Experimentos de DOSY utilizando RMN de 19F para o estudo de misturas complexas

GUILHERME FONSECA DAL POGGETTO

“EXPERIMENTOS DE DOSY UTILIZANDO RMN DE 19_{F PARA O}

ESTUDO DE MISTURAS COMPLEXAS”

CAMPINAS/SP 2015

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE CAMPINAS INSTITUTO DE QUÍMICA

GUILHERME FONSECA DAL POGGETTO

“EXPERIMENTOS DE DOSY UTILIZANDO RMN DE 19_{F PARA O ESTUDO DE}

MISTURAS COMPLEXAS”

ORIENTADOR: PROF. DR. CLÁUDIO FRANCISCO TORMENA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO APRESENTADA AO

INSTITUTO DE QUÍMICA DA UNICAMP PARA

OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE EM QUÍMICA NA ÁREA DE QUÍMICA ORGÂNICA.

ESTE EXEMPLAR CORRESPONDE Á VERSÃO FINAL DA DISSERTAÇÃO DEFENDIDA POR GUILHERME FONSECA DAL POGGETTO, E ORIENTADA PELO PROF. DR. CLÁUDIO FRANCISCO TORMENA.

_______________________ ASSINATURA DO ORIENTADOR

CAMPINAS/SP 2015

“I believe in intuition and inspiration. Imagination is more

important than knowledge. For knowledge is limited,

whereas imagination embraces the entire world, stimulating

progress, giving birth to evolution. It is, strictly speaking, a

real factor in scientific research.”

Dedico esta dissertação de mestrado a meus queridos e

saudosos amigos Danilo Dias e André de Sousa.

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a toda minha família, meus pais e irmão por todo apoio, não apenas no mestrado. Em segundo ao pessoal do TPMY, minha segunda família.

Ao Prof. Cláudio Tormena pela orientação, conselhos, paciência e amizade. Aos membros da banca.

A todos meus amigos da graduação e da pós graduação.

Ao Bowser, Mendigo, Aspira, Pira, Jessie, Maguila e Tsubaza. A galera Senzala pela bagunça.

Ao Renan, Tatá, Denize, Lucas e Maiara por toda a ajuda neste trabalho, pelas risadas e pela amizade.

Ao som do B3LYP (Mineiro, Vitão e Borghi). A todo o pessoal do LFQO (até a Monique).

Ao Prof. Dr. Roberto Rittner Neto e ao Prof. Dr. Mathias Nilsson. Ao pessoal da Bruker.

Ao pessoal dos laboratórios de RMN e de graduação!

A UNICAMP, todos os funcionários (em especial a Bel) e professores por tudo.

CURRICULUM VITAE

Guilherme Fonseca Dal Poggetto

Formação Educacional

2009 – 2013 Bacharel em Química

Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) Campinas/SP – Brasil.

Orientador: Prof. Dr. Carlos Roque Duarte Correia Projeto: “Estudo da Hidrogenólise de 2-arilpirrolidinas quirais para a síntese de aminoalcoois” (DQO).

Agência de Fomento: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

Artigos em Revistas Científicas

1) “19_{F DOSY NMR analysis for spin systems with nJFF couplings”;} Dal Poggetto, G.; Favaro, D.; Nilsson, M.; Morris. G.; Tormena, C.; Magnetic Resonance in Chemistry, 52, 172–177, 2014.

Participação de Eventos, Congressos e Encontros

1) 13ª Conferência Latino Americana de Físico-Química Orgânica. 2015 – Carlos Paz, Argentina. “19F Matrix-Assisted DOSY: An NMR tool for mixture analysis of fluorocompounds”

(Apresentação Oral).

2) Encontro Regional da Sociedade Brasileira de Química (SBQ) – MG. 2014 – Poços de Caldas, Brasil. “19F Matrix Assisted DOSY no estudo de misturas complexas” (Pôster).

3) XIII Jornada Brasileira de Ressonância Magnética. 2014 – Pirenópolis, Brasil. “19F DOSY para sistemas com acoplamentos

n_J

FF” (Apresentação Oral e Pôster).

4) 243rd American Chemical Society (ACS) National Meeting. 2012 – San Diego, Estados Unidos. “General Strategy for sphingosine

5) II International Workshop on Organic Chemistry. 2010 – Campinas, Brasil (Ouvinte).

Premiação

Melhor Pôster na Área de Físico-Química. Encontro Regional da Sociedade Brasileira de Química – MG. 2014 – Poços de Caldas, Brasil.

Programas Didáticos/UNICAMP

1) Programa de Estágio de Capacitação Docente (PED) – Grupo C QO622 – Química Orgânica Experimental II. Supervisores: Prof. Dr. Luís Carlos Dias, Prof. Dr. Sebastião Fonseca e Prof. Dra. Cátia Ornelas. Período: 2º semestre de 2014.

2) Programa de Estágio de Capacitação Docente (PED) – Grupo C. QO423 – Fundamentos de Ressonância Magnética Nuclear. Supervisor: Prof. Dr. Cláudio Francisco Tormena. Período: 1º semestre de 2014.

3) Programa de Auxilio a Docência (PAD). QG107 – Química Geral para Biologia. Supervisores: Prof. Dr. José Alencar Simoni e Prof. Dr. Watson Loh.

Período: 1º semestre de 2013.

4) Programa de Auxilio a Docência (PAD). QG102 – Química Geral Experimental. Supervisor: Prof. Dr. Juliano A. Bonacin.

Resumo

Título: “Experimentos de DOSY utilizando RMN de 19F para o estudo de misturas complexas”

“Espectroscopia de Difusão Ordenada”, ou DOSY (do inglês

“Diffusion-Ordered Spectroscopy”), baseia-se na capacidade de separação de sinais de

compostos diferentes de acordo com o seu coeficiente de difusão, e por isto, dificuldades surgem quando sinais se sobrepõem ou quando os compostos possuem tamanhos muito semelhantes. O que é uma situação muito comum em análises de soluções de isômeros ou quando espécies quimicamente semelhantes estão presentes.

A sobreposição de sinais pode ser evitada pelo uso de um núcleo diferente do tradicional 1H, tal como o 19F, cujos espectros possuem uma gama espectral grande, o que tipicamente leva a sinais bem resolvidos. Quanto aos componentes de tamanho semelhante, o progresso em “DOSY Auxiliado por Matriz”, ou MAD (do inglês “Matrix-Assisted DOSY”), solucionou este problema e reforçou o DOSY como uma ferramenta poderosa. MAD dá ao analista o poder de manipular o comportamento de difusão dos compostos, por interação com uma matriz, geralmente um agente surfactante ou um agente de complexação, que interage diferente com cada componente da mistura.

Aqui se demonstra a utilização de uma sequência de pulsos de 19F DOSY para vários benzenos fluorados. Para os compostos com constantes de acoplamento

n_J

FF, a “modulação devido ao J" pode ser suprimida usando a sequência

Oneshot45. Também se avalia a eficiência de micelas de SDS e AOT como agentes de separação para soluções dos isômeros de fluorfenóis e fluoranilinas. O sitio de interação, entre solutos e surfactantes, foram investigados utilizando experimentos medindo o efeito Overhauser nuclear.

19_{F MAD fornece uma ferramenta poderosa para a análise de misturas, com o}

potencial de ser muito útil para o estudo de medicamentos, em particular, no estudo de degradação de fármacos.

Abstract

Title: “DOSY experiments using 19F NMR for the study of complex mixtures” Diffusion-Ordered Spectroscopy (DOSY) analysis is based on the ability to separate signals from different compounds depending on their diffusion coefficient, and can therefore struggle when NMR signals overlap or when the compounds are of very similar size. This is naturally a common situation in drug analysis, where isomers and other chemically similar species are present.

Signal overlap can be avoided by using a nucleus such as 19F instead of the traditional 1H, because 19F NMR spectra are typically very sparse and have a much larger spectral range, leading to well-resolved signals. As for the similar size components, developments in “Matrix-Assisted DOSY” (MAD), have alleviated this problem and further strengthened DOSY as a powerful tool. MAD gives the analyst the power to manipulate diffusion behaviour by differential interaction with a matrix, commonly a surfactant or a complexation agent, binding differently with the each component of the mixture.

