Universidade Federal da Bahia Escola de Medicina Veterinária
Programa de Pós Graduação em Ciência Animal nos Trópicos
Salvador-Bahia 2010
Metapneumovírus Aviário: Levantamento
Soroepidemiológico e Caracterização Molecular em Criações Industriais e de Galinhas de Quintal no Pólo Avícola da Bahia
TATIANE SANTANA SALES
METAPNEUMOVÍRUS AVIÁRIO: LEVANTAMENTO
SOROEPIDEMIOLÓGICO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR EM CRIAÇÕES INDUSTRIAIS E DE GALINHAS DE QUINTAL NO PÓLO
AVÍCOLA DA BAHIA
Dissertação apresentada à Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos, na área de Saúde Animal.
Orientadora: Prof. Dra. Lia Muniz Barretto Fernandes
Salvador – Bahia 2010
FICHA CATALOGRÁFICA
SALES, Tatiane Santana
Metapneumovírus Aviário: Levantamento Soroepidemiológico e Caracterização Molecular em Criações Industriais e de Galinhas de Quintal no Pólo Avícola da Bahia/ Tatiane Santana Sales. – Salvador, 26/03/2010. 83p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) - Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, 2010.
Professora Orientadora – Prof. Dra. Lia Muniz Barretto Fernandes
Palavras-chave – Metapneumovírus Aviário, Frangos de corte, Galinhas de quintal, Elisa indireto, reação em cadeia de polimerase-Nested-transcriptase reversa.
1 – Sales, Tatiane Santana 2 – Metapneumovírus Aviário 3 – Infecção em frangos de corte e galinhas de quintal I- Metapneumovírus Aviário: Levantamento Soroepidemiológico e Caracterização Molecular em Criações Industriais e de Galinhas de Quintal no Pólo Avícola da Bahia.
METAPNEUMOVÍRUS AVIÁRIO: LEVANTAMENTO
SOROEPIDEMIOLÓGICO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR EM CRIAÇÕES INDUSTRIAIS E DE GALINHAS DE QUINTAL NO PÓLO
AVÍCOLA DA BAHIA
TATIANE SANTANA SALES
Dissertação defendida e aprovada para obtenção do grau de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos.
Salvador, 26 de março de 2010.
Comissão Examinadora:
__________________________________________________ Prof. Dra. Lia Muniz Barretto Fernandes – Universidade Federal da Bahia
Orientadora
__________________________________________________ Prof. Dra. Silvia Ines Sardi– Universidade Federal da Bahia
__________________________________________________
Prof. Dra. Deborah Bittencourt Mothé Fraga – Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz /FIOCRUZ/BA.
Aos meus pais, Dinalva e Albis, pelo incentivo constante e amor, em todos os momentos.
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Prof. Dra. Lia Muniz Barretto Fernandes, pelos ensinamentos, pelo imenso apoio e incentivo e pela atenção constante a mim dispensada, mas, em especial por ter sido responsável pelo meu despertar para a pesquisa científica e o trabalho acadêmico na área de Avicultura;
Ao Prof. Paulo César Costa Maia, pelo apoio constante e incentivo, pelos ensinamentos, e pelo exemplo de paciência e sabedoria;
A meus pais e minha irmã, Taisa, por todo o amor e incentivo e por estarem ao meu lado, sempre;
A Raildo, pelo amor, dedicação e paciência; por sempre acreditar em mim e fazer com que, ao seu lado, qualquer obstáculo pareça fácil de ser ultrapassado;
As minhas queridas amigas, Cida, Amanda, Elen e Leane nenhuma palavra poderia fielmente representar o quanto a nossa amizade é importante para mim;
Aos meus amigos, Deco, Jamille, Nanda, Miriam, Ilka, Vivi, Alexandra, Aninha e Madiane pelo conforto através de palavras doces e verdadeiras;
À Izabella e Priscila, pela convivência harmoniosa e pelos bons momentos compartilhados;
Ao grupo GESAV, por toda alegria presente nos momentos de trabalho e diversão;
As colegas do Laboratório de Diagnóstico das Parasitoses em Animais, principalmente, Rosa, Katty, Sara e Lari, pelo imensurável apoio;
Ao Colegiado de Pós-Graduação da Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia;
A todos os professores, funcionários e estudantes da Pós-Graduação da Escola de Medicina Veterinária da Universidade Federal da Bahia, pelos bons momentos compartilhados no período do mestrado, especialmente, aos colegas Vitor, Karine, Luciana, Laura, Bárbara, Alfeu,Thadeu e Aroldo;
À CAPES pela concessão da bolsa de mestrado;
Por fim, a todos que contribuíram direta ou indiretamente, para a realização desse trabalho.
Há muitas razões para duvidar e uma só para crer."
ÍNDICE
LISTA DE TABELAS ... X LISTA DE FIGURAS ...XI LISTA DE ABREVIATURAS ... XII RESUMO... XIII SUMMARY ... XIV
1. INTRODUÇÃO...1
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 2
2.1. DEFINIÇÃO ... 2
2.2. HISTÓRICO E DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA ... 4
2.3. CARACTERÍSTICAS DO AGENTE... 5
2.3.1. CLASSIFICAÇÃO E ESTRUTURA DO AMPV ... 5
2.3.2. REPLICAÇÃO VIRAL ... 7 2.3.3. SUBTIPOS DO AMPV...8 2.4. EPIDEMIOLOGIA ... ..10 2.4.1. ESPÉCIES SUSCEPTÍVEIS ... ..10 2.4.2. TRANSMISSÃO ... ..11 2.4.3. PATOGENIA ... 12
2.4.4. SINAIS CLÍNICOS E LESÕES ANATOMOPATOLÓGICAS ... .13
2.5. IMUNOLOGIA ... 15 2.6. DIAGNÓSTICO...17 2.6.1. CLÍNICO...17 2.6.2. SOROLOGIA...18 2.6.3. ISOLAMENTO VIRAL...20 2.6.4. IDENTIFICAÇÃO VIRAL...21
2.6.5. DETECÇÃO DO GENOMA VIRAL...22
2.7. PREVENÇÃO E CONTROLE DO AMPV...22
3. ARTIGOS CIENTÍFICOS...26
3.1. ARTIGO 1...26
3.2. ARTIGO 2...41
4. CONSIDERAÇÕES GERAIS ... 60
LISTA DE TABELAS
ARTIGO 1
FREQUÊNCIADE ANTICORPOS CONTRA METAPNEUMOVÍRUS AVIÁRIO
EM CRIAÇÕES INDUSTRIAIS E DE GALINHAS DE QUINTAL NO PÓLO AVÍCOLA DA BAHIA.
TABELA 1- Frequência de anticorpos, valores de titulação, coeficiente de variação e desvio padrão pela infecção pelo Metapneumovírus aviário em aves de criações de frangos de corte e de galinhas de quintal no pólo avícola da Bahia ... 31
TABELA 2- Frequência de anticorpos contra o Metapneumovírus aviário em lotes de frangos de corte e propriedades de galinhas de quintal no pólo avícola da Bahia ... 32
ARTIGO 2
DETECÇÃO DO METAPNEUMOVÍRUS AVIÁRIO EM CRIAÇÕES DE FRANGOS DE CORTE E GALINHAS DE QUINTAL ATRAVÉS DA TÉCNICA DE REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE-NESTED-TRANSCRIPTASE REVERSA (NESTED RT-PCR) NO PÓLO AVÍCOLA DA BAHIA.
TABELA 1- Frequência de títulos de anticorpos contra Metapneumovírus Aviário e detecção viral em criações de frangos de corte e galinhas de quintal no Pólo avícola da Bahia... 47
TABELA 2- Detecção do Metapneumovírus Aviário em criações de frangos de corte e galinhas de quintal em diferentes estações do ano no Pólo avícola da Bahia ... 50
LISTA DE FIGURAS
REVISÃO DE LITERATURA
FIGURA 1- Comparação entre os genomas dos gêneros pneumovírus e metapneumovírus. (Adaptado de Easton, 2004) ... 5
ARTIGO 1
FREQUÊNCIADE ANTICORPOS CONTRA METAPNEUMOVÍRUS AVIÁRIO
EM CRIAÇÕES INDUSTRIAIS E DE GALINHAS DE QUINTAL NO PÓLO AVÍCOLA DA BAHIA.
FIGURA 1- Análise das amostras de soro na infecção pelo Metapneumovírus aviário em frangos de corte e galinhas de quintal no pólo avícola da Bahia, em relação à presença e ausência de sintomas respiratórios, por percentual ... 33
ARTIGO 2
DETECÇÃO DO METAPNEUMOVÍRUS AVIÁRIO EM CRIAÇÕES DE FRANGOS DE CORTE E GALINHAS DE QUINTAL ATRAVÉS DA TÉCNICA DE REAÇÃO EM CADEIA DE POLIMERASE-NESTED-TRANSCRIPTASE REVERSA (NESTED RT-PCR) NO PÓLO AVÍCOLA DA BAHIA.
