INSTRUÇÕES DE USO ENZIMAIMUNOENSAIO PARA DETERMINAÇÃO QUANTITATIVA DO HORMÔNIO LUTEINIZANTE (LH) EM SORO HUMANO

LH

INSTRUÇÕES

DE

USO

ENZIMAIMUNOENSAIO PARA DETERMINAÇÃO

QUANTITATIVA DO HORMÔNIO LUTEINIZANTE

(LH) EM SORO HUMANO

S

“

”

Conservar entre 2 e 8°C.

S

Hormônio Luteinizante (LH).

F

Para determinação quantitativa da concentração do Hormônio Luteinizante (LH) em soro humano. Este teste é utilizado no diagnóstico e controle de tratamento de disfunções gonadais.

I

O Hormônio Luteinizante (LH) é produzido no lobo anterior da hipófise de homens e mulheres em resposta ao Hormônio Liberador do Hormônio Luteinizante (LH-RH ou Gn-RH), secretado pelo hipotálamo. O LH, também chamado de Hormônio Estimulador das Células Intersticiais (ICSH), nos homens, é uma glicoproteína com peso molecular aproximado de 30.000 daltons. É composto por duas cadeias de aminoácidos associadas de forma não covalente, denominadas alfa e beta. A cadeia alfa é semelhante à encontrada nos hormônios TSH, FSH e hCG. A diferença entre esses hormônios encontra-se na composição dos aminoácidos de suas subunidades beta, responsáveis por sua diferenciação imunológica.

Nos homens, a secreção basal de LH é esporádica e possui a função primária de estimular as células intersticiais (células de Leydig) a produzir testosterona. A variação da concentração de LH nas mulheres saudáveis com menstruação regular depende do complexo ciclo ovulatório e da seqüência dos eventos hormonais do eixo gônadas – hipotálamo – hipófise. Cada ciclo menstrual é iniciado pela diminuição dos níveis de progesterona e estradiol que precede a ovulação. Como resultado da diminuição dos níveis hormonais, o hipotálamo aumenta a secreção de fatores liberadores de gonadotrofina que, por sua vez, estimula a hipófise a aumentar a produção e secreção de FSH. Os níveis aumentados de FSH estimulam vários folículos durante a fase folicular, um dos quais irá amadurecer para conter o óvulo. Enquanto o folículo se desenvolve, o estradiol é secretado, vagarosamente a princípio, mas por volta do 12º ou 13º dia do ciclo normal, aumenta rapidamente. O LH é liberado em resultado do aumento rápido do estradiol em função da estimulação da hipófise e do aumento dos níveis de GnFR e FSH. Esses eventos representam a fase pré-ovulatória.

A ovulação ocorre cerca de 12 a 18 horas após o pico máximo do LH. Depois de liberado o óvulo, o corpo lúteo é formado e secreta progesterona e estrógeno, que regulam o mecanismo de retroalimentação do LH. A fase lútea rapidamente segue a fase ovulatória e é caracterizada por

altos níveis de progesterona, um segundo aumento do estradiol e níveis baixos de LH e FSH, que resultam dos efeitos do mecanismo de retroalimentação negativo do estradiol e da progesterona no eixo hipotalâmico-hipofisário. Após a concepção, o embrião em desenvolvimento produz hCG que estimula o corpo lúteo a continuar sua produção de progesterona e estradiol. Se não ocorrer a fecundação, o corpo lúteo regride e a conseqüente diminuição dos níveis de progesterona e estradiol resulta na menstruação. Pacientes com hipogonadismo apresentam níveis séricos elevados de LH. A diminuição dos hormônios esteróides nas mulheres é decorrente de ovários imaturos, falência ovariana primária, ovário policístico ou menopausa. Nestes casos a secreção de LH não está regulada. Nos homens, ocorre uma perda semelhante de hormônios regulatórios quando os testículos se desenvolvem anormalmente ou quando estão ausentes (anorquia). Níveis altos de LH também podem ser encontrados nos homens em casos de falência testicular primária e na Síndrome de Klinefelter, apesar dos níveis de LH não estarem necessariamente elevados se a secreção de andrógenos continuar. Concentrações elevadas também estão presentes em casos de jejum prolongado, insuficiência renal, hipertireoidismo e cirrose hepática.

