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TATIANA KUGELMEIER. Colheita e análise do sêmen de macacos de cheiro (Saimiri sciureus) por vibroestimulação: do condicionamento ao coágulo seminal

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TATIANA KUGELMEIER

Colheita e análise do sêmen de macacos de cheiro (Saimiri sciureus) por vibroestimulação: do condicionamento ao coágulo seminal

Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo para obtenção do título de Doutor em Ciências Departamento: Reprodução Animal Área de concentração: Reprodução Animal Orientador:

Prof. Dr. Cláudio Alvarenga de Oliveira

São Paulo 2011

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RESUMO

KUGELMEIER, T. Colheita e análise do sêmen de macacos de cheiro (Saimiri sciureus) por vibroestimulação: do condicionamento ao coágulo seminal. [Collection and evaluation of semen from the squirrel monkey (Saimiri sciureus) using vibroestimulation: from conditioning to seminal coagulum]. 2011. 110 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011.

Os macacos de cheiro (S. sciureus) são primatas neotropicais bastante ativos e que se estressam facilmente em cativeiro. Os métodos de colheita e avaliação do sêmen na espécie não foram padronizados de forma a reproduzi-los em diferentes centros de criação. O sêmen forma um firme coágulo imediatamente após a ejaculação e até o momento, nenhum método foi capaz de dissolvê-lo totalmente. Assim, a proposta deste estudo foi avaliar o condicionamento de S. sciureus ao método de colheita de sêmen por vibroestimulação peniana com o auxílio de observações comportamentais e dosagem de cortisol sérico. Objetivou-se ainda analisar o sêmen dos animais por meio de testes físicos e morfofuncionais, com e sem a utilização de enzima proteolítica para a dissolução do coágulo seminal. Foram estudados 12 machos adultos, alojados em dupla, em ambiente controlado. O condicionamento a vibroestimulação peniana foi desempenhado pela técnica de reforço positivo por meio de recompensa alimentar. Para a dissolução do coágulo seminal empregou-se a tripsina em três doses e dois tempos de incubação. O cortisol foi dosado pelo método de radioimunoensaio em amostras de soro. No presente estudo os animais foram condicionados às estimulações, porém a taxa de obtenção de ejaculados foi baixa. Contudo, a análise dos parâmetros físicos e morfofuncionais dos ejaculados obtidos mostrou altas porcentagens de espermatozóides móveis e com movimentos progressivos retilíneos com progressão boa à rápida. Somente os parâmetros concentração e espermatozóides com membrana plasmática íntegra foram menores do que o descrito para o gênero. A integridade do acrossomo e grau de atividade mitocondrial foram descritos pela primeira vez para a espécie e apresentaram alta porcentagem de integridade. O tratamento com a tripsina não foi eficaz na dissolução do coágulo nas concentrações de 0,5, 1 ou 5%, mas também não causou danos significativos aos espermatozóides. A dosagem de cortisol sérico demonstrou haver uma resposta aguda e não duradoura ao estresse logo após o procedimento de colheita de sêmen. O maior sucesso no emprego da vibroestimulação peniana

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para colheita de sêmen de macacos de cheiro parece depender de ajustes nas técnicas de contenção e estimulação, sazonalidade reprodutiva e contato olfativo com as fêmeas.

Palavras-chave: Saimiri sciureus. Vibroestimulação peniana. Condicionamento. Cortisol. Coágulo seminal.

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ABSTRACT

KUGELMEIER, T. Collection and evaluation of semen from the squirrel monkey (Saimiri sciureus) using vibroestimulation: from conditioning to seminal coagulum. [Colheita e análise do sêmen de macacos de cheiro (Saimiri sciureus) por vibroestimulação: do condicionamento ao coágulo seminal]. 2011. 110 f. Tese (Doutorado em Ciências) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2011.

