UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE – UFF INSTITUTO DE QUÍMICA – IQ
QUÍMICA INDUSTRIAL
ANA CHRISTINA SILVA DE OLIVEIRA
DETERMINAÇÃO DE POLIFENÓIS TOTAIS EM VINHOS POR ESPECTROFLUORIMETRIA
NITERÓI - RJ 2016
ANA CHRISTINA SILVA DE OLIVEIRA
DETERMINAÇÃO DE POLIFENÓIS TOTAIS EM VINHOS POR ESPECTROFLUORIMETRIA
Monografia de final de curso apresentada ao Curso de Graduação em Química Industrial da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Bacharel em Química Industrial.
Orientadora: Profa. Dra. Flávia Ferreira de Carvalho Marques Coorientadora: Profa. Dra. Raquel Andrade Donagemma
NITERÓI - RJ 2016
O 48 Oliveira, Ana Christina Silva de
Determinação de polifenóis totais em vinhos por espectrofluorimetria/ Ana Christina Silva de Oliveira. - Niterói: [s. n.], 2016.
49f.
Trabalho de Conclusão de Curso – (Bacharelado em Química Industrial) – Universidade Federal Fluminense, 2016.
1. Composto fenólico. 2. Vinho. 3. Espectroscopia de fluorescência. 4. Método analítico. I. Título.
Agradecimentos
Primeiramente a Deus, que sempre esteve comigo e me deu tudo o que tenho. Obrigada por me fortalecer a cada dia e me dar razões para continuar.
Às professoras Flávia Marques e Raquel Donagemma pela orientação na elaboração dessa pesquisa. Muito obrigada pelo suporte, auxílio e por me permitir usufruir dos equipamentos do Laboratório de Química Analítica Fundamental e Aplicada (LaQAFA). Aos amigos do LaQAFA que tornaram este período de pesquisa o mais agradável possível.
Aos meus pais, Myrian e Waldecy que sempre me apoiaram e acreditaram em mim. Sempre me incentivaram em todos os momentos para que esse sonho se tornasse realidade. Muito obrigada pelo amor, carinho e apoio. Amo vocês!
À minha querida irmã Ana Claudia, que sempre traz alegria ao meu dia. Obrigada pela compreensão todas as vezes que tive que negar algum evento por causa dos afazeres da universidade. Obrigada pela sua amizade e companheirismo.
À minha avó Almerinda, que desde sempre cuidou de mim como uma filha e sempre esteve por perto quando precisei. Obrigada por sempre acreditar em mim e sempre sonhar com meu sucesso.
Aos meus queridos amigos da UFF que tornaram esses anos incríveis. Obrigada por todas as risadas, brincadeiras, e a relação de parceria que construímos. Aos queridos amigos que fiz durante o intercâmbio e contribuíram para que eu tivesse os 16 meses mais intensos da vida. Obrigada por tudo que vivemos juntos e todas as memórias que escrevemos. As minhas amigas que moraram comigo durante esses anos em Niterói. Obrigada por serem minha família do lado de cá da baía.
Resumo
Os compostos fenólicos são responsáveis pela cor, aroma e sabor nos vinhos e sucos de uva. Estes apresentam propriedades antioxidantes importantíssimas que vem sendo estudadas para a prevenção de doenças como o mal de Alzheimer e Parkinson. Existe então, a necessidade que a determinação de compostos fenólicos seja estudada e novos métodos sejam desenvolvidos para tal análise. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um método simples para determinação de polifenóis totais por espectrofluorimetria. As condições analíticas otimizadas foram: soluções da amostra e padrão preparadas em água ultrapura e solução tampão Britton-Robinson pH 8,5 e varredura normal com medições dos sinais fluorescentes em exc / em = 280/360 nm. O método analítico foi validado demonstrando linearidade na faixa de 0,01 a 0,3 mg L-1. Os limites de detecção e quantificação foram 0,003 e 0,01 mg L-1 respectivamente. Repetitividade e precisão intermediária com RSD menores que 1,6% demonstrando boa precisão do método. A viabilidade e exatidão do método foram avaliadas através dos testes de recuperação (n=3) do analito nas amostras de vinho branco e tinto na faixa de 98 a 101% indicando exatidão e aplicabilidade apropriada. O método foi aplicado na quantificação de polifénois totais em amostras de vinhos brancos e tintos de várias marcas e o resultado foi expresso em mg equivalentes de ácido gálico (EAG) L-1. A determinação quantitativa foi realizada de forma direta, sem tratamento das amostras. O índice de polifenóis totais em vinhos tintos variou de 71 a 110 mg EAG L-1 e em vinhos brancos de 58 a 60 mg EAG L-1. O método desenvolvido apresentou bom potencial para determinação de polifenóis totais em amostras de vinhos tintos e brancos.