A ausência de secreção do lobo anterior da hipófise pode provocar a diminuição dos níveis de LH. Conforme esperado, baixos níveis de LH podem levar à infertilidade masculina e feminina. Níveis baixos de LH também podem ser decorrentes da secreção diminuída de GnRH pelo hipotálamo. Assim sendo, valores baixos de LH podem indicar alguma disfunção hipofisária ou hipotalâmica, mas a fonte real do problema deve ser confirmada por outros testes.

Para o diagnóstico diferencial da disfunção gonadal, hipofisária ou hipotalâmica, a dosagem de LH é realizada rotineiramente em conjunto com o FSH, visto que suas funções no organismo estão intimamente relacionadas. Além disso, os níveis hormonais são usados para determinar a menopausa, o pico ovulatório e monitorar a terapia endócrina.

P

T

O LH Biocheck é um ensaio enzimático imunoabsorvente em fase sólida. O teste utiliza um anticorpo monoclonal de camundongo anti-alfa-LH para a imobilização da fase sólida (poços da microplaca) e um anticorpo monoclonal de camundongo anti-beta-LH na solução do conjugado enzimático. A amostra é adicionada e reage simultaneamente com os dois anticorpos, de forma que as moléculas de LH ficam posicionadas entre os anticorpos da fase sólida e os do conjugado. Após incubação de 45 minutos em temperatura ambiente, a placa é lavada para remover os anticorpos marcados não ligados. Adiciona-se em seguida a solução de 3, 3’, 5, 5’ Tetrametilbenzidina (TMB - Substrato) e a placa é incubada por 20 minutos, resultando no aparecimento de uma cor azul. O desenvolvimento da cor azul é interrompido pela adição de HCl 1N (Solução de Bloqueio) e a cor amarela resultante é

medida espectrofotometricamente em 450 nm. A concentração de LH é diretamente proporcional à intensidade da cor na amostra testada.

R

• 01 placa de poliestireno com 96 microcavidades destacáveis contendo anticorpo monoclonal de camundongo Anti-Alfa-LH imobilizado.

Manter a placa acondicionada dentro da embalagem plástica contendo dessecante.

• Calibradores (Liofilizados): 06 frascos contendo LH humano em matriz de soro bovino, nas concentrações 0 / 5 / 15 / 50 / 100 e 200 mUI/mL e Bromonitro dioxano 0,04 g/dL como preservativo. Reconstituir seguindo as instruções do tópico “Preparação dos Reagentes”. • Conjugado: 01 frasco com 13mL de solução tamponada

em pH 7,6 contendo anticorpo monoclonal de camundongo anti-beta-LH conjugado com Peroxidase, H2SO4, e Bromonitro dioxano 0,04 g/dL como preservativo.

• Substrato TMB: 01 frasco com 11mL de solução tamponada em pH 3,5 contendo 3, 3’, 5, 5’- Tetrametilbenzidina 0,5 mmol/L, Peróxido de hidrogênio 1 µmol/L e Bromonitro dioxano 0,04 g/dL como preservativo.

Extremamente fotossensível. Protegê-lo da ação da luz. O reagente deve permanecer incolor ou levemente azulado; o aparecimento de coloração azul mais intensa indica contaminação e o reagente deve ser descartado. • Solução de Bloqueio: 01 frasco com 11mL de solução

de Ácido Clorídrico (HCl 1N).

Materiais necessários, mas não inclusos:

• Pipetas automáticas de precisão. • Ponteiras descartáveis.