Here, we demonstrate the use of a modified 19F DOSY experiment for various fluorinated benzenes. For compounds with significant nJFF coupling constants,

as is common, the undesirable “J-modulation” can be efficiently suppressed using the Oneshot45 pulse sequence. We have also evaluate the efficiency of SDS (normal) and AOT (reverse) micelles as separation agents for mixtures containing positional isomers of fluorophenols and fluoroanilines using 19F MAD. The interaction sites between solutes and surfactants were investigated using different Nuclear Overhauser Effect experiments.

19_{F MAD provides a powerful tool for mixture analysis by NMR with the}

potential to be very useful for the study of pharmaceutical formulations, in particular in the study of drug degradation.

Sumário

Lista de Tabelas ... XXI Lista de Figuras ... XXIII Símbolos utilizados nas Sequências de Pulsos ... XXVII

1. Introdução ... 1

1.1.Considerações Gerais ... 1

1.2.O Movimento Browniano – O fenômeno físico da difusão ... 3

1.3.O Uso da RMN nas medidas de Difusão ... 6

1.4.Sequências de Pulsos de RMN ... 12

1.5.Matrix-Assisted DOSY (MAD) ... 22

1.6.O núcleo de 19F ... 27

2. Objetivos ... 31

3. Parte experimental ... 33

3.1.Preparo das soluções estoque ... 33

3.2.Equipamentos utilizados ... 35

3.3.Experimentos de difusão ... 35

4. Resultados e Discussão ... 37

4.1.Sequências de Difusão adaptadas para 19F ... 37

4.1.1. 19F DOSY Oneshot ... 37

4.1.2. 19F DOSY Oneshot45 ... 39

4.2.19F “Matrix Assisted DOSY” (MAD) ... 47

4.2.1. 19F MAD utilizando SDS ... 47

4.2.2. 19F MAD utilizando AOT... 56

4.3.Cálculos de interação com os surfactantes ... 68

4.4.Estudos das Interações com as Micelas ... 72

5. Conclusões ... 85

Lista de Tabelas

Tabela 1 – Concentração das soluções estoque utilizadas ... 34

Tabela 2 – Valores estatísticos para os fluorfenóis com SDS ... 51

Tabela 3 – Valores estatísticos para as fluoroanilinas com SDS ... 56

Tabela 4 – Valores estatísticos para os fluorfenóis com AOT ... 59

Tabela 5 – Valores estatísticos para os fluoroanilinas com AOT ... 60

Tabela 6 – Valores estatísticos para as fluoroanilinas com 25 mM de AOT adicionando 5 mM de NaOH ... 68

Tabela 7 – Coeficientes da Regressão Linear dos Gráficos nas Figuras 52 e 53 ... 70

Tabela 8 – Fração do soluto complexando com o surfactante (fb) para os compostos estudados. ... 70

Lista de Figuras

Figura 1 – Publicações relacionadas à DOSY, por ano ... 2 Figura 2 – Movimento Browniano de uma partícula ... 3 Figura 3 – Robert Brown ... 4 Figura 4 – Sequência de pulsos de Eco de Spin (SE) ... 6 Figura 5 – Sequência de pulsos Eco de Spin com Pulso de Gradiente de Campo (PFG-SE) ... 7 Figura 6 – Resultado da Magnetização quando não há perda do sinal por difusão ... 8 Figura 7 – Resultado da Magnetização quando há perda do sinal por difusão ... 8 Figura 8 – Gráfico da Intensidade do Sinal (I) pela Força do Gradiente de Campo (G)... 9 Figura 9 – Perfil de decaimento dos sinais de uma mistura de água, cafeína e 1-propanol, sendo atenuados na direção da Força do Gradiente. ... 10 Figura 10 – Espectro DOSY ... 11 Figura 11 – Efeito da J-modulation sobre um sexteto do tipo AX5 ... 13 Figura 12 – Esquema da sequência de Pulsed Field Gradient Stimulated Echo (PFGSTE) ... 14 Figura 13 – Esquema da sequência de Oneshot ... 15 Figura 14 – Esquema da sequência de Bipolar Pulse Pair Stimulated Echo (BPPSTE) .... 16 Figura 15 – DOSY utilizando a sequência Oneshot ... 18 Figura 16 – Esquema da sequência de Oneshot45 ... 20 Figura 17 – DOSY utilizando a sequência Oneshot45 ... 22 Figura 18 – Dodecil sulfato de sódio (SDS) e Docusato de sódio (AOT). ... 24 Figura 19 – Ilustração esquemática do equilíbrio dinâmico do SDS com um analito ... 25 Figura 20 – Gráfico do Coeficiente de Difusão do surfactante versus o inverso da concentração de surfactante ... 27 Figura 21 – Alguns fármacos contendo átomos de flúor ... 29 Figura 22 – Fórmulas estruturais dos compostos que serão estudados. a) 2-fluoranisol b) 1-bromo-2,3-difluorbenzeno; c) 1-bromo-2,4,5-trifluorbenzeno; d) isômeros do fluorfenol; e) isômeros da fluoranilina. ... 32 Figura 23 – Sequência de 19F DOSY Oneshot ... 37 Figura 24 – Espectros de 1H DOSY Oneshot e de 19F DOSY Oneshot da mistura de 3-fluorfenol e 2-fluoranisol ... 38 Figura 25 – Sequência de 19F DOSY Oneshot45 ... 40 Figura 26 – Espectro 1D de 19F DOSY, utilizando Oneshot e Oneshot45, para uma amostra de 1-bromo-2,3-difluorobenzeno ... 41

Figura 27 – Espectro de 19F DOSY do 1-bromo-2,3-difluorobenzeno, utilizando a sequência Oneshot45 ... 42 Figura 28 – Espectro de 19F DOSY da mistura de 2,3-difluorobenzeno e 1-bromo-2,4,5-trifluorobenzeno, utilizando a sequência Oneshot45 ... 43 Figura 29 – Espectros menos atenuados 1D de 19F DOSY da mistura de 1-bromo-2,3-difluorobenzeno e 1-bromo-2,4,5-trifluorobenzeno, em DMSO-d6, a) utilizando Oneshot45 e b) utilizando Oneshot ... 44 Figura 30 – Perfil dos pulsos de excitação ... 45 Figura 31 – Gráfico do número de scans versus o coeficiente de difusão, de uma mistura de meta (círculo), orto (quadrado) e para (triângulo) fluorfenol (Figura 22d). ... 46 Figura 32 – Gráficos do Coeficiente de Difusão do SDS ... 48 Figura 33 – Gráfico do inverso da concentração do SDS versus o coeficiente de difusão, variando a concentração dos fluorfenóis ... 49 Figura 34 – Gráfico da difusão dos sinais de SDS, para-fluorfenol e do TSP-d4 versus a concentração de SDS ... 50 Figura 35 – 19F DOSY de misturas contendo fluorfenóis com SDS ... 51 Figura 36 – Gráfico da concentração de SDS versus o coeficiente de difusão dos fluorfenóis ... 52 Figura 37 – Valores das constantes físicas dos fenóis estudados ... 53 Figura 38 – Gráfico da concentração de SDS versus o coeficiente de difusão das fluoroanilinas ... 55 Figura 39 – 19F DOSY de misturas contendo fluoroanilinas com SDS ... 55 Figura 40 – Diferentes tipos de micelas ... 57 Figura 41 – Gráfico da concentração de AOT versus o coeficiente de difusão dos fluorfenóis ... 57 Figura 42 – 19F DOSY de uma mistura contendo os fluorfenóis com AOT. ... 58 Figura 43 – Gráfico da concentração de AOT versus o coeficiente de difusão das fluoranilinas ... 59 Figura 44 - 19F DOSY de uma mistura contendo as fluoroanilinas com AOT. ... 60 Figura 45 – Valor de T1 e T2 para moléculas de acordo com seu tamanho ... 61 Figura 46 – Sinais de 19F da para-fluoroanilina sem e com a adição de AOT ... 62 Figura 47 – Influência do Campo Magnético (B0) e da Temperatura (T) na dinâmica do equilíbrio de interação ... 63 Figura 48 – Efeito do aumento da temperatura, no sinal de 19F, de uma amostra de para-fluoranilina com AOT em um campo de 11,7 Tesla ... 64 Figura 49 – Efeito do aumento do campo B0, no sinal de 19F, em uma amostra de para-fluoroanilina com AOT em uma temperatura de 45 oC ... 65

