UNIVERSIDADE DO SUL DE SANTA CATARINA CURSO DE ODONTOLOGIA
GABRIELA PONTES DA SILVA
EFETIVIDADE DO ÓLEO ESSENCIAL Lemon Tea Tree NA
ELIMINAÇÃO DO BIOFILME DE E. faecalis EM DENTINA BOVINA
Palhoça 2017
GABRIELA PONTES DA SILVA
EFETIVIDADE DO ÓLEO ESSENCIAL Lemon Tea Tree NA
ELIMINAÇÃO DO BIOFILME DE E. faecalis EM DENTINA BOVINA
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Odontologia da Universidade do Sul de Santa Catarina como requisito parcial à obtenção do título de Cirurgião Dentista.
Orientadora: Profa. Dra. Josiane de Almeida
Palhoça 2017
GABRIELA PONTES DA SILVA
EFETIVIDADE DO ÓLEO ESSENCIAL Lemon Tea Tree NA
ELIMINAÇÃO DO BIOFILME DE E. faecalis EM DENTINA BOVINA
Este Trabalho de Conclusão de Curso foi
julgado adequado à obtenção do título de Cirurgião Dentista e aprovado em sua forma final pelo Curso de Odontologia da
Universidade do Sul de Santa Catarina.
Palhoça, 14 de novembro de 2017. Banca Examinadora:
______________________________________________________ Profa. Dra. Josiane de Almeida
Orientadora
Universidade do Sul de Santa Catarina
______________________________________________________ Profa. Ms. Morgane Marion Kuntze
Membro da Banca
Universidade Federal de Santa Catarina
______________________________________________________
Profa. Ms. Daniela Peressoni Vieira Schuldt
Membro da Banca
AGRADECIMENTOS
À Deus por estar sempre comigo, protegendo e guiando.
Aos meus pais que amo tanto, Nelson e Rose, por toda a dedicação que tiveram por mim ao longo da vida e também durante a faculdade. A vocês eu dedico todas as minhas vitórias e a minha gratidão, por terem dado tudo o que puderam de si para me proporcionar sempre o melhor. Vocês sempre serão os meus maiores exemplos e vou procurar sempre dar orgulho a vocês!
Ao meu noivo, Matheus, por me dar tanto amor e me cuidar nos dias em que o cansaço era maior. Por toda força e compreensão nos finais de semana dedicados ao TCC e até mesmo durante a semana nas noites em que não pude estar presente nem ao menos para conversar. Por confiar em mim e ser meu primeiro paciente na minha primeira extração em Cirurgia. Obrigada por estar ao meu lado em todos os momentos. Pensar no nosso futuro me instiga a sempre fazer o meu melhor. Muito obrigada meu amor!
À minha irmã mais velha, Priscila, por estar ao meu lado me aconselhando e por me dar esse presente lindo, Vicente, que dá cor as nossas vidas. Vocês e o Carlinhos moram no meu coração.
À minha irmã, Carolina, por apenas ser minha melhor amiga. Você e o Gustavo são muito importantes para mim.
Ao meu irmãozinho, Nelsinho, por todos os abraços e beijinhos nos momentos solitários em meu quarto.
Aos meus pacientes, em especial às minhas primas Roberta, Thalia e a minha querida tia Renata, por confiarem no meu trabalho e potencial, deixando eu cuidar dos seus sorrisos. Muito obrigada!
À minha querida dupla de clínica e da vida, Letícia Back, que esteve comigo durante todos esses anos de faculdade. Por me aturar toda segunda-feira de manhã com meu péssimo humor, por todos os funks ouvidos e dançados, por todos os chopps e coxinhas, por conversar
comigo 24 horas por dia, pois não basta me ver o dia inteiro, tem que ligar de noite também! Por sempre estar disposta a me ajudar! Obrigada minha dupra!
Aos amigos feitos no Curso de Odontologia, Rafa, Andressa, Nicole, Fran, Juliana, Manu, Jean, Luísa, Yasminn e Ana Carolina, por fazerem meus dias mais engraçados e felizes. Já estou com saudades!
Aos amigos feitos na faculdade, Júlia, Paola, Yslan, Mari e outros estagiários, por me aguentarem todos os dias na clínica, por sempre estarem à disposição quando precisei, por muitas vezes ficarem fora do horário de trabalho me ajudando, por serem essas pessoas maravilhosas! Obrigada.
À minha orientadora, Josiane de Almeida, por me mostrar esse mundo de laboratório de microbiologia e fazer com que eu me apaixonasse por ele. Por estar disponível em todos os horários que eu precisei, por me explicar mil vezes até em forma de desenho quando eu não entendia, pela paciência ao ensinar, pela confiança depositada em mim, pelos elogios e puxões de orelha que muitas vezes mereci. Uma professora maravilhosa que tive a honra de ter como orientadora e, por fim, se tornando amiga. Nada disso seria possível sem sua ajuda.
Ao professor Celino e ao estagiário Vinícius por terem me recebido tão bem em cada dia de trabalho no laboratório de Microbiologia. Obrigada por toda ajuda.
Ao meu colega de pesquisa, Josias Griggio, por todas as manhãs, tardes e noites no laboratório, por toda a ajuda em cada etapa da pesquisa e pela companhia.
À Morgane Marion por toda ajuda e disponibilidade para o preparo das amostras e analise do MEV, por gentilmente ter aceitado o convite para compor a banca do meu TCC e disponibilizar tempo para contribuir e enriquecer este trabalho. Obrigada pela atenção, pela disponibilidade e pelo carinho.
À professora Daniela Peressoni por ter aceitado o convite para compor a banca do meu TCC, por ter abdicado tempo de sua agenda corrida para que eu pudesse ter outra grande profissional contribuindo para este trabalho. Agradeço por todos os ensinamentos e por participar da minha trajetória acadêmica dentro do curso de Odontologia.
A todos os professores do curso de Odontologia da Unisul, por dividirem comigo seu tempo, pela partilha de conhecimento, paciência, pelos ensinamentos para a vida e principalmente pela amizade. Obrigada por terem me ensinado a sempre questionar, a duvidar, a pensar e a sonhar. Talvez esqueceremos dos rostos e nomes, mas levarei as lições aprendidas.
À Universidade do Sul de Santa Catarina, pelo suporte, pela ajuda e por ter me acolhido durante esses anos de curso.
Ao Laboratório Central de Microscopia Eletrônica (LCME) da Universidade Federal de Santa Catarina por gentilmente permitir a análise das amostras por meio da microscopia eletrônica de varredura.
Obrigada a todos aqueles que participaram de forma direta ou indireta da minha vida acadêmica e pessoal.
“A vida me ensinou a nunca desistir. Nem ganhar, nem perder, mas procurar evoluir.” (Charlie Brown Jr)
SILVA, G. P. Efetividade do óleo essencial Lemon Tea Tree na eliminação do biofilme de
E. faecalis em dentina bovina. 2017. 54 f. Trabalho de Conclusão de Curso (TCC) – Curso de
Odontologia, Universidade do Sul de Santa Catarina, Palhoça.
RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar e comparar, ex vivo, a efetividade do óleo essencial Lemon Tea Tree (LTT) e do hidróxido de cálcio [Ca(OH)2] contra o biofilme de E. faecalis
estabelecido no canal radicular de dentes bovinos. Após a formação do biofilme de E. faecalis em 42 tubos de dentina de dentes bovinos, os espécimes foram divididos aleatoriamente de acordo a medicação intracanal empregada (n=14): G1- Ca(OH)2; G2- LTT 5%; e G3- controle
- solução salina 0,85%. Passados 7 dias, as medicações foram removidas e a coleta microbiológica do biofilme remanescente foi realizada. Os tubos de dentina sem as medicações foram imediatamente imersos em meio de cultura estéril e armazenados por mais 7 dias para a análise do efeito antimicrobiano residual das medicações. Após este período, foi feita uma nova coleta microbiológica. Do material coletado nos dois momentos, foi realizado o teste de viabilidade bacteriana, por meio da contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFCs). Quatro espécimes de cada grupo foram submetidos à análise em microscopia eletrônica de varredura para observação da arquitetura do biofilme. Os valores médios de CFUs foram analisados pelos testes one way ANOVA e post hoc Tukey (P < 0,05). Logo após a remoção da medicação, o Ca(OH)2 demonstrou uma redução de100% das células microbianas (P < 0,001)
e o óleo LTT 5%, de 96,31% (P < 0,004), comparados ao controle. Apenas o Ca(OH)2
apresentou efeito antimicrobiano residual significativo (P = 0,001), ainda que o LTT 5% tenha eliminado 69,89% das células de E. faecalis. O LTT 5%, empregado na forma de medicação intracanal, apresentou excelente efetividade antimicrobiana, comparável ao Ca(OH)2, contra o
biofilme de E. faecalis estabelecido na dentina do canal radicular de dentes bovinos.
