4. Resultados e Discussão
4.1. Sequências de Difusão adaptadas para 19 F
Uma vez que os sinais de 19F se apresentam muito mais resolvidos do que os sinais de 1H, para obter espectros de DOSY melhores, a sequência de
1H DOSY Oneshot foi adaptada como parte da tese de doutorado da Dra.
Denize C. Favaro, para o 19F{1H}, conforme ilustrado na Figura 23. [50]
19F Gz
Δ
Gp -Gp G1 G1 1+α 1-α 1+α 2α 2α 1-αδ/2
δ/2
HCPD
1H QNP_X SW.F SW.HFigura 23 – Sequência de 19F DOSY Oneshot
É importante notar na Figura 23 a presença de uma linha de comando da QNP (Quattro Nucleus Probe) switch. A unidade QNP é utilizada para que
50 Denize C. Favaro; Tese de Doutoramento, Instituto de Química,
seja utilizado o mesmo amplificador para pulsar os núcleos de 1H e 19F. Isto permite que o mesmo amplificador seja utilizado para pulsar na frequência de
19F durante a maior parte da sequência e durante a aquisição em 19F desacople 1H, fornecendo assim espectros de difusão de flúor desacoplados de
hidrogênio.
Assim, ao comparar um espectro de uma mistura contendo 3- fluorfenol e 2-fluoranisol (Figura 22d e Figura 22c) de 1H DOSY (Figura
24a) e um espectro de 19F DOSY (Figura 24b) da mesma mistura, observa-se que para o 1H todos os núcleos de ambas as espécies tem frequências muito próximas (entre 6,5 e 7,5 ppm). Assim, como os sinais são todos sobrepostos, além de valores de difusão de cada composto, ainda encontram-se valores intermediários de difusão. Desta forma, se obtém uma informação errada da quantidade de espécies em solução, além da dúvida sobre qual valor tomar para os seus respectivos coeficientes de difusão.
Figura 24 – Espectros: a) 1H DOSY Oneshot e b) 19F DOSY Oneshot da mistura de 3-fluorfenol (19F em -113 ppm) e 2-fluoranisol (19F em -138 ppm)
Porém, ao se analisar o espectro de 19F DOSY (Figura 24b), pode ser observado claramente que cada sinal do flúor gera apenas um sinal correspondente na dimensão da difusão. Desta forma, nota-se inequivocamente que apenas duas espécies estão em solução. Isto ocorre, pois os sinais de 19F apresentam-se como singletos totalmente resolvidos, não ocorrendo desta forma a sobreposição que gera sinais duvidosos na dimensão da difusão.
4.1.2.
19F DOSY Oneshot45
Quando a sequência de 19F DOSY Oneshot foi aplicada para sistemas aromáticos difluorados, foi observada distorção nos sinais devido ao efeito da
J-modulation e, como os acoplamentos 19F-19F são muito maiores do que os acoplamentos 1H-1H [51], a distorção devida a J-modulation é muito mais pronunciada para espectros de difusão de Flúor. Assim, surge a necessidade de se adaptar a sequência Oneshot45, descrita por Botana e colaboradores utilizando 1H, para o 19F{1H}.
51 Dolbier Jr, W. R.; “Guide to Fluorine NMR for Organic Chemists”, John
19 F Gz
Δ
Gp -Gp G1 G1 1+α 1-α 1+α 2α 2α 1-α δ/2 δ/2 45°HCPD
1H QNP_X SW.F SW.HFigura 25 – Sequência de 19F DOSY Oneshot45
Para avaliar-se a utilidade da sequência de Oneshot45 comparada com a Oneshot tradicional para 19F DOSY, uma amostra contendo 1-bromo-2,3- difluorobenzeno (Figura 22a), foi analisada. Ambas as medidas foram feitas utilizando condições idênticas na análise, como tempo de difusão (Δ) e duração do pulso de gradiente (δ). Os resultados obtidos estão ilustrados na
Figura 26 – Espectro menos atenuado 1D de 19F DOSY a) utilizando Oneshot e b) utilizando Oneshot45 para uma amostra de 1-bromo-2,3-difluorobenzeno,
em DMSO-d6. [52][53]
Como pode ser observado na Figura 27a, a distorção devido a J-
modulation foi completamente eliminada utilizando a sequência de Oneshot45, e os sinais de difusão apresentam perfeito alinhamento, com um
coeficiente de difusão médio de (5,11 ± 0,02) × 10-10m2 s-1.