Figura 50 – Valores do coeficiente de lipofilicidade (logP) das fluoroanilinas estudadas e valores da constante ácida (pka) de seus respectivos ácidos conjugados ... 66 Figura 51 - 19F DOSY de uma mistura contendo as fluoranilina com AOT, com a adicão de 5 mM de NaOH ... 67 Figura 52 - Coeficiente de difusão de SDS versus o inverso de sua concentração ... 69 Figura 53 - Coeficiente de difusão de AOT versus o inverso de sua concentração ... 69 Figura 54 – Mapas de contorno de HOESY e NOESY dos sinais do meta-fluorfenol com o SDS ... 73 Figura 55 – Valores máximos para NOE e ROE ... 74 Figura 56 – Espectros do 3-fluorfenol em CCl4 com AOT: 1H e 1H seletivo ... 75 Figura 57 – Espectros 1D de experimentos de 1H ROESY seletivo, utilizando SDS como matriz com os fluorfenóis ... 76 Figura 58 – Espectros 1D de experimentos de 1H ROESY seletivo, utilizando SDS como matriz com as fluoranilinas ... 77 Figura 59 – Transferência de magnetização do analito para os hidrogênios da micela .... 78 Figura 60 – Espectros 1D de experimentos de 1H ROESY seletivo, utilizando AOT como matriz com os fluorfenóis ... 80 Figura 61 – Espectros 1D de experimentos de 1H ROESY seletivo, utilizando AOT como matriz com as fluoranilinas ... 80 Figura 62 – Espectros 1D de experimentos de 1H ROESY seletivo da para-fluoroanilina, utilizando AOT como matriz: adicionando 5 mM de NaOH e sem NaOH ... 82

Símbolos utilizados nas Sequências de Pulsos

Δ

Duração do Pulso de Gradiente

FID (Aquisição) Pulso (duro) de 90o

Pulso (duro) de 180o

Pulso (duro) de 45o

Pulso de Radiofrequência Pulso de Gradiente de Campo

Gradiente de Incremento de Campo

Tempo de spin-eco

Fator de Desbalanceamento de pulso

1.

Introdução

1.1. Considerações Gerais

Ressonância magnética nuclear (RMN) é o instrumento mais amplamente utilizado pelos químicos para a determinação estrutural de compostos em solução. [1] É uma ferramenta extremamente versátil e razoavelmente sensível, mas tem um grande inconveniente: a análise de compostos em misturas. Por este motivo, é mais bem utilizado em compostos que foram cuidadosamente isolados.

Porém, como muitos dos problemas mais desafiadores - e muitos dos estudos propostos por químicos sintéticos e pela indústria - são apresentados como misturas complexas, de difícil e demorada separação, um grande esforço por parte dos pesquisadores na área do RMN se dedica a separação de misturas em seus componentes individuais, para que assim estes possam ser identificados sem prévia purificação. [2]

Uma das técnicas empregadas, a Diffusion-Ordered Spectroscopy (DOSY ou “Espectroscopia de Difusão Ordenada”), tenta contornar essa limitação, separando virtualmente os sinais de RMN de moléculas diferentes, de modo que os sinais provenientes de espécies diferentes possam ser distinguidos. [3]

Nos últimos anos, os métodos baseados em análise de difusão de misturas têm sido um dos principais campos de desenvolvimento da RMN, o

1 _{a) Gil, V.; Geraldes, C.; “Ressonância Magnética Nuclear: Fundamentos,}

Métodos e Aplicações”, 2ª ed. Fundação Calouste Gulbenkian, 2002. b)

Simpsons, J. H.; “Organic Structure determination: Using 2-D NMR

Spectroscopy”, London, Elsevier, 2008.

2 _{Morris, G. A.; “Encyclopedia of Nuclear Magnetic Resonance”, - Advances}

in NMR, Chichester, John Wiley & Sons Ltd., 2002.

que é demonstrado pelo grande aumento no número de publicações recentes relacionados ao DOSY (Figura 1).

Figura 1 – Publicações relacionadas à DOSY, por ano. [4]

O uso de experimentos com pulsos de gradientes de campo permitem que os sinais provenientes de espécies de diferentes tamanhos moleculares de uma mistura sejam distinguidos. No DOSY de alta resolução, mesmo pequenas diferenças no coeficiente de difusão entre espécies são suficientes para permitir que o espectro de uma mistura intacta seja decomposto em sub-espectros dos componentes individuais. [5]

Devido a esta facilidade, além de economia de tempo, a área farmacêutica tem aproveitado e demonstrado muito interesse nesta

4 _{Retirado de sciencedirect.com no dia 27 de março de 2015}

5 _{a) Colbourne, A. A.; Meier, S.; Morris, G. A.; Nilsson, M.; Chem. Commun.}

49, 10510–10512, 2013. b) Nilsson, M.; Morris, G. A.; Magn. Reson. Chem. 44, 655–660, 2006.

metodologia, em especial para a análise da degradação de fármacos [6], no controle de pureza de medicamentos [7] e em estudos fisiológicos. [8]

1.2. O Movimento Browniano – O fenômeno físico da difusão

A Difusão (ou Autodifusão) Molecular, assim como a convecção ou a dispersão, é um dos diversos tipos de “fenômenos de transporte” que ocorrem devido ao movimento browniano (Figura 2). [9] A característica que torna a difusão única é que esta resulta em transporte de massa, levando uma partícula de um lugar ao outro, sem a necessidade de agentes externos ou de agitação do meio (ou bulk) sendo, portanto, um processo espontâneo.

Figura 2 – Movimento Browniano de uma partícula

6 _{Holzgrabe, U.; Malet-Martino, M. J. Pharm. Bio. Anal. 55, 679–687, 2011.} 7 _{Trefi, S.; Gilard, V.; Malet-Martino, M.; Martino, R.; J. Pharm. Bio. Anal.}

44, 743–754, 2007.

8 _{Trefi, S.; Gilard, V.; Balayssac, S.; Malet-Martino, M.; Martino, R.; J.}

Pharm. Bio. Anal. 46, 707–722, 2008.

O fenômeno foi reportado pela primeira vez no começo do século XIX por Robert Brown [10] (á quem o nome “movimento browniano” é dedicado para a descrição de um movimento aleatório das partículas). Brown, um botânico escocês que estudava grãos de pólen (entre outras, da espécie Clarkia

pulchella) em água, através de um microscópio, notou que as partículas se

moviam aleatoriamente na suspensão. Este movimento foi atribuído por ele, inicialmente, como um movimento voluntário das partículas, devido a alguma propriedade da matéria viva.

Figura 3 – Robert Brown (1773 – 1858)

Paul Berg [11] descreve um experimento muito útil que ilustra o fenômeno da difusão. Se uma gota de corante fluorescente for introduzida cuidadosamente em uma jarra de água cristalina, a coloração inicialmente ficará concentrada no ponto onde foi adicionada. Porém, ao longo do tempo, a coloração se espalhará simetricamente de forma radial pela jarra, sem que haja

10 _{Brown, R., (editado por John J. Bennett); “The miscellaneous botanical}

works of Robert Brown”, Vol. 1, London, 1866.

11 _{Berg H.C.; “Random Walks in Biology”, New Jersey, Princeton University}

a necessidade de outros processos de agitação e, portanto, um processo espontâneo.

A difusão, diferentemente do que Brown acreditava inicialmente, ocorre apenas devido as colisões entre moléculas em líquidos e gases, e se deve pela própria energia térmica do sistema [9]. Assim, outra característica interessante deste movimento, é que este ocorre mesmo quando o equilíbrio termodinâmico é atingido, diferentemente do pensamento clássico da difusão, enunciado pela Primeira Lei de Flick, [12] que descreve que partículas (assim como o calor) fluem de regiões de alta concentração para regiões de concentrações mais baixas. Entretanto, a difusão continua ocorrendo mesmo em sistemas sem gradientes de concentração.

