS- PAGE (Figura 12).

52 70 100 55 40 35 25 57

Figura 12: Produto da digestão da proteína recombinante Mp-Chi purificada com ULP-1 e frações eluídas da coluna cromatográfica durante a separação do peptídeo His-Tag + SUMO, indicado pela seta preta, da cadeia polipeptídica da proteína recombinante (~47kDa), apontada pela seta vermelha. Pode-se notar que esta estratégia de separação foi efetiva, dado que a fração em que a proteína foi eluída não apresenta resíduos do peptídeo. As bandas situadas acima da formada pela proteína clivada são resultado de digestão parcial da proteína purificada. O marcador de peso molecular utilizado foi o Page Ruler™ Prestained Protein Ladder, da Fermentas. Os números à esquerda da lane do marcador indicam as massas moleculares das bandas, em kDa.

O flow through e a lavagem incluem, respectivamente, proteínas que não se ligam à matriz cromatográfica e que se ligam fracamente a ela. Uma vez que o material carregado na coluna, graças à qualidade da purificação, contém apenas os produtos da digestão da proteína recombinante, os quais interagem com média e alta afinidade com a matriz, não se deve esperar a presença de qualquer proteína nestas duas frações da purificação. De fato, não é possível observar qualquer banda nas lanes correspondentes a tais frações na Figura 12.

Nesta purificação, grande parte da Mp-Chi foi eluída com 50mM de imidazol, enquanto que o peptídeo His-Tag + SUMO foi liberado da coluna após a aplicação de 150mM de imidazol, possibilitando a separação deles. Isto se deve a grande diferença entre as afinidades desses dois ligantes à coluna. Vale ressaltar que, neste ponto, como já houve a remoção da His-Tag, a quitinase interage com a matriz cromatográfica apenas através dos núcleos imidazólicos das histidinas componentes da sua própria estrutura primária, o que a torna mais facilmente removível da coluna de purificação quando comparada ao peptídeo His-Tag +

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SUMO ou à proteína recombinante não digerida, os quais são eluídos a partir de concentrações de 100mM de imidazol.

5. Análise de dicroísmo circular (CD)

No sentido de verificar se as proteínas heterólogas purificadas estavam propriamente enoveladas, analisamos o comportamento óptico delas em solução através de dicroísmo circular. A proteína Cf-Avr4 exibiu um espectro típico de polipeptídeos desordenados (sem estruturas secundárias definidas), o que indicou que esta proteína estava desenovelada. Em decorrência disso, não foi possível utilizá-la em outros experimentos. Todas as demais proteínas geraram espectros consistentes com o de proteínas enoveladas (Figuras 13 e 14).

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Figura 13: Espectros de dicroísmo circular da proteína recombinante Mp-Chi e suas versões mutantes. Todas as proteínas geraram espectros típicos de polipeptídeos propriamente enovelados. Ademais, é possível observar que todas as quitinases (nativa e mutantes) produziram espectros bastante similares, sugerindo que as mutações inseridas não acarretaram alterações conformacionais drásticas em nenhuma das versões da Mp-Chi.

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Figura 14: Espectros de dicroísmo circular das proteínas recombinantes MR04303, MR05413, Cf-Avr4, Cf-Ecp6 e Tc-GH19. O espectro gerado pela proteína Cf-Avr4 indicou que ela estava desenovelada e não poderia ser utilizada em outros experimentos. Todas as demais proteínas recombinantes exibiram padrões típicos de proteínas enoveladas.

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6. Quantificação da atividade quitinolítica

Os ensaios de medição de atividade quitinolítica indicaram que as proteínas Mp-Chi, Mp-Chi-Q167E, Mp-Chi-L238M e Tc-GH19 não são capazes de degradar nenhum dos substratos testados. Diferentemente, as proteínas Mp-Chi- Q167E_L238M, MR04303 e MR05413 exibiram atividade hidrolítica (Figuras 15 e 16). A ausência de atividade catalítica apresentada pela quitinase Tc-GH19 inviabilizou o seu uso nos ensaios de avaliação da capacidade protetora da Mp-Chi (experimentos indicados nas seções 9 e 10).

Figura 15: Atividades quitinolíticas das quitinases heterólogas e das quitinases de Trichoderma medidas através da intensidade do sinal de fluorescência emitido a 450 nm pela 4-metilumbeliferona (4-MU). O branco corresponde ao controle negativo do ensaio e as quitinases de Trichoderma, incluídas no kit Chitinase

Assay Kit (Sigma-Aldrich), foram empregadas como controle positivo. As barras apresentadas indicam o erro

padrão associado às medidas em cada condição, que foram realizadas em triplicata técnica. Os códigos M2133, M9763 e M5639, indicados na legenda, se referem aos substratos empregados para detecção de atividade de N- acetilglicosaminidase, exoquitinase e endoquitinase, respectivamente.

