Bioensaios celulares: Princípios e Aplicações

Bioensaios celulares:

Princípios

e Aplicações

Letícia Veras Costa Lotufo

Laboratório de Oncologia Experimental Departamento de Fisiologia e Farmacologia,

UFC

PROGRAMA:

•  11/02

– aula 1 - Princípios básicos – Ensaios de

citotoxicidade

– aula 2 –Alvos celulares - Ciclo celular

•  12/02

– aula 3 – Alvos celulares - Citoesqueleto

– aula 4 - Morte celular: apoptose versus

Cultura de células

•  Cultura de células é o processo pelo qual células são mantidas vivas e em crescimento fora de seu tecido original em condições controladas

•  Usos:

–  biologia celular –  farmacologia –  bioengenharia

Aplicações do cultivo celular

Histórico

•  Descoberta:

– 1907: Ross Granville Harrison (Embriologista - John Hopkins Medical School)

“…Ele dissecou o tubo medular de um embrião de sapo de cerca de meio centímetro e o mergulho em linfa fresca de sapo, que logo coagulou.” (Peres & Curi, 2005). Assim começou a cultura de tecidos…

Trabalho publicado: Harrison, R.G. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine, 4: 140-13, 1907.

Histórico:

•  Trecho do Trabalho de Harrison

(1907):

•  “Quando se tomam as precauções assépticas

adequadas, os tecidos sobrevivem nessas condições por um semana e, em alguns casos, foram mantios espécimes vivos durante aproximadamente quatro semanas.”

Histórico

•  Alexis Carrel (Rockefeller Institute for Medical

Research) – buscava formas de prolongar o tempo de vida das células em cultura.

1912 – Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina Descobriu que a troca de meio onde eram mantidas as células favorecia o

prolongamento do tempo de vidadas células. Carrel, A. Journal of Experimental Medicine, 15: 516-528, 1912.

Histórico

•  George Gey (John Hopkins Medical School) – 1952

– Henrietta Lacks –cancer de útero – Células HeLa – crescimento

rápido

Histórico

•  Hayflick and Moorhead (1961)

•  25 linhagens de fibroblastos derivadas de fetos

•  Características que distinguem as linhagens •  Cultivo celular como uma importante

ferramenta para o entendimento de processos biológico

Trabalho publicado: “The serial cultivation of human diploid cells strains”. Experimental cell Research, 25(3): 585-621.

HARRY EAGLE (1955) -Nutrition
Needs
of
Mammalian
Cells
in
Tissue


Culture.
Science,
September
16,
1955,
122
(3168):
501–504

•  Realizou uma análise sistemática dos nutrientes necessários ao crescimento de células animais em cultura;

•  Estudou o crescimento de duas linhagens de células: •  células HeLa

•  células L

•  O meio em que cultivou estas células continha: •  Mistura de sais

•  Carbohidratos •  Aminoácidos

Aminoácidos Vitaminas Sais Outros Proteínas (necessárias em meios sem soro, quimicamente definidos) Arginina Cistina Glutamina Histidina Isoleucina Leucina Lisina Metionina Fenilalanina Treonina Triptofano Tirosina Valina Biotina Colina Folato Nicotinamida Pantotenato Piridoxal Tiamina Riboflavina NaCl KCl NaH₂PO₄ NaHCO₃ CaCl₂ MgCl₂ Glicose Penicilina Estreptomicina Vermelho de fenol Soro Insulina Transferrina

Factores específicos de crescimento

 
Algumas
células
não
crescem
nem
se
diferenciam
se
a
placa

não
 estiver
coberta
com
componentes
específicos
da
matriz
extracelular



Vantagens:

•  Estudo do comportamento da células em condições controladas - sem a influência animal

•  Uniformidade da amostra

•  Reprodutibilidade dos experimentos

•  Exposição a fármacos em concentrações definidas (Farmacocinética)

•  Redução da utilização de animais – Princípios éticos (3Rs)

Desvantagens:

•  Gasto elevado de material;

•  Condição de crescimento da cultura; •  Instabilidade de cultura celular;

•  Perda de características;

•  Dificuldade de extrapolação para o modelo de organismo intacto.