FIGURA 1- Distribuição dos títulos de anticorpos contra o Metapneumovírus Aviário no lote de frangos de corte, positivo para a detecção viral... 48
FIGURA 2 - Distribuição dos títulos de anticorpos contra o Metapneumovírus Aviário em criações de galinhas de quintal, positivas para a detecção viral... 49
LISTA DE ABREVIATURAS
AMPV - Metapneumovírus Aviário TRT - Vírus da Rinotraqueíte dos Perus SCI - Síndrome da Cabeça Inchada Kb - Quilobase
nm - nanômetro vRNA - RNA viral
mAbs - anticorpos monoclonais EUA - Estados Unidos da América hMPV - Metapneumovírus Humano pH - Potencial hidrogeniônico IFI - Imunofluorescência Indireta SN - Soroneutralização
ELISA - Ensaio de imunoadsorção enzimática SPF - ave livre do patógeno específico
TOC - cultura de órgão traqueal de embriões de galinhas VERO - Células renais do macaco Verde Africano CEF - cultura de fibroblasto de embriões de galinha
Células QT-35 - Células de fibrosarcoma de codornas japonesas CER - Células rugosas de embriões de galinha
BGM - Células de rins de macaco Grivet
CEL - Células de fígado de embriões de galinha VN - vírus neutralização
IFD - Imunofluorescência direta IP- imunoperoxidase
PCR - reação em cadeia da polimerase
RT-PCR - reação em cadeia pela polimerase-transcriptase reversa RFLP - polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição
RRT-PCR - reação em cadeia da polimerase - transcriptase reversa em tempo real pb - pares de bases
SALES, T. S. Metapneumovírus Aviário: Levantamento Soroepidemiológico e Caracterização Molecular em Criações Industriais e de Galinhas de Quintal no Pólo Avícola da Bahia. Salvador, Bahia, 2010. 83p. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos) - Escola de Medicina Veterinária, Universidade Federal da Bahia, 2010.
RESUMO
A infecção pelo Metapneumovírus Aviário (AMPV) em galinhas é frequentemente associada a problemas respiratórios e à Síndrome da Cabeça Inchada (SCI), enfermidade responsável por perdas econômicas significantes no sistema intensivo de produção avícola. Existem poucas informações quanto à ocorrência de infecção pelo AMPV em lotes de frangos de corte e criações de galinhas de quintal nas diferentes regiões do Brasil. Este trabalho teve como objetivo investigar a incidência da infecção pelo AMPV em criações não vacinadas de frangos de corte e galinhas de quintal no pólo avícola do Estado da Bahia. Amostras séricas de 622 frangos de corte e 268 galinhas de quintal foram coletadas para a realização de análise sorológica através da técnica de ELISA indireto. Também foi realizada a detecção molecular utilizando o Nested RT-PCR. Os resultados obtidos demonstraram que 144 (23,15%) amostras de frangos de corte e 187 (69,78%) amostras de galinhas de quintal apresentaram títulos positivos para a infecção pelo AMPV. Os lotes de frangos de corte avaliados apresentaram freqüência de anticorpos contra o vírus de 77,14% e as criações de galinhas de quintal 94,12%. No Nested RT-PCR foi detectado o RNA do AMPV subtipo A em 11,11% dos lotes de frangos de corte e 22,22% das criações de galinhas de quintal. Estes resultados demonstram a presença da infecção pelo AMPV em ambos os sistemas de criação avaliados. Além disso, sugerem que diferentes tipos de criações e as condições climáticas podem influenciar na presença do AMPV no ambiente. Novos estudos devem ser realizados a fim de verificar se as condições climáticas, bem como a presença de aves migratórias ou comércio de aves vivas, podem influenciar na presença do Metapneumovírus aviário no meio ambiente e sua disseminação nas criações avícolas do Estado da Bahia.
Palavras-chave: Metapneumovírus Aviário; Frangos de corte; Galinhas de quintal; Elisa indireto; reação em cadeia de polimerase-Nested-trancriptase reversa.
SALES, T. S. Avian Metapneumovírus: Serological survey and molecular characterization in broilers and backyard chicken reared at the avian pole of Bahia Salvador, Bahia, 2010. 83p. Dissertation (Master of Animal Science in the Tropics) – School of Veterinary Medicine, Federal University of Bahia, 2010.
SUMMARY
Avian Metapneumovírus (AMPV) infection in chickens is frequently associated to respiratory problems and to the Swollen Head Syndrome (SCI), illness that causes significant economic losses in poultry industry. Little information is available concerning the occurrence of AMPV infection in broiler and backyard chicken creations in the different regions of Brazil. The aim of this work was investigate the incidence of AMPV infection in broiler and backyard chicken not vaccinated reared in the avian pole of the State of the Bahia. Serum samples of 622 broilers and 268 of backyard chickens were collected in order to perform serological analysis using indirect ELISA. Molecular detection was carried out the utilizing the Nested RT-PCR. The results obtained showed that 144 (23,15%) of broiler samples and 187 (69,78%) of backyard chicken samples presented positive titers. Broilers flocks analyzed had frequency of antibodies against the virus of 77.14% and the backyard chicken creations of 94,12%. RNA of AMPV subtype A was detected using nested RT-PCR in 11.11% of broilers flocks and 22.22% of backyard chicken creations. These results indicate that AMPV infection was present in both systems of production studied. Beyond that, suggest that factors related to the poultry management and the climatic conditions can influence the presence of the AMPV in the environment. Subsequent studies are necessary in order to verify if climatic conditions, as well as the presence of migratory birds or commerce of a live birds, can influence the presence of the Avian Metapneumovírus in the environment and its dissemination in poultry flocks of the State of the Bahia.
Keywords: Avian Metapneumovírus; broilers; backyard chicken; indirect Elisa; Nested RT-PCR.
1. INTRODUÇÃO
A avicultura ocupa posição de destaque dentre as atividades agroindustriais brasileiras, liderando o ranking das exportações agropecuárias nacionais, correspondendo a 43% das exportações avícolas em todo o mundo. De acordo com a União Brasileira de Avicultura (UBA) e a Associação Brasileira dos Produtores e Exportadores de Frango (ABEF), em 2009 o país produziu 10.969 milhões de toneladas de carne de frango, sendo que, desse total, 3,6 milhões de toneladas foram enviados para 146 países, gerando uma receita cambial de US$ 6,158 bilhões (LANA, 2000; QUEVEDO, 2009).
As regiões Sul e Sudeste do Brasil ainda concentram a produção avícola nacional, mas a expansão da área de produção de grãos vem promovendo o desenvolvimento da atividade em outras regiões. A região Nordeste, que tem o estado da Bahia como principal produtor de carne de frango, apresentou taxa de crescimento de abate de 27,95% entre os anos de 1994 e 2005 (EVANGELISTA et al., 2008; SANTOS FILHO et al., 2009).
A crise mundial, iniciada no final de 2008, afetou todos os setores da economia, causando a queda da renda per capita na maioria dos países do mundo. Essa redução se refletiu na importação da carne brasileira, gerando impacto sobre o setor avícola e resultando na diminuição de 2,79% nas exportações mundiais em comparação com o ano de 2008 (QUEVEDO, 2009).
Em momentos de crise econômica, reduzir custos é fundamental para a manutenção da viabilidade. Os custos diretos e indiretos relacionados à sanidade avícola podem ser minimizados a partir do conhecimento a respeito dos patógenos mais frequentes. Os problemas respiratórios possuem extrema relevância para a avicultura industrial e, dentre eles a Síndrome da Cabeça Inchada (SCI) vem se destacando não só por sua manifestação clínica, mas também por causar imunossupressão, favorecendo a associação com outros agentes (COOK, 2000; CHARY et al., 2002a).
Considerando a falta de informações a respeito da epidemiologia da Síndrome da Cabeça Inchada na Bahia, este estudo se propôs a avaliar a presença do Metapneumovírus aviário em plantéis comerciais e não comerciais do Estado, identificando o subtipo circulante e observando também os fatores ambientais que podem favorecer a presença do vírus na região.
2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1. DEFINIÇÃO
O Metapneumovírus aviário (AMPV) é o agente etiológico da Rinotraqueíte dos Perus (TRT) e é responsável por infecções agudas do trato respiratório superior de perus. Em galinhas a infecção pelo AMPV é frequentemente associada a problemas respiratórios e à Síndrome da Cabeça Inchada (SCI). Uma enfermidade emergente que acomete as galinhas em todas as idades, pode apresentar-se na forma subclínica ou aguda e encontra-se disseminada por todo o mundo (O’BRIEN, 1985; COOK, et al., 1988; NUNOYA et al., 1991).