SILVA, G. P. Efetividade do óleo essencial Lemon Tea Tree na eliminação do biofilme de
E. faecalis em dentina bovina. 2017. 54 f. Trabalho de Conclusão de Curso (TCC) – Curso de
Odontologia, Universidade do Sul de Santa Catarina, Palhoça.
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate and compare, ex vivo, the effectiveness of Lemon Tea Tree essential oil (LTT) and calcium hydroxide [Ca(OH)2] against E. faecalis biofilm on root
canal of bovine teeth. After E. faecalis biofilm formation in 42 dentin tubes of bovine teeth, the specimens were randomly divided according to the intracanal dressing (n=14): G1- Ca(OH)2;
G2- LTT 5%; e G3- control - saline 0.85%. After 7 days, intracanal medication was removed and the collection of microbiological samples from the remaining biofilm was performed. The dentin tubes without medication were immediately immersed in sterile culture medium and stored for 7 days to allow the analysis of residual antimicrobial effect of each medication. After that, another microbiological sampling was performed. The bacterial viability test, by colony forming units (CFUs) counting, was carried out from the material collected in both moments. The architecture of biofilms of 4 specimens of each group were analyzed by scanning electron microscopy. The mean values of CFUs were analyzed by one way ANOVA and post hoc Tukey tests (P < 0.05). Results obtained after removal of medications showed a 100% microbial reduction promoted by Ca(OH)2 (P < 0,001) and 96,31% promoted by LTT 5% (P < 0,004),
compared to the control. Only Ca(OH)2 showed significant residual antimicrobial effect (P =
0,001), although LTT 5% had eliminated 69,89% of E. faecalis cells. The LTT 5%, as intracanal dressing, showed excellent antimicrobial effectiveness, comparable to the Ca(OH)2, against E.
faecalis biofilm on root canal of bovine teeth.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Resultado do teste de viabilidade celular logo após o uso das medicações. ... 28 Figura 2. Fotomicrografias obtidas em MEV mostrando a superfície dentinária e a arquitetura dos biofilmes logo após a remoção das medicações... 289 Figura 3. Resultado do efeito antimicrobiano residual das medicações.. ... 28 Figura 4. Fotomicrografias obtidas em MEV mostrando a superfície dentinária e a arquitetura dos biofilmes sete dias após a remoção das medicações.. ... 31
LISTA DE TABELAS
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
E. faecalis – Enterecoccus faecalis Ca(OH)2 – hidróxido de cálcio
pH– potencial hidrogeniônico LTT – Lemon Tea Tree
MEV – microscopia eletrônica de varredura et al. – e colaboradores
CEUA – Comitê de Ética no Uso de Animais mm – milímetros
mL– mililitros
NaOCl – hipoclorito de sódio
EDTA – ácido etilenodiamino tetra-acético BHI – Brain Heart Infusion
TSB – Trypticase Soy Broth DO– densidade ótica
UFC – unidade formadora de colônia n – número de amostras G1 – grupo 1 G2 – grupo 2 G3 – grupo 3 P.A. – pró-analise S1 – suspensão 1 S2 – suspensão 2 kW – quilowatt
SPSS – Statistical Package for the Social Sciences P – probabilidade de significância
Log – logaritmo
LISTA DE SÍMBOLOS % – porcentagem µL – microlitro ºC – graus Celsius # – calibre < – menor = – igual
SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ... 16 2. PROPOSIÇÃO ... 19 2.1. OBJETIVO GERAL ... 19 2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 19 3. PRODUTO DE PESQUISA ... 20 3.1 RESUMO ... 20 3.2 ABSTRACT ... 21 3.3 INTRODUÇÃO ... 21 3.4 MATERIAL E MÉTODOS ... 21
3.4.1 Preparo dos espécimes ... 23
3.4.2 Formação do biofilme ... 23
3.4.3 Grupos experimentais e medicações ... 24
3.4.4 Teste de viabilidade bacteriana – contagem de UFC ... 25
4.4.5 Análise estatística ... 25
3.5.RESULTADOS ... 26
3.5.1 Efeito antimicrobiano imediato... 26
3.5.2 Efeito antimicrobiano residual ... 26
3.5.3 Influência do tempo na ação antimicrobiana das medicações ... 27
3.6. DISCUSSÃO ... 32
3.7 CONCLUSÃO ... 36
3.8 REFERÊNCIAS ... 36
4. CONCLUSÕES FINAIS ... 43
5. REFERÊNCIAS ... 44
ANEXO A - Padrão de Apresentação da Revista ... 49
1. INTRODUÇÃO
Em condições de normalidade a polpa dentária possui vitalidade e é livre de microrganismos. Contudo, quando por alguma razão, normalmente em decorrência de cárie, a polpa sofre necrose, microrganismos da cavidade oral penetram a cavidade pulpar. Esses microrganismos se multiplicam e ocupam o sistema de canais radiculares, liberando toxinas e subprodutos que atingem os tecidos periapicais, principalmente via forame apical. Consequentemente, instala-se um processo inflamatório nos tecidos perirradiculares, dando início a uma doença infecciosa denominada periodontite apical (SIQUEIRA; RÔÇAS, 2008).
A visualização radiográfica de periodontite apical só é possível após determinado período de tempo. Portanto, assume-se que lesões periapicais representam um processo patológico causado por uma infecção intracanal de longa data (STRINDBERG, 1956). Durante esse processo infeccioso, um grande número de bactérias tem tempo e condições suficientes para se adaptar ao ambiente e se estabelecer em posições estratégicas na forma de um biofilme maduro e organizado (STRINDBERG, 1956).
O biofilme microbiano caracteriza-se como uma comunidade de microrganismos, formado por uma ou por múltiplas espécies, embebida em uma estrutura extracelular polimérica produzida pelas próprias bactérias durante o processo de maturação (JAKUBOVICS & KOLENBRANDER, 2010). Essa matriz, formada por exopolissacarídeos, fornece estabilidade mecânica ao biofilme, confere proteção contra as defesas do hospedeiro e estresse do ambiente (QUAH et al., 2012), e também impede o contato direto de agentes antimicrobianos com os microrganismos, diminuindo, portanto, sua efetividade (ARIAS-MOLIZ et al., 2010). Quando associados em biofilme, os microrganismos possuem atividade metabólica diversificada e mais eficiente, além de serem fenotipicamente e fisiologicamente diferentes dos planctônicos (QUAH et al., 2012), com destaque para o aumento da resistência em até mil vezes (PROSSER
et al., 1987; GILBERT et al., 1997; JOHNSON et al., 2002).
Os microrganismos resistentes, que permanecem no canal após o preparo químico-mecânico, são os responsáveis pelo insucesso do tratamento endodôntico, e dão origem às chamadas infecções persistentes (PINHEIRO et al., 2003). O Enterococcus faecalis é uma das bactérias frequentemente encontradas em canais radiculares nos casos de insucesso do tratamento endodôntico. Esses cocos gram-positivos são dispostos em pares ou em pequenas cadeias (SUNDQVIST et al., 1998) e possuem diversos fatores de resistência, como capacidade de sobrevivência na ausência de nutrientes (SUNDQVIST et al., 1998), capacidade de penetração em profundidade nos túbulos dentinários (LOVE, 2001) e alta tolerância ao pH alcalino (EVANS et al., 2002). Além disso, ao aderir-se ao colágeno da dentina, o E. faecalis
é capaz de se organizar na forma de biofilme, sem que haja a necessidade de suporte de outras bactérias (LOVE, 2001). Esses fatores tornam o E. faecalis mais resistente à ação das medicações, como por exemplo, o hidróxido de cálcio [Ca(OH)2], dificultando sua eficácia
(SAATCHI et al., 2014). Como tem sido isolado de forma rotineira em canais com necessidade de retratamento (22% à 77%), o E. faecalis transformou-se no agente etiológico mais importante e mais relacionado ao insucesso endodôntico (PINHEIRO et al., 2003; SIQUEIRA; RÔÇAS, 2004).
Na tentativa de eliminar a etiologia da periodontite apical, ou seja, os microrganismos presentes no canal radicular, e assim promover a saúde dos tecidos periapicais, torna-se necessária a execução do tratamento endodôntico, com ênfase para o processo de desinfecção (RODRIGUES et al., 2017). No entanto, a complexa anatomia do sistema de canais radiculares impossibilita que as técnicas de preparo convencionais atinjam determinadas regiões dificultando a eliminação de microrganismos.
Diversos curativos intracanal (DEONIZIO et al., 2015; VALVERDE et al., 2017) são empregados em endodontia na tentativa de auxiliar a desinfecção não alcançada em sua totalidade durante o preparo mecânico, por meio dos instrumentos, e durante o preparo químico, por meio das soluções irrigadoras (JOSE et al., 2016; VALERA et al., 2016).