• Água destilada ou deionizada. • Vórtex ou equivalente. • Vidraria

• Timer ou cronômetro

• Papel absorvente ou papel toalha.

• Papel de gráfico milimetrado, se necessário.

• Leitora de microplaca que possua filtro com banda de passagem de até 10nm e leitura média de densidades ópticas de 0-3 D.O. em 450 - 630 nm.

A

K

M

1. O Kit deve ser armazenado entre 2 e 8°C. 2. A microplaca deve ser mantida sempre em sua

embalagem, bem fechada e com dessecante para proteger da umidade.

3. Os reagentes são estáveis até a data de expiração do kit, desde que conservados na temperatura indicada. 4. Evitar exposição dos reagentes ao calor, luz solar ou

luz forte direta, durante armazenagem ou uso.

P

C

E

1. Material potencialmente infectante:

Todos os reagentes foram testados e comprovados não reativos para a presença de vários agentes contaminantes, em especial anticorpos anti-HIV 1 e 2 e HbsAg. Entretanto, nenhum teste laboratorial pode assegurar com certeza absoluta que quaisquer agentes infecciosos, incluindo vírus da Hepatite B e HIV, estejam ausentes. Tratar os reagentes, portanto, como amostras altamente infectantes como recomendam as normas da Secretaria de Vigilância Sanitária local, incluindo os procedimentos com relação à manipulação e descarte dos mesmos. 2. O kit é designado para uso diagnóstico “in vitro”. 3. Não pipetar com a boca. Não fumar, comer ou beber

dentro da área de trabalho onde reagentes e amostras estiverem sendo manuseados.

4. Não utilizar os reagentes após a data de expiração do kit e não misturar ou trocar reagentes de lotes diferentes.

5. A Solução de Bloqueio é cáustica e corrosiva. Em caso de contato, lavar imediatamente o local afetado com água em profusão. Em caso de ingestão acidental, procurar auxílio médico imediato. Não provocar vômitos.

6. Recolocar as tampas dos frascos imediatamente após o uso. Não misturar as tampas dos reagentes.

7. Cada cavidade da placa pode ser utilizada somente uma vez.

8. Não utilizar, na reação enzimática, soluções contendo azida sódica como aditivo ou conservante.

C

A

P

1. Coletar o sangue e separar o soro.

2. Não é necessário nenhum tratamento prévio da amostra.

3. Devem ser utilizadas somente amostras de soro sem aditivos ou conservantes.

4. As amostras de soro devem ser armazenadas entre 2 e 8°C por até 48 horas, e devem ser congeladas a −20°C ou menos para períodos mais longos. Amostras congeladas devem ser misturadas por inversão várias vezes após seu descongelamento. Evitar repetidos congelamentos e descongelamentos de amostras. 5. Amostras fortemente hemolisadas ou fortemente

lipêmicas podem interferir nos resultados.

6. Atenção: Amostras contendo azida sódica não devem ser utilizadas.

P

R

• Reconstituir cada calibrador liofilizado com 1 mL de

água destilada ou deionizada. Após a reconstituição,

deixar em repouso por 20 minutos. Homogeneizar delicadamente por inversão e com movimentos circulares até a dissolução completa do conteúdo dos frascos. O material reconstituído deve ser armazenado entre 2-8°C (até 30 dias). Sugere-se o armazenamento em alíquotas a -20°C visando o aumento da

estabilidade. O material congelado deve ser degelado uma única vez.

• Todos os reagentes devem ser misturados suavemente por inversão ou movimentos circulares antes do uso. Evitar a formação de espuma.

P

Antes da realização do teste espere que os reagentes, padrões e controles atinjam a temperatura ambiente (18 a 25ºC).

1.

2. Pipetar 50 µL de padrões reconstituídos, controles e amostras nos poços apropriados.

3. Adicionar 100 µL do Conjugado em todos os poços. Homogeneizar por 30 segundos através de movimentos circulares. É importante uma homogeneização rigorosa. 4. Incubar por 45 minutos em temperatura ambiente

(18-25°C).