The squirrel monkeys (S. scireus) are very active neotropical primates, who get easily stressed in captivity. The semen collection and evaluation methods in this species have not been standardized to make possible their reproduction in different breeding centers. The semen turns into a firm coagulum immediately after the ejaculation, and, so far, any method was able to dissolve it completely. Therefore, the aim of this study was to evaluate the conditionment of S. sciureus to the semen collection method through the penile vibrostimulation with the assistance of behavioural observation and serum cortisol. Another objective was to analyze the semen of these animals through physical and morphofunctional tests, with and without the use of proteolytic enzymes to dissolve the semen coagulum. The study was performed in twelve male adults, hosted in couples, in a controlled environment. The training for the penile vibrostimulation was made through the positive reinforcement technique, with food reward. To dissolve the semen coagulum, it was made use of trypsin, at three doses and two incubation periods. Cortisol was measured through radioimmunoassay in serum samples. For this study, the animals were conditioned to the stimulations, though the semen attainment rate was low. Therefore, the analysis of the physical and morphofunctional semen parameters resulted in high percentages of mobile spermatozoa, with a straight-line progressive movement (good to fast progression). Only the parameters concentration and integrity of sperm plasma membrane were lower than the pattern for this genus. The achrossome integrity and the mitochondrial activity were described for the first time for this species and presented high integrity percentage. The treatment with trypsin was effective in dissolving the coagulum in concentrations of 0.5, 1 or 5%, but did not bring significant hazard to the spermatozoa. Measurement of serum cortisol showed an acute and not durable response to stress immediately after semen collection

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proceedings. The biggest success in the employment of the penile vibrostimulation in the collection of the squirrel monkey semen seems to depend on the handling and stimulation techniques, reproductive seasonality and contact with the female´s smell. Keywords: Saimiri sciureus. Penile vibrostimulation. Conditioning. Cortisol. Seminal coagulum.

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1 INTRODUÇÃO

Os primatas neotropicais despertam grande interesse em diversas áreas do conhecimento, tais como neurociência, comportamento, imunologia, virologia, bioquímica, biologia molecular, genética, parasitologia, medicina tropical (TORRES et al., 2010) e reprodução (HEWITSON, 2004). O considerável crescimento nas pesquisas com esses primatas, observado nas últimas quatro décadas, pode ser atribuído à disponibilidade das espécies, ao tamanho de pequeno e médio porte, à adaptabilidade às condições de cativeiro, ao bom desempenho reprodutivo e à facilidade de manejo (TORRES et al., 2010).

O Brasil possui mais de 90 espécies identificadas de primatas, o que lhe confere a posição de país com a maior diversidade do mundo. No entanto, a crescente pressão antrópica sobre as populações selvagens provoca uma drástica diminuição e, muitas vezes, a extinção de espécies, antes mesmo de serem conhecidas (RYLANDS et al., 2000).

Nesse contexto, o melhor conhecimento da fisiologia reprodutiva de determinada espécie pode auxiliar programas de conservação a desenvolverem tecnologias de reprodução assistida para criação em cativeiro de espécies ameaçadas (ESTRADA; GARBER; 2009; WOLF, 2009).

O gênero Saimiri ou macaco de cheiro é um dos gêneros mais conhecidos dentre os primatas neotropicais, devido ao seu extensivo uso em cativeiro

Das cinco espécies do gênero, duas são consideradas vulneráveis (S. oestedii e S. vanzolinii) e uma corre risco de extinção (S. ustus). S. sciureus e S. boliviensis não estão ameaçadas; porém, como ocorre com a maioria dos primatas não humanos, as populações em vida livre de todas as espécies do gênero encontram-se em declínio (IUCN, 2009).

Em estudos reprodutivos, o gênero Saimiri foi utilizado como modelo para estudo da sazonalidade e efeito do deslocamento entre hemisférios sobre a reprodução, testes de protocolos de indução da ovulação na mulher e, principalmente, em estudos sobre fertilização in vitro (DUKELOW, 1983). Atualmente é modelo para estudos sobre a bioquímica do trabalho de parto e prolapso dos órgãos pélvicos (ABEE, 2000).

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Apesar de amplamente utilizados nas pesquisas, a fisiologia reprodutiva de Saimiri ainda é pouco conhecida, o que implica na redução do desempenho reprodutivo em cativeiro. Sabe-se que nas fêmeas o ciclo reprodutivo apresenta uma sazonalidade marcante, cujos fatores determinantes ainda não são totalmente conhecidos e parecem envolver uma complexa relação entre fatores socioambientais. Apesar de apresentarem uma taxa de concepção razoável em cativeiro, são muito suscetíveis ao estresse e apresentam altas taxas de aborto e morte neonatal. Possuem um ciclo ovariano extremamente curto, sem presença de menstruação, de difícil monitoramento por citologia vaginal ou observações comportamentais.

