Comparação dos marcadores sorológicos da replicação do vírus da hepatite B: estudos sobre o sistema AgHBe/anti-HBe, DNA polimerase virai e HBV-DNA

P I N H O . J . R. R . ; F O N S E C A , L . E . P . d a ; S O N G , Y u ; M I Y A M O T O , Y . ; C A R R I L H O , F . J . ; G R A N A T O , C . F . H . & S I L V A , L . C . d a — C o m p a r i s o n o f s e r u m h e p a t i t i s B v i r u s r e p l i c a t i o n m a r k e r s i n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c h e p a t i t i s B ; s t u d i e s o n H B e A g A n t i H B e s y s t e m , v i r a l D N A p o l y m e r a s e a n d H B V - D N A . R e v . I n s t . M e d . t r o p . S . P a u l o , 31(5): 32 8 3 3 5 , 1989. t h e n s t o p p e d a d d i n g P r o n a s e 1 m g / m l , t h a t b r e a k s v i r a l c a p s i d . S a m p l e s wer e t h e n d e p o s e d on 2. 5 c m d i a m e t e r G F / C filters a n d n o n incor p o r a t e d n u c l e o t i d e s wer e r e m o v e d b y thre e w a -s h i n g -s i n 5 % t r i c l o r o a c e t i c a c i d , 5 0 m M S o d i u m P i r o p h o s p h a t e . A f t e r d r y i n g , filter s wer e c o u n -ted i n s c i n t i l l a t i o n s o l u t i o n i n a b e t a - c o u n t e r . S a m p l e s wer e c o n s i d e r e d p o s i t i v e w h e n ther e is a s i g n i f i c a n t differenc e b e t w e e n th e 2 t u b e s , c o m p a r e d t o n e g a t i v e c o n t r o l s . D E T E C T I O N O F H B e A g A N D A N T I H B e w a s p e r f o r m e d w i t h A b b o t t d i a g n o s t i c K i t s . S A M P L E S — 3 8 H B s A g p o s i t i v e s e r u m s a m pies f r o m c h r o n i c h e p a t i t i s B p a t i e n t s wer e a s s a y e d b y th e 3 m e t h o ds d e s c r i b e d a b o v e . R E S U L T S C o m p a r a t i v e r e s u l t s b e t w e e n th e thre e s a m pies p r e p a r a t i o n p r o c e d u r e s ar e s h o w n i n figur e 1. I n t e r m s o f d e t e c t i o n o f p u r i f i e d c l o n e d H B V D N A , a l l th e t e c h n i q u e s c o u l d d e t e c t a s littl e as 10 0 p g o f D N A d i l u t e d a s d e s c r i b e d a b o v e . No h y b r i d i z a t i o n s i g n a l w a s d e t e c t e d w i t h th e n e g a t i v e c o n t r o l sera . W h e n c o m p a r i n g th e de -t e c -t i o n o f ou r s -t a n d a r d s e r u m s a m p l e d i l u -t i o n s , t e c h n i q u e s A a n d B g a v e s i g n a l s t i l l th e 1/1 6 d i l u t i o n , b u t t e c h n i q u e C s h o w n n o s i g n a l , e v e n w i t h th e h a l f - d i l u t e d s a m p l e . O p e r a t i o n a l l y th e m o s t s i m p l e t e c h n i q u e i s by fa r t e c h n i q u e A t h a t n e e d s no s e p a r a t e d treat -m e n t o f i n d i v i d u a l s e r u -m s a -m p l e s a n d a l l o w s a r a p i d a n d efficien t f i l t r a t i o n o f s a m p l e s . T e c h n i q u e B , b e s i d e s a l o n g e r o p e r a t i o n t i m e , elicit s i n s o m e s a m p l e s the a p p e a r a n c e of p r o t e i n c l o t s t h a t b l o c k t o t a l f i l t r a t i o n o f s a m p l e s in c o m m e r c i a l m a n i f o l d s y s t e m s . C o n s i d e r i ng these r e s u l t s , the othe r h y b r i d i z a t i o n s wer e p e r f o r m e d a c c o r d i n g t o t e c h n i q u e A , L o n g e r a u t o r a d i o g r a p h i c e x p o s u r e s ( 7 d a y s) allo w th e d e t e c t i o n o f a s little as 1 0 p g o f p u r i f i e d D N A , a s s h o w n i n figur e 2 , w i t h o u t c o m p r o m i s i n g s p e c i f i c i t y . T h e r e s u l t s o f th e a n a l y s i s of 3 8 s e r u m s a m p i e s b y th e f o u r s e r o l o