52 Reproduzido com a autorização de John Wiley and Sons (Nº da licença:
3636590601134).
53 Dal Poggetto, G.; Favaro, D.; Nilsson, M.; Morris, G. A.; Tormena, C.;
Figura 27 – Espectro pseudo 2D de 19F DOSY do 1-bromo-2,3- difluorobenzeno, em DMSO-d6, utilizando a sequência Oneshot45. [52] [53]
Para demonstrar o potencial da sequência Oneshot45 para sistemas com diferentes acoplamentos 19F-19F, uma mistura mais complexa contendo 1- bromo-2,3-difluorobenzeno e 1-bromo-2,4,5-trifluorobenzeno (Figura 22a e
Figura 22b) foi escolhida. O composto trifluorado foi escolhido por
apresentar uma faixa com diversos valores de acoplamentos homonucleares (5JFF = 4,4 Hz, 4JFF = 13,6 Hz, e 3JFF = 22,4 Hz) e porque este padrão de
substituição (2,4,5-) é comum em compostos farmacêuticos que contenham flúor, como o sitagliptin. [54]
O espectro de 19F DOSY Oneshot45 desta mistura está apresentado na
Figura 28. Devido aos sinais bem resolvidos de 19F, os sinais na dimensão da difusão apresentam-se claramente separados, demonstrando que há apenas a presença de duas substâncias contendo flúor, em solução. Os seus coeficientes
54 S. Swallow, “Medicinal Chemistry from Biophysical Aspects to Clinical
de difusão médios foram determinados, com boa confiança estatística, sendo (4,88 ± 0,03) × 10-10m2s-1, para o composto trifluorado (Figura 22c), e 5,32 ± 0,02 × 10-10m2 s-1, para o composto difluorado (Figura 22b).
Figura 28 – Espectro pseudo 2D de 19F DOSY da mistura de 1-bromo-2,3- difluorobenzeno (azul) e 1-bromo-2,4,5-trifluorobenzeno (vermelho), em
DMSO-d6, utilizando a sequência Oneshot45. [52] [53]
Observou-se, em uma análise mais atenta nos espectros 1D desta mistura (Figura 29), que para ambas as sequências, uma pequena distorção nas intensidades relativas dos sinais é observada.
Figura 29 – Espectros menos atenuados 1D de 19F DOSY da mistura de 1- bromo-2,3-difluorobenzeno e 1-bromo-2,4,5-trifluorobenzeno, em DMSO-d6,
a) utilizando Oneshot45 e b) utilizando Oneshot. [52] [53]
Estes efeitos ocorrem devido às distorções de Off-ressonance. Como o
offset (frequência em que a radiofrequência, RF, é pulsada), localizado no
centro do espectro, não excita homogeneamente toda região espectral do flúor, quanto mais longe um sinal estiver do offset, menos este sentirá o valor correto
do pulso. [55] Na Figura 30, pode-se observar que o decaimento de um pulso de radiofrequência é senoidal a partir do offset.
Figura 30 – Perfil dos pulsos de excitação de: a) um pulso duro, e b) um
pulso seletivo. O centro do perfil de decaimento representa o valor de offset. Essas distorções são mais pronunciadas quando se utiliza a sequência de Oneshot45 (Figura 29a) devido ao último pulso extra de 45º estar longe de seu valor nominal e um pouco de caráter anti-fase ainda ser adicionado aos sinais, levando distorções nas intensidades dos mesmos. Ao analisarem-se os sinais com a sequência Oneshot (Figura 29b), observa-se que este efeito é menos pronunciado, mas o efeito de J-modulation é notório.
Por isto, optou-se pela utilização da sequência Oneshot45 apenas em sistemas onde há acoplamento 19F-19F (e por isso J-modulation), e a sequência
Oneshot para sistemas onde há apenas singletos para os sinais de flúor.
Existem duas formas de resolver o problema de distorções de off-
ressonance, a mais elegante é desenvolver uma sequência com pulsos de
excitação compostos, capazes de excitar toda a janela espectral com a mesma
55 Keeler, J.; “Understanding NMR Spectroscopy”, 2ª ed., John Wiley & Sons
potência nominal, e a outra forma é realizar uma ciclagem de fase para garantir que o efeito de off-ressonance seja cancelado.