O estudo da difusão molecular em soluções pode fornecer uma gama de propriedades físicas moleculares, incluindo tamanho, formato, agregação, encapsulamento, complexação e ligações de hidrogênio. [2]

O efeito de autodifusão pode ser caracterizado quantitativamente pelo

Coeficiente de Difusão, D. [13] Enquanto, em um sistema isotrópico, o deslocamento médio de uma molécula (dxyz) sobre as três dimensões é nulo, o

quadrado da média do deslocamento (zrms), em apenas uma dimensão, é

diferente de zero, sendo possível quantificar esta distância percorrida, em um período de tempo t, pela fórmula:

𝒛

= (𝟐𝑫𝒕)

12 _{Atkins, P. W.; “Concept in Physical Chemistry”, Vol. 1, Oxford, Oxford}

University, 1995.

Nesta equação, zrms representa o valor quadrático médio (do inglês,

root mean square) da distância percorrida. Assim, o coeficiente de difusão é

uma média da taxa do quadrado do deslocamento molecular médio, e por isso possui unidade de m2s-1. [14]

1.3. O Uso da RMN nas medidas de Difusão

Medidas de difusão por RMN são feitas desde 1950 quando Hahn desenvolveu a sequência de pulsos de “eco de spin”, ou Spin-Eco (Figura 4).

[15] _{Hahn observou e elucidou o efeito da difusão molecular sobre as}

amplitudes dos ecos de spin. A partir de então, soube-se que seria possível medir a difusão molecular monitorando as amplitudes dos ecos na presença de campo magnético variável. [3]

Figura 4 – Sequência de pulsos de Eco de Spin (SE)

Em 1954, Carr e Purcell, utilizando o conceito de “eco de spin” desenvolvido por Hahn, descreveram que uma variação no campo magnético poderia ser originada pela própria não homogeneidade do campo local. A

14 _{Claridge, T. D. W.; “High-Resolution NMR Techniques in Organic}

Chemistry”, Tetrahedron Organic Chemistry Vol. 27, 2ª ed., Oxford, Elsevier,

2009.

partir disto, mediram coeficientes de difusão de várias substâncias em solução.

[16]

A sequência de eco de spin com pulso de gradiente de campo (“Pulsed

Field Gradient Spin-Echo” ou PFG-SE), desenvolvida por Stejskal e Tanner

em 1965 (Figura 5) também é derivada do conceito de “eco de spin” de Hahn, porém não se baseia na não homogeneidade do campo local. [17] Esta sequência utiliza dois pulsos de gradiente de campo magnético para o estudo do efeito do movimento translacional na intensidade do sinal. [18]

Figura 5 – Sequência de pulsos de Eco de Spin com Pulso de Gradiente de

Campo (PFG-SE)

Desta forma, após o primeiro pulso de gradiente, a magnetização (que esta sobre o plano transversal) é codificada durante o tempo τ, e após a fase da magnetização ser invertida pelo pulso de 180º, o segundo pulso de gradiente decodifica o sinal, reorientando a magnetização. Desconsiderando a relaxação por T2 (relaxação transversal), se um determinado componente não se

16 _{Carr, H. Y.; Purcell, E. M.; Physical Review 94, 630-638, 1954.} 17 _{Stejskal, E. O.; Tanner, J. E.; J. Chem. Phys. 42, 288-292, 1965.}

18 _{Grebenkov, D. S.; Concepts in Magnetic Resonance Part A 36, 24–35,}

difundir, a intensidade final da sua magnetização se mantém igual a sua intensidade inicial (Figura 6), ou seja, não há perda de sinal. Porém, caso haja alguma difusão do componente (durante todo o tempo Δ), haverá movimento longitudinal (sobre o eixo da bobina, z), acarretando em uma decodificação incompleta, havendo assim diminuição (ou atenuação) do sinal final em relação ao sinal inicial (Figura 7). [19]

Figura 6 – Resultado da Magnetização quando não há perda do sinal por

difusão, não há atenuação do sinal.

Figura 7 – Resultado da Magnetização quando há perda do sinal por difusão,

há atenuação do sinal.

A cada aumento na intensidade do pulso de gradiente de campo, haverá uma refocalização menos efetiva da magnetização, devido a uma maior difusão da espécie, acarretando em um sinal mais atenuado. Assim, um gráfico da intensidade do sinal pela força do gradiente de campo resulta em um perfil de decaimento exponencial do sinal (Figura 8).

Figura 8 – Gráfico da Intensidade do Sinal (I) pela Força do Gradiente de

Campo (G), no qual pode ser observado um perfil de decaimento exponencial. Após coletar uma série de espectros 1D, adquiridos com o aumento da amplitude dos gradientes, ainda existe a necessidade de se extrair a informação dos coeficientes de difusão das espécies de interesse. Em seu artigo de 1965, Stejskal e Tanner realizaram um estudo mais aprofundado sobre o fenômeno da difusão em solução, o que os permitiu elaborar uma equação, dependente dos parâmetros da sequência de pulsos, que descrevesse este decaimento exponencial:

𝑰 = 𝑰

𝐞𝐱𝐩 [−𝜸

𝜹

𝒈

𝑫 (𝜟 −

𝟑

)]

pulso, como tempo de difusão (Δ), gradiente de campo (g), duração do pulso

de gradiente (δ), e constante magnetogírica do núcleo analisado (γ). Desta

forma, utilizando a equação de Tanner-Stejskal para a regressão exponencial do gráfico da Figura 8, o valor do Coeficiente de Difusão (D), pode ser obtido

juntamente como seu erro estatístico associado.

Isto permite que cada componente do espectro de RMN 1D possua um valor de difusão associado, desde que nenhum componente do espectro esteja sobreposto, e que cada sinal seja relativo à apenas uma espécie. Como resultado, cada perfil de decaimento reflete apenas o comportamento de um componente molecular, como pode ser observado na Figura 9.

Figura 9 – Perfil de decaimento dos sinais de uma mistura de água, cafeína e

Uma maneira elegante de se apresentar os resultados dos experimentos de difusão é utilizando uma representação de contornos pseudo 2D, que é chamado de DOSY (Diffusion-Ordered Spectroscopy ou Espectroscopia de Difusão Ordenada). [20] Nesta forma de apresentação, uma dimensão (eixo das abscissas) representa o deslocamento químico e a outra dimensão (eixo das ordenadas) representa os coeficientes de difusão de cada componente, conforme demonstrado na Figura 10.

Figura 10 – Espectro pseudo 2D ou DOSY. A regressão exponencial da

equação de Stejskal-Tanner gera um valor para D (Coeficiente de Difusão) e um erro estatístico associado.

20 _{Barjat, H.; Morris, G. A.; Smart, S.; Swanson, A. G.; Williams, S. C. R.; J.}

O pseudo 2D, forma de apresentação mais amplamente utilizada, é sintetizado de forma que o centro do sinal de contorno, na dimensão da difusão, representa a magnitude do coeficiente de difusão e a largura do sinal, nesta mesma dimensão, reflete a magnitude do erro estatístico da regressão exponencial, representado tipicamente como um perfil Gaussiano.

Esta apresentação do DOSY diferencia os sinais de compostos em uma mistura a partir de seus coeficientes de difusão, permitindo a obtenção de sub-espectros para todas as espécies separadas, levando a caracterização de cada componente na mistura, sem a necessidade da separação física.

Devido a tamanhas vantagens, o DOSY vem sendo muito utilizado nos últimos anos para análise de misturas, tanto sintéticas, como de produtos naturais ou de fármacos [7] e, pela sua vasta utilização, novas sequências de pulsos foram sendo desenvolvidas ao longo dos anos de forma a se obter espectros cada vez melhores, como menos artefatos possíveis. [21]

1.4. Sequências de Pulsos de RMN

Um sequência simples para adquirir espectros de DOSY é a já mencionada spin-eco com pulso de gradiente de campo (PFG-SE), que decodifica os sinais após o tempo de difusão. Porém, esta sequência apresenta dois problemas: a relaxação transversal (T2) durante o tempo de difusão (o que

acarreta também na atenuação do sinal) e J-modulation. [22]

21 _{Souza, A. A.; Marsioli, A. J.; Ferreira, A. G.; Laverde Jr., A.; Fujiwara, F.}

Y.; Figueiredo, I. M.; Vizzotto, L.; Fernandes, S. A.; “Fundamentos e

Aplicações da Ressonância Magnética Nuclear – Difusão Molecular por RMN”, Vol. 4, 1ª ed., AUREMN, 2009.