5. Desprezar o conteúdo dos poços e lavá-los 5 vezes com água destilada ou deionizada. Invertê-los em papel absorvente, batendo para retirar o excesso de líquido.

Atenção: lavagens insuficientes ocasionam resultados

falsamente elevados.

6. Pipetar 100 µL do Substrato em todos os poços. Homogeneizar.

7. Incubar por 20 minutos em temperatura ambiente (18-25°C), ao abrigo da luz.

8. Pipetar 100 µL de Solução de Bloqueio em todos os poços.

9. Homogeneizar por 30 segundos. Nesta etapa a mudança da cor azul para a amarela deve ser completa, a fim de evitar resultados duvidosos. 10. Ler as densidades ópticas em 450 - 630 nm, em até 10

minutos.

C

R

1. Calcular a média dos valores de absorbância (A450) para cada conjunto de calibradores, controles e amostras.

2. Preparar uma curva padrão locando a média de absorbância obtida para cada padrão contra a sua concentração em mUI/mL em papel de gráfico milimetrado, com os valores de absorbância no eixo Y e as concentrações no eixo X.

3. Usar a média dos valores de absorbância para cada amostra para determinar a concentração correspondente de LH em mUI/mL, utilizando a curva padrão.

4. Para amostras diluídas, calcular o resultado final

multiplicando o valor obtido pelo fator de diluição.

E

C

P

A tabela abaixo apresenta os resultados de um ensaio padrão típico com as leituras de densidade óptica em 450 nm demonstradas no eixo Y contra as concentrações de LH demonstradas no eixo X.

Atenção: os valores de D.O. são apenas ilustrativos e não

devem ser usados para cálculo de determinações. Cada laboratório deve determinar seus próprios valores.

O valor de absorbância pode variar em função da incubação à temperatura ambiente, visto que diferentes laboratórios apresentam diferentes temperaturas.

LH (mUI/mL) Absorbância (450 nm) 0 0,043 5 0,148 15 0,328 50 0,947 100 1,656 200 2,704 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 100 200 300 Concentração de LH (mUI/mL) A b s o rb â n c ia ( 4 5 0 n m )

V

E

Cada laboratório deve estabelecer seus próprios valores de referência, baseado em sua população. Diferenças na técnica de ensaio podem afetar os resultados. Abaixo apresentamos os valores citados na Referência nº 16 da OMS: ADULTO mUI/mL Homens 1,24 – 7,8 Mulheres: Fase Folicular Pico Ovulatório Fase Lútea 1,68 – 15,0 21,9 – 56,6 0,61 – 16,3 Mulheres Pós Menopausa 14,2 – 52,3

C

D

1.

S

:

A sensibilidade de um kit de ELISA pode ser definida como a mais baixa concentração, diferente de zero, que pode ser detectada, calculada a partir de 95% (do limite de confidência do padrão) do kit.

Notas de Procedimento

- Não se recomenda a utilização de mais de 32

cavidades para cada ensaio, principalmente para pipetagem manual.

- Cada pipetagem, após iniciada, não deve ser

interrompida.

- Utilizar preferencialmente uma pipeta multi-canal para

Os testes de sensibilidade foram feitos a partir de amostras de valores conhecidos, de forma crescente, a fim de determinar a faixa mínima de concentração em que a reação ocorreria. Para tanto, 8 kits foram selecionados aleatoriamente e testados 10 vezes com cada uma das amostras, cujos valores de concentração variam de 0,35 a 2,2 mUI/mL.

Os resultados dos testes realizados determinaram, portanto, que o limite mínimo de detecção do kit é 1,0 mUI/mL.

2.