Tendo em vista que não se consegue reproduzir a doença somente com a infecção pelo AMPV, pois este tem o papel de agente primário afetando o trato respiratório das aves. As galinhas podem estar infectadas e não apresentar sintomatologia clínica (DROUAL & WOOLCOCK, 1994; AL-ANKARI et al., 2001). Contudo, os sintomas clínicos na infecção pelo AMPV podem evoluir para um quadro respiratório severo e prolongado, quando o vírus abre porta para as infecções secundárias virais e/ou bacterianas, principalmente pela
Escherichia coli (AUNG et al., 2008).
A Síndrome da Cabeça Inchada é resultante da interação do AMPV com agentes responsáveis pela coinfecção em aves como a Pasteurella spp., Mycoplasma synoviae,
Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma imitans, Bordetella avium, Ornithobacterium rhinotracheale, Escherichia coli, o vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas, Doença de
Newcastle e Doença Infecciosa Bursal (MORLEY & THOMSON, 1984; COOK et al., 1991; NAYLOR et al., 1992; JONES, 1996; EMPEL et al., 1996; MAJO´ et al., 1997; GANAPATHY et al., 1998; KHEHRA et al., 1999; COOK et al., 2001; VAN DE ZANDE et al., 2001b).
A severidade e duração da SCI também estão relacionadas aos fatores ambientais, tais como, manejo inadequado, ventilação insuficiente, altos níveis de amônia, densidade populacional elevada e más condições de higienedo galpão (HAFEZ, 1993; AL-ANKARI et al., 2004).
Em frangos de corte infectados pelo AMPV, os sintomas clínicos manifestam-se entre três a seis semanas de idade e a enfermidade tem curso de duas a três semanas. A morbidade e mortalidade variam, de acordo com o agente secundário, tipo de criação, manejo e condições ambientais presentes. Nestas aves as perdas econômicas podem chegar a 20%, causando elevada taxa de morbidade (100%) e um baixo índice de mortalidade que pode variar de 1 a 5%. Geralmente menos de 4% do galpão mostra o inchaço na cabeça. Todavia quando ocorrem infecções secundárias virais e/ou bacterianas o índice de mortalidade do plantel pode alcançar de 20% a 30%; e a condenação de carcaça no abatedouro encontra-se entre 5 a 15% (PATTISON et al., 1989; JING et al., 1993; GOUGH et al., 1994).
As matrizes e poedeiras comerciais são afetadas principalmente no início do pico de postura, podendo estender até o final da produção. Em matrizes a morbidade varia de 3 a 10%, com índice de mortalidade em torno de 1 a 3%. Também ocorrem perdas devido à queda de postura durante a segunda e terceira semanas pós-infecção e aumento da mortalidade embrionária em torno de 3 a 10%, além de ser observado nascimento de pintinhos de má qualidade e problemas na qualidade interna dos ovos. Já em poedeiras comerciais, as taxas de morbidade e mortalidade ficam em trono de 8 e 2%, com queda da
produção de ovos e alteração da qualidade da casca dos ovos (MORLEY & THOMSON, 1984; O`BRIEN, 1985; BELL & ALEXANDER, 1990).
2.2. HISTÓRICO E DISTRIBUIÇÃO GEOGRÁFICA
O AMPV foi primeiramente isolado em perus, na África do Sul, no final da década de 1970 (BUYS & DU PREEZ, 1980; BUYS et al., 1989). Posteriormente, a infecção pelo vírus foi identificada sorologicamente em poedeiras comerciais na Europa (COOK, 2000), Reino Unido (MCDOUGALL & COOK, 1986), em frangos de corte na Espanha (DIAZ DE ESPADA & PERONA, 1984), França (GIRAUD et al., 1986), em matrizes na Inglaterra (WIETH et al., 1987), em galinhas em Israel (WEISMAN et al., 1988), em frangos de corte no Marrocos (EL HOUADFI et al., 1991), em matrizes no México (DECANINI et al., 1991), em frangos de cortes, matrizes e poedeiras das principais regiões avícolas do Brasil (ARNS & HAFEZ, 1992), Alemanha (NAYLOR & JONES, 1993), Holanda (COOK et al., 1993a), em frangos de corte e matrizes no Taiwan (LU et al., 1994), América Central e na América do Sul (JONES, 1996) e frangos de corte no Paquistão (AHMAD et al., 2005). A sorologia positiva para o AMPV também foi relatada em avestruzes no Zimbábue (CADMAN et al., 1994) e em gaivotas no mar Báltico (HEFFELS-REDMANN et al., 1998). O AMPV foi isolado em galinhas na Inglaterra (JONES et al., 1987), em frangos de corte e matrizes na Alemanha (HAFEZ, 1992), em matrizes nos Estados de Minas Gerais e São Paulo no Brasil (ARNS & HAFEZ, 1995), em frangos de corte no Japão (TANAKA et al., 1995; TANAKA et al., 1996a), em frangos de corte, matrizes e poedeiras em Israel (BANET-NOACH et al., 2005) e na Jordânia (GHARAIBEH & ALGHARAIBEH, 2007). Nos Estados Unidos da América o primeiro isolamento de AMPV ocorreu em criações comerciais de perus no Colorado, após um surto de doença respiratória em 1997 (SENNE et al., 1997; SEAL, 1998; COOK, et al., 1999). Na França, duas amostras do vírus foram isoladas de patos no ano de 1985 (BAYON-AUBOYER et al., 2000).
2.3 CARACTERÍSTICAS DO AGENTE
2.3.1. CLASSIFICAÇÃO E ESTRUTURA DO AMPV
O Metapneumovírus Aviário, pertence à Ordem Virinae, Família Paramyxoviridae, Subfamília Pneumovirinae, gênero Metapneumovírus (LING et al., 1992; PRINGLE, 1999; NJENGA et al., 2003). Anteriormente este patógeno pertencia ao gênero Pneumovírus, mas recentemente foi classificado como um Metapneumovírus, pois contém oito genes (3´-N-P-M-F-M2-SH-G-L-5’) organizados de forma diferente dos 10 genes (3’-NS1-NS2-N-P-M-SH-G-F-M2-L-5’) dos pneumovírus (EASTON et al., 2004). O genoma dos metapneumovírus não possui os genes NS1 e NS2; e os genes F e M2 estão localizados entre os genes M e SH, enquanto que nos pneumovírus, eles se localizam entre os genes G e L (YU et al., 1992b; RANDHAWA et al., 1997; PRINGLE, 1998).
Figura 1: Comparação entre os genomas dos gêneros pneumovírus e metapneumovírus. (Adaptado de Easton, 2004).
O AMPV possui um genoma de 13.3Kb, composto por RNA de fita simples, sentido negativo, envelopado e não segmentado; que codifica oito genes, denominados, Nucleoproteína (N), fosfoproteína (P), proteína Matrix (M), proteína de Fusão (F), segunda Matrix (M2), pequena proteína hidrofóbica (SH), proteína de ligação (G) e a proteína RNA polimerase dependente do RNA viral (L) (EVANS et al., 1996; NJENGA et al., 2003). O
vírus apresenta um acentuado pleomorfismo e projeções de 13 a 14 nm, distribuídas uniformemente na superfície. A forma esférica, muitas vezes observada, apresenta diâmetro de 80 a 200 nm, podendo apresentar longos filamentos de até 400 nm de comprimento (BÄCHI & HOWE, 1973). O envelope viral, derivado da membrana plasmática da célula hospedeira, é coberto por projeções e o nucleocapsídeo tem conformação helicoidal. O Metapneumovírus Aviário não apresenta atividade hemaglutinante e neuramínica, sendo incapaz de aglutinar eritrócitos de mamíferos e aves (GIRAUD et al, 1986; WYETH et al., 1987; EASTON et al., 2004).
O complexo RNA-polimerase do vírus é composto pelo RNA genômico viral (vRNA) associado às proteínas N, L e P. Este complexo é o modelo ativo para replicação e transcrição viral (EASTON et al., 2004). A proteína L é o componente principal deste complexo e se liga a sequência promotora na porção 3’ do RNA genômico, iniciando a síntese de novos RNAs virais, incluindo o RNA mensageiro. Contudo, a proteína L não tem capacidade de começar a transcrição ou replicação sem a presença da proteína P, que fornece o prolongamento que a proteína L necessita para a sua liberação e produção dos transcritos internos. A proteína N possui uma estreita associação com o RNA genômico e induz o RNA viral a formar uma estrutura helicoidal (BARIK, 2004; EASTON et al., 2004).