g i c m e t h o d s d e s c r i b e d a b o v e , are s h o wn i n t a b l e 1 . H i b r i d i z a t i on s i g n a l s w i t h v a r i e d i n t e n s i t y ove r a c l e a r b a c k g r o u n d f r o m s o m e o f thes e s a m p l e s were s h o w n i n figur e 3 e v e n w i t h s o m e s p i l l a g e a n d n o r o u n d s p o t c a u s e d b y th e m a n i f o l d a p p a r a t u s a v a i l a b l e . T A B L E D N A D N A D N A D N A a n d + -- a n d T o t a l P o l . P o l . P o l . P o l . + - ₊ -I H B e A g + 17 3 1 5 26 A n t i H B e - 6 5 . 5 ^ 11.5'r 3.9"r 19.7^ I I H B e A g + 0 0 0 1 1 A n t i H B e + I I I H B e A g - 0 0 1 8 9 A n t i H B e + l i . i <; < 88.9f'f I V H B e A g - 0 0 0 2 2 A n t i H B e T o t a l 17 3 2 16 38 C o m p a r a t i v e r e s u l t s of h y b r i d i z a t i o n ( D N A ) a nd D N A p o l y m e r a s e ( P O L . ) a s s a y s i n 4 different g r o u p s a c c o r d i n g to H B e A g a n ti H B e s t a t u s . D I S C U S S I O N D e v e l o p m e n t o f m o l e c u l a r b i o l o g y a l l o w e d the s t a n d a r d i z a t i o n o f v e ry s p e c i f i c a nd s e n s i t i v e

P I N H O . J . R . R ; F O N S E C A , L . E . P . d a ; S O N G . Y u ; M I Y A M O T O . Y : C A R R I L H O , F . J . ; G R AN A T O , C . F . H . & S I L V A , L . C d a — C o m p a r i s o n o f s e r u m h e p a t i t i s B v i r u s r e p l i c a t i o n m a r k e r s i n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c h e p a t i t i s B : s t u d i e s o n H B e A g / A n t i H B e s y s t e m , v i r a l D N A p o l y m e r a s e a n d H B V - D N A . R e v . I n s t . M e d . t r o p . S . P a u l o , 31(5): 32 8 335 , 1989 . m e t h o d s d r i v e n t o th e d i r e c t d e t e c t i o n o f c o m plete H B V p a r t i c l e s c o m p o n e n t s , s u c h a s D N A p o l y m e r a s e a n d v i r a l D N A . I n i t i a l l y r e s t r a i n e d to r e s e a r c h l a b o r a t o r i e s , thes e t e c h n i q u e s h a v e been s o s i m p l i f i ed t h a t , n o w a d a y s , the detectio n of H B V D N A a n d D N A p o l y m e r a s e ar e c o n s i -dered e s s e n t i a l d i a g n o s t i c tool s fo r d e t e r m i n i n g the r e p l i c a t i o n s t a t u s o f c h r o n i c h e p a t i t i s B p a tients, n e c e s s a r y fo r i n d i c a t i o n , follow-u p a n d p r o g n o s i s o f a n t i v i r a l o r c o r t i c o s t e r o i d s t h e r a p y6 -S i n c e it s firs t a p p l i c a t i o n i n th e b e g i n n i n g of thi s d e c a d e , m a n y g r o u p s p r o p o s e d s e v e r a l different p r o c e d u r e s fo r s e r u m H B V D N A detec -t i o n . R e c e n -t l y , W A L T E R e -t a l . . 1 9 8 7 '9 a n d Z E L D I S e t a l . , 1986; < 1 c o m p a r e d s o m e differen t t e c h n i q u e s , a n d e a c h p r o p o s e d on e d i f f e r e n t t e c h n i q u e a s t h e b e s t o n e . W e c o m p a r e d th e S c o t t o ' s t e c h n i q u e p r o p o s e d b y Z E L D I S e t a l . a n d Walter' s t e c n i q u e w i t h ou r r o t i n e t e c h n i q u e , w h i c h i s a m o d i f i c a t i o n o f L i e b e r m a n n ' s t e c h n i que. W e go t d i s a p p o i n t i n g r e s u l t s w i t h W a l t e r ' s t e c h n i q u e , a n d , c o m p a r a b l e r e s u l t s u s i n g S c o t -to's p r o c e d u r e s . I n o u r h a n d s , p r e v i o u s d e n a t u r a t i o n o f s e r u m s a m p l e s c o u l d elici t a p p e a r a n c e o f protei n clots t h a t wil l b l o c k f i l t r a t i o n i n c o m m e r c i a l m a nifold a p p a r a t u s . O t h e r g r o u p u s i n