Limitações:

•  Necessidade de operadores experientes (com

conhecimentos da técnica em condições assépticas, etc);

•  Perda de características fenotípicas;

•  Necessidade do uso de marcadores devido à perda de características fenotípicas;

•  Instabilidade das células (sobretudo em linhagens celulares imortais).

Inimigos da culturas de células:

•  -As células são muito vulneráveis a contaminações – TÉCNICAS ASSÉPTICAS

•  Microorganismos crescem 10-50 vezes mais rápido que as células de mamífero, e são mais tolerantes a variações de temperatura, pH e disponibilidade de nutrientes.

•  Microorganismos desenvolvem resistência aos antibióticos

Fatores que aumentam a

probabilidade de contaminação:

•  Descongelamento do nitrogênio líquido

•  Utilização de enzimas para obtenção de culturas primárias

•  Culturas primárias podm vir contaminadas por microorganismos

•  Diluição excessiva das células

Equipamentos necessários:

Câmara de de fluxo laminar – sistema que permite remoção de partíclas do ar, proteção contra contaminação cruzada

Equipamentos necessários:

•  Manutenção da temperatura a 37°C

Técnicas Básicas:

•  Aquisição das linhagens

– Linhagens permanentes e cultura primária

•  Congelamento e descongelamento

– N2 líquido

– Uso de crioprotetor – DMSO

•  Manutenção das células

– Meio de cultura, Temperatura, pH,

Umidade

Linhagens permanentes


(imortais ou transformadas)

•  Capacidade ilimitada de crescimento

em cultura

•  Origem:

– Derivadas de células tumorais

– Transfecção com oncogenes

– Carcinógeno

Cultura primária

•  Preparadas diretamente das células

obtidas de um tecido de um

organismo, com ou sem etapa inicial

de desagregação

•  Crescimento

finito

em cultura

Evolução de uma linhagem

celular

Subcultivo ou Repicagem

Transferência
do
conteúdo
de
um
frasco
para
dois
novos

frascos
 –
troca
de
meio


Células
aderidas
–
necessidade
de
um
agente
desagregador

 (tripsina)


Contagem de células

Viabilidade celular - Exclusão por

Azul de Tripan

Azul de Tripan

Inviável

Viável Tripan Amostra _Contagem

Cinética de crescimento celular

–  alimento –  estímulo –  ambiente fase
lag
 fase
log
 plateau
 declínio
 tempo
 númer o
de
células 


Avaliação da citotoxicidade

•  Citotoxicidade é a capacidade de se ser tóxico à células •  Métodos colorimétricos ou fluororimétricos:

–  MTT / XTT –  SRB –  Alamar Blue –  Calceína AM –  EthD •  Citostático x citotóxico •  Tempo e concentração

-  Rápido   Sensível   Confiável   Seguro   Eficiente   Custo-benefício

Exigências de um teste de

citoxicidade

in vitro

:

Princípios do método:

•  O MTT (ou XTT) são metabolizados pelas

células viáveis pruduzindo formazan – Leitura

colorimétrica

•   no. células viáveis –  metabolização

 coloração

•  Não é um bom método para discriminar entre

atividade citostática e citocida

•  XTT e MTT –possuem solulibidade diferente

•  MTT-metabolização mais eficiente

Citoplasma
 meio
extra‐celular
 Berridge
&
Tan,
1993
 Doadores
de
e‐
 NADH₂ NADPH
 FADH


+


Avaliação da atividade antiproliferativa em

células tumorais


Incubação
das
células
 com
as
amostras






 (fator
de
diluição
2)
 >
[

]
=
100
mcg/mL
 0h
 24h
 48h
 72h
 Leitura
da
 absorbância


diluição
(1/2)
 branco
 C
‐
 100
mcg/mL
 0
1,56
3,13
 6,25
 12,5
 25
 50
 ₁₀₀ [
mcg/mL]
 Valor es
de
ab sorbância


Princípios do método

•  Alamar blue – convertido na forma

reduzida pelas enzimas mitocondriais

•  Forma reduzida – detecção colorimétrica

e fluororimétrica

•  Reagente estável, solúvel em água,

•  Minimamente tóxico – permite

Azul
 Róseo


Hidroresofurin


Incolor



 
Alamar
Blue
fluoresce
dentro
da
célula

 ALAMAR
BLUE
é
reduzido
em
resposta
a
uma
‘redução
química’
do
meio
 devido
ao
crescimento
celular
ou
por
ação
de
enzimas
mitocondriais.
  