Abstract
Phenolic compounds are responsible for the color, flavor and taste in wine and grape juices. Those present very important antioxidant characteristics that have been being used for studies to prevent diseases like Alzheimer and Parkinson. In this way, there is the necessity to improve the determination of phenolic compounds to suggest a new method to develop this kind of analysis. Along these lines, the aim of this project was to develop a new method for the determination of total polyphenols using spectrofluorimetry. The optimized analytical conditions were: sample and standard solutions prepared in ultrapure water and Britton-Robinson buffer pH 8.5; normal scanning with fluorescent measureaments at exc / em = 280/360 nm. The analytical method was validated showing linearity from 0.01 to 0.03 mg L-1. The detection and quantification limits were 0.003 and 0.01 mg L-1 respectively. Repeatability and intermediate precision presented RSD lower than 1,6% showing a good precision of the method. The viability and accuracy were verified through recuperation tests (n=3) presenting results from 98% to 101% showing a good accuracy and applicability. The method was applied in the quantification of total polyphenols in red and white wine from different brands and the results were expressed in mg acid gallic equivalent (GAE) L-1.The analysis could be done without treating the samples. The analysis showed the presence of gallic acid in wine and juice samples. In red wine, the index of total polyphenol content varies from 71 to 110 mg GAE L-1. To white wine it was found a concentration between 58 and 60 mg GAE L-1. The method developed showed itself a good potential to the total polyphenol content in red and white wine samples.
Keywords: Spectrofluorimetry, wines, total polyphenols content.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO 13
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA 14
2.1. Produção do vinho 14
2.1.1. Aspectos importantes na produção de vinho tinto 14 2.1.2. Aspectos importantes na produção de vinho branco 15
2.1.3. Fermentação alcoólica 15
2.2. Qualidade do Vinho 16
2.3. Compostos Fenólicos 16
2.4. Antioxidantes e sua função no combate à doenças 19
2.5. Métodos de análise 20 2.6. Espectrofluorimetria 21 3. OBJETIVOS E JUSTIFICATIVAS 25 3.1. Objetivos 25 3.1.1. Objetivo geral 25 3.1.2. Objetivos específicos 25 3.2. Justificativas 25
4. MATERIAIS, REAGENTES, SOLUÇÕES, INSTRUMENTAÇÃO E MÉTODOS
26
4.2. Amostras 27 4.3. Instrumentação e condições para medidas
espectrofluorimétricas
27
4.4. Tratamento de rejeitos 28
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 29
5.1. Estudo da influência solvente 29
5.2. Estudo da influência do pH 30
5.3. Estudo da influência do tratamento fotoquímico 31 5.4. Estudo da influência da proporção água ultrapura:tampão
Britton-Robinson
33
5.5. Condições finais experimentais otimizadas para a determinação espectrofluorimetria do ácido gálico
34
5.6. Obtenção dos parâmetros analíticos de mérito 38
5.7. Aplicação do método analítico 39
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS 41 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 42
Lista de Figuras
Figura 1: Estrutura básica de um flavonóide. 17
Figura 2: Estrutura de um tanino hidrolisável. 18
Figura 3: Estrutura do ácido gálico. 18
Figura 4: Diagrama simplificado do processo de fluorescência. 21 Figura 5: Modelo simplificado de um espectrofluorímetro. 24 Figura 6: Espectrofotômetro de Fluorescência Varian modelo Cary Eclipse. 28 Figura 7: Espectros de excitação e emissão fluorescente de (a) solução aquosa de ácido gálico 1,0 mg L-1 e (b) água ultrapura (branco). Medições feitas em fenda de 10 nm e λexc/λem = 280/ 360 nm.
29
Figura 8: Espectros de excitação e emissão fluorescentes da solução aquosa de ácido gálico 1,0 mg L-1 preparada em tampão Britton-Robinson em diferentes valores de pH: (a) 7,0; (b) 8,0; (c) 8,5; (d) 9,0; (e) 10,0; (f) 11,0. Medições feitas em fenda de 10 nm e λexc/λem = 280/ 360 nm.