O Ca(OH)2 é uma medicação intracanal empregada há muitos anos na Endodontia.
Foi introduzido por Hermann, em 1920, para a terapia de dentes vitais, e posteriormente também demonstrou sucesso como curativo intracanal de dentes infectados (HOLLAND et al.,
1983). O Ca(OH)2 apresenta capacidade de dissolução de matéria orgânica (SUKAWAT;
SRUSUWAN, 2002), biocompatibilidade (FAVA, 1998; FILHO et al., 1999), atividade antiinflamatória e capacidade de indução do reparo de tecidos periapicais (ESTRELA et al., 1995). Embora sua principal propriedade seja a atividade antibacteriana, que ocorre devido ao seu pH elevado, aproximadamente pH 12 (BYSTROM; CLAESSON; SUNDQVIST, 1985), ele não pode ser considerado uma medicação capaz de erradicar os microrganismos (LIMA et al., 2012), uma vez que mesmo após sua utilização biofilmes são detectados no sistema de canais radiculares (NAIR et al., 2005; RICUCCI; SIQUEIRA, 2010).
Com o intuito de superar esse desafio e promover a desinfecção dos canais na superfície da dentina e em sua profundidade, novos medicamentos têm sido testados. Uma tendência que tem ganhado espaço na Odontologia é o uso de medicamentos derivados de plantas, como os óleos essenciais (SAMADI et al., 2011; CECCHINI et al., 2012; QUINTAS et al., 2015; SHETTY et al., 2016; NIKOLIĆ et al., 2017). Esses óleos são substâncias
aromáticas, obtidas por hidrodestilação, destilação ou por um processo mecânico realizado em
flores, ervas, frutas ou especiarias (RUBIOLO et al., 2010). Umas das principais propriedades dos óleos essenciais são a ação antibacteriana, antiviral, antifúngica e inseticida (BAKKALI et al., 2008; BICCHI et al., 2008; GOUNARIS, 2010; LUCKER; BOUWMEESTER; AHARONI, 2007; MIGUEL, 2010; POURMORTAZAVI; HAJIMIRSADEGUI, 2007; RUBIOLO et al., 2010; SANGWAN et al., 2001). Além disso, os óleos essenciais também são capazes de eliminar os radicais livres e podem desempenhar um papel importante contra algumas doenças, como a disfunção cerebral, câncer, doença cardíaca e declínio do sistema imunológico (ARUOMA, 1998; KAMATOU; VILJOEN, 2010).
Alguns óleos essenciais têm demonstrado resultados promissores, principalmente quando utilizados na forma de enxaguante bucal (QUINTAS et al., 2015). O óleo essencial extraído da planta Citrus Medica Limonum (Lemon Tea Tree – LTT) destaca-se pelas suas propriedades terapêuticas, dentre elas a inibição do crescimento de bactérias patogênicas (NIKOLIĆ et al., 2017). Em endodontia, os óleos essenciais têm sido testados na forma de solução irrigadora (SAMADI et al., 2011) e têm demonstrado efeito antimicrobiano significativo contra o biofilme de E. faecalis (ABBASZADEGAN et al., 2016) e Staphylococcus aureus (PORFÍRIO et al., 2017) formado sobre a superfície da dentina.
Com base no exposto, o uso dos óleos essenciais, em particular o Lemon Tea Tree, com potencial de eliminar o biofilme na superfície do canal radicular, poderia se tornar uma estratégia efetiva para o controle da infecção endodôntica e aumento do índice de sucesso dos tratamentos.
2. PROPOSIÇÃO
2.1. OBJETIVO GERAL
Avaliar e comparar, ex vivo, o efeito antimicrobiano do óleo essencial Lemon Tea Tree (LTT) 5% e do Ca(OH)2 contra o biofilme de E. faecalis estabelecido na dentina do canal
radicular de dentes bovinos.
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
i. Avaliar, por meio da contagem de unidades formadoras de colônias (UFCs), o efeito antimicrobiano imediato do Ca(OH)2 e do óleo essencial LTT 5% contra o biofilme de E.
faecalis estabelecido na dentina do canal radicular de dentes bovinos.
ii. Avaliar, por meio da contagem de UFCs, o efeito antimicrobiano residual das medicações Ca(OH)2 e óleo essencial LTT 5% contra o biofilme de E. faecalis estabelecido na
dentina do canal radicular de dentes bovinos.
iii. Analisar, se presente, por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV), a arquitetura do biofilme de E. faecalis na superfície da dentina do canal radicular, após o uso das medicações.
3. PRODUTO DE PESQUISA
Artigo formatado conforme as diretrizes da revista Arquivos em Odontologia UFMG (ANEXO 1)
Efetividade do óleo essencial Lemon Tea Tree na eliminação do biofilme de Enterococcus
faecalis em dentina bovina
Effectiveness of Lemon Tea Tree essential oil against Enterococcus faecalis biofilm on bovine dentin
Gabriela Pontes da Silva, DDS, Josias Griggio, DDS, Josiane de Almeida, DDS, PhD Departamento de Endodontia, Universidade do Sul de Santa Catarina, Palhoça, SC, Brasil.
3.1 RESUMO
Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar e comparar, ex vivo, a efetividade do óleo essencial Lemon Tea Tree (LTT) e do hidróxido de cálcio [Ca(OH)2] contra o biofilme de E.
faecalis estabelecido no canal radicular de dentes bovinos. Material e Métodos: Após a formação do biofilme de E. faecalis em 42 tubos de dentina de dentes bovinos, os espécimes foram divididos aleatoriamente de acordo a medicação intracanal empregada (n=14): G1- Ca(OH)2; G2- LTT 5%; e G3- controle - solução salina 0,85%. Passados 7 dias, as medicações
foram removidas e a coleta microbiológica do biofilme remanescente foi realizada. Os tubos de dentina sem as medicações foram imediatamente imersos em meio de cultura estéril e armazenados por mais 7 dias para a análise do efeito antimicrobiano residual das medicações. Após este período, foi feita uma nova coleta microbiológica. Do material coletado nos dois momentos, foi realizado o teste de viabilidade bacteriana, por meio da contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFCs). Quatro espécimes de cada grupo foram submetidos à análise em microscopia eletrônica de varredura para observação da arquitetura do biofilme. Os valores médios de CFUs foram analisados pelos testes one way ANOVA e post hoc Tukey (P < 0,05). Resultados: Logo após a remoção da medicação, o Ca(OH)2 demonstrou uma redução de100%
das células microbianas (P < 0,001) e o óleo LTT 5%, de 96,31% (P < 0,004), comparados ao controle. Apenas o Ca(OH)2 apresentou efeito antimicrobiano residual significativo (P = 0,001),
ainda que o LTT 5% tenha eliminado 69,89% das células de E. faecalis. Conclusão: O LTT 5%, empregado na forma de medicação intracanal, apresentou excelente efetividade antimicrobiana, comparável ao Ca(OH)2, contra o biofilme de E. faecalis estabelecido na
dentina do canal radicular de dentes bovinos.
3.2 ABSTRACT
Aim: The aim of this study was to evaluate and compare, ex vivo, the effectiveness of Lemon Tea Tree essential oil (LTT) and calcium hydroxide [Ca(OH)2] against E. faecalis
biofilm on root canal of bovine teeth. Methods: After E. faecalis biofilm formation in 42 dentin tubes of bovine teeth, the specimens were randomly divided according to the intracanal dressing (n=14): G1- Ca(OH)2; G2- LTT 5%; e G3- control - saline 0.85%. After 7 days, intracanal
medication was removed and the collection of microbiological samples from the remaining biofilm was performed. The dentin tubes without medication were immediately immersed in sterile culture medium and stored for 7 days to allow the analysis of residual antimicrobial effect of each medication. After that, another microbiological sampling was performed. The bacterial viability test, by colony forming units (CFUs) counting, was carried out from the material collected in both moments. The architecture of biofilms of 4 specimens of each group were analyzed by scanning electron microscopy. The mean values of CFUs were analyzed by one way ANOVA and post hoc Tukey tests (P < 0.05). Results: Results obtained after removal of medications showed a 100% microbial reduction promoted by Ca(OH)2 (P < 0,001) and
96,31% promoted by LTT 5% (P< 0,004), compared to the control. Only Ca(OH)2 showed
significant residual antimicrobial effect (P = 0,001), although LTT 5% had eliminated 69,89% of E. faecalis cells. Conclusion: The LTT 5%, as intracanal dressing, showed excellent antimicrobial effectiveness, comparable to the Ca(OH)2, against E. faecalis biofilm on root
canal of bovine teeth.
Uniterms: Biofilms. Disinfection. Enterococcus faecalis. Volatile oils.