22 _{Aguilar, J. A.; Nilsson, M.; Bodenhausen, G.; Morris, G. A.; Chem.}

Figura 11 – Efeito da J-modulation sobre um sexteto do tipo AX5. [23]

J-modulation se apresenta como a distorção de um sinal acoplado a

outros spins, como pode ser visto na Figura 11. Esta distorção se apresenta como a soma de termos dispersivos aos termos de pura absorção. O surgimento desta distorção pode gerar valores errôneos na difusão, levando ao surgimento de sinais não esperados e resultando em interpretações também errôneas, como será demonstrado mais adiante.

Isto ocorre, pois (considerando a PFG-SE) após a magnetização ser rotacionada ao plano transversal pelo pulso de 90ºX, ela irá evoluir livremente

durante o tempo t. O deslocamento químico será refocalizado, mas não a evolução do acoplamento J. [24] Na descrição por produtos de operadores, a magnetização transversal, de um sistema de dois núcleos acoplados AX de spins ½, com operadores Î1 e Î2, respectivamente, pode ser descrita, após o eco de spin de (90º – 𝜏 2⁄ – 180º – 𝜏 2⁄ ), como:

𝑀𝑥𝑦 =

cos(𝜋𝐽

𝜏) Î

+

sin(𝜋𝐽

𝜏) 2Î

Î

+

𝐜𝐨𝐬(𝝅𝑱

𝝉) Î

+

𝐬𝐢𝐧(𝝅𝑱

𝝉) 𝟐Î

Î

23 _{Figura gentilmente cedida por Prof. Mathias Nilsson e Dr. Adolfo Botana}

(University of Manchester – UK).

24 _{Villar, J. D. F.; “Fundamentos e Aplicações da Ressonância Magnética}

Os termos contendo Î1x e Î2x representam magnetização em fase (em verde), e normalmente são ajustados como modo de absorção no espectro. Entretanto, os termos contendo Î1xÎ2z e Î2xÎ1z (em vermelho), que representam a magnetização anti-fase, acrescentam caráter de dispersão no sinal e, portanto, contribuem para deformação da definição do sinal, gerando a J-modulation. Durante todo o tempo de difusão (Δ) a magnetização se encontra no plano XY, levando ainda a uma atenuação por relaxação transversal (T2).

Por este motivo, a maior parte das sequências utilizadas para difusão atualmente são baseadas em eco estimulado com pulso de gradiente de campo (“Pulsed Field Gradient Stimulated-Echo” ou PFG-STE) (Figura 12). Neste caso, a magnetização é armazenada no eixo z durante a maior parte do tempo de difusão, onde é apenas afetada pela relaxação longitudinal (T1), que

geralmente é mais lenta que a relaxação transversal (T2). Isto permite que

maiores tempos de difusão sejam utilizados, e a J-modulation seja muito reduzida, mas não eliminada.

Figura 12 – Esquema da sequência de Pulsed Field Gradient Stimulated Echo

No entanto, estas sequências necessitam de uma longa ciclagem de fase, para que os caminhos de transferência de coerência sejam os desejados e que coeficientes de difusão apropriados sejam obtidos, levando a experimentos muito longos (tipicamente de mais de 20 minutos). Desta forma, uma nova sequência, descrita por Pelta e colaboradores, [25] focava na obtenção de espectros de DOSY sem a necessidade de ciclagem de fase (com tempos de aquisição de menos de 1 minuto). Esta sequência foi chamada então de Oneshot (Figura 13), pois permitia a obtenção de espectros com boa definição do sinal (signal lineshape) com apenas um transiente por valor de força gradiente utilizado (i.e. 1 scan por gradiente).

Figura 13 – Esquema da sequência de Oneshot

A Oneshot deriva inicialmente da sequência de eco estimulado com par de pulsos bipolares [26] (“Bipolar Pulse Pair Stimulated Echo”, BPPSTE),

25 _{Pelta, M. D.; Morris, G. A.; Stchedroff, M. J.; Hammond, S. J.; Magn.}

Reson. Chem. 40, S147-S152, 2002.

26 _{Wider, G.; Dötsch, V.; Wüthrich, K.; J. Magn. Reson. Series A 108,}

ilustrado na Figura 14, que normalmente requer que haja EXORCYCLE, [27] para garantir que apenas magnetização espacialmente codificada contribua para o sinal final.

Figura 14 – Esquema da sequência de Bipolar Pulse Pair Stimulated Echo

(BPPSTE)

A primeira variação da Oneshot em relação á BPPSTE é o desbalanceamento dos dois pares de pulso bipolares de gradiente, para que ambos estejam na razão de 1+α : 1-α, isto defasa qualquer magnetização não refocalizada pelo pulso de 180º, removendo a necessidade do EXORCYCLE.

Desta maneira, a sequência refocaliza o deslocamento químico mas perde a refocalização do lock do sinal do deutério, o que levaria a perda da definição do sinal em condições de alta resolução. Isto foi contornado ao serem adicionados pulsos de balanciamento do gradiente aplicado no início e no final do tempo de difusão, Δ, mantendo estes pulsos extras o mais próximo

27 _{Bodenhausen, G.; Freeman, R.; Turner, D. L.; J. Magn. Reson. 27, 511-514,}

possível entre si e dos pares bipolares, para minimizar distorções no sinal do lock. O mesmo princípio é aplicado quando um pulso de gradiente de campo, durante o período Δ, é adicionado (Gradiente de purga, Gp), defasando

coerências de ordens maiores que zero. Distorções no sinal do lock são reduzidas se seu par balanceado for acrescentado logo antes do tempo de difusão, Δ, ou seja, no começo da sequência, chegando finalmente a sequência da Figura 13.

A equação da atenuação do sinal utilizando a sequência Oneshot é levemente diferente daquela descrita por Stejskal-Tanner:

𝐈(𝐠) 𝐈(𝟎)

= 𝐞𝐱𝐩⁡{−𝛄

_𝐠

_𝛅

_{𝐃 [𝚫 + 𝛅}

+ 𝛕

]

Onde g é a amplitude dos pulsos de gradiente, cada um de duração de 𝛿 2⁄ , γ é a razão magnetogírica do núcleo analisado, α é o fator de desbalanceamento, Δ é tempo de difusão e τ é a duração do eco de spin. Esta expressão é levemente alterada dependendo da forma dos pulsos de gradiente de campo (como por exemplo, trapezoidal, senoidal, etc...).

Nestas sequências, inclusive na Oneshot, o deslocamento químico é refocalizado mas o acoplamento escalar não é, levando a J-modulation. [28] Como descrito anteriomente, espectros com J-modulation apresentam sinais com componentes tanto de absorção quanto de dispersão. Artefatos nos experimentos de difusão surgem pois o decaimento de sinais de dispersão ocorrem mais lentamente que sinais de absorção. Este artefato pode ser observado na Figura 15, em que a sobreposição dos sinais do 2-pentanol e do

28 _{Momot, K. I.; Kuchel, P. W.; Concepts in Magnetic Resonance Part A 28,}

1-propanol, unida á J-modulation, informa erroneamente a presença de uma terceira espécie na solução.

Figura 15 – 1H DOSY utilizando a sequência Oneshot. A expansão da região mostra o efeito da J-modulation no sinal, e o artefato que a mesma gera no

espectro pseudo 2D. [29] [30]

A primeira complicação gerada pela J-modulation é o aumento do número e a extensão de sobreposições de sinais. A segunda é mais sutil: o coeficiente de difusão aparente devido a J-modulation pode ser maior ou menor do que a soma de seus componentes de absorção e de dispersão (uma vez que ambos têm diferentes formas de decaimento com o aumento da força

29 _{Reproduzido com a autorização da Elsevier (Nº da licença:}

3636591481838).

30 _{Botana, A.; Aguilar, J. A.; Nilsson, M.; Morris, G. A.; J. Mag. Reson. 208,}

do gradiente). Portanto, um número inesperado de coeficientes de difusão pode ser obtido, levando a uma errônea interpretação na quantidade, e na natureza, das espécies envolvidas na solução, assim como já demonstrado na

Figura 15.