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Figura 16: Atividades quitinolíticas da quitinase Tc-GH19 e das quitinases de Trichoderma medidas através da intensidade do sinal de fluorescência emitido a 450 nm pela 4-metilumbeliferona (4-MU). O branco corresponde ao controle negativo do ensaio e as quitinases de Trichoderma, incluídas no kit Chitinase Assay Kit (Sigma-Aldrich), foram empregadas como controle positivo. As barras apresentadas indicam o erro padrão associado às medidas em cada condição, que foram realizadas em triplicata técnica. Os códigos M2133, M9763 e M5639, indicados na legenda, se referem aos substratos empregados para detecção de atividade de N- acetilglicosaminidase, exoquitinase e endoquitinase, respectivamente.

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7. Ensaios de ligação à quitina

A incubação das proteínas recombinantes com os cinco substratos testados mostrou que todas ligam-se à quitina, uma vez que são identificadas junto ao pellet de carboidrato quando os substratos usados são a quitina e/ou beads de quitina (Figura 17). Notavelmente, a quitinase Mp-Chi-MBS, diferente da Mp-Chi e suas outras versões mutantes, não se ligou às beads de quitina e permaneceu parcialmente na fração não ligada à quitina, o que pode ser resultado da afinidade reduzida à quitina esperada para esta proteína.

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Figura 17:Precipitação por afinidade a carboidratos das proteínas recombinantes. Notavelmente, todas as proteínas foram encontradas na fração precipitada (P) quando em presença dos substratos de quitina, o que indica que elas são capazes de se ligar a este carboidrato. A fração sobrenadante (S) contém as proteínas que não se ligaram ao substrato avaliado. A proteína Cf-Ecp6 foi incluída neste experimento como um controle positivo, uma vez que sua capacidade de ligação à quitina já foi demonstrada previamente (de Jonge et al. 2010).

8. Calorimetria de titulação isotérmica (ITC)

Complementarmente ao ensaio de ligação à quitina, foi avaliada a interação entre a proteína heteróloga Mp-Chi e quito-oligômeros de seis unidades (GlcNAc6) através de calorimetria de titulação isotérmica (ITC). Os resultados

obtidos indicaram que a quitinase de M. perniciosa se liga à GlcNAc6 com alta

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1, o que sugere que a Mp-Chi apresenta um único sítio de ligação a estas moléculas (Figura 18).

Figura 18: Dados brutos (painel superior) e valores de calor integrado (painel inferior) da calorimetria de titulação isotérmica da proteína Mp-Chi em presença do quito-oligômero GlcNAc6. Os dados obtidos indicam que a quitinase liga-se à GlcNAc6 com alta afinidade (constante de dissociação Kd= 13.02 nM) e com uma estequiometria próxima a 1, indicando que a proteína possui um único sítio de interação com tais quito- oligômeros. Figura: Dra. Andrea Sanchéz-Vallet.

9. Teste de proteção de hifas contra a ação de quitinases

No sentido de averiguar se as quitinases Mp-Chi e MR04303 apresentam capacidade protetora contra quitinases cataliticamente ativas, foi iniciada a padronização deste experimento. Diferente do esperado, não foi observada qualquer inibição de crescimento do micélio de Trichoderma sp. promovida pela quitinase de

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e ultrapassados pelas hifas mesmo quando continham elevadas concentrações da quitinase comercial (Figura 19). Por isso, não foi possível utilizar este ensaio para avaliar o potencial protetor das proteínas de M. perniciosa e M. roreri.

Figura 19: Padronização do ensaio de proteção de hifas contra quitinases cataliticamente ativas. (a) Esquema ilustrativo da configuração das placas no início do experimento. Na região central foi posicionado um grão de arroz colonizado por Trichoderma sp., em torno do qual foram dispostos quatro discos de papel filtro contendo concentrações crescentes de quitinase de S. griseus. (b) Representação esquemática de um possível resultado esperado para o experimento de inibição de crescimento por quitinases. Conforme ilustrado, o micélio poderia ter crescido sobre os discos contendo apenas tampão e a menor concentração de quitinase, mas ter sido inibido nas regiões adjacentes aos discos contendo as maiores quantidades de enzima. (c) Foto de uma das placas após 5 dias de incubação a 28°C. O micélio claramente cresceu homogeneamente em todas as direções, não havendo nenhum sinal de inibição. Frente a isto, não foi possível utilizar este experimento para a avaliação funcional das proteínas Mp-Chi e MR04303.

