DIAGNÓSTICO

O diagnóstico e a detecção da infecção pelo AMPV são difíceis, pois envolvem tanto a dificuldade em isolar o vírus do hospedeiro, devido ao curto tempo de replicação do vírus no trato respiratório superior da ave, quanto à ausência de sinais clínicos da doença em aves infectadas pelo AMPV na fase aguda da doença, que dura cerca de uma semana (COOK et al., 1991; JONES, 1996; JIRJIS et al., 2000).

2.6.1. CLÍNICO

Em galinhas o diagnóstico clínico não é sugestivo da infecção pelo AMPV, pois o AMPV serve como agente primário propiciando a instalação de infecções secundárias virais e/ ou bacterianas, principalmente causada pela Escherichia coli, resultando no agravamento dos sinais clínicos, como o surgimento da Síndrome da cabeça inchada (SCI) associada à tosse, espirro, ronqueira, descarga nasal e conjuntivite, além de torcicolo e opistótono, resultantes de infecção bacteriana no ouvido médio da ave (O’BRIEN, 1985; NUNOYA et al., 1991).

As condições ambientais também podem influenciar no aparecimento da SCI nas aves, como o manejo inadequado, ventilação deficiente, alta densidade de aves, altos níveis de amônia, além da presença de agentes de infecções secundárias (HAFEZ, 1993).

Sendo assim, os sintomas clínicos da infecção pelo vírus em galinhas não são suficientes para identificação da enfermidade, havendo a necessidade de recorrer a métodos de diagnóstico laboratoriais para se obter o diagnóstico definitivo da doença e confirmação da ação do vírus (JONES, 1996).

2.6.2. SOROLOGIA

Na rotina da avicultura industrial, as aves são monitoradas utilizando métodos sorológicos, que representam uma alternativa mais rápida e eficiente, possibilitando o acompanhamento do status vacinal dos plantéis e/ou a circulação do vírus a campo na região (COOK, 1997).

A resposta imune humoral para o Metapneumovírus Aviário pode ser detectada pelas técnicas sorológicas de Imunofluorescência Indireta (IFI), Soroneutralização (SN) e o ensaio de imunoadsorção enzimática (ELISA). Estas técnicas são freqüentemente utilizadas por serem consideradas ferramentas úteis para o diagnóstico sorológico deste agente. (BAXTER-JONES et al., 1989b; VILLEGAS, 1998; ALKAHALAF et al., 2002; BROOR & BHARAJ, 2007).

A Imunofluorescência Indireta (IFI) é um teste sensível e específico e pode ser utilizado como teste de triagem, pois detecta a presença de anticorpos contra o AMPV, antes de serem realizadas as técnicas de isolamento e identificação viral (BAXTER-JONES et al., 1986).

O ensaio Imunoenzimático indireto (ELISA Indireto) por ser mais sensível e específico, quando comparada aos outros testes sorológicos, é indiscutivelmente a técnica mais comumente utilizada para a detecção de anticorpos contra o AMPV em plantéis avícolas. Esse teste é de realização rápida e pode ser utilizado para a avaliação de um elevado número de amostras de soros. Além disso, permite o monitoramento sorológico da ação das vacinas viva atenuada e inativada nas aves, bem como o estudo epidemiológico do AMPV

nas criações avícolas (O’LOAN et al., 1989; ETERRADOSSI et al., 1995; JONES, 1996; MEKKES & WIT, 1998; VILLEGAS, 1998; LIMA et al., 1999; ALKAHALAF et al., 2002).

Diferentes tipos de Kit de ELISA estão disponíveis comercialmente para o diagnóstico do AMPV em diferentes espécies de aves, e estes Kits podem ser sensíveis ou não para o diagnóstico de subtipos heterólogos (JONES, 1996; CHIANG et al., 2000). Os ELISAs baseados no vírus bruto e purificado são amplamente utilizados (CHETTLE & WYETH, 1988; O’LOAN et al., 1989).

Existem também, em diferentes laboratórios, testes de ELISA desenvolvidos para o diagnóstico do AMPV baseados em proteínas recombinantes virais, tais como a proteína matriz (M) e a nucleoproteína (N) expressa pela Escherichia coli (GULATI et al., 2000; GULATI et al., 2001); além do ELISA de bloqueio e o ELISA baseado no peptídeo da Nucleoproteína (N) (TURPIN et al., 2003; ALVAREZ et al., 2004). Para diferenciar os isolados ou subtipos AMPV identificados em alguns países, foi desenvolvido o ELISA baseado em anticorpos monoclonais (COLLINS et al., 1993).

Vários reagentes específicos para a detecção da infecção pelo AMPV vêem sendo desenvolvidos. Os anticorpos monoclonais são utilizados por serem capazes de diferenciar cepas dos subtipos A e B do AMPV, além de servirem como nova ferramenta para o estudo da infecção, da patogênese e do diagnóstico da doença causada pelo vírus (COOK et al., 1993a). Já foram criados também anticorpos monoclonais com ações que envolvem tanto, a neutralização da molécula F1 da proteína de fusão (F) do vírus inibindo a fusão deste com membrana celular, quanto à capacidade de reagirem com a Nucleoproteína (N) do subtipo C do AMPV (TANAKA et al., 1996b; YU et al., 2006).