Neste trabalho optamos por realizar um estudo do efeito da ciclagem de fase, por ser uma solução bem mais simples do que o desenvolvimento de uma sequência de pulsos. Como demonstrado na Figura 31, os espectros apresentam boas correlações e erros estatísticos muito baixos se forem adquiridos de forma adequada, ou seja, é necessário utilizar um número apropriado de scans. A partir de um determinado número de scans, 32 neste caso, o valor de difusão dos compostos analisados não varia.
0 10 20 30 40 50 60 125 250 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 orto-fluorphenol meta-fluorphenol para-fluorphenol C oef icient e de D if usã o ( 19 F ) / m 2 s -1 x 1 0 -10 Número de Scans (NS)
Figura 31 – Gráfico do número de scans versus o Coeficiente de difusão, de
uma mistura de meta (círculo), orto (quadrado) e para (triângulo) fluorfenol (Figura 22d).
Os pulsos compostos de excitação para experimentos de 19F estão em desenvolvimento pela doutoranda Jane Power no laboratório do Professor Mathias Nilsson (University of Manchester – UK), colaborador deste projeto.
Estes resultados de 19F DOSY foram publicados na revista “Magnetic
Resonance in Chemistry”. [53]
4.2.
19F “Matrix Assisted DOSY” (MAD)
Nos últimos anos alguns artigos de separação de misturas isoméricas por 1H DOSYempregando micelas foram realizados, inclusive dois deles pelo grupo de pesquisa, no qual se desenvolve o presente projeto [56]. Porém, não existe nenhum estudo na literatura utilizando micelas para a separação de isômeros por DOSY com detecção de 19F. As sequências descritas anteriormente neste exame foram utilizadas para estudar o efeito de micelas de SDS e AOT (Figura 18) na separação de regioisômeros, como orto, meta e
para-fluorfenol e fluoranilina (Figura 22d e Figura 22e).
4.2.1.
19F MAD utilizando SDS
Inicialmente, foi determinada a Concentração Micelar Crítica (CMC) do SDS com fluorfenóis – valor de concentração de surfactante a partir da qual micelas são formadas em solução. Para esta medida, diversas técnicas podem ser utilizadas. Tais como: light scatering, osmometria de pressão de vapor, luz ultra-violeta ou RMN. [57] Utilizando as medidas de difusão por RMN (Figura 32), foi possível determinar a CMC para o SDS.
56 a) Tormena, C. F.; Evans, R.; Haiber, S.; Nilsson, M.; Morris, G. A.; Magn.
Reson. Chem. 48, 550–553, 2010. b) Tormena, C. F.; Evans, R.; Haiber, S.; Nilsson, M.; Morris, G. A.; Magn. Reson. Chem. 50, 458–465, 2012.
Figura 32 – Gráficos do Coeficiente de Difusão do SDS (analisando o triplete
do CH3 do SDS) por a) concentração de SDS; b) inverso da concentração de
SDS
Utilizando o gráfico do inverso da concentração de SDS (Figura 32b), foi possível determinar que antes da concentração de 4,0 mM não havia micelas, e depois da concentração de 9,1 mM estas já se formavam, pois as inclinações das retas antes e depois da CMC são diferentes. Podemos concluir que estas inclinações são diferentes devido ao raio hidrodinâmico do SDS em solução ser menor do que o raio hidrodinâmico da micela. A intersecção das duas retas resulta no valor de CMC, medido aqui como aproximadamente 4,8 mM (para soluções contendo 10 mM de cada isômero do fluorfenol). Valor coerente com a literatura (4,8 mM). [58]
Um segundo estudo foi realizado, determinando o efeito da concentração dos fluorfenóis na CMC do SDS. Na Figura 33, observou-se que com o aumento da concentração dos fluorfenóis, ocorre uma diminuição
58 Zhou, W.; Zhu, L.; J. Hazardous Mat. B109, 213–220, 2004.
na CMC. Este fato sugere que o fluorfenol facilita a formação de micelas, mesmo em baixas concentrações de SDS. [59]
Figura 33 – Gráfico do inverso da concentração do SDS versus o coeficiente
de difusão, variando a concentração dos fluorfenóis.
Ainda, a fim de avaliar se a variação no coeficiente de difusão é devido à interação do fluorfenol com o surfactante, ou se este é devido a efeitos de viscosidade ou obstrução, foi construído um gráfico correlacionando a difusão do SDS, do para-fluorfenol e do TSP-d4 com a concentração de
surfactante (Figura 34).