31
Figura 9: Espectros de excitação e emissão fluorescente (λexc = 280 nm e λem = 360 nm, fenda de 10 nm) da solução aquosa de ácido gálico 1,0 mg L-1, após diferentes tempos de irradiação UV: (a) 0 min; (b) 15 min; (c) 30 min, sendo os espectros da água ultrapura (branco) apresentados em (d).
32
Figura 10: Espectros de excitação e emissão fluorescente (λexc = 280 nm e λem = 360 nm, fenda de 10 nm) de soluções de ácido gálico 1,0 mg L-1 preparadas em água ultrapura:tampão Britton Robinson pH 8,5 nas seguintes proporções (% v/v): (a) 100% tampão; (b) 3:7; (c) 1:1; (d) 7:3; (e) 9:1.
33
Figura 11: Curva analítica para as soluções de ácido gálico em água ultrapura: tampão Britton-Robinson pH 8,5(1:1 % v/v). Medições em λem = 360 nm; fenda de 10 nm.
Lista de Tabelas
Tabela 1: Efeito da irradiação UV no sinal fluorescente do ácido gálico 1,0 mg L-1. Medições realizadas em fenda de 10 nm e λexc/λem = 280/ 360 nm.
32
Tabela 2: Resumo das condições experimentais selecionadas para determinação espectrofluorimétrica do ácido gálico.
34
Tabela 3: Recuperações obtidas na amostras de vinhos tintos e branco. 37 Tabela 4: Parâmetros analíticos de mérito do método desenvolvido por espectrofluorimetria.
38
Tabela 5: Determinação de polifenóis totais em vinhos tintos em equivalentes de ácido gálico.
39
Tabela 6: Determinação de polifenóis totais em vinhos brancos em equivalentes de ácido gálico.
Lista de Siglas e Abreviaturas
IBRAVIN – Instituto Brasileiro do Vinho LD – Limite de Detecção
LQ – Limite de Quantificação
OIV – International Organization of Vine and Wine
LaQAFA – Laboratório de Química Analítica Fundamental e Aplicada CLAE – Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência
CG – Cromatografia Gasosa
exc – Comprimento de onda de excitação
em – Comprimento de onda de emissão
EAG – Equivalentes de ácido gálico IPT – Índice de polifenóis totais
1. INTRODUÇÃO
Os vinhos são obtidos através do processo de fermentação alcoólica da uva madura e fresca ou do suco de uva fresco. Fatores como o tipo de tratamento pelos quais as uvas são submetidas durante o processo de produção, o tipo de solo e o clima da região em que as uvas são cultivadas afetam diretamente a composição do vinho (AQUARONE, 2001).
Os vinhos são conhecidos pelo alto teor de polifenóis totais em sua composição. Estes agem como antioxidantes, impedindo a destruição de células, além de influenciar diretamente na sua qualidade (DALLABRIDA, 2008). O estudo da determinação de polifenóis totais em matrizes alimentícias é de extrema relevância, pois a ingestão de alimentos ricos nestes compostos pode auxiliar no tratamento de doenças causadas pela degeneração de células.
Atualmente, a determinação de polifenóis totais em vinhos pode ser feita através de métodos espectrofotométricos, cromatográficos (geralmente associados aos espectrofotométricos), eletroquímicos e pelo uso de biossensores (ARCHELA, 2013). Estes têm se mostrado eficazes em seus objetivos, porém ainda apresentam algumas limitações como a degradação da amostra, elevado consumo de reagentes e o alto tempo de reação (ZAIA et al, 1998).
Visto a importância do estudo de polifenóis totais, este trabalho tem por objetivo desenvolver, validar e implementar um novo método de determinação destes em vinhos por espectrofluorimetria, buscando eliminar as limitações dos métodos atuais.
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1. Produção do vinho
O vinho é obtido através do processo de fermentação alcoólica da uva madura e fresca ou suco de uva fresco e sua composição está relacionada com a origem das uvas; ou seja, o tipo de solo, clima, região onde são cultivadas e o tipo de tratamento pelos quais estas são submetidas durante o processo de produção e conservação do vinho (AQUARONE, 2001).