Nos vírus RNA de fita simples negativa, a proteína M esta associada à face interna da membrana das células infectadas (WUNNER & PRINGLE, 1976). Esta proteína tem duas funções: associar se a proteína N para impedir a transcrição viral durante a montagem e promover a associação da proteína N com o envelope nascente. Sendo provável que as proteínas M e M2 dividam estas funções (GHILDYAL et al., 2002).
No envelope viral estão inseridas, duas glicoproteínas de superfície: a proteína G, que está envolvida na ligação do vírus com o receptor da célula hospedeira (LEVINE et al., 1987); e a proteína F, que é responsável pela fusão entre o envelope viral com a membrana celular, e também na formação de sincício nas células infectadas (SCHOWALTER et al., 2006). A
proteína F é sintetizada como um precursor inativo F0, que no momento que chega ao Complexo de Golgi é clivado por proteases para formar as subunidades F1 e F2 biologicamente ativas. Portanto, a clivagem de F0 é determinante para a infectividade e patogenicidade viral. (WALSH & HRUSKA, 1983; LAMB et al., 2006). A terceira proteína de superfície SH, tem função desconhecida; com uma elevada expressão na superfície das células infectadas, mas é pouco incorporada pelo vírus (HUANG et al., 1985; OLMSTED & COLLINS, 1989; BROOR & BHARAJ, 2007).
As glicoproteínas de ligação (G) e de fusão (F), além de realizarem as funções descritas acima, são os dois principais antígenos do AMPV, que efetivamente estimulam a resposta de anticorpos neutralizantes no hospedeiro natural (QINGZHONG et al., 1994; JUSASZ & EASTON, 1994; KAPCZYNSKI, 2004).
2.3.2. REPLICAÇÃO VIRAL
A etapa inicial é a adsorção da glicoproteína G com o receptor celular. Após esta ligação, a glicoproteína F também presente no envelope viral sofre uma mudança conformacional e se funde a membrana celular. Em seguida, o complexo da RNA-polimerase responsável por toda a síntese do RNA viral é liberado no citoplasma. O genoma do RNA viral é utilizado como molde tanto para a síntese do RNA mensageiro (mRNA), quanto para a síntese da fita antigenômica (+). A replicação viral ocorre no citoplasma da célula, após a síntese do mRNA e das proteínas virais. O antigenoma (+) produzido é utilizado como molde para as cópias de RNA genômico (-). A montagem do complexo RNA-polimerase também ocorre no citoplasma, a partir da associação da nucleoproteína com o RNA viral (RNA-N) formando a estrutura helicoidal do genoma viral. Em seguida este complexo RNA-N se associa com as proteínas P e L dando origem ao complexo RNA-polimerase. A montagem do envelope viral ocorre na superfície celular. As glicoproteínas da membrana viral são sintetizadas no retículo endoplasmático da célula hospedeira sofrendo uma maturação conformacional antes de serem transportadas para o Complexo de Golgi, onde a proteína F
é clivada formando as moléculas F1 e F2 funcionais. Por fim, as glicoproteínas são transportadas à membrana citoplasmática, ocorrendo o alinhamento do complexo RNA-polimerase associado à proteína M próximo às regiões modificadas da membrana celular, e em seguida, novos vírions são liberados na superfície celular (EASTON et al., 2004).
2.3.3. SUBTIPOS DO AMPV
No final da década de 1990 acreditava-se que só existia um sorotipo do AMPV, contendo dois subtipos distintos diferenciados com base na utilização de anticorpos monoclonais (mAbs) (COLLINS et al., 1993; COOK et al., 1993a) e na análise da sequência de nucleotídeos do gene da glicoproteína G altamente variável (JUHASZ & EASTON, 1994; NAYLOR et al., 1997a; COOK et al., 1999; COOK & CAVANAGH, 2002). Estas amostras do vírus foram classificadas como subtipos A e B presentes no continente europeu (JUHASZ & EASTON, 1994). Tendo, o subtipo A do AMPV sido isolado pela primeira vez na África do Sul e Grã-Betanha, ao passo que o subtipo B foi isolado em países do continente europeu, tais como: Hungria, Espanha e Itália; e na Jordânia (COOK & CAVANAGH, 2002; GHARAIBEH & ALGHARAIBEH, 2007). Ambos os subtipos também foram identificados no Japão e nas Américas do Sul e Central (SEAL, 1998; SEAL et al., 2000; MASE et al., 2003). Vinte anos depois do primeiro isolamento do vírus, o subtipo C foi descrito após identificação em isolados do AMPV no Colorado, Estados Unidos da América (EUA), em criações de perus (COOK et al., 1999; SHIN et al., 2000b; SHIN et al., 2002a). O subtipo C foi identificado a partir da comparação das sequências dos genes das proteínas M (SEAL, 1998), F (SEAL, 2000), N e P (DAR et al., 2001) com a sequência dos genes dos subtipos A e B. O AMPV isolado nos EUA apresentava uma identidade genética significativamente diferente dos subtipos da Europa (NJENGA et al., 2003). Em 1985 na França, foi relatada uma nova variante do AMPV geneticamente diferente dos subtipos A e B denominada de subtipo D, identificada de dois isolados obtidos de patos (BÃYON-AUBOYER et al., 2000). Os subtipos A, B e D do AMPV são mais intimamente relacionados uns com os outros do que com o subtipo C (SHIN et al.,
2002a). As sequências de aminoácidos dos genes G, SH e L do subtipo C apresentam uma maior semelhança com os isolados de Metapneumovírus Humano (hMPV) do que com os outros subtipos do AMPV (TOQUIN et al., 2003).
A glicoproteína G do AMPV é uma importante determinante dos subtipos, pois é uma região muito variável do genoma e demonstra heterogeneidade genômica entre os subtipos (JUHASZ & EASTON, 1994). O gene G dos subtipos A, B, C e D apresenta diferentes sequências de aminoácidos e nucleotídeos (RANDHAWA et al., 1997; BÄYON-AUBOYER et al., 1999; JACOBS et al., 2003; ALVAREZ et al., 2003).
A análise filogenética dos genes F e M do AMPV mostram semelhanças na sequência de aminoácidos de 83% e 89%, respectivamente, entre os subtipos A e B (YU et al., 1992a; YU et al., 1992b). O subtipo C do vírus compartilha 78% e 67% da sequência de aminoácidos do gene das proteínas M e F, respectivamente, idênticos aos subtipos A e B (SEAL, 1998; SEAL, 2000). Já o subtipo D tem 70% e 80,5% de similaridade na sequência de aminoácidos com os subtipos A e B; e 77,6% a 97,2% de identidade com o subtipo C (BÃYON-AUBOYER et al., 2000).
No Brasil, o primeiro isolamento do AMPV foi realizado em criações de matrizes nos Estados de Minas Gerais e São Paulo (ARNS & HAFEZ, 1995). O sequenciamento do gene da glicoproteína G foi realizado em dois isolados de matrizes com SCI, sendo identificados como subtipo A e possuindo uma similaridade de 99% na sequência de aminoácidos do gene G com o subtipo A europeu (DANI et al., 1999a).
Recentemente, o subtipo B foi isolado pela primeira vez em criações de poedeiras comerciais, não vacinadas, no Estado de São Paulo. A comparação da sequência de aminoácidos do gene G deste isolado brasileiro com isolados do subtipo B de outros países apresentam semelhança de 96.1% (CHACÓN et al., 2007).
2.4. EPIDEMIOLOGIA
2.4.1. ESPÉCIES SUSCEPTÍVEIS
O AMPV tem como hospedeiros naturais perus e galinhas. Além dessas espécies domésticas, as galinhas d’angola e os faisões também têm sido infectados com êxito pelo vírus (PICAULT et al., 1987; GOUGH et al., 1988; CATELLI et al., 2001). Os pombos, gansos e patos foram considerados por muito tempo como refratários à infecção pelo AMPV (GOUGH et al., 1988). No entanto, em 1999 demonstrou-se a doença em patos da Moscóvia (TOQUIN et al., 1999). Logo depois, o vírus foi isolado de pardais, gansos, andorinhas e estorninhos selvagens nos EUA (SHIN et al., 2000b) e também de gansos Canadenses (BENNETT et al., 2002). Sugere-se que estas espécies de aves selvagens participam na manutenção e disseminação do vírus no meio ambiente. Anticorpos contra o AMPV foram encontrados em avestruzes (CADMAN et al., 1994) e em gaivotas do Mar Báltico (HEFFELS-REDMANN et al.,1998), mas o vírus não foi isolado dessas duas espécies.