3.3 INTRODUÇÃO
Em condições de normalidade a polpa dentária possui vitalidade e é livre de microrganismos. Contudo, quando por alguma razão, normalmente em decorrência de cárie, a polpa sofre necrose, microrganismos da cavidade oral penetram a cavidade pulpar. Esses microrganismos se multiplicam e ocupam o sistema de canais radiculares, liberando toxinas e subprodutos que atingem os tecidos periapicais, principalmente via forame apical. Consequentemente, instala-se um processo inflamatório nos tecidos perirradiculares, dando início a uma doença infecciosa denominada periodontite apical 1.
Na tentativa de eliminar a etiologia da periodontite apical, ou seja, os microrganismos presentes no canal radicular, e assim promover a saúde dos tecidos periapicais, torna-se
necessária a execução do tratamento endodôntico, com ênfase para o processo de desinfecção
2. No entanto, a complexa anatomia do sistema de canais radiculares impossibilita que as
técnicas de preparo convencionais atinjam determinadas regiões dificultando a eliminação de microrganismos. Esses permanecem no sistema de canais e túbulos dentinários, aderidos às paredes de dentina, e organizados na forma de biofilme 3, condição em que possuem maior
resistência aos efeitos de agentes antimicrobianos 4.
Diversos curativos intracanal 5,6 são empregados em endodontia na tentativa de
auxiliar a desinfecção não alcançada em sua totalidade durante o preparo mecânico, por meio dos instrumentos, e durante o preparo químico, por meio das soluções irrigadoras 7,8. Ainda que
o hidróxido de cálcio [Ca(OH)2] possua pH elevado, aproximadamente pH 12 9, e tenha
capacidade de dissolução de matéria orgânica 10, ele não pode ser considerado uma medicação
capaz de erradicar os microrganismos 11, uma vez que mesmo após sua utilização biofilmes são
detectados no sistema de canais radiculares 3,12.
O Enterococcus faecalis é uma bactéria gram-positiva anaeróbica facultativa que possui diversos fatores de resistência, como capacidade de sobrevivência na ausência de nutrientes 13, capacidade de penetração em profundidade nos túbulos dentinários 14 e alta
tolerância ao pH alcalino 15. Além disso, o E. faecalis, ao aderir-se ao colágeno da dentina, é
capaz de se organizar na forma de biofilme, sem que haja a necessidade de suporte de outras bactérias 14. Esses fatores tornam o E. faecalis mais resistente à ação das medicações, como por
exemplo, o Ca(OH)2, dificultando sua eficácia 16.
Com o intuito de superar esse desafio e promover a desinfecção dos canais na superfície da dentina e em sua profundidade, novos medicamentos têm sido testados. Uma tendência que tem ganhado espaço na Odontologia são os medicamentos derivados de plantas, como os óleos essenciais 17–21, em razão da sua efetiva ação antibacteriana, antiviral e
antifúngica 22–24. O óleo essencial extraído da planta Citrus Medica Limonum (Lemon Tea Tree
– LTT) destaca-se pelas suas propriedades terapêuticas, dentre elas a inibição do crescimento de bactérias patogênicas 21. Em endodontia, os óleos essenciais têm sido testados na forma de solução irrigadora 17 e medicação intracanal 25, demonstrando efeito antimicrobiano significativo contra o biofilme de E. faecalis 25 e Staphylococcus aureus 26 formado sobre a superfície da dentina.
Com base no exposto, o uso dos óleos essenciais, em particular o Lemon Tea Tree, com potencial de eliminar o biofilme intracanal, poderia se tornar uma estratégia efetiva para o controle da infecção endodôntica e aumento no índice de sucesso dos tratamentos. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar, ex vivo, o efeito antimicrobiano imediato e residual do
Ca(OH)2 e do óleo essencial Lemon Tea Tree 5% contra o biofilme de E. faecalis estabelecido
na dentina do canal radicular de dentes bovinos.
3.4 MATERIAL E MÉTODOS 3.4.1 Preparo dos espécimes
Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade do Sul de Santa Catarina (registro CEUA 17.025.4.02.IV).
Foram utilizados 21 dentes incisivos bovinos, os quais foram armazenados em solução de formol 10% à 37ºC até o início do experimento. Os dentes tiveram suas coroas e a porção apical removidas com o auxílio de um disco diamantado dupla-face sob refrigeração constante, de forma a se obter segmentos radiculares de aproximadamente 20 mm de comprimento. O tecido pulpar foi extirpado com o auxílio de limas e extirpa-nervos, sob irrigação constante de 5 mL de hipoclorito de sódio (NaOCl) 1% (ASFER, São Caetano do Sul, São Paulo, Brasil). Em seguida, os segmentos radiculares foram seccionados transversalmente, com o auxílio de um disco diamantado dupla-face sob refrigeração constante, e foram obtidos 2 tubos de dentina de 10 mm de comprimento(n=42). O diâmetro dos canais foi padronizado em 3 mm, por meio da utilização de uma broca cilíndrica, adaptada em peça reta, em toda a extensão do canal. Para a remoção da lama dentinária os tubos de dentina foram imersos em 3 mL de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA) 17% (Biodinâmica, Ibiporã, Paraná, Brasil), seguido de 3 mL de NaOCl 1% (ASFER). Após, a superfície externa dos tubos foi impermeabilizada por meio da aplicação de duas camadas de esmalte de unha (Colorama, L’Oréal Brasil Comercial de Cosméticos Ltda, RJ, Brasil). Todos os tubos de dentina foram esterilizados em autoclave a 121ºC por 24 minutos, mantidos hidratados em 10 mL de soro fisiológico estéril 0,85% (Eurofarma, São Paulo, SP, Brasil).
3.4.2 Formação do biofilme
O inóculo foi preparado a partir de uma única colônia de E. faecalis (ATCC 29212) (INCQS 00033, Coleção de Microrganismos de Referência em Vigilância Sanitária-CMRVS, FIOCRUZ-INCQS, Rio de Janeiro, RJ) em meio de cultura caldo Brain Heart Infusion (BHI) (KASVI, Curitiba, Paraná, Brasil). Previamente à formação do biofilme no interior dos canais radiculares, foi realizada uma curva de crescimento bacteriano e a determinação da relação
entre a leitura de Densidade Ótica de culturas desta linhagem bacteriana, obtida em espectrofotômetro à 550 nm (DO550), e o número de unidades formadoras de colônias
(UFCs)/mL. Para tanto, uma cultura estática de E. faecalis em Trypticase Soy Broth (TSB) (KASVI) foi mantida a 37oC, da qual alíquotas foram retiradas em intervalos de tempo
regulares, e a leitura da DO550 foi determinada em espectrofotômetro ou leitora de microplacas.
No momento em que a cultura entrou em fase exponencial de crescimento, diluições decimais sucessivas da mesma foram realizadas em solução salina estéril 0,85% (Eurofarma) e alíquotas foram plaqueadas em placas de petri contendo ágar BHI (KASVI). Após incubação a 37oC, foi
realizada a contagem de UFCs, que permitiu a determinação do número de UFC/mL e a relação UFC/mL x DO550 específica para E. faecalis.
A formação do biofilme no interior dos canais foi realizada em condições assépticas. Os tubos de dentina esterilizados foram imersos individualmente em tubos Eppendorf contendo 1 mL de inóculo, preparado a partir de uma cultura overnight de E. faecalis 1% em caldo BHI e sacarose 0,2% (KASVI). Os tubos foram armazenados em estufa a 37ºC por 7 dias, sendo o meio de cultura renovado diariamente. Após este período os tubos de dentina foram imersos em 1 mL de soro fisiológico e agitados com o auxílio de um vórtex, por 10 segundos, para a remoção das bactérias não aderidas ao biofilme.
3.4.3 Grupos experimentais e medicações
Após o período de contaminação, os tubos de dentina foram aleatoriamente divididos em três grupos (n=14), de acordo com a medicação empregada: G1) Ca(OH)2; G2) óleo
essencial Lemon Tea Tree 5%; e G3) controle - solução salina 0,85% (Eurofarma).
Para a obtenção da pasta de Ca(OH)2, foram espatulados 2 gramas de Ca(OH)2
Pró-Análise (P.A.) (Biodinâmica) associados à 70 gotas de veículo propilenoglicol, resultando em uma mistura com consistência de creme dental 27.
O óleo essencial extraído da planta Citrus Medica Limonun (Lefleuria Pure & Natural, USA) foi diluído em água destilada estéril de forma a se obter um líquido na concentração de 5%.