2.1.1. Aspectos importantes da produção de vinho tinto
Numa produção convencional de vinho tinto a extração de sólidos dos cachos de uva geralmente é feita por maceração e acompanha a fermentação alcoólica. A intensidade da maceração determina fatores importantes para a qualidade do vinho. Um exemplo disso é a cor característica do vinho tinto, causada pela intensa maceração. Embora vinhos brancos e champanhes também envolvam o processo de maceração da casca, como nestes o processo é feito por menos tempo e menor intensidade, o pigmento presente na casca não é transferido ao suco em larga escala. Assim como os pigmentos, compostos fenólicos também são transferidos da casca para o suco. Assim, a intensidade da maceração deve ser ajustada ao tipo de vinho que se quer produzir (RIZZON et al, 2009).
A qualidade da uva também influencia diretamente na qualidade do vinho, determinando qual será a composição de compostos fenólicos, teor de açúcar e acidez. Assim, o tempo da colheita também deve ser estipulado para que a uva tenha atingido maturidade suficiente para cumprir seus objetivos na produção de vinho (SANTOS, 2007).
Resumidamente a produção de vinho tinto se define em quatro etapas: processos mecânicos da colheita (esmagamento, desengace e enchimento de tanques); processos no reator (fermentação alcoólica primaria e maceração); drenagem (separação do vinho e do bagaço por desengorduramento) e fermentações finais (exaustão do açúcar restante por fermentação alcoólica e maloláctica) (RIBÉREAU-GAYON et al, 2006).
2.1.2. Aspectos importantes na produção de vinho branco
Diferentemente do vinho tinto, o vinho branco é obtido a partir da fermentação alcoólica do suco sem a presença dos sólidos e essa é a principal distinção entre a produção dos dois tipos de vinho. Assim, a produção de vinhos brancos pode ser feita com uvas tintas desde que essas sejam prensadas antes da fermentação de forma que não passem pigmentação ao suco (GÓES, 2005).
Outro fator importante é que na produção de vinho branco a etapa de maceração é praticamente nula e ocorre na ausência de álcool, na etapa de pré-fermentação. Como não existe a etapa de maceração propriamente dita, a etapa de pré-fermentação age delimitando a passagem de compostos responsáveis pelas qualidades e defeitos da uva (RIZZON et al, 2009).
A produção de vinho branco se resume nas seguintes etapas: Pré-fermentação (colheita, esmagamento, prensa e clarificação); processos no reator (fermentação alcoólica e maloláctica); transfega; classificação e filtração (RIBÉREAU-GAYON et al, 2006).
2.1.3. Fermentação Alcoólica
A história do vinho é tão antiga que tem relação com as primeiras reações químicas percebidas pelo homem através do processo de fermentação alcoólica. Esta é um processo biológico que ocorre em substratos açucarados, no qual estes se transformam em etanol e dióxido de carbono. Microrganismos podem catabolizar açúcares com o fim de produzir energia química celular por vias aeróbia e anaeróbia. Assim, chama-se de fermentação alcoólica, quando uma molécula de sacarose é oxidada produzindo etanol e gás carbônico, como mostra a Equação 1 (STEINLE, 2013).
C6H12O6 2CH3CH2OH + 2CO2 Equação 1: Fermentação alcoólica
As leveduras, organismos eucariotos pertencentes a classe dos fungos, são os microrganismos mais utilizados na fermentação alcoólica. Devido a sua anatomia, as
pode ser degradada por meio de uma sequencia de reações em cadeia ativadas por enzimas específicas (SILVA, 2007).
2.2. Qualidade do Vinho
si ei . 8 de 1 88 de ine e vin e id id e e men çã c ó ic d m s sim es de v sã esc e m d ”. Segundo o Art. 8º da mesma lei, o vinho pode ser caracterizado com base em sua classe, cor, e teor de açúcar, levando em conta fatores característicos de cada caracterização como teor alcoólico, pela presença de bolhas e variedade da uva (BRASIL, 1988).
A composição do vinho consiste em basicamente 86% de água, 12% de etanol, 1% de glicerol, 0,4% ácidos orgânicos e 0,1% de taninos e fenólicos. Os taninos são polímeros de outros compostos químicos presentes no vinho. Mudanças na estrutura dos taninos gera uma alta influencia no envelhecimento, na cor, no corpo e no sabor do vinho (BRUNNING, 2015). A composição está associada a origem das uvas pelo qual foi produzido. Fatores como o tipo de solo, o tipo de tratamento que se dá as uvas durante a produção e o clima da região em que são cultivadas determinam a proporção desses compostos no vinho. Assim, dependendo da origem da uva o vinho será uma boa fonte de compostos fenólicos que apresentam propriedades antioxidantes (SANTOS, 2007).