A doença respiratória causada pelo Metapneumovírus aviário é aguda e contagiosa, acometendo aves comerciais e silvestres em várias partes do mundo. O vírus tem sido isolado de galinhas de todas as idades (ALEXANDER et al., 1986; PICAULT et al., 1987; TANAKA et al., 1995; COOK, 2000). Entretanto, frangos de corte de duas a seis semanas de idade; e matrizes e poedeiras comerciais entre 24 e 36 semanas de idade são mais susceptíveis a doença induzida pelo AMPV (MORLEY & THOMSON, 1984; HAFEZ & LÖHREN, 1990; HAFEZ, 1993).
Nas criações de galinhas a doença causada pelo vírus pode ser mais severa em aves jovens do que em aves mais velhas; embora as galinhas mais velhas sejam mais susceptíveis a infecção pelo AMPV (ALEXANDER et al., 1986; COOK et al., 1993b). Em criações de matrizes e poedeiras as aves mais velhas com oviduto maduro e em produção são mais
suscetíveis a infecção, do que as aves jovens que possuem o oviduto imaturo (COOK et al., 2000).
2.4.2. TRANSMISSÃO
O vírus pode ser transmitido pelo contato direto de aves doentes com aves sadias, ou contato indireto, através de pessoas, equipamentos e veículos. Não há provas até o momento de transmissão vertical em galinhas, havendo relatos apenas da passagem de anticorpos maternos para a progênie (GIRAUD et al., 1986; JONES, 1996).
A principal forma de disseminação do AMPV das aves doentes para sadias é através de aerossóis. No entanto, a contaminação da água e alimento por muco e secreções nasais das aves doentes, pode ser considerada outra via de contágio. Além disso, podem existir dentro do plantel aves portadoras assintomáticas, que transmitem o vírus para as aves saudáveis. É importante ressaltar que o vírus excretado nas fezes e pelo trato respiratório das aves infectadas, tem um curto período de viabilidade no ambiente (JONES, 1996).
A disseminação do vírus nos galpões parece ser muito rápida (cerca de 24 horas) em lotes de frangos de corte e matrizes criados em contato direto e mantidos sobre a cama, em condições de clima seco, calor intenso, poeira e baixa umidade bem como má ventilação. No caso das poedeiras comerciais criadas em gaiolas, e aves em galpões separados, a transmissão da doença é relativamente mais lenta (cerca de uma a duas semanas) (O’BRIEN, 1985; BAXTER- JONES et al., 1989a; ARNS & HAFEZ, 1995; ALKHALAF et al., 2002).
Em criações comerciais, as secreções nasais das aves doentes podem contaminar superfícies inanimadas, como instalações, bandejas de ovos, madeira, telhas de cerâmica, botas de borracha, pneus e plástico (TIWARI et al., 2006). Contudo, a sobrevivência do vírus nas instalações e equipamentos do galpão pode ser afetada por muitas variáveis químicas e
físicas, incluindo a temperatura, umidade, pH, presença de matéria orgânica e exposição a vários produtos químicos (TOWNSEND et al., 2000; VELAYUDHAN et al., 2003).
O vírus apresenta sensibilidade à ação de desinfetantes virucidas (clorofórmio, compostos fenólicos, glutaraldeído e compostos de amônia quaternária) e a sanitizantes para as mãos a gel, com formulação a base de álcool, que podem ser utilizados pelos funcionários das granjas (ARNS & HAFEZ, 1992; PATNAYAK et al., 2008). Ele também pode ser inativado pelo calor à temperatura de 56oC ou 60oC por 30 minutos. E é estável em intervalos de pH entre 3,0 e 9,0 (MCDOUGALL & COOK, 1986; COLLINS & GOUGH, 1988; BUYS et al., 1989).
Em galpões que possuem aves infectadas pelo AMPV, é recomendada após a saída do lote a realização do vazio sanitário, que deve ser mantido por mais de seis dias, para que se tornem seguros para o realojamento das aves nos pólos avícolas (TIWARI et al., 2006).
2.4.3. PATOGENIA
As aves se infectam por inalação do Metapneumovírus aviário presente no ar ou partículas de poeira carreadoras do vírus. O vírus penetra pelo trato respiratório superior, e tem predileção pelas células epiteliais ciliadas da mucosa dos cornetos nasais, da laringe e da traquéia, que são barreiras naturais de defesa do trato respiratório e onde ocorre à replicação primária do vírus causando ciliostase (parada do movimento ciliar) e destruição do epitélio. Conseqüentemente, outras bactérias e vírus, não podem ser retidos, o que facilita a ocorrência de infecções secundárias. Posteriormente, o vírus migra para o oviduto, via corrente sanguínea, onde ocorre uma segunda replicação viral no epitélio ciliado do trato reprodutivo da mesma maneira como ocorreu no trato respiratório (JONES et al., 1988; COOK et al., 1991; CATELLI et al., 1998; VAN DE ZANDE et al., 1999).
A detecção do vírus é realizada principalmente no trato respiratório superior da ave infectada, embora sua permanência nesta região ocorra por um curto período de tempo (CHARY et al., 2002a). Apesar de rara pode haver detecção do vírus nos sacos aéreos e pulmões; quando em decorrência da presença de outros patógenos, e dos danos causados por estes nos tecidos do trato respiratório superior, o AMPV se dissemina para outros órgãos da ave, principalmente para os que compõem o trato respiratório inferior (COOK et al., 1991; CATELLI et al., 1998; VAN DE ZANDE et al., 1999; SEAL, 2000).
O AMPV tambémpode causar doenças reprodutivas, derivadas da replicação viral tanto no epitélio ciliado do trato reprodutor das fêmeas, quanto nas células epiteliais ciliadas e não ciliadas dos ductos eferentes dos testículos dos machos (AIRE, 1980; PRADHAN et al., 1983; VILLARREAL et al., 2007).
Nos diferentes subtipos do AMPV existe uma variação na extensão e sítio de replicação. O subtipo A invade principalmente o trato respiratório superior, infectando duas vezes mais células epiteliais e produzindo uma quantidade maior de partículas virais do que o subtipo B (VAN DE ZANDE et al., 1999).
2.4.4. SINAIS CLÍNICOS E LESÕES ANATOMOPATOLÓGICAS
A infecção pelo AMPV em criações de frangos de corte causa uma doença respiratória caracterizada pela presença de espirros, tosse, ronqueira, estertores, lacrimejamento, conjuntivite, descargas nasais, muco na traquéia, sonolência e depressão. Quando o AMPV associa-se as infecções secundárias virais e/ou bacterianas, principalmente pela Escherichia
coli, o quadro respiratório se agrava desenvolvendo a Síndrome da Cabeça Inchada (SCI)
que é constituída pelo edema submandibular, inchaço do tecido periorbital da face e dos seios infraorbitais. O edema subcutâneo pode ser tão extenso a ponto de forçar o fechamento dos olhos, com isso as aves encontram dificuldade em se movimentarem dentro do galpão na busca de alimento, o que faz com que morram por inanição. (O’BRIEN, 1985;
MCDOUGALL & COOK, 1986; COOK et al., 1988; PATTISON et al., 1989; HAFEZ, 1993; LU et al., 1994; JONES, 1996).
Em matrizes à infecção pelo AMPV causa à SCI que é seguida por sintomas nervosos na fase final da doença com a presença de movimentos involuntários da cabeça, tremores, torcicolo e opistótono, que não são provocados por lesões do sistema nervoso, mas sim devido à inflamação do ouvido interno e órgãos responsáveis pelo equilíbrio, em um percentual significativo das aves. Além disso, pode-se observar uma redução na fertilidade e eclodibilidade dos ovos férteis. (O’BRIEN, 1985; PATTISON et al., 1989; HAFEZ, 1993; VILLEGAS, 1998).
Em galos reprodutores o vírus causa doença respiratória, edema facial e redução da fertilidade, em razão de uma baixa concentração de espermatozóides viáveis. Em condições geralmente precárias também podem ser observadas penas quebradas, crista cianótica e depressão (VILLARREAL et al., 2007).
Nas criações de poedeiras comerciais o vírus causa uma leve doença do trato respiratório, com sintomas clínicos, como: espirros, tosse e estertores, que evoluem e resultam na SCI, que ocorre junto com uma momentânea queda na produção de ovos e perda da qualidade da casca do ovo, resultando em casca fina; e a presença de diarréia (JING et al., 1993; COOK et al., 2000; SUGIYAMA et al., 2006).