De forma a eliminar os efeitos da J-modulation, diversos métodos e sequências foram empregadas ao longo dos anos. [31] E apesar de muitos a eliminarem, todos perdem sensibilidade devido a perdas por relaxação e normalmente necessitam de longas ciclagens de fase, além de que, não eliminam J-modulation devido a acoplamentos fortes (como no caso de acoplamentos geminais).

Como já era descrito por Torres e colaboradores [32], a adição de um elemento de “purga” no final da sequência Oneshot (em geral adicionando pulsos de radiofrequência) levam a eliminação desta modulação. Diversos métodos são sugeridos na literatura, entre eles: “trim pulse” [33], LED com gradiente de “homospoil” [34], “chirp based” com filtro em z. [35]

Botana e colaboradores [30] descreveram a sequência de Oneshot45 (Figura 16), onde a adição de um pulso de 45º agiria como elemento de “purga” mais efetivamente do que os métodos anteriores.

31 _{a) Takegoshi, K.; Ogura, K.; Hikichi, K.; J. Magn. Reson. 84, 611–615,}

1989. b) van Zijl, P. C. M.; Moonen, C. T. W.; von Kienlin, M.; J. Magn.

Reson. 89, 28–40, 1990.

32 _{Torres, A. M.; Cruz, R. D.; Price, W. S.; J. Mag. Reson. 193, 311-316,}

2008.

33 _{Pelta, M. D.; Barjat, H.; Morris, G. A.; Davis, A. L.; Hammond, S. J.; Mag.}

Res. Chem. 36, 706-714, 1998.

34 _{Gibbs, S. J.; Johnson Jr., C. S.; J. Mag. Reson. 93, 395-402, 1991.}

35 _{Bohlen, J.; Burghardt, I.; Rey, M.; Bodenhausen; G.; J. Mag. Reson. 90,}

Figura 16 – Esquema da sequência de Oneshot45

Assim, quando o pulso de 45º for aplicado ao longo do eixo x, imediatamente após a Oneshot, a magnetização em fase é inalterada, mas os termos anti-fase são alterados como descrito a seguir:

sin(𝜋𝐽₁₂𝜏) 2Î_1𝑦Î_2𝑧+ sin(𝜋𝐽₁₂𝜏) 2Î_2𝑦Î_1𝑧𝜋→ ⁄ (Î4 1𝑥+Î2𝑥)

+ 𝐜𝐨𝐬(𝝅 𝟒⁄ ) 𝐬𝐢𝐧(𝝅𝑱𝟏𝟐𝝉) 𝟐Î𝟏𝒚Î𝟐𝒛 − 𝐬𝐢𝐧(𝝅 𝟒⁄ ) 𝐬𝐢𝐧(𝝅𝑱𝟏𝟐𝝉) 𝟐Î𝟐𝒚Î𝟏𝒛

+ 𝐜𝐨𝐬(𝝅 𝟒⁄ ) 𝐬𝐢𝐧(𝝅𝑱𝟏𝟐𝝉) 𝟐Î𝟐𝒚Î𝟏𝒛 − 𝐬𝐢𝐧(𝝅 𝟒⁄ ) 𝐬𝐢𝐧(𝝅𝑱𝟏𝟐𝝉) 𝟐Î𝟏𝒚Î𝟐𝒛

[Equação 5]

No Produto de operadores associados ao pulso de 45º nos termos anti-fase, descritos na Equaçaõ 5, os termos em vermelho e os termos em verde cancelam-se entre si. É importante relembrar que na descrição dos produtos de operadores para a magnetização do eco de spin (ou do eco estimulado) dos termos em fase e anti-fase, por serem ortogonais entre si (i.e. por apresentarem comutador nulo), podem ser manipulados separadamente. Já que _{cos(𝜋 4⁄ ) =} 𝑠𝑒𝑛(𝜋 4⁄ ), estes termos se cancelam, e a magnetização anti-fase indesejada é

removida. O pulso de purga de 45º permite a eliminação completa de (em teoria) qualquer magnetização anti-fase de sistemas do tipo AX e, para tempos de ecos de spin curtos, a maior parte da magnetização anti-fase para sistemas de spin mais complexos.

Todos os termos bilineares (aqueles da forma ÎiyÎjz, com i e j acoplando entre si) se cancelam, e metade da coerência de termos de alta ordem é transformado em coerência de multiple-quantum, indetectável. A adição do pulso nesta sequência requer apenas uma ciclagem de fase de dois transientes para bons resultados, então o aumento no tempo de experimento não é muito grande. Na Figura 17 observamos que mesmo com a sobreposição parcial dos sinais do 2-pentanol e do 1-propanol, utilizando a Oneshot45, os sinais podem ser atribuidos corretamente.

Figura 17 – 1H DOSY utilizando a sequência Oneshot45. A expansão da região mostra que o efeito da J-modulation no sinal foi eliminado, gerando

uma atribuição correta das correlações do pseudo 2D. [29] [30]

1.5. Matrix-Assisted DOSY (MAD)

Além de artefatos, como é o caso da J-modulation, alguns dos problemas encontrados nos experimentos de DOSY, são a sobreposição de sinais e a semelhança dos coeficientes de difusão de alguns componentes da mistura. Uma forma de resolver o segundo problema é empregar alguma substância que modifique os coeficientes de difusão de cada um dos componentes da mistura, uma técnica chamada de MAD (“Matrix Assisted

DOSY” ou DOSY Auxiliado por Matriz). [36] Dentre essas substâncias auxiliares podemos destacar surfactantes, polímeros ou ciclodextrinas. [37]

Para entender os princípios envolvidos no MAD, a equação de Stokes-Einstein [38] deve ser analisada. Nesta, descrita abaixo, observa-se que o coeficiente de difusão (D) é uma propriedade física que depende tanto da Constante de Boltzman (KB), quanto da temperatura (T), da viscosidade do meio (η) e também do raio hidrodinâmico da espécie (R). Assim, compostos

do mesmo tamanho, possuem coeficientes de difusão muito próximos, e não são separados no domínio da difusão.

𝑫 =

𝑲

𝑻

𝟔𝝅𝜼𝑹

Nos experimentos de MAD, agentes complexantes ou surfactantes, como o SDS (Dodecil sulfato de sódio) ou o AOT (Docusato de sódio) (Figura 18), que apresentam grande valor de raio, interagem dinamicamente com os compostos de uma mistura alterando, deste modo, seu raio hidrodinâmico. Ao aumentar-se o raio hidrodinâmico, diminui-se o valor da difusão, e por isso, os valores de coeficientes de difusão aparente dos analitos também diminuem.

36 _{Evans, R.; Haiber, S.; Nilsson, M.; Morris, G. A.; Anal. Chem. 81,}

4548-4550, 2009.

37 _{Johnson, C. S.; Prog. Nucl. Mag. Res. Spec. 34, 203-256, 1999.}

Figura 18 – Acima, Dodecil sulfato de sódio (SDS); Abaixo, Docusato de

sódio (AOT).

Como cada composto interage diferentemente com o agente complexante, pois apresentam diferentes constantes de equilíbrio (k) [39], cada componente da mistura é diferenciado na dimensão da difusão (Figura 19).

39_{Thureau, P.; Ancian, B.; Viel, S.; The´vand, A.; Chem. Commun., 200–202,}

Figura 19 – Ilustração esquemática do equilíbrio dinâmico do SDS com um

analito. À esquerda da seta de equilíbrio estão representados os analitos em solução e a micela de SDS e, à direita da seta de equilíbrio, o analito

complexado pela micela de SDS.