2.3. Compostos fenólicos
Compostos fenólicos são basicamente aqueles que possuem uma ou mais hidroxilas ligadas ao anel benzênico. Apesar de terem a função que denomina álcoois, estes são mais ácidos do que álcoois de cadeia alifática. Compostos fenólicos podem se associar entre si e formar compostos mais complexos que seus respectivos originais. A composição dos compostos fenólicos em uvas também pode depender do meio ambiente, época da colheita, processamento e armazenamento. Gerando assim, diferentes propriedades nas uvas e consequentemente nos vinhos. (ARCHELA et al, 2013).
Compostos fenólicos em geral são relacionados a qualidade do vinho por influenciarem na cor, aroma, corpo, estabilidade oxidativa e sabor. Sua presença também denota as maiores diferenças entre vinhos brancos e tintos já que espera-se que estes tenham um maior teor de compostos fenólicos em geral. Além disso, compostos fenólicos também são conhecidos por suas propriedades antioxidantes que acredita-se serem eficazes na prevenção de doenças por combaterem a oxidação das células. Por estes motivos, o teor de compostos fenólicos em vinhos é recorrentemente estudado (CABRITA et al, 2014).
Os polifenóis são resultados de combinações das diversas estruturas dos compostos fenólicos existentes. Nos vinhos, os polifenóis estão representados, pelos os flavonóides e os taninos (BRUNNING, 2015). Os flavonóides são caracterizados pela estrutura de um difenil propano com dois anéis benzênicos ligados a um anel pirano (Figura 1). Essa estrutura básica varia de acordo com a quantidade de hidroxilas que podem estar ligadas a ela (BEHLING, 2004).
Figura 1: Estrutura básica de um flavonóide.
Os taninos podem ser hidrolisáveis ou condensados. Os hidrolisáveis consistem de ácidos elágicos glicosilados (Figura 2) e de ésteres de ácidos fenólicos. Estes após hidrólise ácida dão origem a pequenas moléculas. Já os condensados são polímeros e oligômeros formados pela policondensação de flavan-3-ol e flavan-3,4-diol (MONTEIRO, 2005).
Figura 2: Estrutura de um tanino hidrolisável.
O ácido gálico (Figura 3) é um sólido orgânico cristalino de cor branca ou levemente amarelado. Este é um dos ácidos fenólicos presentes no vinho, na classe dos taninos. Na natureza é encontrado em plantas e frutos como a uva. Pode ser obtido pela hidrólise do ácido tânico com ácido sulfúrico ou através da extração em planta (POLEWSKI et al, 2005).
Figura 3: Estrutura do ácido gálico.
O ácido gálico, assim como outros ácidos fenólicos, tem propriedades antioxidantes e é muito importante na indústria farmacêutica, na produção de papel, corantes e tintas e como antioxidante na indústria de alimentos. Assim como outros compostos fenólicos, este também é transmitido para o vinho no processo de fermentação (ZHENG & WANG, 2001).
O ácido gálico demonstra atividade antifúngica e antiviral. Também age como antioxidante na prevenção da destruição de células. Especificamente apresentou citoxidade no combate à células cancerosas, no entanto, sem prejudicar células saudáveis. Também pode ser utilizado como adstringente em casos de hemorragia interna e no
2.4. Antioxidantes e sua função no combate à doenças
Em plantas e seres vivos ocorrem reações de oxidação vitais para o bom funcionamento do organismo. Estas começam pela ação dos radicais livres, no entanto, quando acontecem em larga escala podem causar um tipo de dano conhecido como stress oxidativo. Nesses casos, substâncias antioxidantes são de grande importância porque elas agem impedindo a reação de oxidação no sistema em questão. A presença de radicais livres em excesso pode gerar reações de oxidação destruindo as células do organismo, o que é o princípio de muitas doenças como o câncer, mal de Parkinson, doenças cardiovasculares e o mal de Alzheimer (FERREIRA & ABREU, 2007).