g thi s t e c h n i -q u e utilis e a sel f p l a n n e d e -q u i p m e n t w i t h l a r g e r wells, t h a t w i l l no t b e b l o c k e d b y thes e c l o t s2 6. M o s t o f th e g r o u p s p r o p o s i n g d i r e c t s p o t t i n g o f s e r u m s a m p l e s do n o t perfor m v a c u u m f i l t r a t i o n to c o n c e n t r a t e t h e m , a s th e p o r u s d i a m e t e r o f n i t r o c e l l u l o s e m e m b r a n e s (22 0 o r 45 0 n m ) i s la r ger t h a n th e d i a m e t e r o f D a n e p a r t i c l e (4 2 n m ) , a n d s o m e v i r u s ar e n o t r e t a i n e d o n n i t r o c e l l u -lose. W A L T E R e t al. , 19872 9 h a v e e v e n s h o w e d p o s i t i v e h y b r i d i z a t i o n s i g n a l s i n fou r o v e r l o a d e d m e m b r a n e s s u b m i t t e d t o v a c u u m filtration . H o wever, thes e g r o u p s h a d t o w o r k w i t h s m a l l e r q u a n t i t i e s o f s e r um ( 5 t h a n u s (25 jd), b e c a u se s a m p l e s diffus e r a p i d l y t h r o u g h n i t r o c e l l u l o s e ( 5 ft\ s a m p l e directl y spotte d c o r r e s p o n d s t o a b o u t 1 c m d i a m e t e r spot) . S o , e v en w i t h th e los t o f s o m e v i r u s t h r o u g h n i t r o c e l l u l o s e m e m b r a n e po -rus, w e c a n a s s a y a q u a n t i t y o f s e r u m 5-fol d h i g h e r t h a n s i m p l e d i r e c t s p o t t i n g , a l l o w i n g g r e a ter s e n s i t i v i t y . U n l i k e othe r g r o u p s 2 6 2 9, w e di d n o t identif y a n y s e r u m i n h i b i t o r o f D N A b i n d i n g to n i t r o c e l l u l o s e , a s our s e n s i t i v i t y w a s i n c r e a s ed w h e n p e r f o r m i n g d i r e c t s p o t t i n g . Z E L D I S e t al. , 19863 1 s u g g e s t t h a t th e 5 ' b i n d i n g protei n c o u l d w o r k a s a b r i d ge t o th e m e m b r a n e . P e r h a p s inte r a c t i o n s b e t w e e n v i r a l e n v e l o p e a n d cor e pro -teins w i t h th e n i t r o c e l l u l o s e , i n v o l v i n g o r no t p o l y m e r i s e d s e r u m a l b u m i n , e n h a n ce the r e t e n t i o n of v i r a l p a r t i c l e s . O t h e r m e t h o d p r o p o s e d t o H B V r e p l i c a t i o n m o n i t o r i n g i s th e d e t e c t i o n o f s e r u m v i r a l D N A p o l y m e r a s e a c t i v i t y . L I N e t al. , 19841 9 d e v e l o p e d a s i m p l i f i e d t e c h n i q u e , s l i g h t l y m o d i f i e d b y us . T o ou r k n o w l e d g e , L i n ' s m e t h o d w a s n e v e r c o m -p a r e d w i t h H B V - D N A d e t e c t i o n . T h i s a s s a y h a s s h o w n a g o o d c o r r e l a t i o n w i t h h y b r i d i z a t i o n (33/38 86.8% ) a n d H B e A g p o s i t i v i t y (2 9 4 0 72.5%). W e f o u n d 3 ser a H B V - D N A p o s i t i v e a n d D N A p o l y m e r a s e n e g a t i v e , a n d 2 othe r w i t h i n verse p a r a m e t e r s . T h e forme r wer e a l l H B e A g p o s i t i v e a n d th e latte r wer e on e H B e A g p o s i t i v e a n d on e a n t i H B e p o s i t i v e . T h i s l a s t s e r u m w a s also a n t i d e l t a p o s i t i v e , a n d , i t m i g h t r e p r e s e n t a fals e p o s i t i v e fo r D N A p o l y m e r a s e . A n o t h e r p o s s i b i l i t y i s t h a t th e v i r u s d e l t a interfere s w i t h the result s o f t h i s a s s a y . S t u d i e s i n v o l v i ng m o r e a n t i d e l t a p o s i t i v e c a s e s wil l b e p e r f o r m ed t o en -l a r g e o u r k n o w -l e d g e a b o u t this . I n c o n c l u s i o n , a s s a y i n g v i r a l D N A p o l y m e rase u s i n g th e t e c h n i q u e d e v e l o p e d b y L I N e t a l . i s a g o o d m a r k e r fo r H B V r e p l i c a t i o n , a l t h o u g h fals e p o s i t i v e s a m p l e s c o u l d r a r e l y a p