Em relação às lesões anatomopatológicas, as principais lesões macroscópicas observadas na infecção pelo AMPV em frangos de corte, matrizes e poedeiras incluem a destruição do epitélio ciliar dos seios nasais e da traquéia resultando em congestões, hemorragias petequiais, lesões necróticas da mucosa da cavidade nasal, traqueal e fenda palatina; com posterior surgimento de uma traqueíte e uma rinite catarral com secreção mucopurulenta (COOK et al., 1991; MAJÓ et al., 1995; VAN DE ZANDE et al., 1999; AUNG et al., 2008). É observada também no tecido subcutâneo uma extensa área gelatinosa amarelada que evolui para um edema purulento e congesto no espaço inter-mandibular, periorbital,
barbela e pescoço das aves (LU et al., 1994). As matrizes e poedeiras podem apresentar também uma variedade de anormalidades do trato reprodutivo incluindo congestão do ovário, presença da gema do ovo no peritônio, causando peritonite e a regressão do ovário, oviduto e dos folículos ovarianos. Em aves que expressam manifestações nervosas, é observado constantemente inflamação do ouvido médio com acúmulo de pus (JONES et al., 1988; COOK et al., 1996; SHIN et al., 2002b).
A infecção natural com o AMPV é mais severa que a infecção experimental, e este fato é resultante da atuação do vírus com outros agentes secundários, demonstrando que existe um sinergismo entre o AMPV e outros patógenos respiratórios desempenhando um papel proeminente no processo da doença clínica com a presença de sinais respiratórios por um longo período, além de originar lesões anatomopatológicas mais severas. A infecção secundária pode exacerbar a infecção pelo AMPV, causando à perda de cílios na superfície epitelial do trato respiratório superior; permitindo dessa maneira que o vírus penetre mais profundamente no trato respiratório da ave e tenha uma persistência mais longa no tecido (VAN DE ZANDE et al., 2001a; ALKHALAF et al., 2002; TURPIN et al., 2002; JIRJIS et al., 2004).
2.5. IMUNOLOGIA
A produção de anticorpos específicos na infecção pelo AMPV em frangos de corte, matrizes e poedeiras comerciais, ocorre três semanas após a infecção, mas nem sempre está relacionada com a manifestação da doença, pois o AMPV pode infectar as galinhas sem necessariamente causar sinais clínicos, ou seja, não existe correlação entre a presença de anticorpos e a doença clínica, mas sim com a infecção. Os anticorpos neutralizantes chegam ao nível mais elevado de produção em cinco a seis semanas após a infecção (WYETH et al., 1987; COOK et al., 1988; HAFEZ & LÖHREN, 1990).
Após o desafio viral, mecanismos de proteção são ativados, como a produção de anticorpos locais (IgA) que protegem a mucosa oculonasal, neutralizam a ação do vírus e impedem o início da infecção pelo vírus nas células-alvo susceptíveis na superfície da mucosa. As imunoglobulinas IgA são secretadas pela glândula de Harder, que é um órgão linfóide secundário localizado na região medial dos olhos da ave; este é um dos principais locais de apresentação do antígeno para os anticorpos, constituindo então no principal sítio de defesa contra infecção respiratória. A localização desta glândula determina o contato primário com o vírus, estimulando a agregação de células linfóides proliferativas que participam da resposta imune local (GALLEGO et al., 1992; CHARY et al., 2002a; BENNETT et al., 2005; CHA et al., 2007; AUNG et al., 2008).
A imunidade celular também participa na defesa contra o AMPV na superfície da mucosa do trato respiratório superior das aves (BENNETT et al., 2005; GANAPATHY et al., 2005).
A resposta imune humoral produz as imunoglobulinas IgM e IgG, que também são responsáveis pela neutralização do vírus. Os anticorpos circulantes são detectados a partir do quinto dia após o aparecimento dos sinais clínicos, através do emprego de técnicas sorológicas que mensuram os títulos de anticorpos tanto na vacinação contra o AMPV, quanto na infecção pelo o vírus. A imunidade humoral também tem ação importante na proteção do trato reprodutivo contra o vírus (BAXTER-JONES et al., 1986; JONES, 1996; COOK, 1997; TURPIN et al., 2002).
Em pintos de um dia de vida os títulos de anticorpos maternos oriundos de reprodutoras vacinadas contra o AMPV permanecem por volta de 15 a 20 dias. Os anticorpos maternos não previnem contra a infecção pelo vírus e não interferem na ação da vacina viva atenuada (COOK et al., 1989b; NAYLOR et al., 1997b).
O Metapneumovírus Aviário tem ação imunossupressora, pois a infecção por este vírus resulta na redução da resposta mitogênica dos linfócitos T, temporariamente. Esta inibição coincide com a fase aguda da doença (CHARY et al., 2002a). A ação imunossupressora acarreta numa elevada suscetibilidade a outras doenças e reduz a capacidade das aves de responder as vacinas vivas virais rotineiramente utilizadas no sistema avícola de produção (CHARY et al., 2002b).
2.6. DIAGNÓSTICO:
O diagnóstico e a detecção da infecção pelo AMPV são difíceis, pois envolvem tanto a dificuldade em isolar o vírus do hospedeiro, devido ao curto tempo de replicação do vírus no trato respiratório superior da ave, quanto à ausência de sinais clínicos da doença em aves infectadas pelo AMPV na fase aguda da doença, que dura cerca de uma semana (COOK et al., 1991; JONES, 1996; JIRJIS et al., 2000).
2.6.1. CLÍNICO
Em galinhas o diagnóstico clínico não é sugestivo da infecção pelo AMPV, pois o AMPV serve como agente primário propiciando a instalação de infecções secundárias virais e/ ou bacterianas, principalmente causada pela Escherichia coli, resultando no agravamento dos sinais clínicos, como o surgimento da Síndrome da cabeça inchada (SCI) associada à tosse, espirro, ronqueira, descarga nasal e conjuntivite, além de torcicolo e opistótono, resultantes de infecção bacteriana no ouvido médio da ave (O’BRIEN, 1985; NUNOYA et al., 1991).
As condições ambientais também podem influenciar no aparecimento da SCI nas aves, como o manejo inadequado, ventilação deficiente, alta densidade de aves, altos níveis de amônia, além da presença de agentes de infecções secundárias (HAFEZ, 1993).
Sendo assim, os sintomas clínicos da infecção pelo vírus em galinhas não são suficientes para identificação da enfermidade, havendo a necessidade de recorrer a métodos de diagnóstico laboratoriais para se obter o diagnóstico definitivo da doença e confirmação da ação do vírus (JONES, 1996).
2.6.2. SOROLOGIA
Na rotina da avicultura industrial, as aves são monitoradas utilizando métodos sorológicos, que representam uma alternativa mais rápida e eficiente, possibilitando o acompanhamento do status vacinal dos plantéis e/ou a circulação do vírus a campo na região (COOK, 1997).
A resposta imune humoral para o Metapneumovírus Aviário pode ser detectada pelas técnicas sorológicas de Imunofluorescência Indireta (IFI), Soroneutralização (SN) e o ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA). Estas técnicas são freqüentemente utilizadas por serem consideradas ferramentas úteis para o diagnóstico sorológico deste agente. (BAXTER-JONES et al., 1989b; VILLEGAS, 1998; ALKAHALAF et al., 2002; BROOR & BHARAJ, 2007).
A Imunofluorescência Indireta (IFI) é um teste sensível e específico e pode ser utilizado como teste de triagem, pois detecta a presença de anticorpos contra o AMPV, antes de serem realizadas as técnicas de isolamento e identificação viral (BAXTER-JONES et al., 1986).
O ensaio Imunoenzimático indireto (ELISA Indireto) por ser mais sensível e específico, quando comparada aos outros testes sorológicos, é indiscutivelmente a técnica mais comumente utilizada para a detecção de anticorpos contra o AMPV em plantéis avícolas. Esse teste é de realização rápida e pode ser utilizado para a avaliação de um elevado número de amostras de soros. Além disso, permite o monitoramento sorológico da ação das vacinas viva atenuada e inativada nas aves, bem como o estudo epidemiológico do AMPV
nas criações avícolas (O’LOAN et al., 1989; ETERRADOSSI et al., 1995; JONES, 1996; MEKKES & WIT, 1998; VILLEGAS, 1998; LIMA et al., 1999; ALKAHALAF et al., 2002).
Diferentes tipos de Kit de ELISA estão disponíveis comercialmente para o diagnóstico do AMPV em diferentes espécies de aves, e estes Kits podem ser sensíveis ou não para o diagnóstico de subtipos heterólogos (JONES, 1996; CHIANG et al., 2000). Os ELISAs baseados no vírus bruto e purificado são amplamente utilizados (CHETTLE & WYETH, 1988; O’LOAN et al., 1989).