Figura 34 – Gráfico da difusão (1H DOSY) dos sinais SDS, para-fluorfenol (10 mM) e do TSP-d4 versus a concentração de SDS.
Neste gráfico pode-se observar que o perfil de decaimento no valor de difusão do TSP é bem diferente do para-fluorfenol. Enquanto o TSP decai apenas devido ao aumento da viscosidade e do efeito de obstrução [60], se apresentando quase que como uma reta de leve declinação, o decaimento do
para-fluorfenol é bem mais brusco, acompanhando o decaimento exponencial
do SDS e, portanto, demonstrando esta interação.
Por este raciocínio, determinou-se que uma baixa concentração de fenóis e uma concentração acima da CMC para o SDS deveriam ser utilizadas, e assim estipular a melhor relação analito/surfactante. Conforme pode ser visto no espectro de 19F DOSY (Figura 35a), os três isômeros do fluorfenol, em uma concentração de 5 mM nas amostras (para cada isômero), apresentam os mesmos valores de difusão na ausência de SDS (pois têm tamanhos muito
próximos), e por isso não é possível diferenciá-los nesta dimensão. Porém, com a adição de SDS em uma concentração de 100 mM, é possível separar os isômeros orto-, meta- e para-fluorfenol (Figura 35b), pois cada composto fluorado interage diferentemente com o SDS.
Figura 35 – 19F DOSY de uma mistura contendo orto (verde), meta (azul) e
para (vermelho) fluorfenol a) sem SDS; b) com 100 mM de SDS.
Pela Tabela 2 confirma-se que não havia separação antes da adição do SDS ao passo que após a adição de SDS os isômeros apresentam valores de difusão distintos.
Tabela 2 – Valores estatísticos para os fluorfenóis com SDS Difusão / m2 s-1 x 10-10
Sem SDS [SDS] = 100mM
Orto-fluorfenol 6,6 ± 0,1 3,11 ± 0,05
Meta-fluorfenol 6,7 ± 0,1 2,63 ± 0,03
Para avaliar o efeito da concentração de SDS, e consequentemente da concentração de micelas, foi realizado um estudo (Figura 36) variando a concentração de SDS e mantendo a concentração dos isômeros de fluorfenol constante (5 mM de cada um deles).
Figura 36 – Gráfico da concentração de SDS versus o Coeficiente de difusão
do orto (verde), meta (azul) e para (vermelho) fluorfenol.
Conforme pode ser visto na Figura 36, quanto maior a concentração de SDS maior é a diferença nos coeficientes de difusão dos isômeros do fluorfenol (melhor separação), atingindo o máximo da separação a 100 mM de SDS. Isto ocorre, pois quanto maior a concentração do SDS, maior o número de micelas para a interação com os analitos, ou seja, maior a proporção do analito interagindo com o SDS do que livre em solução.
Esta tendência deixa de ocorrer quando a concentração de SDS se torna superior a 100 mM, pois acima desta concentração, o isômero orto- fluorfenol se separa mais dos outros compostos. Uma interpretação plausível é
de que acima de 100 mM a proporção do isômero orto interagindo com a micela e em solução não se altera e, desta forma, sua variação no coeficiente de difusão, é praticamente devido ao aumento da viscosidade e do efeito de obstrução. Pelos valores de pka (constante de dissociação ácida) para os fenóis, apresentados na Figura 37, é possível visualizar que o orto-fluorfenol é o isômero mais ácido, ou seja, tem a tendência a ser desprotonado a um valor mais baixo de pH do meio do que os outros isômeros.
Figura 37 – Valores das constantes físicas dos fenóis estudadas.