Os tubos de dentina foram imersos individualmente em tubos Eppendorf contendo 1 mL das medicações, aonde permaneceram por 7 dias, armazenados em estufa a 37ºC. Após este período, os tubos de dentina foram imersos em solução salina 0,85% (Eurofarma) e submetidos à agitação em vórtex, por 30 segundos, para a remoção de toda a medicação aderida à dentina. Em seguida, para permitir a determinação do efeito antimicrobiano imediato das medicações, o biofilme remanescente foi coletado por meio da limagem dos canais radiculares
com o auxílio de limas endodônticas K-file #80 (Dentsply Maillefer, Ballaigues, Suíça). As células bacterianas coletadas do biofilme foram inseridas em outro tubo Eppendorf contendo 1 mL de solução salina 0,85% (Eurofarma) estéril. Obteve-se, portanto, uma suspensão bacteriana, a qual foi processada para a análise da viabilidade bacteriana por meio da contagem de UFCs, conforme descrito a seguir.
Com o intuito de avaliar o efeito antimicrobiano residual das medicações, após a coleta do biofilme do canal radicular, os tubos de dentina foram inseridos em outro Eppendorf contendo 1 mL de BHI (KASVI) estéril e armazenados em estufa a 37ºC por mais 7 dias, com renovação diária do meio de cultura. Decorrido este período, os tubos foram submetidos novamente ao procedimento de limagem dos canais radiculares conforme descrito acima. Dessa forma, foram obtidas duas suspensões bacterianas: uma logo após o uso da medicação intracanal (suspensão 1 = S1), e outra, após o período de 7 dias sem medicação (suspensão 2 = S2).
3.4.4 Teste de viabilidade bacteriana – contagem de UFC
Imediatamente após a obtenção de cada suspensão bacteriana, foi realizado o teste de viabilidade bacteriana em 10 amostras de cada grupo, por meio da contagem de UFCs. A partir das suspensões bacterianas (S1 e S2) foram feitas diluições decimais sucessivas. Uma alíquota de 100 µL foi removida, pipetada e plaqueada sobre a superfície do ágar BHI (KASVI). As placas foram incubadas a 37ºC por 24 horas e decorrido este período foi feita a contagem de UFCs. O experimento foi realizado em duplicata.
Quatro tubos de dentina de cada grupo foram analisados em MEV, sendo dois tubos obtidos logo após a ação da medicação e os outros dois, logo após o período de espera de 7 dias. Para o processamento, os tubos de dentina foram clivados longitudinalmente, de forma a se obter duas hemissecções. As hemissecções foram fixadas em glutaraldeído, desidratadas, montadas em stubs e recobertas com ouro. A superfície da dentina radicular e a arquitetura do biofilme, quando presente, foi observada por meio de MEV, operando a 10 kW, com aumentos de 2.000x a 7.500x.
4.4.5 Análise estatística
O valor médio de UFC/mL para cada amostra foi determinado e os dados normalizados a partir da transformação em log10 de cada valor de UFC/mL. Com auxílio do software SPSS versão 21.0, foi avaliada a homogeneidade das variâncias pelo teste de Levene e a normalidade
dos resíduos pelo teste Shapiro-Wilk. Assim, para dados não paramétricos foi aplicado o teste Kruskal-Wallis para amostras independentes e o teste post hoc Dunn para a comparação dos pares. Os testes one way ANOVA e post hoc Tukey foram usados quando os dados apresentaram distribuição paramétrica. P valores < 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.
3.5 RESULTADOS
3.5.1 Efeito antimicrobiano imediato
Na figura 1 são mostrados os valores médios de células remanescentes viáveis do biofilme (log UFC), ou seja, células que permaneceram aderidas à dentina do canal radicular logo após o uso das medicações. Com a realização do teste de viabilidade bacteriana foi possível determinar que os biofilmes do grupo controle com solução salina 0,85% continham 5,56 x 105
UFCs por biofilme. Comparados a este, ambos os tratamentos foram efetivos na eliminação das células do biofilme de E. faecalis. Após o uso do Ca(OH)2,100% das células microbianas do
biofilme foram eliminadas (P < 0,001). Demonstrando ação antimicrobiana semelhante ao Ca(OH)2 (P = 0,324), o tratamento com o óleo essencial LTT 5% reduziu 96,31% das UFCs
comparadas ao controle (P < 0,004).
Nas figuras 2a-2f é possível verificar a arquitetura do biofilme presente nas amostras do grupo controle, a superfície dentinária livre de E. faecalis nas amostras tratadas com Ca(OH)2, e a presença de pequenos aglomerados bacterianos nas amostras tratadas com LTT
5%.
3.5.2 Efeito antimicrobiano residual
A análise do efeito antimicrobiano residual, ou seja, após o período de sete dias na ausência das medicações em contato com as paredes de dentina do canal radicular, demonstrou a permanência de células viáveis no biofilme de E. faecalis nas amostras do grupo controle (1,08 x 106 UFCs por biofilme) (Fig. 3).
A medicação Ca(OH)2 apresentou um efeito antimicrobiano residual significativo
quando comparado ao controle (P = 0,001), com uma redução de 79,31% de células viáveis de E. faecalis. O efeito antimicrobiano residual da medicação experimental LTT 5% foi semelhante ao promovido pelo Ca(OH)2 (P = 0,106). Contudo, a eliminação de 69,89% das
células viáveis de E. faecalis não foi significativa comparada ao controle não tratado, com solução salina 0,85% (P = 0,073) (Fig. 3).
As figuras 4a-4f apresentam a superfície dentinária do canal radicular recoberta com biofilme de E. faecalis nas amostras do grupo controle, e com alguns aglomerados bacterianos na superfície da dentina e no interior dos túbulos dentinários nas amostras tratadas com Ca(OH)2 e LTT 5%, após o período de 7 dias na ausência de medicação.
3.5.3 Influência do tempo na ação antimicrobiana das medicações
Na tabela 1 é comparado, para cada grupo, o número de células remanescentes viáveis do biofilme de E. faecalis logo após a remoção da medicação do canal radicular com o número de células viáveis que recolonizaram a superfície do canal radicular após o período de sete dias na ausência de medicação.
O grupo controle com solução salina 0,85% apresentou valores de UFCs (log UFC) semelhantes em ambos os períodos (P = 0,190). Tanto o Ca(OH)2 quanto o óleo essencial LTT
5% não mantiveram a efetividade da ação antimicrobiana com o passar do período de sete dias na ausência da medicação. A superfície do canal radicular, inicialmente descontaminada pela ação antimicrobiana do Ca(OH)2, que caracterizou-se pela erradicação do biofilme de E.
faecalis, foi recolonizada (2,24 x 105 UFCs) após o período de sete dias na ausência da
medicação (P = 0,014). Após o período de espera de sete dias sem o óleo essencial LTT 5% foi observado um aumento de 3,06 x 105 UFCs viáveis de E. faecalis na superfície do canal
Figura 1. Resultado do teste de viabilidade celular logo após o uso das medicações. Este gráfico de barras apresenta a distribuição das células viáveis remanescentes do biofilme de E. faecalis aderidas à dentina do canal radicular logo após o uso das medicações Ca(OH)2 e óleo essencial LTT 5% durante 7 dias. Sobre o eixo são apresentadas
as UFCs por biofilme, transformadas em log (log UFC). As barras de erros mostram o desvio padrão. Os asteriscos apontam as diferenças significativas comparadas ao controle não tratado, com solução salina 0,85%.
Figura 2. Fotomicrografias obtidas em MEV mostrando a superfície dentinária e a arquitetura dos biofilmes logo após a remoção das medicações. 2a-b) presença de denso e espesso biofilme recobrindo a superfície do canal radicular nas amostras não tratadas - controle (solução salina 0,85%); 2c-d) superfície dentinária livre de bactérias, logo após o tratamento com Ca(OH)2; 2e-f) presença de pequenos aglomerados bacterianos sobre a superfície
dentinária e penetrando o interior de alguns túbulos dentinários, após tratamento do biofilme com LTT 5%. (Magnitude 2.000 – 7.500 x).
Figura 3. Resultado do efeito antimicrobiano residual das medicações. Este gráfico de barras indica os valores de log UFC médios das células viáveis de E. faecalis que recolonizaram a dentina do canal radicular após sete dias da remoção das medicações Ca(OH)2 e óleo essencial LTT 5%. Sobre o eixo são apresentadas as UFCs por
biofilme, transformadas em log (log UFC). As barras de erros mostram o desvio padrão. Asteriscos apontam diferenças significativas comparadas ao controle não tratado, com solução salina 0,85%.
Figura 2. Fotomicrografias obtidas em MEV mostrando a superfície dentinária e a arquitetura dos biofilmes sete dias após a remoção das medicações. 4a-b) presença de denso e espesso biofilme recobrindo a superfície do canal radicular nas amostras não tratadas - controle (solução salina 0,85%); 4c-d) presença de aglomerados bacterianos penetrando o interior de alguns túbulos dentinários, após tratamento do biofilme com Ca(OH)2; 4e-f) presença de
aglomerados bacterianos na superfície dentinária e penetrando o interior de alguns túbulos dentinários, após tratamento do biofilme com LTT 5%. (Magnitude 4.300 – 7.000 x).