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10. Teste de proteção de esporos

Em substituição ao teste de proteção de hifas, foi conduzido o teste de proteção de esporos para averiguar a capacidade protetora da quitinase de M.

perniciosa. Neste experimento, esporos em germinação de T. viride foram

inicialmente incubados com as proteínas Mp-Chi, Cf-Avr4 ou Cf-Ecp6 e em seguida expostos a um extrato quitinolítico. Notavelmente, foi possível observar que a presença da proteína recombinante Mp-Chi não impede a degradação das hifas em crescimento pelo extrato lítico (Figura 20), mostrando que a quitinase de M.

perniciosa não apresenta efeito protetor sobre elas. Como esperado (van den Burg

et al. 2006), a proteína recombinante Cf-Avr4 mostrou ação protetora, em contraste com a proteína Cf-Ecp6, que não protege hifas contra enzimas hidrolíticas (de Jonge et al. 2010).

Figura 20: Resultados do tratamento de esporos em germinação de Trichoderma viride com água (H2O), extrato quitinolítico de folhas de tomateiro (Extrato quitinolítico [EQ]) ou incubação com as proteínas recombinantes Mp-Chi, Cf-Avr4 e Cf-Ecp6 seguida de exposição ao extrato quitinolítico (Mp-Chi + EQ, Avr4 + EQ, e Ecp6 + EQ, respectivamente). Esses resultados são representativos de três experimentos independentes. As proteínas efetoras Cf-Avr4 e Cf-Ecp6 (gentilmente cedidas pelo grupo do Prof. Dr. Bart Thomma) foram usadas como controle positivo e negativo, respectivamente. As barras de escala presentes nas figuras representam 100 µm.

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11. Alcalinização de suspensão de células vegetais

Imediatamente após a percepção de um patógeno por células vegetais ocorre um rápido fluxo de íons através da membrana celular e, como consequência, observa-se alcalinização do meio extracelular (Mishra et al. 2012). Dessa maneira, é possível reconhecer se respostas imunes de plantas foram elicitadas medindo a variação do pH de suspensões de células durante os minutos que sucedem o tratamento com uma dada molécula. Esta ferramenta experimental, que é amplamente utilizada em trabalhos envolvendo imunidade vegetal, foi empregada para avaliar a capacidade das quitinases estudadas de prevenir a ativação da imunidade desencadeada por quitina.

Para que o ensaio de alcalinização de suspensões celulares forneça resultados claros e informativos, é imprescindível que as proteínas estudadas não elicitem respostas nas células de tabaco per se. Por isso, foi primeiramente avaliado o efeito de cada uma das proteínas heterólogas que seriam avaliadas com esta plataforma experimental sobre as suspensões celulares. Nenhuma delas induziu alcalinização do meio de cultura (Figura 21).

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Figura 21: Medição da alcalinização de suspensões de células de tabaco tratadas com quito-oligômeros (GlcNAc6) e cada uma das proteínas heterólogas que foram incluídas nos experimentos de alcalinização de suspensões celulares. O ΔpH máximo normalizado pela resposta induzida pelo tratamento com GlcNAc6 é indicado no eixo vertical. Nenhuma das proteínas (gráficos (a) e (b)) induziu alcalinização do meio de cultura. As barras apresentadas indicam o erro padrão associado às medidas em cada condição.

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Em seguida, foi avaliado o efeito da Mp-Chi sobre a percepção de quito- oligômeros de seis unidades (GlcNAc6) pelas células de tabaco. Notavelmente, o

tratamento das suspensões celulares com GlcNAc6 previamente incubado com a

proteína recombinante Mp-Chi produziu uma alcalinização sutil do meio de cultura quando comparada à desencadeada apenas por GlcNAc6 (Figura 22), indicando que

a quitinase de M. perniciosa impede a percepção de quito-oligômeros pelas células vegetais. Em contrapartida, não houve diferença entre a resposta produzida pela exposição das células de tabaco ao fragmento de 22 aminoácidos que constitui o antígeno da flagelina (flg22) e flg22 incubada com Mp-Chi, sugerindo que a quitinase de M. perniciosa não interfere no reconhecimento deste elicitor bacteriano.

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Figura 22: Medição da alcalinização de suspensões de células de tabaco tratadas com quito-oligômeros (GlcNAc6), flg22 e combinações dos elicitores com as proteínas estudadas. O ΔpH máximo normalizado pela resposta induzida pelo tratamento com GlcNAc6 ou flg22 é indicado no eixo vertical. (a) É evidente que a proteína recombinante Mp-Chi promove a redução da variação de pH induzida por quitina, sugerindo que a quitinase de M. perniciosa é capaz de impedir a imunidade vegetal desencadeada por quitina (Chitin-Triggered

Immunity). A proteína efetora Cf-Ecp6 de C. fulvum foi usada como controle. (b) Quando incubada com flg22, a

quitinase Mp-Chi não impede a alcalinização do meio de cultura, o que indica que a proteína não interfere no reconhecimento deste elicitor pelas células de tabaco. As barras apresentadas indicam o erro padrão associado