2.6.3. ISOLAMENTO VIRAL

O isolamento do AMPV em casos de infecção a campo é raro, pois as tentativas podem ter resultados negativos se não forem realizadas no início do curso da infecção, ainda com a presença do vírus no trato respiratório superior da ave. Isto ocorre devido ao fato de que o vírus se replica e persiste por um curto espaço de tempo neste tecido, não estando mais presente quando aparecem os sinais clínicos mais evidentes resultantes da infecção secundária (COOK et al., 1991; JONES, 1996; ALKHALAF et al., 2002; CHARY et al., 2002a). Se as aves manifestarem sinais clínicos, é indicado selecionar outras aves da mesma propriedade ou em um galpão ao lado, que ainda não apresentam sinais clínicos visíveis, mas já possam estar infectadas pelo vírus para se tentar o isolamento do AMPV

(COOK et al., 1988).

Para a realização do isolamento do AMPV são coletadas amostras que incluem swabs traqueal e cloacal ou fragmentos de tecidos da traquéia, cornetos nasais e pulmões. São dois os métodos de rotina empregados para isolamento viral utilizando estas amostras. A utilização de ovos embrionados de galinha livre do patógeno específico (SPF) com seis dias de incubação, através do saco vitelino, sendo necessárias algumas passagens para serem observadas hemorragias, atrofia e mortalidade nos embriões; além da obtenção do fluido alantóide e da membrana do saco vitelino infectados pelo AMPV (COOK et al., 1999; GOYAL et al., 2000). É também empregada a inoculação em cultivo celular, onde ocorre a replicação e atenuação do vírus após algumas passagens. Alguns exemplos de cultivos celulares são: cultura de órgão traqueal de embriões de galinhas (TOC), onde se observa a ciliostase; cultivo de linhagens de células renais de macaco Verde Africano (VERO), células do fibroblasto de embriões de galinha (CEF), células QT-35 (células de fibrosarcoma de codornas japonesas), células rugosas de embriões de galinha (CER), células BGM (células de rins de macaco Grivet) e células de fígado de embriões de galinha (CEL). Todas estas células podem apresentar efeito citopático, áreas focais de arredondamento celular e formação de sincícios quando ocorre a replicação do AMPV (MCDOUGALL & COOK, 1986; WILLIAMS, et al., 1991a; COOK et al., 1999; GOYAL

et al., 2000; BENNETT et al., 2002; SABARA & LARENCE, 2002).

2.6.4. IDENTIFICAÇÃO VIRAL

O efeito citopático não é uma característica especifica do Metapneumovírus Aviário, logo existem técnicas de detecção do vírus que devem ser utilizadas em meios de cultivo celular, tais como: Vírus neutralização (VN) (JONES, 1996), Imunofluorescência direta (IFD) (JONES et al., 1987; COOK & CAVANAGH, 2002), imunoperoxidase (IP) (MAJÓ et al., 1995; CATELLI et al., 1998), microscopia eletrônica e métodos imunoquímicos (MCDOUGALL & COOK, 1986; JONES et al., 1988; CATELLI et al., 1998; YU et al., 2006).

O AMPV pode ser detectado em cultivo de células VERO, através da técnica de Imunofluorescência Indireta (IFI) (JIRJIS et al., 2002). A Soroneutralização (SN) é uma técnica sensível e pode ser utilizada em vários meios de culturas celulares, como: TOC, CEF, CEL, VERO (GIRAUD et al., 1986; O’LOAN et al., 1989; WILLIAMS et al., 1991a; COOK et al., 1993a).

A técnica de Vírus Neutralização (VN) tem elevada sensibilidade e embora demorada, tem sido utilizada para comparar amostras do vírus através da neutralização cruzada (BAXTER-JONES et al., 1987).

Os meios aplicados na identificação do vírus em secções de tecidos como traquéia, cornetos nasais e pulmões; incluem imunoperoxidase (IP), Imunohistoquímica, Imunofluorescência direta (IFD) e microscopia eletrônica (JONES, 1996; CATELLI et al., 1998; JIRJIS et al., 2000; JIRJIS et al., 2001; VELAYUDHAN et al., 2005).

2.6.5. DETECÇÃO DO GENOMA VIRAL

A biologia molecular é utilizada para detecção e tipificação do AMPV, tendo como vantagem a capacidade de detectar o vírus numa amostra que apresente baixa carga viral, além de fornecer resultado mais rápido e mais sensível, quando comparado ao isolamento viral (JING et al., 1993). É composta por técnicas como PCR (reação em cadeia da polimerase), RT-PCR (reação em cadeia pela polimerase-transcriptase reversa), análise por enzimas de restrição e sequenciamento de aminoácidos de um fragmento do gene, RFLP (análises polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição), PCR em tempo real, Nested RT-PCR e RRT-PCR (PCR- transcriptase reversa em tempo real) (DANI et al., 1999a; DANI et al., 1999b; VELAYUDHAN et al., 2005).

A técnica mais utilizada para detecção do RNA do vírus é a RT-PCR tipo-específica, que utiliza os primers para a sequência do gene G viral (CAVANAGH et al., 1999; SHIN et al., 2000a). Ela é utilizada para identificar outros subtipos que possam vir a acometer os plantéis brasileiros, além dos subtipos A e B (DANI et al., 1999a; CHACÓN et al., 2007). Contudo, a técnica da Nested RT-PCR vem demonstrando ser mais sensível, quando comparada ao RT-PCR (MASE et al., 1996; DANI et al., 1999b). A vantagem da Nested RT-PCR é que ela já identifica o subtipo não havendo necessidade de isolamento viral em ovos embrionados ou em cultivos celulares, assim como não necessita da realização de sequeciamento ou da análise com enzimas de restrição do amplificado para a identificação dos subtipos do AMPV. Estes pontos acabam agilizando a identificação do agente em caso de suspeita de infecção pelo AMPV a campo.