Tabela 1. Influência do tempo na ação antimicrobiana das medicações. São apresentados os valores médios de UFCs de E. faecalis coletadas da superfície do canal radicular logo após a remoção das medicações e após sete dias na ausência das medicações.
Teste de viabilidade bacteriana (UFCs) Medicações
Período Ca(OH)2 LTT 5% Controle
Imediato 0 a 2,05 x 104 a 5,56 x 105 a
Residual 2,24 x 105 b 3,26 x 105 b 1,08 x 106 a
Letras minúsculas diferentes na mesma coluna indicam diferença significativa.
3.6 DISCUSSÃO
O presente estudo avaliou, ex vivo, o efeito antimicrobiano imediato e residual de diferentes compostos sobre o biofilme de E. faecalis estabelecido na dentina do canal radicular de dentes bovinos. O emprego desses dentes é necessário e de extrema relevância, uma vez que possibilita a obtenção de resultados mais próximos da realidade clínica. Dentes bovinos são uma opção plausível, sendo rotineiramente utilizados em diversas pesquisas da área odontológica 28-30, visto que apresentam semelhança morfológica e histológica aos dentes humanos 31, 32. Assim, evita-se variabilidade, uma vez que a dentina humana e a bovina possuem
diâmetro e número dos túbulos dentinários por mm² semelhantes proporcionalmente. Logo, desde que sejam utilizados preparos padronizados, a dentina bovina é um substituto adequado para a dentina humana 31, 32 .
Para o estabelecimento do biofilme, os canais radiculares foram inoculados com E. faecalis, o qual permaneceu em contato com as paredes dentinárias durante 7 dias. O período de formação do biofilme é bastante diversificado entre os estudos relatados na literatura, variando normalmente de 24 horas a 30 dias 33, 34. Contudo, biofilmes de 7 dias são amplamente empregados quando o intuito é avaliar o efeito antimicrobiano de soluções irrigadoras e curativos intracanal 35, 36. Além disso, a espécie bacteriana E. faecalis foi escolhida, visto que está frequentemente relacionada aos casos de insucesso do tratamento endodôntico, devido a sua capacidade de formação de biofilme e alta resistência frente aos agentes antimicrobianos, como o curativo intracanal à base de Ca(OH)2 37, 16.
A metodologia empregada nesta pesquisa, baseada na contagem de UFCs, com o intuito de verificar a viabilidade de células remanescentes do biofilme após o uso das medicações, já
foi validada em outras investigações 38- 40. Embora haja relatos de que esta análise possa
superestimar a eficácia dos agentes antimicrobianos, devido a presença de células bacterianas
metabolicamente inativas ou de células viáveis, mas não cultiváveis 41, um estudo recente
demonstrou que o método de contagem de CFU é válido, sensível, e apresenta alta correlação
com o teste molecular de análise do DNA bacteriano 42 quando o objetivo é avaliar a viabilidade
celular após o tratamento do biofilme.
Os biofilmes do grupo controle, ou seja, as células microbianas expostas à solução salina 0,85%, apresentaram uma estrutura uniforme, que recobriu toda a superfície da dentina do canal radicular. As células apresentaram-se enclausuradas na matriz extracelular e o número de microrganismos permaneceu constante ao longo do experimento, considerando os dois momentos de coleta das suspensões para plaqueamento (Fig. 2a-b e 4a-b). Já é sabido que a solução salina 0,85% não apresenta poder antibacteriano e não possui capacidade de dissolução de matéria orgânica, sendo, portanto, empregada como controle em diversos estudos 43-49.
No presente trabalho, após a permanência do curativo de Ca(OH)2 no canal radicular
em contato direto com as células bacterianas, o biofilme de E. faecalis foi erradicado. Achados de estudos prévios demonstram que um período de 7 dias de ação do Ca(OH)2 sobre o biofilme
já seria suficiente para eliminar ou reduzir a quantidade de microrganismos e toxinas que possam ter permanecido após o preparo químico-mecânico 50,51. A taxa de redução microbiana observada na maioria dos estudos varia entre 24,25% 52 e 100% 53, 11. O Ca(OH)
2 é amplamente
utilizado em endodontia como medicação intracanal, principalmente em razão da sua atividade antimicrobiana, que ocorre devido ao alto pH 9. Tal propriedade justifica os achados do presente estudo. Os elevados valores de pH promovem danos irreparáveis às células, sendo responsáveis pela inibição do sistema enzimático, desnaturação de proteínas e pelo dano à parede celular e ao DNA bacteriano 54.
O efeito residual apresentado pelo Ca(OH)2 caracterizou-se pela redução de 79,31% das
células viáveis, quando comparado ao controle. De acordo com estudos 55,56, testes bacteriológicos deveriam ser realizados após, no mínimo, 48 a 96 horas, da intervenção endodôntica, visto que as amostras obtidas imediatamente após os procedimentos antissépticos podem não refletir as condições microbiológicas reais do sistema de canais radiculares. Um estudo clínico prévio, no qual coletas bacteriológicas foram realizadas após 72 horas da remoção do curativo de Ca(OH)2, demonstrou resultado semelhante ao presente trabalho, com
uma eliminação de 70% dos microrganismos 57. Os resultados de uma pesquisa mais recente, no qual a coleta microbiológica foi realizada após o período de 7 dias da remoção do Ca(OH)2,
Embora o Ca(OH)2 tenha apresentado ação antimicrobiana residual comparado ao
controle não tratado, quando feita a comparação intragrupo, ou seja, quando comparado o número de UFCs presentes logo após a remoção do Ca(OH)2 com o número de UFCs após 7
dias da remoção da medicação, um aumento significativo de UFCs por biofilme foi observado, evidenciando a recolonização do canal radicular por microrganismos remanescentes. Uma possível explicação pode ser a permanência das bactérias nos túbulos dentinários 58, 11, em regiões não alcançadas pela medicação 14. No momento em que o Ca(OH)
2 foi removido do
canal radicular e o meio de cultura estéril foi mantido por mais 7 dias, microrganismos que se alojaram no interior dos túbulos podem ter se multiplicado e alcançado a luz do canal novamente, conforme evidenciado na análise em MEV (Fig. 4c-4d). Cabe ressaltar que a capacidade de invasão dos túbulos, juntamente com a habilidade para formar biofilmes e resistir a altos valores de pH são um dos principais mecanismos de resistência do E. faecalis 9, 59. Outra provável justificativa que permitiu e/ou facilitou a recolonização bacteriana pode ter sido a capacidade de tamponamento apresentada pela dentina, que reduz a efetividade antimicrobiana do Ca(OH)2 60. O alto pH apresentado pelo Ca(OH)2 é reduzido pelo efeito tampão da dentina,
ou seja, enquanto o Ca(OH)2 estavapresente nos canais, valores maiores de pH podem ter se
mantido constantes ou terem sido pouco reduzidos, o que provocou a erradicação das bactérias. Contudo, após sua remoção dos canais, a dentina pode ter restabelecido seus valores normais de pH e o efeito antimicrobiano do Ca(OH)2 foi reduzido 60, permitindo que as bactérias que
penetraram a profundidade da dentina recolonizassem a superfície do canal. Estes achados vão ao encontro dos resultados anteriores 11, os quais também demonstraram erradicação de E. faecalis logo após a remoção do Ca(OH)2 e um aumento bacteriano significativo na luz dos
canais 7 dias após a remoção da medicação.
Os óleos essenciais têm ganhado destaque na área médica e odontológica em razão das suas propriedades antifúgica 61, antiviral 62 e antimicrobiana 63,64 sendo equivalente à clorexidina e ao NaOCl contra o E. faecalis 65. Neste estudo, logo após o tratamento do biofilme com o óleo essencial LTT 5%, foi observada uma redução de 96,31% das UFCs comparado ao grupo controle. Este achado vai ao encontro de um estudo prévio, no qual foi avaliada a atividade antimicrobiana do óleo essencial e do Ca(OH)2 também contra o biofilme de E.
faecalis estabelecido nos canais radiculares 25. Os autores demonstraram que ambas as
medicações erradicaram o biofilme após a permanência nos canais por sete dias. Os resultados de um estudo semelhante, no qual outros óleos essenciais foram testados contra o biofilme,
indicaram que estes compostos poderiam ser empregados como medicação intracanal, em razão da capacidade de inibição do crescimento do biofilme de E. faecalis após 12 horas de contato66.