Removeram
“meio
reduzido”
(cultura
de
24‐48h)
>>>
+
AB/24h
 






>>>
AB
estável
e
não
produziu
fluorescência
  
Meio
com
células
mostrou
altos
valores
de
fluorescência
(~47RFU)
  
Fluorescência
própria
das
células
~
5RFU
 Presença
de
células
é
essencial
para
redução
do
AB


 
Alamar
Blue
fluoresce
dentro
da
célula

 ‐ 
Fluorescência
primária
no
citoplasma
 Assim...
AB
captado
>>
Reduzido
no
 citoplasma
>>
Excretado
para
o
meio
 Citoplasma
com
fluorescência
constante

 Pontos
brilhantes
(mitocôndrias???)

 Núcleos
fluorescentes



RESAZURINA

RESOFURINA

HIDRORESOFURINA
 Çélulas
viáveis
 Sinal
fraco
 Células
mortas
 Alto
sinal
de
fluorescência
 
ALAMAR
BLUE
depende
do
“status”
de
oxi‐redução
 
Presença
de
células
>>>
Redução
do
meio
ou
do
AB

 
Fluorescência
encontrada
no
núcleo
e
citoplasma
 
Diaforases:
Resazurina
>>>>>>>>>>>
Resofurina
 
Células
de
mamíferos,
bactérias
(mitocôndrias
ou
citoplasma)


PRECAUÇÕES
IMPORTANTES:
 ‐ 
Observar
reatividade
cruzada
do
AB
com
compostos
testados
 ‐ 
Otimizar
culturas
celulares
>>>
Evitar
redução
excessiva
do
AB
 VANTAGENS:
 ‐ 
Melhor
para
determinar
pontos
específicos
de
viabilidade
(CI₅₀)
 ‐ 
Menos
laborioso
 ‐ 
Mais
barato
que
a
maioria
dos
outros
testes
por
HTS
 







5g
de
resazurina
‐
400L
de
solução

 







Conc.
final
de
10%
no
meio
de
cultura


Contagem
 Incubação
com
as
 amostras
 Alamar
Blue

 Absorbância
em
570nm
 e
595nm
 Cultura
de
células


Teste de citotoxicidade in vitro

Ensaio do alamar blue

Células
plaqueadas
e
drogas
diluídas
 usando
o
HTS
(High
throughput
screening)



SULFORODAMINA B


Descrito por Skehan et al., 1990. New colorimetric cytotoxicity assay for anticancer-drug screening. J.

Princípio do método

•  Corante róseo carregado negativamente (aminoxantina) tomado por aminoácidos básicos

•   no. de células -  tomada do corante

•  Método sensível e rápido – utiliza menos células

•  Permite descriminar atividade citostática de citocida

10% TCA

0,4% SRB

1% AA

Placa TimeZero tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br tz tz tz br

Cell 1 Cell 2 Cell 2

tz – TimeZero br – Branco

Placa Test/Drug (uma para cada cell)

t t t c t t t c t t t t t t c t t t c t t t t t t c t t t c t t t t t t c t t t c t t t t t t c t t t c t t t t t t c t t t c t t t t t t s t t t s t t t ds t t t s t t t s t t t ds

Test 1 Test 2 Drug

D – Drug t – Test c – Control S – Standard ds – Drug-Standard.

Resultados

Alguns trabalhos

comparativos…

Objetivos

•  Comparar a performance do Alamar blue e

do MTT como teste de citoxicidade

Conclusões

•  Os ensaios são comparáveis

•  Ambos são baseados em transformações

enzimáticos – falsos positivos ou negativos

•  Importância da observação morfológica

Alguns trabalhos

comparativos…

Objetivos

•  Comparação SRB e MTT

•  2 linhagens HT29 (cancer coloretal) e

11B (carcinoma de células

esquamosas)

•  6 substâncias com # mecanismos

• 

Conclusões

•  SRB – melhor linearidade

•  Resultados comparáveis

•  SRB – placas podem ser guardadas por

várias semanas