Vale a pena ressaltar que o valor do coeficiente de difusão aparente, neste caso, corresponde ao valor médio ponderado da difusão do analito livre e do analito interagindo com a matriz. [40] Ou seja, a difusão experimental (aparente ou observada) é uma média ponderada da difusão do composto solvatado pelo solvente e do composto complexado pela micela, como descreve a equação abaixo:

𝑫

= 𝒙⁡𝑫

+ 𝒚⁡𝑫

Onde Dobservado é o valor de difusão de cada soluto medido pelo

experimento de DOSY com surfactante, Dsolvatado é o valor de difusão do

soluto medido sem adição de surfactante, Dcomplexado é o valor de difusão do

complexo soluto-surfactante e onde 𝑥 + 𝑦 = 1. Desta relação ainda é possível obter o k (constantes de equilíbrio) de cada um dos analitos com o surfactante

[41]_{, utilizando a equação a seguir:}

𝒌 =

𝒇

(𝟏−𝒇

⁡)⁡⁡([𝒔𝒖𝒓𝒇]

−𝒇

[𝒔𝒐𝒍𝒖𝒕]

)

Onde [surf]0 é a concentração do surfactante no meio, [solut]0 é a

concentração de soluto e 𝑓_𝑏 é a fração do soluto que esta complexado com o surfactante. Esta fração pode assumir valores entre 0, se nenhum analito interage com o surfactante, e 1, se todo analito está complexado. A medida experimental da fração complexada, 𝑓_𝑏, pode ser calculada pela equação abaixo:

𝒇

_𝒃

=

𝑫

−𝑫

𝑫

−𝑫

Nesta equação, Dcomplexado, a difusão do complexo isômero-surfactante,

pode ser aproximada ao valor de difusão apenas da micela, Dsurfactante. Este

valor de difusão do surfactante é a difusão do surfactante a uma concentração infinita no meio, e é medido pela regressão linear do gráfico do Coeficiente de

Difusão do surfactante (medido por DOSY) pelo inverso da concentração de surfactante (Figura 20), sendo este o coeficiente linear.

Figura 20 – Gráfico do Coeficiente de Difusão do surfactante versus o inverso

da concentração de surfactante. O coeficiente linear da reta (em vermelho) indica difusão do surfactante a uma concentração infinita.

1.6. O núcleo de

F

Como experimentos de DOSY apresentam melhor resultado quando não há sobreposição de sinais entre os componentes da mistura, surge a nescessidade de utilizar outras técnicas de RMN [42] ou outros núcleos ativos na RMN diferente do 1H, em sistemas onde há sobreposição de sinais ou que estes não estejam bem definidos – como é o caso onde há acoplamentos de segunda ordem. Uma alternativa são experimentos com o núcleo de 19F. Este, por possuir spin ½, ser o único isótopo ativo presente na natureza (i.e. 100% de abundância natural) e possuir grande razão magnetogírica (γ), de 25,18x107 rad T-1 s-1, é bastante sensível para espectroscopia 1D de RMN (83% de sensibilidade relativa ao 1H). Adicionalmente, suas propriedades permitem

uma boa comparação com a RMN 1H e, por isso, com o 1H DOSY. Além de seus grandes acoplamentos dipolares 19F-19F e 1H-19F permitirem que o efeito nuclear Overhauser (nOe) seja medido. [43]

Porém, uma das características intrínsecas mais úteis e simples do núcleo de 19F é sua sensibilidade à alteração do deslocamento químico frente a pequenas alterações no ambiente químico. Enquanto a janela de 1H é em torno de 15 ppm, para a maioria dos compostos orgânicos, a janela do 19F é de 400 ppm. [44] Devido a isso, os espectros de 19F são bem resolvidos, o que impede que diferentes picos estejam sobrepostos, melhorando a qualidade de espectros de DOSY. Soma-se a isso o fato dos compostos empregados como matriz não possuírem átomos de flúor em sua estrutura e, assim sendo, não apresentarem sinais em experimentos de 19F. Assim, adaptar sequências de pulso para que a aquisição de sinais seja feita na frequência do núcleo de flúor se torna indispensável.

Além do já citado, diversos compostos de interesse farmacêutico apresentam átomos de flúor em sua composição (Figura 21) [45], abrindo um grande leque para a aplicação de RMN de 19F no controle de qualidade desses fármacos, bem como no estudo de processos de degradação dos mesmos. Desta forma, a aplicação do 19F DOSY para estes sistemas apresentaria uma redução de custos e de tempo de análise para a indústria farmacêutica, onde é interessante estudar a composição de uma mistura de maneira mais simples ao invés da utilização de técnicas de separação física, acopladas á técnicas de análise (como por exemplo, CG-MS, HPLC-UV ou LC-NMR), onde há a

43 _{Marsh, E. N. G.; Suzuki, Y.; ACS Chem. Bio. 9, 1242-1250, 2014.}

44 _{Zhao, Y.; Markopoulos, G.; Swager, T. M.; J. Am. Chem. Soc.}

136,10683-10690, 2014.

45_{Purser, S.; Moore, P. R.; Swallow, S.; Gouverneur, V.; Chem. Soc. Rev. 37,}

necessidade de um operador com conhecimento de ambas as técnicas e equipamentos mais caros.

2.

Objetivos

Em face do exposto, o presente projeto tem como objetivo empregar a técnica DOSY e MAD para os núcleos de 1H e 19F no estudo de misturas dos isômeros de posição orto-, meta- e para-fluorfenóis (Figura 22d) e fluoranilinas (Figura 22e), utilizando os surfactantes SDS e AOT como agente de separação das espécies químicas contidas nas misturas analisadas. Será testada a eficiência da sequência OneShot adaptada para 19F, de forma a determinar-se os coeficientes de difusão de uma espécie fluorada, exemplificada aqui com o 2-fluoranisol (Figura 22c). Ainda, serão analisados sistemas aromáticos contendo mais de um átomo de flúor (Figura 22a e

Figura 22b) para avaliar o efeito do acoplamento homonuclear nJFF nos

experimentos de 19F DOSY empregando a sequência OneShot45 adaptada para

19_F.

Finalmente, estudos com a utilização de experimentos de RMN 1D e 2D baseados no efeito Overhauser nuclear (NOESY, HOESY e ROESY) serão conduzidos para que assim se possa compreender a interação substrato/surfactante, de forma a elaborar um modelo de interação dos mesmos para que estudos de outros sistemas, utilizando 19F DOSY, sejam previstos.

Figura 22 – Fórmulas estruturais dos compostos que serão estudados. a)

1-bromo-2,3-difluorbenzeno; b) 1-bromo-2,4,5-trifluorbenzeno; c) 2-fluoranisol; d) isômeros do fluorfenol; e) isômeros da fluoranilina.

3.

Parte experimental

3.1. Preparo das soluções estoque

Todas as amostras utilizadas são comercialmente disponíveis e foram utilizadas sem prévia purificação. Soluções estoques de cada amostra foram preparadas nos solventes utilizados, sendo estes ou água deuterada (para os casos onde micelas normais de SDS foram utilizadas) ou tetraclorometano dopado com 10% de cicloexano perdeuterado (para os casos onde micelas reversas de AOT foram utilizadas).

Uma tabela contendo as massas e volumes de solvente utilizados para cada composto foi construída e os valores de concentrações finais foram utilizados para a diluição dos mesmos nas misturas padrões preparadas (Tabela 1). Todas as misturas preparadas foram calculadas para um volume final de 0,8 mL, e foram adicionados TSP-d4 (2,2,3,3-d4

-3-(trimetilsilil)propanoato de sódio) ou TMS (tetrametilsilano) como referências para os espectros de RMN de 1H.

Tabela 1 – Concentração das soluções estoque utilizadas

Composto Massa / mg Volume / mL

(Solvente) Concentração do Estoque / mM SDS 5623,3 [46] 50 (D2O) 390 AOT 4801,3 [46] 50 (CCl4) 216 orto-fluoroanilina - 2 (D2O) 160 [47] orto-fluoroanilina 35,6 2 (CCl4) 160 meta-fluoroanilina - 2 (D2O) 189 [47] meta-fluoroanilina 47,1 2 (CCl4) 212 para-fluoroanilina - 2 (D2O) 182 [47] para-fluoroanilina 47,6 2 (CCl4) 214 orto-fluorofenol 83,4 2 (D2O) 372 orto-fluorofenol 61,2 2 (CCl4) 273 meta-fluorofenol 85,9 2 (D2O) 383 meta-fluorofenol 52,2 2 (CCl4) 233 para-fluorofenol 85,1 2 (D2O) 366 para-fluorofenol 49,3 2 (CCl4) 220

As amostras contendo 2-fluoranisol, bromo-2,3-difluorbenzeno e 1-bromo-2,4,5-trifluorbenzeno foram preparadas utilizando 5 mg de cada composto para 0,8 mL de cada solução, não sendo preparadas soluções estoques para as mesmas.

46 _{Os surfactantes foram pesados sem prévia secagem e, uma vez que são}

higroscópicos, apresentam um pouco de água em sua massa.