Uma investigação recente demonstrou que o óleo essencial Citrus Lemon Tea Tree é mais efetivo na eliminação de bactérias, comparado ao óleo Tea Tree de Melaleuca Alternifolia, mais efetivo contra fungos. Tais óleos, quando associados, demonstraram efeito sinérgico, ou seja, sua aplicação combinada revelou um aumento na atividade antimicrobiana. Os autores incentivaram o uso de oléos essenciais para a prevenção e tratamento de doenças bucais 21. A
ação antimicrobiana apresentada pelo óleo essencial LTT 5% pode ser justificada pelos danos causados às bactérias, inicialmente afetando a tensão interfacial nos lipídios constituientes da parede celular bacteriana e das mitocôndrias e, posteriormente, destruindo o restante das estruturas bacterianas 67.
O efeito residual da medicação experimental LTT 5% foi aproximado ao promovido pelo Ca(OH)2. Contudo, a eliminação de 69,89% das células viáveis de E. faecalis promovida
pelo LTT 5% não foi significativa comparada ao controle com solução salina 0,85%. Uma possível explicação para a eliminação parcial do biofilme de E. faecalis após o uso da medicação intracanal pode estar associada à própria resistência dos microrganismos quando estruturados na forma de biofilme. Nessa organização, os microrganismos apresentam-se fenotipicamente e fisiologicamente diferentes dos planctônicos 68. Ainda, a matriz extracelular polimérica produzida pelas células microbianas durante o processo de maturação do biofilme 69 pode ter servido como uma barreira química 70 e dificultado a difusão das partículas do óleo LTT no interior do biofilme. Uma vez que a difusão é o mecanismo de transporte dominante nos biofilmes, a mobilidade e a biodisponibilidade das partículas ativas do óleo irão depender, em grande parte, do coeficiente de difusão, o qual está relacionado ao tamanho das partículas e às características físico-químicas, assim como da natureza do biofilme 71. Além disso, uma inadequada interação entre o óleo e a parede celular bacteriana durante o período de 7 dias em que a medicação permaneceu no interior do canal radicular pode ter dificultado sua ação.
Quando feita a comparação intragrupo, ou seja, quando avaliada a influência do tempo sobre o efeito antimicrobiano da medicação LTT 5%, foi observado um aumento significativo de 5 log UFCs por biofilme entre os dois períodos de coleta bacteriológica, semelhante ao apresentado pelo Ca(OH)2. Até o presente momento, não foram evidenciados na literatura
trabalhos que tenham avaliado o efeito antimicrobiano do óleo essencial LTT 5% sobre o biofilme de E. faecalis após 7 dias da sua remoção. Portanto, esses resultados possivelmente sejam justificados com base nos mesmos argumentos mencionados para o Ca(OH)2, no que diz
respeito à capacidade dos microrganismos de se alojarem na profundidade dos túbulos dentinários e, após se multiplicarem, alcançarem a luz do canal novamente (Fig. 4e-4f). Somam-se a isso, os mecanismos de resistência do E. faecalis 9, 58.
Diante dos resultados obtidos, abre-se uma perspectiva de uso do óleo essencial LTT como medicação intracanal. Ainda assim, outros experimentos são necessários, a fim de testar outras concentrações, avaliar a efetividade do óleo contra um biofilme multiespécies, analisar seu efeito citotóxico e também suas propriedades biológicas.
3.7 CONCLUSÃO
Este estudo mostrou que tanto o óleo essencial Lemon Tea Tree 5% como o Ca(OH)2,
empregado na forma de medicação intracanal, foram capazes de eliminar de maneira expressiva as células bacterianas do biofilme de E. faecalis estabelecido na dentina do canal radicular de dentes bovinos. Embora não tenha impedido a recolonização bacteriana do canal radicular, assemelhando-se à ação do Ca(OH)2, o LTT 5% pode ser considerado um potencial candidato
à agente antibiofilme para uso na terapia endodôntica.
3.8 REFERÊNCIAS
1 Siqueira JF Jr, Rôças, Clinical implications and microbiology of bacterial persistence after treatment procedures. Journal of Endodontics 2008; 34:1291– 1301.
2 Rodrigues RCV, Zandi H, Kristoffersen AK, Enersen M, Mdala I, Ørstavik D etal. Influence of the Apical Preparation Size and the Irrigant Type on Bacterial Reduction in Root Canal–treated Teeth with Apical Periodontitis. J Endod 2017. 3 Nair PNR, Henry S, Cano V, Vera J. Microbial status of apical root canal
system of human mandibular first molars with primary apical periodontitis after ‘‘one-visit’’ endodontic treatment. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 2005;99: 231–352.
4 Mah TF, O’Toole GA. Mechanisms of biofilm resistance to antimicrobial agents. Trends Microbiol 2001; 9: 34–9.
5 Deonizio MA, Teixeira BD, Gabardo ML, Batista A, Kowalczuck A, Sydney G. Influence of calcium hydroxide dressing and two irrigants on the filling of artificial lateral canals. Indian Journal Dent Res 2015; 26: 588.
6 Valverde ME, Baca P, Ceballos L, Fuentes MV, Ruiz-Linares M, Ferrer-Luque CM. Antibacterial efficacy of several intracanal medicaments for endodontic therapy. Dent Mater Journal 2017.
Comparative Evaluation of Antimicrobial Activity of QMiX, 2.5% Sodium Hypochlorite, 2% Chlorhexidine, Guava Leaf Extract and Aloevera Extract Against Enterococcus faecalis and Candida albicans - An in-vitro Study. J Clin Diagn Res 2016; 10: 20-23.
8 Valera MC, Oliveira SA, Maekawa LE, Cardoso FG, Chung A, Silva SF et al. Action of Chlorhexidine, Zingiber officinale, and Calcium Hydroxide on Candida albicans, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, and Endotoxin in the Root Canals. Journal Contemp Dent Pract 2016; 17: 114–8
9 Byström A, Sundqvist G. Bacteriologic evaluation of the efficacy of mechanical root canal instrumentation in endodontic therapy. Scand J Dent Res 1981; 89:321– 328.
10 Sukawat C, Srisuwan T. A Comparison of the Antimicrobial Efficacy of Three Calcium Hydroxide Formulations on Human Dentin Infected with Enterococcus faecalis. J Endod 2002; 28: 102–104.
11 Lima RKP, Guerreiro-Tanomaru JM, Faria-Júnior NB, Tanomaru-Filho M. Effectiveness of calcium hydroxide-based intracanal medicaments against Enterococcus faecalis. Int Endod J 2012; 45: 311–6.
12 Ricucci D, Siqueira JF. Biofilms and Apical Periodontitis: Study of Prevalence and Association with Clinical and Histopathologic Findings. J Endod 2010; 36: 1277–1288.
13 Sundqvist G, Figdor D, Persson S, Sjögren U. Microbiologic analysis of teeth with failed endodontic treatment and the outcome of conservative re-treatment. Oral Surgery, Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endodontology 1998; 85: 86– 93.
14 Love RM. Enterococcus faecalis: a mechanism for its role in endodontic failure. Int. Endod. J. 2001;34:399-405.
15 Evans M, Davies JK, Sundqvist G, Figdor D. Mechanisms involved in the resistance of Enterococcus faecalis to calcium hydroxide. Int Endod J 2002; 35: 221–228.
16 Saatchi M, Shokraneh A, Navaei H, Maracy MR, Shojaei H. Antibacterial effect of calcium hydroxide combined with chlorhexidine on Enterococcus faecalis: a systematic review and meta-analysis. J Appl Oral Sci; 22: 356–65.
17 Samadi N, Zaree R, Bakhtiar H, Salehnia A, Azimi S. Comparative antibacterial efficacy of endemic satureja khuzistanica jamzad essential oil, sodium
hypochlorite and chlorhexidine gluconate solutions as root canal irrigations. Dent Res J (Isfahan) 2011; 8: 28–32.
18 Cecchini, C. et al. Antimicrobial Efficacy of Achillea ligusticaAll. (Asteraceae) Essential Oils against Reference and Isolated Oral Microorganisms. Journal Chemistry & Biodiversity 2012;1:12-24.
19 Quintas, V. et al. Antiplaque Effect of Essential Oils and 0.2% Chlorhexidine on an In Situ Model of Oral Biofilm Growth: A Randomised Clinical Trial. Plos one 2015;
20 Shetty et al. Antimicrobial effects of Citrus sinensis peel extracts against dental caries bacteria: An in vitro study. Journal of clinical and experimental dentistry 2016; 8: 71-77.
21 Nikolić MM, Jovanović KK, Marković TL, Marković DL, Gligorijević NN, Radulović SS et al. Antimicrobial synergism and cytotoxic properties of Citrus limon L., Piper nigrum L. and Melaleuca alternifolia (Maiden and Betche) Cheel essential oils. J Pharm Pharmacol 2017.
22 Gounaris Y. Biotechnology for the production of essential oils, flavours and volatile isolates. A review. Flavour Fragr. J. 2010; 25: 367–386.