P I N H O , J . R. R . : F O N S E C A , L . E . P . d a ; S O N G , Y u ; M I Y A M O T O , Y . ; C A R R I L H O , F . J ; G R A N A T O , C . F . H . Sz S I L V A , L . C . d a — C o m p a r i s o n o f s e r u m h e p a t i t i s B v i r u s r e p l i c a t i o n m a r k e r s i n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c h e p a t i t i s B : s t u d i e s o n H B e A g A n t i H B e s y s t e m , v i r a l D N A p o l y m e r a s e a n d H B V - D N A . R e v . I n s t . M e d . t r o p . S . P a u l o . 31(5): 32 8 335 . 1989 . pear. C o m p a r i n g t o h y b r i d i z a t i o n , i t h a s th e a d -v a n t a g e o f i n -v o l -v i n g t r i t i u m l a b e l l e d n u c l e o t i des, t h a t ar e les s h a z a r d o u s , easie r t o h a n d l e , a n d h a v e l o n g e r h a l f life . C a r e f u l s t o r a g e o f ser a is v e r y i m p o r t a n t b e c a u s e th e e n z y m e i s ver y l a b i l e1 3. We ar e n ow t r y i n g to s i m p l i f y th e p r e c i p i t a t i o n a n d w a s h i n g s t e p s , o p t i m i z e positive/ne g a t i v e rati o a n d r e p r o d u t i b i l i t y , w h i c h i s a c o m -m o n p r o b l e -m i n v o l v i n g e n z y -m a t i c r e a c t i o n s . F o r th e firs t t i m e i n ou r c o u n t r y , th e c o m p a r i s o n betwee n H B e A g a n t i H B e s y s t e m a n d mo -l e c u -l a r b i o -l o g i c a -l r e p -l i c a t i o n m a r k e r s i n c h r o n i c h e p a t i t i s B p a t i e n t s w a s performed . T h i s i s v e r y i m p o r t a n t d u e t o h i g h g e o g r a p h i c v a r i a b i l i t y o f this correlation . O u r r e s u l t s s h o w t h a t a m o n g H B e A g p o s i t i v e / a n t i - H B e n e g a t i v e p a t i e n t s , 19.2% d o no t s h o w othe r s e r u m r e p l i c a t i o n m a r k e r a n d 80.8 % s h o w on e o f t h e m a t l e a s t . O n the othe r h a n d , 1 9 a n ti H B e p o s i t i ve p a t i e n t h a d d e t e c t a b l e D N A p o l y m e r a s e b u t n o H B V D N A . T h i s s a m p l e w a s a l r e a d y d i s c u s s e d a b o v e. N o n e of ou r a n t i H B e p o s i t i v e s a m p l e s h o w n H B V D N A . T h e s e result s ar e i n t e r m e d i a t e t o thos e f r o m other g r o u p s , w h e r e H B V r e p l i c a t i o n m a r k e r s were f o u n d i n m o s t (6 7 - 100 % ) H B e A g p o s i t i v e s a m p l e s a n d i n fe w t o m o r e t h a n h a l f a n t i - H B e p o s i t i v e s a m p l e s . M a ny r e a s o n s m ay e x p l a i n ou r results. F i r s t , we s t u d i e d c h r o n i c h e p a t i t i s B p a -tients, s o m e o f t h e m e v o l v i n g b y s p o n t a n e o u s or i n d u c e d H B e A g / a n t i H B e s e r o c o n v e r s i o n , t h a t c o u l d e x p l a i n th e H B e A g p o s i t i v e / D N A ne -g a t i v e sera . S e c o n d , s o m e p a t i e n t s i n a d v a n c e d s t a g e s o f d i s e a s e c o u ld m a i n t a i n t h i s s e r o l o g i c a l p a t t e r n6 1 1 . T h i r d , S ã o P a u l o i s a r e g i o n wer e the H B V p r e v a l e n ce i s a b o ut 2 %5, c o r r e s p o n d i n g to m e d i u m e n d e m i c i t y r e g i o n , w i t h a p a u c i t y of s t u d i e s t h r o u g h th e w o r l d a t thi s p o i n t . T h i s c o u l d e x p l a i n th e i n t e r m e d i a t e c h a r a c t e r i s t i c o f our p o p u l a t i o n , w i t h m o r e H B e A g D N A n e g a