Existem também, em diferentes laboratórios, testes de ELISA desenvolvidos para o diagnóstico do AMPV baseados em proteínas recombinantes virais, tais como a proteína matriz (M) e a nucleoproteína (N) expressa pela Escherichia coli (GULATI et al., 2000; GULATI et al., 2001); além do ELISA de bloqueio e o ELISA baseado no peptídeo da Nucleoproteína (N) (TURPIN et al., 2003; ALVAREZ et al., 2004). Para diferenciar os isolados ou subtipos AMPV identificados em alguns países, foi desenvolvido o ELISA baseado em anticorpos monoclonais (COLLINS et al., 1993).
Vários reagentes específicos para a detecção da infecção pelo AMPV vêem sendo desenvolvidos. Os anticorpos monoclonais são utilizados por serem capazes de diferenciar cepas dos subtipos A e B do AMPV, além de servirem como nova ferramenta para o estudo da infecção, da patogênese e do diagnóstico da doença causada pelo vírus (COOK et al., 1993a). Já foram criados também anticorpos monoclonais com ações que envolvem tanto, a neutralização da molécula F1 da proteína de fusão (F) do vírus inibindo a fusão deste com membrana celular, quanto à capacidade de reagirem com a Nucleoproteína (N) do subtipo C do AMPV (TANAKA et al., 1996b; YU et al., 2006).
2.6.3. ISOLAMENTO VIRAL
O isolamento do AMPV em casos de infecção a campo é raro, pois as tentativas podem ter resultados negativos se não forem realizadas no início do curso da infecção, ainda com a presença do vírus no trato respiratório superior da ave. Isto ocorre devido ao fato de que o vírus se replica e persiste por um curto espaço de tempo neste tecido, não estando mais presente quando aparecem os sinais clínicos mais evidentes resultantes da infecção secundária (COOK et al., 1991; JONES, 1996; ALKHALAF et al., 2002; CHARY et al., 2002a). Se as aves manifestarem sinais clínicos, é indicado selecionar outras aves da mesma propriedade ou em um galpão ao lado, que ainda não apresentam sinais clínicos visíveis, mas já possam estar infectadas pelo vírus para se tentar o isolamento do AMPV
(COOK et al., 1988).
Para a realização do isolamento do AMPV são coletadas amostras que incluem swabs traqueal e cloacal ou fragmentos de tecidos da traquéia, cornetos nasais e pulmões. São dois os métodos de rotina empregados para isolamento viral utilizando estas amostras. A utilização de ovos embrionados de galinha livre do patógeno específico (SPF) com seis dias de incubação, através do saco vitelino, sendo necessárias algumas passagens para serem observadas hemorragias, atrofia e mortalidade nos embriões; além da obtenção do fluido alantóide e da membrana do saco vitelino infectados pelo AMPV (COOK et al., 1999; GOYAL et al., 2000). É também empregada a inoculação em cultivo celular, onde ocorre a replicação e atenuação do vírus após algumas passagens. Alguns exemplos de cultivos celulares são: cultura de órgão traqueal de embriões de galinhas (TOC), onde se observa a ciliostase; cultivo de linhagens de células renais de macaco Verde Africano (VERO), células do fibroblasto de embriões de galinha (CEF), células QT-35 (células de fibrosarcoma de codornas japonesas), células rugosas de embriões de galinha (CER), células BGM (células de rins de macaco Grivet) e células de fígado de embriões de galinha (CEL). Todas estas células podem apresentar efeito citopático, áreas focais de arredondamento celular e formação de sincícios quando ocorre a replicação do AMPV (MCDOUGALL & COOK, 1986; WILLIAMS, et al., 1991a; COOK et al., 1999; GOYAL
et al., 2000; BENNETT et al., 2002; SABARA & LARENCE, 2002).
2.6.4. IDENTIFICAÇÃO VIRAL
O efeito citopático não é uma característica especifica do Metapneumovírus Aviário, logo existem técnicas de detecção do vírus que devem ser utilizadas em meios de cultivo celular, tais como: Vírus neutralização (VN) (JONES, 1996), Imunofluorescência direta (IFD) (JONES et al., 1987; COOK & CAVANAGH, 2002), imunoperoxidase (IP) (MAJÓ et al., 1995; CATELLI et al., 1998), microscopia eletrônica e métodos imunoquímicos (MCDOUGALL & COOK, 1986; JONES et al., 1988; CATELLI et al., 1998; YU et al., 2006).
O AMPV pode ser detectado em cultivo de células VERO, através da técnica de Imunofluorescência Indireta (IFI) (JIRJIS et al., 2002). A Soroneutralização (SN) é uma técnica sensível e pode ser utilizada em vários meios de culturas celulares, como: TOC, CEF, CEL, VERO (GIRAUD et al., 1986; O’LOAN et al., 1989; WILLIAMS et al., 1991a; COOK et al., 1993a).
A técnica de Vírus Neutralização (VN) tem elevada sensibilidade e embora demorada, tem sido utilizada para comparar amostras do vírus através da neutralização cruzada (BAXTER-JONES et al., 1987).
Os meios aplicados na identificação do vírus em secções de tecidos como traquéia, cornetos nasais e pulmões; incluem imunoperoxidase (IP), Imunohistoquímica, Imunofluorescência direta (IFD) e microscopia eletrônica (JONES, 1996; CATELLI et al., 1998; JIRJIS et al., 2000; JIRJIS et al., 2001; VELAYUDHAN et al., 2005).
2.6.5. DETECÇÃO DO GENOMA VIRAL
A biologia molecular é utilizada para detecção e tipificação do AMPV, tendo como vantagem a capacidade de detectar o vírus numa amostra que apresente baixa carga viral, além de fornecer resultado mais rápido e mais sensível, quando comparado ao isolamento viral (JING et al., 1993). É composta por técnicas como PCR (reação em cadeia da polimerase), RT-PCR (reação em cadeia pela polimerase-transcriptase reversa), análise por enzimas de restrição e sequenciamento de aminoácidos de um fragmento do gene, RFLP (análises polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição), PCR em tempo real, Nested RT-PCR e RRT-PCR (PCR- transcriptase reversa em tempo real) (DANI et al., 1999a; DANI et al., 1999b; VELAYUDHAN et al., 2005).
A técnica mais utilizada para detecção do RNA do vírus é a RT-PCR tipo-específica, que utiliza os primers para a sequência do gene G viral (CAVANAGH et al., 1999; SHIN et al., 2000a). Ela é utilizada para identificar outros subtipos que possam vir a acometer os plantéis brasileiros, além dos subtipos A e B (DANI et al., 1999a; CHACÓN et al., 2007). Contudo, a técnica da Nested RT-PCR vem demonstrando ser mais sensível, quando comparada ao RT-PCR (MASE et al., 1996; DANI et al., 1999b). A vantagem da Nested RT-PCR é que ela já identifica o subtipo não havendo necessidade de isolamento viral em ovos embrionados ou em cultivos celulares, assim como não necessita da realização de sequeciamento ou da análise com enzimas de restrição do amplificado para a identificação dos subtipos do AMPV. Estes pontos acabam agilizando a identificação do agente em caso de suspeita de infecção pelo AMPV a campo.
2.7. PREVENÇÃO E CONTROLE DO AMPV
Para fins de prevenção e controle da infecção do AMPV e da ocorrência da SCI, deve-se determinar quais os “fatores predisponentes” em potencial que incidem sobre o plantel de aves, como: tipo de ave acometida (frango de corte, poedeira comercial, reprodutora) e o
período de ocorrência (idade). O emprego de medidas de biosseguridade, boas condições de higiene e práticas de manejo como a limpeza e desinfecção de equipamentos e instalações, boas condições da cama, utilização de vazio sanitário, densidade populacional adequada, aves com a mesma idade e boas condições de ambiência (variações de temperatura e ventilação adequada), são importantes para ajudar a prevenir ou minimizar os efeitos da infecção pelo AMPV (COOK, 2000; GOYAL et al., 2003; AL-ANKARI et al., 2004).
Os surtos causados pelo Metapneumovírus aviário nas criações avícolas comerciais são contidos através de ações como o rápido despovoamento e/ou quarentena de pólos afetados pelo vírus. Além disso, é necessária a aplicação imediata e rigorosa de medidas de biosseguridade e desinfecção de fômites e instalações contaminadas, as quais podem ser deixadas em vazio sanitário por um período de tempo adequado para que o APMV desapareça por processo natural (TIWARI et al., 2006).
Embora não exista tratamento para a infecção pelo AMPV, avanços relacionados à compreensão da patogênese da doença causada pelo vírus em determinados hospedeiros naturais fornecem estratégias combinadas de terapias imunomoduladoras/ anti-inflamatórias e antivirais. Além disso, antibióticos devem ser utilizados para controlar as infecções bacterianas secundárias que se instalam após a infecção pelo vírus (COOK, 2000; GOYAL et al., 2003; EASTON et al., 2004).