A importância dos antioxidantes é tanta que similares sintéticos começaram a ser produzidos. Porém indícios de problemas causados provavelmente por estes já começaram a serem detectados e mais pesquisas a respeito de antioxidantes naturais vem sendo realizadas (DONNELLY & ROBINSON, 1995).
Dentre as muitas formas que os antioxidantes podem agir, no corpo humano estes podem reduzir os níveis de colesterol oxidado. Antioxidantes são capazes de doar hidrogênios à radicais livres o tornando inertes por ressonância. Assim, os radicais livres são reduzidos por meio dessa neutralização (DALLABRIDA, 2008).
2.5. Métodos de análise
Vários métodos para identificação e quantificação de compostos fenólicos em alimentos têm sido desenvolvidos. Esses métodos são baseados em diferentes princípios e são usados para quantificar polifenóis totais, determinar um composto específico ou uma classe de fenólicos.
Existem algumas metodologias descritas para a determinação de compostos fenólicos por cromatografia. A cromatografia gasosa (CG) (LAMIKANRA et al, 1996) e a cromatografia a líquido a de alta eficiência (CLAE) (DUTRA et al, 2010) por exemplo, são técnicas usadas tanto na separação quanto na quantificação de fenólicos. Os métodos
eletroanalíticos, usam as propriedades elétricas dos analitos presentes em uma amostra provendo resultados quantitativos e qualitativos (OLIVEIRA-ROBERTH et al, 2012).
Os métodos espectrofotométricos são os mais utilizados na determinação de polifenóis totais. Estes medem quantitativamente as propriedades de reflexão ou transmissão de uma amostra em função do comprimento de onda. Porém independente do tipo de reagente utilizado, não são métodos específicos, pois detectam todos os grupos fenólicos presentes no extrato (NACZK & SHAHIDI, 2004).
O método de Folin-Ciocalteau tem sido usado como método oficial pela International Organization of Vine and Wine na determinação de compostos fenólicos totais em vinhos. Este método utiliza uma mistura de ácido fosfotúngstico (H3PW12O40) e ácido fosfomolíbdico (H3PMo12O40 que tem a função de oxidar os compostos fenólicos presentes no vinho. Após a oxidação, a mistura é reduzida ao óxidos azuis de Molibdênio (Mo8O23) e Tungstênio (W8O23). Essa solução pode ser determinada por espectrofotometria já que apresenta absorção máxima em 750 nm (INTERNATIONAL ORGANIZATION OF VINE AND WINE, 2016).
Apesar de muito eficiente o método de Folin-Ciocalteau apresenta algumas desvantagens em relação a espectrofluorimetria. A técnica de Folin-Ciocalteau necessita de operações múltiplas enquanto que a técnica de espectrofluorimetria necessita apenas da diluição da amostra. Por ser um método que utiliza reações intermediárias, a técnica de Folin-Ciocalteau causa alterações químicas na amostra o que não ocorre por espectrofluorimetria. A técnica de Folin-Ciocaleteau necessita de um período de incubação entre a adição dos reagentes, o que deixa o processo mais lento. Em oposição, na técnica de espectrofluorimetria as amostras podem ser preparadas e lidas em seguida deixando o processo mais rápido (ZAIA et al, 1998).
Quando a determinação é espectrofotométrica, os polifenóis totais são expressos em equivalentes de ácido gálico ou outro composto fenólico. Isso se dá devido a impossibilidade da técnica de determinar a presença de um ou grupo de fenólicos. A ampla variedade de compostos fenólicos em vinhos dificulta a determinação dos mesmos.
Fatores como a dificuldade de extração, a presença de interferentes e complexidade química da matriz também dificultam sua determinação em matrizes alimentícias (ARCHELA, 2013).
Assim, faz-se uma estimativa da concentração dos fenólicos e o resultado é apresentado como o índice de polifenóis totais (IPT). Muitos compostos fenólicos podem ser usados como padrão, o critério de escolha envolve a estabilidade e a abundância no composto na matriz. No método de Folin-Ciocalteau, por exemplo, para vinhos o índice de polifenóis totais é determinado em equivalentes de ácido gálico (EAG) visto que este é um ácido fenólico proeminente e representativo no vinho (ONIVOGUI et al, 2014).