tive p a t i e n t s t h a n N o r t h e r n E u r o p e a n d U S A , a n d w i t h fewe r a n t i H B e / D N A p o s i t i v e p a t i e n t s t h a n f o u n d i n h i g h l y e n d e m i c areas . S t u d i e s w i t h larger p o p u l a t i o n s , fro m differen t e t h n i c a n d r e g i o n a l o r i g i n s w i l l b e p e r f o r m ed i n a l a r g er s t u d y . A n y w a y , thes e d a t a c l e a r l y d e m o n s t r a t e s o m e d i s a g r e e m e n t b e t w e e n H B e A g a n d H B V D N A o r D N A p o l y m e r a s e d e t e c t i o n i n c h r o n i c h e p a t i t i s B p a t i e n t s a n d reinforc e th e n e c e s s i t y of m o n i t o r i n g t h e m i n th e follo w u p o f thes e p a tients. C o m p a r i s o n betwee n sorologi c m a r k e r s a n d d e t e c t i o n o f t i s s u a l v i r a l a n t i g e n s a n d i n s i t u h y b r i d i z a t i o n 2 5 ar e u n d e r i n v e s t i g a t i o n i n our l a b o r a t o r i e s . R E S U M O C o m p a r a ç ã o d o s m a r c a d o r e s s o r o l ó g i c o s d a re¬ p l i c a ç ã o d o v í r u s d a h e p a t i t e B : e s t u d o s s o b r e o s i s t e ma A g H B e / a n t i H B e, D N A p o l i m e r a s e v i -r a l e H B V - D N A . A d e t e c ç ã o d o g e n o m a d o H B V n o sor o po r h i b r i d i z a ç ã o m o l e c u l a r é o m a i s s e n s í v e l e espe ¬ cífico m a r c a d o r d a r e p l i c a ç ã o e i n f e c t i v i d a de d o H B V , s e n d o s u a u t i l i z a ç ão p r o p o s t a c o m o técni -c a r o t i n e i r a n o a -c o m p a n h a m e n t o d e d o e n ç a s re¬ l a c i o n a d a s a est e v í r u s . C o m p a r a n d o diferente s t é c n i c a s d e s c r i t a s a n t e r i o r m e n t e , e s c o l h e m o s a d e p o s i ç ã o d i r e t a d a s a m o s t r a s s é r i c a s sobr e a m e m b r a n a d e n i t r o c e l u l o s e s o b filtraçã o a v á -c u o , s e g u i da de b a n h os d e s n a t u r a n t es e n e u t r a l i¬ s a n t e s c o m o m a i s p r á t i c a e s i m p l e s, c om s e n s i b i -l i d a d e e q u i v a -l e n t e . O e n s a i o d a D N A p o l i m e r a s e u s a n d o á c i d o f o s f o n o f ó r m i c o c o m o i n i b i d o r v i r a l e s p e c í f i c o m o s t r o u 86.8 % d e c o n c o r d â n c i a c o m a d e t e c ç ã o d i r e t a d o D N A v i r a l , s e n d o , p o r t a n t o, u m a alte r n a t i v a v i á v e l n o a c o m p a n h a m e n t o d e p a c i e n t e s c o m h e p a t i t e c r ô n i c a B . E n c o n t r a m o s 19,2 % d a s a m o s t r a s A g H B e p o s i t i v o s s e m outro s m a r c a d o r e s d e r e p l i c a ç ã o v i r a l . P o r o u t r o l a d o , n e n h u m a a m o s t r a a n t i

H B e p o s i t i v a tev e H B V D N A detectável . Discor d â n c i a entr e este s dois s i s t e m a s foi e x t e n s a m e n -te d e s c r i t a , e c o n f i r m a m os p e l a p r i m e i ra ve z es-te fato e m p a c i e n t e s c o m h e p a t i t e c r ô n i c a B e m n o s s o p a í s . T é c n i c a s d e b i o l o g i a m o l e c u l a r s ã o , p o r t a n t o , f u n d a m e n t a i s n a d e t e r m i n a ç ã o d a re¬ p l i c a ç ã o v i r a l e m c a d a p a c i e n t e . A C K N O W L E D G E M E N T S We ar e gratefu l t o D o c t o r s J o s é C a r l o s d a C o s t a M a i a a n d M a r i a H e l e n a J u l i a n i fo r th e al -p h a — 3 2 P d A T P , a n d t o D o c t o r s F r a n c i s G a l i ¬ bert a n d C h r i s t i a n T r e p o fo r th e p l a s m i d c o n t a i n i n g th e c l o n e d H B V g e n o m e , t o w h o m w e ar e d e e p l y i n d e b t e d .