Os programas de vacinação são um importante reforço para as estratégias de controle do Metapneumovírus aviário no sistema intensivo de produção avícola. Em frangos de corte a utilização de vacina viva atenuada, resulta em uma proteção local de quatro a cinco dias pós-vacinação e a soroconversão é normalmente detectada após duas semanas. A vacina viva atenuada confere uma proteção eficaz tanto em relação à doença clínica após o desafio com o vírus, quanto na habilidade de induzir anticorpos, embora não evite que as aves sejam infectadas pelo AMPV (COOK, 1997; VILLEGAS, 1998; GANAPATHY & JONES, 2007).
A administração cuidadosa e correta da vacina viva atenuada proporciona excelente proteção às aves (COOK et al., 1989a; WILLIAMS et al., 1991a). Logo deve se tomar cuidado com alguns fatores que podem alterar a qualidade da água de beber utilizada na administração da vacina viva para as aves, afetando assim a viabilidade desta vacina, tais como: cloro, detergente e matéria orgânica. Para neutralizar esses elementos e manter a viabilidade da vacina, são utilizados estabilizadores, tais como o leite em pó desnatado, que são adicionados na água de beber oferecida as aves no momento da vacinação (CSEREP, 2003).
As vacinas vivas atenuadas de AMPV são rotineiramente utilizadas na Europa e América do Sul para proteger os frangos de corte da Síndrome da Cabeça Inchada (TARPEY et al., 2007). Entretanto, deve-se ter cautela ao utilizar a vacina viva, pois o AMPV é um vírus com genoma RNA sendo mais instável geneticamente. Logo, a vacina viva pode sofrer mutação e com isso ocorrer à reversão da virulência, que pode acarretar no aparecimento da doença nas aves (JONES, 1996; CATELLI et al., 2006). Além disso, a patogenicidade residual do AMPV utilizado nas vacinas pode resultar na eliminação do vírus para o meio ambiente, levando para à contaminação deste e dificultando assim os esforços empregados para erradicação do vírus (CHA et al., 2007).
No início da criação de matrizes e poedeiras comerciais a administração da vacina viva atenuada impede a ocorrência da doença respiratória nas aves; e a vacina inativada aplicada por via ocular ou spray antes do início da postura, garante um bom desempenho quanto à proteção do sistema reprodutivo, diminuindo a ocorrência de queda na postura dos ovos, no caso de um surto de AMPV. O emprego de esquema de vacinação com estes dois tipos de vacina confere uma melhor proteção nestas aves, que têm um ciclo de produção longo
(COOK et al., 1996; COOK et al., 2000; SUGIYAMA et al., 2006).
O esquema de vacinação para machos reprodutores também consiste na aplicação dos dois tipos de vacinas, a vacina viva com oito e 14 semanas de idade e a vacina inativada com 20 semanas (VILLARREAL et al., 2007).
Para a prevenção da infecção pelo AMPV em galinhas e perus, vacinas vivas e inativadas dos subtipos A e B têm sido desenvolvidas e utilizadas nas criações comercias em todo o mundo. Alguns autores afirmam que existe uma excelente proteção cruzada entre vacinas contra o AMPV dos subtipos A e B (WILLIAMS et al., 1991b; ETERRADOSSI et a.l, 1995; PATNAYAK et al., 2002). As vacinas dos subtipos A e B protegem contra o AMPV do subtipo C (COOK et al., 1999). No entanto, aves imunizadas com o subtipo C não são protegidas de desafios com os subtipos A e B.
A aplicação simultânea das vacinas vivas atenuadas de AMPV, vírus da Doença de Newcastle (NDV) e vírus da Bronquite Infecciosa das Galinhas (IBV), reduz a produção de anticorpos contra o AMPV nas aves vacinadas, pois o NDV e o IBV competem pelo mesmo sítio de ligação no epitélio da mucosa da traquéia. Logo, deve se respeitar o intervalo de aplicação de no mínimo 15 dias entre estas vacinas (CAVANAGH et al., 1999; TURPIN et al., 2002; TARPEY et al., 2007).
Atualmente a vacinação no ovo embrionado de galinhas e perus com 18 e 24 dias de incubação, respectivamente, vem sendo utilizada como via de administração da vacina viva atenuada contra o AMPV. A vacinação no ovo embrionado não causa efeitos adversos na incubação e saúde das aves pós-eclosão, e também confere títulos de anticorpos vacinais elevados (WORTHINGTON et al., 2003; HESS et al., 2004).
Outros tipos diferentes de vacinas vêm sendo desenvolvidos para a prevenção do AMPV, como a vacina virosoma que é produzida para conter proteínas da membrana do vírus num complexo lipossoma, ela não é infecciosa porque não possui o ácido nucléico; e também não contém as proteínas (L, N ou P) de replicação viral. Quando esta vacina é administrada no trato respiratório das aves diminui tanto os sinais clínicos da doença, quanto à carga viral, além de estimular a resposta imune celular e humoral das aves (KAPCZYNSKI, 2004). Outro tipo de vacina contra o vírus desenvolvida é a vacina de DNA com genes do AMPV, que levou a diminuição significativa da carga viral no tecido respiratório e redução dos sinais clínicos em aves após o desafio com o vírus (KAPCZYNSKI & SELLERS,
2003).
3. ARTIGOS CIENTÍFICOS 3.1. ARTIGO 1
FREQUÊNCIADE ANTICORPOS CONTRA METAPNEUMOVÍRUS AVIÁRIO
EM CRIAÇÕES INDUSTRIAIS E DE GALINHAS DE QUINTAL NO PÓLO AVÍCOLA DA BAHIA.
SALES, Tatiane Santana 1*; HERVAL, Elen Fabiane Guimarães1; SILVA, Priscila Sousa da1; LIMA, Jamille Machado de1; RAMOS, Izabella1; MAIA, Paulo César Costa1; FERNANDES, Lia Muniz Barretto1
1
Universidade Federal da Bahia, Escola de Medicina Veterinária, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, Avenida Ademar de Barros, 500, Ondina, Salvador, Bahia, Brasil.
* Correspondência para o autor - E-mail: tatiane.santana@yahoo.com.br
RESUMO
Este estudo teve como objetivo determinar a freqüência de anticorpos contra o Metapneumovírus Aviário (AMPV) em criações, não vacinadas, de frangos de corte e galinhas de quintal no pólo avícola do Estado da Bahia. Coletaram-se 622 amostras de soro de criações de frangos de corte e 268 amostras de galinhas de quintal. A sorologia foi realizada por meio do Kit comercial de ELISA indireto FlockChek* AMPV (Lab. IDEXX ©). Na análise estatística utilizou-se o Teste T de Student com intervalo de confiança de 95%. Detectou-se aves soropositivas para o AMPV tanto nos frangos de corte (144; 23,15%) quanto nas galinhas de quintal (187; 69,78%) (p = 0,1). Os lotes de frangos de corte tiveram freqüência de anticorpos contra o AMPV de 77,14% e as propriedades de
aves caipiras 94,12%. No grupo de frangos de corte evidenciou-se anticorpos contra o vírus em 66,67% e 33,33% das aves com e sem sintomas respiratórios, respectivamente. Já nas aves caipiras foram encontradas soropositivas tanto nas aves com sintomas respiratórios (60,43%) quanto naquelas sem sintomas (39,57%). Os resultados demonstram que houve infecção pelo vírus nas criações de frangos de corte e de galinhas de quintal, sugerindo a presença do AMPV no pólo avícola da Bahia.
PALAVRAS-CHAVES: Metapneumovírus aviário, frangos de corte, galinhas de quintal, ELISA indireto.
FREQUENCY OF ANTIBODIES AGAINST AVIAN METAPNEUMOVIRUS IN INDUSTRIAL CREATIONS AND BACKYARD CHICKENS ON POULTRY POLE
OF BAHIA.
ABSTRACT
This study aimed to determine the frequency of antibodies against avian metapneumovirus (AMPV) in broilers and backyard chickens raised in the Pole of Avian Production of Bahia. There were collected 622 and 268 serum samples of broilers and backyard chickens, respectively. Serology was realized using indirect ELISA FlockChek* AMPV (Lab. IDEXX ©) and statistical analysis was performed using Student T, with confidence interval of 95%. Seropositives were detected in 144 broilers (23,15%) and in 187 backyard chickens (69,78%). Flocks of broilers had frequency of antibodies against AMPV totalizing 77,14% and backyard chickens totalizing 94,12%. In broilers group, antibodies were observed in 66,67% and 33,33% of birds with or without respiratory signs respectively. In backyard chickens high frequency was found in birds with symptoms (60,43%) as in asymptomatic ones (39,57%). Results showed that broilers and backyard chickens had been infected by the virus, suggesting the presence of AMPV on Avian Pole of Bahia.