23 Lücker J, Bouwmeester HJ, Aharoni A. Metabolic engineering of terpenoid biosynthesis in plants. In: Applications of Plant Metabolic Engineering. 2007: 219–236.
24 Miguel MG. Antioxidant activity of medicinal and aromatic plants. A review. Flavour Fragr. J. 2010; 25: 291–312.
25 Rubiolo P, Sgorbini B, Liberto E, Cordero C, Bicchi C. Essential oils and volatiles: Sample preparation and analysis. A review. Flavour Fragr. J. 2010; 25: 282–290.
26- Abbaszadegan A, Dadolahi S, Gholami A, Moein MR, Hamedani S, Ghasemi Y et al. Antimicrobial and Cytotoxic Activity of Cinnamomum zeylanicum, Calcium Hydroxide, and Triple Antibiotic Paste as Root Canal Dressing Materials. J Contemp Dent Pract 2016; 17: 105–13.
27 Porfírio EM, Melo HM, Pereira AMG, Cavalcante TTA, Gomes GA, de Carvalho MG et al. In Vitro Antibacterial and Antibiofilm Activity of Lippia alba Essential Oil, Citral, and Carvone against Staphylococcus aureus. Scientific World Journal 2017.
endotoxinas bacterianas em canais radiculares com polpa necrosada e avaliação dos efeitos citotóxicos. Tese (Doutorado em Odontologia Restauradora) – Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, 2010.
29 Arias, M.P. et al. Effect of ultrasonic streaming on intra-dentinal disinfection and penetration of calcium hydroxide paste in endodontic treatment. Journal of Applied Oral Science 2016; 6:575-581.
30 Pereira, T. C. Intratubular disinfection with tri-antibiotic and calcium hydroxide pastes. Acta Odontologica Scandinavica 2017; 75: 87-93.
31 Schilke R, Lisson J, Bauss O et al. Comparison of the number and diameter of dentinal tubules in human and bovine dentine by scanning electron microscopic investigation. Journal Archives of oral biology 2000; 50:355-361.
32 Campos, I. DA C. M.; Campos, C. N.; Vitral, R. W. F. O Uso de Dentes Bovinos como Substitutos de Dentes Humanos em Pesquisas Odontológicas: Uma Revisão da Literatura. Pesquisa Brasileira em Odontopediatria e Clínica Integrada 2008; 8: 127-132.
33 Wang Z, Shen T, Haapasalo M. Effectiveness of endodontic disinfecting olutions against young and old Enterococcus feacalis biofilms in dentin canals. J. Endod. 2012;38:1376-9.
34 Du X, Huang C, Frencken JE, Yang T. Inhibition of early biofilm formation by glass-ionomer incorporated with chlorhexidine in vivo: a pilot study. Aust Dent J 2012;57:58-64.
35 DE Almeida, J., Santos, G. V., Orsi, M. T., Cechella, B. C., Bernardi, A. V., Felippe, W. T. Treatment of the Enterococcus faecalis root canal biofilm with nanoparticle suspensions and conventional irrigants. Arquivos em Odontologia 2015; 51: 32-38.
36 Del Carpio-Perochena AE, Bramante CM, Duarte MA, Cavenago BC, Villas-Boas MH, Graeff MS, et al. Biofilm dissolution and cleaning ability of different irrigant solutions on intraorally infected dentin. J Endod. 2011;37:1134-8.
37 Basrani B, Tjaderhane L, Santos JM, et al. Efficacy of chlorhexidine- and calcium hydroxide-containing medicaments against Enterococcus faecalis in vitro. Oral Surgery Oral Medicine Oral Pathology Oral Radiology Endodontics 2003; 96:618 –624.
YAG irradiation, antibacterial photodynamic therapy and sodium hypochlorite treatment on Enterococcus faecalis biofilms. Int Endod J 2012; 45: 482–491.
39 Rahimi S, Shahi S, Gholizadeh S, Shakouie S, Rikhtegaran S, Soroush Barhaghi MH et al. Bactericidal effects of Nd:YAG laser irradiation and sodium hypochlorite solution on Enterococcus faecalis biofilm. Photomed Laser Surg 2012; 30: 637–41.
40 Chen X, Li P, Wang X, Gu M, Zhao C, Sloan AJ et al. Ex vivo antimicrobial efficacy of strong acid electrolytic water against Enterococcus faecalis biofilm. Int Endod J 2013; 46: 938–946.
41 Moher D, Liberati A, Tetzlaff J, Altman D. Preferred reporting items for systematic reviews and meta-analyses: the PRISMA statement. Int J Surg 2010;8.
42 de Almeida, J., Hoogenkamp, M., Felippe, W. T., Crielaard, W., van der Waal, S. V. Effectiveness of EDTA and Modified Salt Solution to Detach and Kill Cells from Enterococcus faecalis Biofilm. Journal of Endodontics 2016; 42: 320-323.
43 Pappen FG, Shen Y, Qian W, Leonardo MR, Giardino L, Haapasalo M. In vitro antibacterial action of Tetraclean, MTAD and five experimental irrigation solutions. Int Endod J 2010; 43: 528–535.
44 Soares JA, Roque de Carvalho MA, Cunha Santos SM, Mendonça RMC, Ribeiro-Sobrinho AP, Brito-Júnior M et al. Effectiveness of Chemomechanical Preparation with Alternating Use of Sodium Hypochlorite and EDTA in Eliminating Intracanal Enterococcus faecalis Biofilm. J Endod 2010; 36: 894– 898.
45 Dagna A, Arciola CR, Florindi F, Scribante A, Saino E, Visai L et al. In vitro evaluation of antimicrobial efficacy of endodontic irrigants. Int J Artif Organs 2011; 34: 914–9.
46 Case PD, Bird PS, Kahler WA, George R, Walsh LJ. Treatment of root canal biofilms of enterococcus faecalis with ozone gas and passive ultrasound activation. J Endod 2012; 38: 523–526.
47 Tirali RE, Bodur H, Ece G. In vitro antimicrobial activity of Sodium hypochlorite, Chlorhexidine gluconate and Octenidine Dihydrochloride in elimination of microor- ganisms within dentinal tubules of primary and permanent teeth. Med Oral Patol Oral Cir Bucal 2012; 17.
48 Xie Q, Johnson BR, Wenckus CS, Fayad MI, Wu CD. Efficacy of berberine, an antimicrobial plant alkaloid, as an endodontic irrigant against a mixed-culture biofilm in an in vitro tooth model. J Endod 2012; 38: 1114–1117.
49 Guerreiro-Tanomaru JM, Nascimento CA, Faria-Junior NB, Graeff MSZ, Watanabe E, Tanomaru-Filho M. Antibiofilm activity of irrigating solutions associated with cetrimide. Confocal laser scanning microscopy. Int Endod J 2014; 47: 1058–1063.
50 Shuping G, Orstavik D, Sigurdsson A, Trope M. Reduction of Intracanal Bacteria Using Nickel-Titanium Rotary Instrumentation and Various Medications. J Endod 2000; 26: 751–755.
51 Siqueira JF, Paiva SSM, Rôças IN. Reduction in the Cultivable Bacterial Populations in Infected Root Canals by a Chlorhexidine-based Antimicrobial Protocol. J Endod 2007; 33: 541–547.
52 Manzur A, González AM, Pozos A, Silva-Herzog D, Friedman S. Bacterial Quantification in Teeth with Apical Periodontitis Related to Instrumentation and Different Intracanal Medications: A Randomized Clinical Trial. J Endod 2007; 33: 114–118.
53 McGurkin-Smith R, Trope M, Caplan D, Sigurdsson A. Reduction of intracanal bacteria using GT rotary instrumentation, 5.25% NaOCl, EDTA, and Ca(OH)2. J Endod 2005; 31: 359–363.
54 Siqueira JF, Lopes HP. Mechanisms of antimicrobial activity of calcium hydroxide: A critical review. Int. Endod. J. 1999; 32: 361–369.
55 Leonardo, M. R., Leal, J. M., Lia, R. C. C., Martins, J. C. R. Filosofia do tratamento de canais radiculares. Necropulpectomia: conceituação. In: Leonardo MR, Leal JM. Endodontia: tratamento de canais radiculares. 3th ed. São Paulo: Panamericana; 1998:127-57.
56 Soares, J. A., Leonardo, M. R., Silva, L. A. B., Tanomaru filho, M., Ito, I. Y. Effect of biomechanical preparation and calcium hydroxide pastes on the antisepsis of root canal systems in dogs. Journal of Applied Oral Science 2005; 13: 93-100.
57 Faria, G., Nelson-Filho, P., Freita, A. C., Assed, S., Ito, I. Y. Antibacterial effect of root canal preparation and calcium hydroxide paste (calen) intracanal dressing in primary teeth with apical periodontitis. Journal of Applied Oral Science 2005; 13: 351-355.