Com isto em mente, podemos assumir que em concentrações mais altas de SDS, que por sua vez apresentam valores cada vez mais alto de pH, exista uma maior proporção do isômero orto na forma de base conjugada (fenólica). O aumento do pH com o aumento da concentração de surfactante aniônico é causado pela formação de uma dupla camada elétrica ao redor da micela, de carga positiva a fim de compensar a carga negativa ao redor da micela. [61] Esta carga positiva da dupla camada é formada, em grande parte,
61 a) Pashley, R. M.; Karamanm M. E.; “Applied Colloid and Surface
Chemistry”, Chichester, John Wiley & Sons, Ltd., pág. 174, 2004. b) Shawn,
D. C.; “Introduction to Colloid and Surface Chemistry”, 4ª ed., Burlington, Elsevier Science Ltd., pág. 93, 1992.
por cátions da solução (como sódio iônico) e hidrogênios ácidos (H+ ou H3O+), deixando o meio do seio da solução mais básico. Assim, uma vez que o
SDS é um surfactante aniônico, e, portanto, possui carga negativa em sua cabeça polar, existe uma repulsão deste com o fenolato [62] e assim o coeficiente de difusão medido deixa de diminuir, o que não ocorre tão evidentemente com os outros fenóis, pois apresentam valores de pka mais elevados.
Ainda, com o aumento da concentração acima de 100 mM de surfactante, o isômero meta logo deixa de diminuir seu valor de coeficiente de difusão na mesma magnitude do isômero para-fluorfenol. Esta tendência também segue os valores de pka das espécies, pois, neste pH haverá cada vez mais fenolato do isômero meta (pka de 8,97), do que para o isômero para (pka de 9,92). Desta forma, estas espécies deixam de se separar a uma concentração mais elevada de surfactante.
Além disso, pelos valores apresentados na Tabela 2, fica claro que o isômero que interage mais fortemente com a micela é o meta-fluorfenol, pois é o que apresenta a maior variação da difusão, seguido pelo para-fluorfenol e, o que menos interage, é o orto-fluorfenol. Estudos da interação destes isômeros com o SDS foram feitos utilizando o efeito nuclear Overhauser, descrito mais adiante.
Mimetizando os resultados obtidos para o fluorfenol, com a utilização de SDS, separou-se virtualmente uma mistura contendo 5 mM de cada isômero de orto, meta e para-fluoranilinas (Figura 38), sendo que o máximo da separação ocorre em uma concentração de 225 mM de SDS.
62 Sabatino, S.; Szczygiel, A.; Sinnaeve, D.; Hakimhashemi, M.; Saveyn,H.;
Figura 38 - Gráfico da concentração de SDS versus o Coeficiente de difusão
do orto (verde), meta (azul) e para (vermelho) fluoroanilina.
Pela Figura 39 confirma-se que não havia separação antes da adição do SDS e após a adição a separação fica evidente.
Figura 39 – 19F DOSY de uma mistura contendo orto (verde), meta (azul) e
Tabela 3 – Valores estatísticos para as fluoroanilinas com SDS Difusão / m2 s-1 x 10-10 Sem SDS [SDS] = 225mM Orto-fluoroanilina 6,7 ± 0,1 1,92 ± 0,02 Meta-fluoroanilina 6,70 ± 0,09 1,76 ± 0,03 Para-fluoroanilina 6,6 ± 0,1 1,85 ± 0,02
Assim, como para o fluorfenol, a meta-fluoranilina é o que apresentou a interação mais forte com o SDS, e a orto-fluoranilina, o isômero que menos interage com o surfactante. Estes resultados para ambas as espécies fluoradas serão explicados mais adiante com a utilização do efeito nuclear Overhauser.
A separação dos isômeros se mostrou eficiente tanto para moléculas contendo grupos ácidos como grupos básicos em sua estrutura, o que indica que a técnica pode ser aplicada para uma ampla gama de compostos.
4.2.2.
19F MAD utilizando AOT
Além do estudo com SDS, o fluorfenol também foi estudado utilizando AOT como agente de separação. Diferentemente do SDS, que era preparado em água deuterada, o AOT foi preparado em soluções de CCl4 (utilizando
10% de C6D12, para o lock). A utilização de um solvente orgânico apolar se
deve ao fato de que o AOT forma micelas reversas, enquanto o SDS apresenta micelas normais (Figura 40).
Micela normal Micela reversa
Figura 40 – Diferentes tipos de micelas
Pela Figura 41, observamos que a separação com AOT é mais pronunciada para o orto-fluorfenol do que para os compostos meta e para.
Figura 41 – Gráfico da concentração de AOT versus o coeficiente de difusão
Analisando atentamente a concentração de 25 mM de AOT observa-se a melhor condição de separação dos três isômeros, com pequenos valores de erro. Este aumento nos valores dos erros para as soluções mais concentradas de surfactante, possivelmente devem-se a problemas de viscosidade e a não homogeneidade do campo (shim). Ainda, a pequena variação no coeficiente de difusão do orto-fluorfenol indica que este provavelmente não está interagindo com a micela (ou está interagindo em uma extensão muito pequena), diferentemente de como os outros dois isômeros interagem, sendo, mais uma vez, esta variação no coeficiente de difusão devido ao efeito de obstrução.