P I N H O , J . R. R . ; F O N S E C A , L . E . P . d a ; S O N G , Y u ; M I Y A M O T O , Y . ; C A R R I L H O , F . J . ; G R A N A T O , C . F . H . & S I L V A , L . C . d a — C o m p a r i s o n o f s e r u m h e p a t i t i s B v i r u s r e p l i c a t i o n m a r k e r s i n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c h e p a t i t i s B : s t u d i e s o n H B e A g / A n t i H B e s y s t e m , v i r a l D N A p o l y m e r a s e a n d H B V - D N A . R e v . I n s t . M e d . t r o p . S . P a u l o , 31(5); 32 8 335 , 1989 . A B R E V I A T I O N S H B V — H e p a t i t i s B V i r u s 1 x S S C — 0.1 5 M N a C l , 0.01 5 M S o d i u m C i -trate 1 x D e n h a r d t — 0.02 % F i c o l l , 0.02 % P o l i v y n i l p i r ¬ rolidine, 0.02 % B S A B S A — B o v i n e sorin e a l b u m i n . R E F E R E N C E S 1. B E R N I N G E R , M. ; H A M M E R , M. ; H O Y E R , B . & G E R I N , J . L . — A n a s s a y fo r d e t e c t i o n o f th e D N A g e n o m e o f h e p a¬ ti tis B v i r u s i n s e r u m . J . m e d . V i r o l . , 9 : 57-66 , 1982 . 2. B O N I N O , F . ; H O Y E R , B . & N E L S O N , J . — H e p a t i t i s B v i r u s D N A i n th e s e r a o f H B s a n t i g e n c a r r i e r s : a m a r k e r of a c t i v e h e p a t i t i s B v i r u s r e p l i c a t i o n i n th e liver . H e p a t o -logy, 1 : 386-391 , 1981 . 3. B R E C H O T , C ; H A D C H O U E L , M. ; S C O T T O , J . : D E G O S , F . ; C H A R N A Y , P . ; T R E P O , C . & T I O L L A I S , P . — D e t e c ¬ t i o n o f h e p a t i t i s B v i r u s D N A i n l i v e r a n d s e r u m : a d i r e c t a p p r a i s a l o f th e c h r o n i c c a r r i e r s t a t u s . L a n c e t , 2: 756-768 , 1981. 4. B R E C H O T , C ; D E G O S , F . ; L U G A S S Y , C ; T H I E R S , V . Z A F R A N I , S . ; F R A N C O , D . ; B E N H A M O U , J . P . ; W A N D S , J . ; I S S E L B A C H E R , K . ; T I O L L A I S , P . & B E R T H E L O T , P . — H e p a t i t i s B v i r u s D N A i n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c l i v e r d i s e a s e a n d n e g a t i v e t e s t s fo r h e p a t i t i s B s u r f a c e a n t i g e n . N e w E n g l . J . Med. , 312 : 270-276 , 1985 . 5. C A R R I L H O , F . J . & D A S I L V A , L . C . — E p i d e m i o l o g i a . I n : D A S I L V A , L . C , e d . — H e p a t i t e s a g u d a s e c r ô n i c a s . S ã o P a u l o , S a r v i e r , 1986 . p . 47-69 . 6. C H A U S S A D E , S . ; T H I E R S, V . ; B O B O C , B . ; H O U S S E T , C ; B R E C H O T , C . & D E G O S , F . — L ' a n t i g e n e H B e e t l ' A D N d u v i r u s B c h e z le s m a l a d e s d ' h e p a t i t e c h r o n i q u e a c t i v e G a s t r o e n t e r o l , c l i n . b i o l . , 10 : 744-747 , 198 6 7. C H U . C . - M ; K A R A Y I A N N I S , P . ; F O W L E R, M . J . F ; M O N ¬ J A R D I N O , J . ; L I A W , Y . - F . & T H O M A S , H . C . — N a t u r a l h i s t o r y o f c h r o n i c h e p a t i t i s B v i r u s i n f e c t i o n i n T a i w a n : s t u d i e s o f h e p a t i t i s B v i r u s D N A i n s e r u m . H e p a t o l o g y , 5: 431-434 , 1985 . 8. C R A X I , A . ; W E L L E R , I . V . D . & B A S S E N D I N E , M . F . — R e l a t i o n s h i p b e t w e e n H B V s p e c i f i c D N A p o l y m e r a s e a n d H B e a n t i g e n / a n t i b o d y s y s t e m i n c h r o n i c H B V infec ¬ t i o n : f a c t o r s d e t e r m i n i n g s e l e c t i o n o f p a t i e n t s a n d o u t c o ¬ m e o f a n t i v i r a l t h e r a p y . G u t , 24 : 143-147 , 1983 . 9. F E I N M A N , S . V .; B E R R I S , B . ; G U H A, A . ; S O O K N A N A N , R . ; B R A D D L E Y , D . W. ; B O N D , W . W . & M A Y N A R D , J . E . D N A : D N A h y b r i d i z a t i o n m e t h o d fo r th e d i a g n o s i s of h e p a t i t i s B i n f e c t i o n . J . v i r o l . Meth. , 8 : 199-206 , 1984 . 10. F I G U S , A . ; B L U M , H . E . ; V Y A S , G . N . ; D E V I R G I L I S , S . ; C A O . A .; L I P P I , M. ; L A I , E . & B A L E S T R I E R I . A . — H e p a t i t i s B v i r a l s e q u e n c e s i n n o n A , n o n B o r h e p a t i t i s B v i r u s r e l a t e d c h r o n i c l i v e r d i s e a s e . H e p a t o l o g y , 4 : 364-368, 1984 . 