E

:

Os seguintes hormônios foram testados para verificação da ocorrência de reações cruzadas:

Hormônio

Testado Concentração % de Reação Cruzada

hCG (OMS, 1ª IRP 75/537) 20 mUI/mL 150 mUI/mL 1.000 mUI/mL 5.000 mUI/mL 10.000 mUI/mL 25.000 mUI/mL 200.000 mUI/ml 400.000 mUI/mL <1 <1 1,0 4,5 8,9 20,5 41,0 65,0 Obs.: A gestação resulta em valores elevados de hCG. Portanto, não se recomenda o uso deste ensaio durante a gestação e imediatamente após o parto.

TSH (OMS, 2ª IRP, 80/558) 31,5 µUI/mL 62,5 µUI/mL 125 µUI/Ml 250 µUI/mL 500 µUI/mL <1 1,0 1,8 3,0 5,5 FSH (OMS, 2ª IRP, HMG) 125 mUI/mL 250 mUI/mL 500 mUI/mL 1,0 1,9 3,5

3.

E

:

Um estudo estatístico utilizando amostras de 113 indivíduos com concentrações de LH variando entre 0,1 a 56 mUI/mL demonstrou boa correlação de resultados com o kit comercialmente disponível utilizado, conforme apresentado abaixo. A comparação entre o kit LH Biocheck e o Kit Nichols Institute´s Allegro® LH forneceu os seguintes dados: N = 113

Coeficiente de Correlação = 0,958 Intervalo de Variação (Slope) = 1,115 Interceptação: 0,49

Média Biocheck = 10,1 mUI/mL Média Nichols = 8,6 mUI/mL

4.

P

:

Intra-Ensaio:

A precisão intra-ensaio foi determinada pela análise repetida de três amostras diferentes de soros controle em um ensaio. A variabilidade intra-ensaio é apresentada na tabela abaixo:

Soro Controle 1 2 3 Número de repetições 18 18 18 Média (mUI/mL de LH) 4,9 23,6 57,9 Desvio Padrão 0,3 1,4 3,9 Coeficiente de Variação (%) 6,5% 5,8% 6,8% Inter-Ensaio:

A precisão inter-ensaio foi determinada pela análise repetida de três amostras diferentes de soros controle em uma série de ensaios calibrados individualmente, conforme mostra a tabela abaixo: Soro Controle 1 2 3 Número de repetições 24 24 24 Média (mUI/mL de LH) 5,1 23,9 57,7 Desvio Padrão 0,4 1,7 3,3 Coeficiente de Variação (%) 8,1% 7,1% 5,7%

5.

E

“H

”:

Não foi observado efeito “Hook” neste ensaio para concentrações de LH de até 4.000 mUI/mL.

L

P

1. Resultados confiáveis e reprodutíveis serão obtidos se o procedimento do teste for seguido com o completo entendimento das instruções de uso e de acordo como as boas práticas laboratoriais.

2. O procedimento de lavagem é importante. Lavagens insuficientes ocasionam falsos resultados.

3. A homogeneização, após a adição de cada reagente, deve ser bem feita para se evitar uma baixa precisão do teste.

4. Como em outros ensaios sorológicos, os resultados deste teste devem ser analisados em conjunto com outras informações disponíveis para se definir uma evolução clínica e o diagnóstico.

5. As amostras de soro utilizadas neste ensaio não podem conter aditivos. Foi demonstrado que o EDTA interfere no procedimento do teste.

C

Q

As boas práticas laboratoriais requerem que os controles sejam passados em cada curva de calibração. Um número significativo de controles deve ser testado para se estabelecer os valores médios e os limites aceitáveis para o seu desempenho.

Recomendamos o uso de soro controle disponível no mercado. Não devem ser utilizados controles que contenham azida sódica.

P

Os padrões de referência do LH são calibrados de acordo com a Primeira Referência Internacional para Preparação de LH para imunoensaio da Organização Mundial de Saúde (OSM, 1ª IRP – 78/549).

R

B

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