Figura 42 – 19F DOSY de uma mistura contendo orto (verde), meta (azul) e
para (vermelho) fluorfenol com 25 mM de AOT.
Mesmo sendo menos visível pelo gráfico de contorno da Figura 42, é possível, observando os dados contidos na Tabela 4, a separação dos isômeros do fluorfenol utilizando AOT.
Tabela 4 – Valores estatísticos para os fluorfenóis com AOT Difusão / m2 s-1 x 10-10
Sem AOT [AOT] = 25 mM
Orto-fluorfenol 14,8 ± 0,2 13,7 ± 0,1
Meta-fluorfenol 14,5 ± 0,2 9,80 ± 0,09
Para-fluorfenol 14,8 ± 0,2 10,26 ± 0,09
Um efeito de separação mais efetiva foi observado utilizando este surfactante com a fluoranilina (Figura 43). Isto deve ocorrer, pois a interação do AOT é bem diferente com cada isômero da fluoranilina, e o mesmo não é observado na interação deste surfactante com cada isômero do fluorfenol. Este efeito talvez exista devido à diferença de propriedades químicas entre os analitos: enquanto o fluorfenol é levemente ácido, a fluoranilina é básica.
Figura 43 – Gráfico da concentração de AOT versus o coeficiente de difusão
Assim, observamos que, também utilizando 25 mM de AOT, foram obtidas condições para a separação destes compostos, como visto na Figura
44. Note que a orto-fluoranilina, assim como acontecia com o orto-fluorfenol,
não interage com o surfactante, ou pelo menos, interage fracamente.
Figura 44 - 19F DOSY de uma mistura contendo orto (verde), meta (azul) e
para (vermelho) fluoroanilina com 25 mM de AOT.
Tabela 5 – Valores estatísticos para os fluoroanilinas com AOT Difusão / m2 s-1 x 10-10
Sem AOT [AOT] = 25 mM
Orto-fluoroanilina 13,6 ± 0,2 13,3 ± 0,3
Meta-fluoroanilina 13,5 ± 0,2 12,7 ± 0,3
Para-fluoroanilina 13,9 ± 0,2 12,1 ± 0,1
Um problema inesperado encontrado, além dos elevados valores de erro estatístico, é que o isômero para interage mais fortemente com o AOT, ao invés do isômero meta como em todos os outros casos. Outro problema
inesperado é que existe um alargamento no sinal de 19F da para-fluoranilina nas misturas com AOT. Este alargamento ocorre provavelmente, pois esta interação pode ser mais forte com este isômero e, portanto, faz com que o complexo analito-surfactante se comporte como uma molécula grande, diminuindo consideravelmente o valor de T2 desta espécie (Figura 45),
alargando este sinal. [63]
Figura 45 – Valor de T1 e T2 para moléculas de acordo com seu tamanho
Na Figura 46, onde as mesmas condições de processamento e aquisição foram utilizadas, é possível perceber este alargamento de sinal.
63 Levitt, M. H.; “Spin Dynamics: Basis of Nuclear Magnetic Resonance”, 2ª
Figura 46 – Sinais de 19F da 4-fluoroanilina sem (acima) e com (abaixo) a adição de AOT. O valor em Hertz sobre o sinal é a largura a meia altura.
Inicialmente, foi sugerido que este alargamento poderia ocorrer devido a um regime de troca intermediário para o equilíbrio entre a 4-fluoranilina e o AOT livres e associados, levando a um sinal alargado ou a “coalescência” do sinal. Ou seja, a interação não teria um regime rápido (onde apenas um sinal seria visível e um valor de constante muito alta), nem um regime lento (onde dois sinais, um do composto livre e um do composto interagindo, seriam visíveis e um valor de constante muito baixo). [64] Este fenômeno pode ser analisado na Figura 47.
Figura 47 – Influência do Campo Magnético (B0) e da Temperatura (T) na
dinâmica do equilíbrio de interação, interferindo na forma e no número de sinais.
É descrito pela literatura que a alteração da temperatura, e do campo magnético utilizado deveria afetar o regime desta interação. Assim,