11. G E N E S C A , J . ; J A R D I , R . ; P R A T , S . : B U T I . M . ; S T E B A N , R . ; H E R N A N D E Z , J . M.; L O P E Z V I V A N C O S , J . ; P U I G D O M E N I C H , P . & G U A R D I A , J . — V a l o r d e l a d e t e r m i¬ n a c i ó n s e r i c a d e l D N A d e l v i r u s d e l a h e p a t i t i s B c o m o m a r c a d o r d e r e p l i c a c i ó n v i r i c a . M e d . c l í n . ( B a r c e l o n a ) , 87 : 665-668, 1986 . 12. G E R B E R , M . A . & T H U N G , S . N . — B i o l o g y o f d i s e a s e : m o l e c u l a r a n d c e l l u l a r p a t h o l o g y o f h e p a t i t i s . L a b . I n -vest., 52 : 572-590 , 1985 . 13. G R A N A T O , C . F . H . — A v a l i a ç ã o d o g r a u d e r e p l i c a ç ã o v i r a l e m i n d i v í d u o s a g u d a o u c r o n i c a m e n t e i n f e c t a d os pelo v í r u s d a h e p a t i t e B : e s t u d o s o b r e o a n t í g e n o H B e . S ã o P a u l o , 1988 . ( D i s s e r t a ç ã o d e m e s t r a d o — F a c u l d a d e de M e d i c i n a d a U n i v e r s i d a d e d e S ã o P a u l o ). 14. G U S T , I . D . ; B U R R E L L , C . J . ; C O U L E P I S , A . G . ; R O B I N S O N . W . S . & Z U C K E R M A N , A . J . — T a x o n o m i c c l a s s i f i ¬ c a t i o n o f h u m a n h e p a t i t i s B v i r u s . I n t e r v i r o l o g y , 25: 14-29, 1986. 15. H A R R I S O N , T . J . ; B A L , V . ; W H E E L E R , E . G ; M E A C O C K , J . J .; H A R R I S O N , J . F. & Z U C K E R M A N . A . J . — H e p a t i t i s B v i r u s D N A a n d e a n t i g e n i n s e r u m f r o m b l o o d d o n o r s i n th e U n i t e d K i n g d o m p o s i t i v e fo r h e p a t i t i s B s u r f a c e a n t i g e n . B r i t . m e d . J . , 290 : 66 3 664 , 1985 . 16. K A P L A N . P . M.; G R E E N M A N , R . L .; G E R I N , J . L . ; P U R ¬ C E L L , R . H . & R O B I N S O N , W . S . — D N A p o l y m e r a s e a s s o c i a t e d w i t h h u m a n h e p a t i t i s B a n t i g e n . J . V i r o l . , 12 : 995-1005,1973. 17. K A R A Y I A N N I S , P . ; F O W L E R , M . J . F .; L O K , A. S . F . ; G R E E N F I E L D , C ; M O N J A R D I N O , J . & T H O M A S , H . C . — D e t e c t i o n o f s e r u m H B V D N A b y m o l e c u l a r h y b r i d i¬ z a t i o n : c o r r e l a t i o n w i t h H B e A g a n t i H B e s t a t u s , r a c i a l o r i g i n , l i v e r h i s t o l o g y a n d h e p a t o c e l l u l a r c a r c i n o m a . J. H e p a t . , 1 : 99-106 , 1985 . 18. L I E B E R M A N N . H . M. ; L E B R E C Q U E , D . P . ; K E W , M. C ; H A D Z I Y A N N I S , S . J. & S H A F R I T Z , D . A . — H e p a t o l o g i c detection o f h e p a t i t i s B v i r u s D N A directl y i n h u m a n s e r u m b y a s i m p l i f i e d m o l e c u l a r h y b r i d i z a t i o n test : c o m p a r i s o n to H B e A g a n t i H B e s t a t us i n H B s A g c a r r i e r s . H e p a t o l o g y, 3: 285-291 , 1983 . 19. L I N , H. J . ; W U , P . ; L A I, C. L .; & C H A K , W . — M i c r o m e t h o d for p h o s p h o n o f o r m i c i n h i b i t i o n a s s a y o f h e p a t i t i s B v i r a l D N A p o l y m e r a s e . C l i n . C h e m . , 30 : 549-552 , 1984 . 20. M A N I A T I S , T . ; F R I T S C H , E . F . & S A M B R O O K . J . — M o l e c u l a r c l o n i n g : a l a b o r a t o r y m a n u a l . C o ld S p r i n g H a r bor, N Y , C o ld S p r i n g H a r b o r L a b o r a t o r y , 1982 . 21. M E I N K O T H , J . & W A H L , G . — R e v i e w : h y b r i d i z a t i o n o f n u c l e i c a c i d s i m m o b i l i z e d o n s o l i d s u p p o r t s . A n a l y t . B i o¬ c h e m . , 138 : 267-284 , 1984 . 22. M O R A C E , G ; V O N D E R H E L M , K . & D E I N H A R D T , F . — D e t e c t i o n o f h e p a t i t i s B v i r u s D N A i n s e r u m b y a r a p i d f i l t r a t i o n h y b r i d i z a t i o n a s s a y . J . v i r o l. Meth. , 12 : 235-242 , 1985.