47 _{As soluções estoque de orto-, meta- e para-fluoranilinas, por serem muito}

insolúveis em água, foram preparadas saturando 5 mL de água deuterada com cada composto, e em seguida, utilizando uma solução de concentração conhecida de para-fluorfenol para sua padronização, estas concentrações foram determinadas como sendo aproximadamente 160, 189 e 182 mM para a

3.2. Equipamentos utilizados

Todas as medidas foram realizadas em um espectrômetro Bruker Avance III, 1H á 500 MHz, com sonda BBO smartprobe e em um Bruker Avance III, 1_{H á 600 MHz, TBI (para} 1_{H) ou TBO (para} 19_{F), todas as sondas}

equipadas com uma bobina de gradiente-z produzindo um gradiente nominal máximo de 55 G cm-1. Os experimentos foram realizados utilizando regulador de temperatura (BCU), fixo em 20oC, para evitar erros por convecção, exceto quando especificado.

3.3. Experimentos de difusão

Os dados de DOSY foram adquiridos utilizando as sequências

OneShot (para singletos) ou OneShot45 (para sistemas com acoplamento nJFF).

Para todas as análises os valores de Tempo de Difusão (Δ ou d20) e Duração do Pulso de Gradiente (δ ou p30) foram otimizados para as melhores condições de difusão (Anexo 25), e variam entre 30-100 ms e 1000-2000 µs, respectivamente. A duração dos pulsos de purga (p19) e do delay para a recuperação do gradiente (d16) foram de 600 µs e 200 µs, respectivamente, exceto quando especificado. O valor do fator de desbalanceamento (α ou cnst14) utilizado foi de 0,2 em todos os casos.

Espectros de DOSY foram construídos utilizando métodos padrões do DOSY Toolbox [48], utilizando os parâmetros da equação modificada de Tanner-Stejskal para levar em conta os efeitos da não-homogeneidade dos pulsos de gradiente de campo. “Reference deconvolution” [49] foi utilizada para corrigir inconsistências instrumentais em alguns casos de forma a aperfeiçoar a resolução dos sinais. Uma largura de sinal de 10 Hz, utilizando

48 _{Nilsson, M.; J. Mag. Res. 200, 296-302, 2009.} 49 _{Morris, G. A.; J. Magn. Reson. 80, 547-552, 1988.}

uma função Lorentziana, foi usada nos espectros de 19F DOSY para garantir uma boa razão de sinal/ruído.

Uma vez que os valores de difusão foram empregados apenas para distinguir os sinais de RMN de compostos em misturas, o eixo do coeficiente de difusão não foi calibrado.

4.

Resultados e Discussão

4.1. Sequências de Difusão adaptadas para

F

4.1.1.

F DOSY Oneshot

Uma vez que os sinais de 19F se apresentam muito mais resolvidos do que os sinais de 1H, para obter espectros de DOSY melhores, a sequência de

1_{H DOSY Oneshot foi adaptada como parte da tese de doutorado da Dra.}

Denize C. Favaro, para o 19F{1H}, conforme ilustrado na Figura 23. [50]

19_F Gz

Δ

δ/2

δ/2

HCPD

Figura 23 – Sequência de 19F DOSY Oneshot

É importante notar na Figura 23 a presença de uma linha de comando da QNP (Quattro Nucleus Probe) switch. A unidade QNP é utilizada para que

50 _{Denize C. Favaro; Tese de Doutoramento, Instituto de Química,}

seja utilizado o mesmo amplificador para pulsar os núcleos de 1H e 19F. Isto permite que o mesmo amplificador seja utilizado para pulsar na frequência de

19_{F durante a maior parte da sequência e durante a aquisição em} 19_{F desacople} 1_{H, fornecendo assim espectros de difusão de flúor desacoplados de}

hidrogênio.

Assim, ao comparar um espectro de uma mistura contendo 3-fluorfenol e 2-fluoranisol (Figura 22d e Figura 22c) de 1H DOSY (Figura

24a) e um espectro de 19F DOSY (Figura 24b) da mesma mistura, observa-se que para o 1H todos os núcleos de ambas as espécies tem frequências muito próximas (entre 6,5 e 7,5 ppm). Assim, como os sinais são todos sobrepostos, além de valores de difusão de cada composto, ainda encontram-se valores intermediários de difusão. Desta forma, se obtém uma informação errada da quantidade de espécies em solução, além da dúvida sobre qual valor tomar para os seus respectivos coeficientes de difusão.

Figura 24 – Espectros: a) 1H DOSY Oneshot e b) 19F DOSY Oneshot da mistura de 3-fluorfenol (19F em -113 ppm) e 2-fluoranisol (19F em -138 ppm)

Porém, ao se analisar o espectro de 19F DOSY (Figura 24b), pode ser observado claramente que cada sinal do flúor gera apenas um sinal correspondente na dimensão da difusão. Desta forma, nota-se inequivocamente que apenas duas espécies estão em solução. Isto ocorre, pois os sinais de 19F apresentam-se como singletos totalmente resolvidos, não ocorrendo desta forma a sobreposição que gera sinais duvidosos na dimensão da difusão.

4.1.2.

F DOSY Oneshot45

Quando a sequência de 19F DOSY Oneshot foi aplicada para sistemas aromáticos difluorados, foi observada distorção nos sinais devido ao efeito da

J-modulation e, como os acoplamentos 19F-19F são muito maiores do que os acoplamentos 1H-1H [51], a distorção devida a J-modulation é muito mais pronunciada para espectros de difusão de Flúor. Assim, surge a necessidade de se adaptar a sequência Oneshot45, descrita por Botana e colaboradores utilizando 1H, para o 19F{1H}.

51 _{Dolbier Jr, W. R.; “Guide to Fluorine NMR for Organic Chemists”, John}

19 F Gz

Δ

HCPD

Figura 25 – Sequência de 19F DOSY Oneshot45

Para avaliar-se a utilidade da sequência de Oneshot45 comparada com a Oneshot tradicional para 19F DOSY, uma amostra contendo 1-bromo-2,3-difluorobenzeno (Figura 22a), foi analisada. Ambas as medidas foram feitas utilizando condições idênticas na análise, como tempo de difusão (Δ) e duração do pulso de gradiente (δ). Os resultados obtidos estão ilustrados na

Figura 26 – Espectro menos atenuado 1D de 19F DOSY a) utilizando Oneshot e b) utilizando Oneshot45 para uma amostra de 1-bromo-2,3-difluorobenzeno,

em DMSO-d6. [52][53]

Como pode ser observado na Figura 27a, a distorção devido a

J-modulation foi completamente eliminada utilizando a sequência de Oneshot45, e os sinais de difusão apresentam perfeito alinhamento, com um

coeficiente de difusão médio de (5,11 ± 0,02) × 10-10m2 s-1.

52 _{Reproduzido com a autorização de John Wiley and Sons (Nº da licença:}

3636590601134).

53 _{Dal Poggetto, G.; Favaro, D.; Nilsson, M.; Morris, G. A.; Tormena, C.;}

Figura 27 – Espectro pseudo 2D de 19F DOSY do 1-bromo-2,3-difluorobenzeno, em DMSO-d6, utilizando a sequência Oneshot45. [52] [53]

Para demonstrar o potencial da sequência Oneshot45 para sistemas com diferentes acoplamentos 19F-19F, uma mistura mais complexa contendo 1-bromo-2,3-difluorobenzeno e 1-bromo-2,4,5-trifluorobenzeno (Figura 22a e

Figura 22b) foi escolhida. O composto trifluorado foi escolhido por

apresentar uma faixa com diversos valores de acoplamentos homonucleares (5JFF = 4,4 Hz, 4JFF = 13,6 Hz, e 3JFF = 22,4 Hz) e porque este padrão de

substituição (2,4,5-) é comum em compostos farmacêuticos que contenham flúor, como o sitagliptin. [54]

O espectro de 19F DOSY Oneshot45 desta mistura está apresentado na

Figura 28. Devido aos sinais bem resolvidos de 19F, os sinais na dimensão da difusão apresentam-se claramente separados, demonstrando que há apenas a presença de duas substâncias contendo flúor, em solução. Os seus coeficientes

54 _{S. Swallow, “Medicinal Chemistry from Biophysical Aspects to Clinical}