Os métodos de colheita e avaliação do sêmen de Saimiri ainda não foram padronizados de forma a reproduzi-los em diferentes centros de criação. O sêmen forma um firme coágulo imediatamente após a ejaculação e até o momento, nenhum método foi capaz de dissolvê-lo totalmente.

Em conjunto, esses fatores dificultam o manejo reprodutivo e o emprego das técnicas de reprodução assistida (ARTs em inglês – Assisted Reproductive Technologies), tais como inseminação artificial, fertilização in vitro, transferência de embriões, criopreservação de gametas e embriões.

O estudo mais detalhado dessas questões permitirá adequar o manejo e estabelecer colônias autossustentáveis, de forma a evitar a retirada desses animais de seu habitat natural. A criação e a reprodução em cativeiro, quando bem planejadas e monitoradas, ainda permitem um melhor controle genético, reprodutivo e sanitário da colônia, de forma a garantir maior qualidade e confiabilidade dos resultados obtidos nas pesquisas.

No Brasil, há duas colônias de S. sciureus disponíveis para pesquisa, uma no Centro Nacional de Primatas (CENP), Instituto Evandro Chagas (IEC), em Ananindeua/PA e outra no Centro de Criação de Animais de Laboratório (Cecal), Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), Rio de Janeiro/ RJ. Ambas as instituições pertencem ao Ministério da Saúde (MS).

A colônia de S. sciureus do Cecal possui cerca de 300 indivíduos, destinados à pesquisa biomédica. O Centro possui, ainda, cerca de 80 S. ustus. Na colônia de S. sciureus, a taxa de prenhez (número de fêmeas prenhes sobre o número total de fêmeas em idade reprodutiva) é de aproximadamente 50%, enquanto a

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produtividade (número de filhotes desmamados sobre o número total de fêmeas em idade reprodutiva) não ultrapassa 30%.

Dessa maneira, o refinamento do manejo diário, com o investimento em programas de treinamento e condicionamento dos animais, poderá contribuir para a redução dos níveis de estresse (PRESCOTT; BOWELL; BUCHANAN-SMITH; 2005) e melhorar o desempenho reprodutivo da colônia (DUKELOW, 1983). Estudos sobre a fisiologia reprodutiva de machos, particularmente da colheita e avaliação do sêmen, permitirão acessar o potencial reprodutivo de determinado animal e, futuramente, aplicar as ARTs.

Assim, a proposta deste estudo foi avaliar o condicionamento de S. sciureus ao método de colheita de sêmen por vibroestimulação peniana com o auxílio de observações comportamentais, bem como as consequências do uso deste método como potencial agente estressor, por meio da dosagem de cortisol sérico. Objetivou-se ainda analisar o sêmen dos animais estudados por meio de testes físicos e morfofuncionais, com e sem a utilização de enzima proteolítica para a dissolução do coágulo seminal.

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6 CONCLUSÕES

De acordo com as condições em que foram conduzidas este experimento podemos inferir que:

Os machos da espécie Saimiri sciureus podem ser condicionados ao método de estimulação e colheita de sêmen por vibroestimulação peniana.

• A dosagem de cortisol sérico demonstrou haver uma resposta aguda e não duradoura ao estresse logo após o procedimento de colheita

É possível colher sêmen de Saimiri sciureus pelo método de vibroestimulação peniana, porém a taxa de sucesso na obtenção de ejaculados parece depender de ajustes nas técnicas de contenção e estimulação, da sazonalidade reprodutiva e do contato olfativo com as fêmeas.

• O sêmen, obtido por vibroestimulação peniana, apresentou porcentagens de espermatozóides móveis e com movimentos progressivos retilíneos acima de 60%, mesmo fora da estação de acasalamento.

• Os parâmetros integridade do acrossomo e grau de atividade mitocondrial foram descritos pela primeira vez para a espécie e apresentaram alta porcentagem de integridade.

• O tratamento com a tripsina não foi eficaz para a dissolução do coágulo seminal nas concentrações 0,5, 1 e 5%, nos tempos de incubação de 20 e 40 minutos a 37º C.

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