P I N H O , J . R. R . ; F O N S E C A , L . E . P . d a ; S O N G , Y u ; M I Y A M O T O , Y . ; C A R R I L H O , F . J . ; G R A N A T O . C . F . H . & S I L V A , L . C . d a — C o m p a r i s o n o f s e r u m h e p a t i t i s B v i r u s r e p l i c a t i o n m a r k e r s i n p a t i e n t s w i t h c h r o n i c h e p a t i t i s B : s t u d i e s o n H B e A g A n t i H B e s y s t e m , v i r a l D N A p o l y m e r a s e a n d H B V - D N A . R e v . I n s t . M e d . t r o p . S . P a u l o , 31(5): 328 335, 1989. 23. N O R D E N F E L T , E . I . & K J E L L E N , L . — D a n e p a r t i c l e s , D N A p o l y m e r a s e , a n d e a n t i g en i n tw o d i s t i n c t c a t e g o r i e s of h e p a t i t i s B a n t i g e n c a r r i e r s . I n t e r v i r o l o g y , 5: 225-232 , 1975. 24. R I G B Y , P . W. J . ; D I E C K M A N , M. ; R H O D E S , C . & B E R G , P . — L a b e l l i n g d e o x y r i b o n u c l e i c a c i d t o h i g h s p e c i f i c a c t i ¬ v i t y i n v i t r o b y n i c k t r a n s l a t i o n w i t h D N A p o l y m e r a s e I. J . m o l e c. B i o l . , 113 : 237-251 , 1976 . 25. R I N T J E S , P . J . M.; V A N D I T Z H U I J S E N , J . ; V A N L O O N , A . M. ; V A N H A E L S T . V . J . G. M. ; B R O N K H O R S T , F . B . & Y A P , S. H . — H e p a t i t i s B v i r u s D N A d e t e c t e d i n f o r m a l i n f i x e d l i v e r s p e c i m e n s a nd it s r e l a t i o n t o s e r o l o g i c m a r k e r s a n d h i s t o p a t h o l o g i c f e a t u r e s i n c h r o n i c l i v e r d i sease. A m e r . J . P a t h ., 120 : 411-418 , 1985 . 26. S C O T T O , J . ; H A D C H O U E L, M. ; H E R Y , C ; Y V A R T , J . ; T I O L L A I S , P . & B R E C H O T , C . — D e t e c t i o n o f h e p a t i t i s B v i r u s D N A i n s e r u m b y a s i m p le s p o t h y b r i d i z a t i o n t e c h¬ n i q u e : c o m p a r i s o n w i t h r e s u l t s fo r o t h e r v i r a l m a r k e r s . H e p a t o l o g y , 3 : 279-284 , 1984 . 27. S T A N D R I N G , D . N . & R U T T E R , W . J . — T h e m o l e c u l a r a n a l y s i s o f h e p a t i t i s B v i r u s . I n : P O P P E R , H . & S C H A F F¬ N E R , F . , e d. — P r o g r e s s i n l i v e r d i s e a s e s . O r l a n d o , G r u n e & S t r a t t o n , 1986 . v . 8 , p . 311-331 . 28. V A N D I T Z H U I J S E N , T . J . M.; S E L T E N , G . C . M. ; V A N L O O N , A . M. ; W O L T E R S , G . ; M A T T H Y S S E N, L . & Y A P , S . H . — D e t e c t i o n o f H e p a t i t i s B v i r u s D N A i n s e r u m a n d r e l a t i o n w i t h I g M c l a s s a n t i H B e titer s i n h e p a t i t i s B v i r u s i n f e c t i o n . J . m e d. V i r o l . , 15 : 49-56, 1985 . 29. W A L T E R , E . ; B L U M . H . E . ; O F F E N S P E R G E R . W . B ; Z E S C H N I G K , C ; O F F E N S P E R G E R , S . & G E R O K , W . — S p o t b l o t h y b r i d i z a t i o n a s s a y fo r th e d e t e c t i o n o f h e p a¬ t i t i s B v i r u s D N A i n s e r u m : f a c t o r s d e t e r m i n i n g it s s e n s i ¬ t i v i t y a n d s p e c i f i c i t y . H e p a t o l o g y , 7: 55 7 562 , 1987 . 30. W E L L E R , I . V . D . ; F O W L E R , M . J . F .; M O N J A R D I N O , J . & T H O M A S , H . C . — T h e d e t e c t i o n o f H B V D N A i n s e r u m b y m o l e c u l a r h y b r i d i z a t i o n : a m o r e s e n s i t i v e m e t h o d fo r th e d e t e c t i o n o f c o m p l e t e H B V p a r t i c l e s . J . m e d. V i r o l . , 9 : 27 3 280 , 1982 . 31. Z E L D I S , J . B .; B E N P O R A T H , E . ; E N A T , R . ; K I R S C H , K . & W A N D S , J . — C o r r e l a t i o n o f H B V D N A a n d m o n o c l o n a l r e a c t i v i t y t o H B s A g i n s e r u m o f p a t i e n t s w i t h H B V i n f e c t i o n . J . v i r o l. Meth. , 14 : 153-166 , 1986 . R e c e b i d o p a r a p u b l i c a ç ã o e m 13/6/1989 .