2.6. Espectrofluorimetria
A espectrofluorimetria, é o método que utiliza a fluorescência para caracterizar ou medir substâncias químicas. A medida que uma molécula absorve um fóton, esta é promovida para um estado de maior energia chamado de estado singleto (S1). Se esta não absorver nenhum fóton, permanece no estado fundamental singleto (S0). Assim, denomina-se então fluorescência quando uma molécula transita de um estado excitado de energia para o estado fundamental liberando fótons com o mesmo número quântico de spin (Figura 4) (AYOLOTU, 2012).
Quando uma molécula é excitada, esta muda para níveis vibracionais mais altos de um nível eletrônico, assim o excesso de energia pode ser dissipado levando o fluoróforo para o fundamental singleto excitado. Devido a relaxação que ocorre durante o processo, o espectro de emissão é obtido independente do comprimento de onda de excitação e assim os espectros de fluorescência vão estar deslocados para comprimentos de onda maiores, ou seja, de menor energia do que os da banda de absorção. Dessa forma, a banda emissão será uma imagem especular da banda de absorção, com seu máximo em comprimentos de onda maiores também que os da banda de absorção. Chama-se esse deslocamento de deslocamento de Stokes (LIMA, 2012).
Alguns fatores como a estrutura da molécula, temperatura, solvente utilizado e o pH da solução influenciam a fluorescência de uma amostra. No caso do solvente, por exemplo, sua polaridade e viscosidade podem aumentar ou diminuir o sinal fluorescente. A quantidade de elétrons deslocalizados também interfere na fluorescência, quanto maior a população destes, maior será o potencial fluorescente da amostra. Assim, na determinação do procedimento experimental deve se considerar aspectos como a escolha do solvente e do pH da solução pois dentre outros, estes podem alterar o sinal de fluorescência (VO-DINH, 1984).
Moléculas orgânicas, principalmente aromáticas como o acido gálico, apresentam elétrons em sistemas deslocalizados, acarretando em forte luminescência. Quando não se tem heteroátomos na estrutura, as transições eletrônicas geralmente envolvem a promoção de um eletron de um orbital ligante para um orbital antiligante . Dá-se a este processo o nome de transição – e ao estado eletrônico resultante de estado excitado *. Em alguns casos, tem-se o estado eletrônico chamado de estado excitado n . Estes ocorrem quando na presença de heteroátomos no sistema conjugado, um estado eletrônico pode resultar da promoção de um elétron de orbital ligante n para um orbital antiligante (HURTUBISE, 1990).
A partir técnica de espectrofluorimetria é possível se obter espectros de emissão molecular através da excitação do analito em comprimentos de onda específicos. Uma vez que uma fonte de energia incide o analito, se obtêm a excitação da amostra no seu
onda maior de emissão. Diferenças de energia entre os estados vibracionais no estado fundamental e no estado excitado são as mesmas, isso acarreta na sobreposição das imagens de excitação e emissão em espectros fluorescentes (HARRIS, 2001).
Num processo de fluorescência, espera-se um aumento da intensidade de fluorescência à medida que se aumenta a concentração da amostra. Quando se observa um decréscimo, tem-se um processo chamado Queenching. Este pode ocorrer durante o estado excitado como o queenching colisional e transferências de energia. O quenching colisional por exemplo, acontece quando o fluoróforo excitado entra em contato com uma molécula que facilita transições do estado fundamental. O queenching também pode ocorrer no estado fundamental através da formação de complexos. O queenching estático ocorre quando o fluoróforo forma um complexo estável com outra molécula (HOF et al, 1997). Para saber um pouco mais sobre a contribuição da fluorescência para reações do estado excitado pode analisar o rendimento quântico. Este definido pelo símbolo ΦF, é medido pela razão entre numero de fótons emitidos pelo numero total de fótons absorvidos (LIMA, 2012).
Um espectrofluorímetro é formado por um conjunto de componentes conforme apresentado na Figura 5.
A fonte de luz gera um alto nível de radiação visível e ultravioleta. Essa radiação deve atingir o colimador onde será absorvida e orientada na direção da fenda. Esta limita a passagem de radiação determinando quanto da mesma chegará a amostra. O monocromador de excitação seleciona o comprimento de onda em que a amostra será incidida. Depois que a amostra é incidida pela radiação, esta passa por outra fenda e pelo monocromador de emissão até chegar ao detector que coletará a informação direcionando-a ao computador (AYOLOTU, 2012).
Figura 5: Modelo simplificado de um espectrofluorímetro (AYOLOTU, 2012).
Fonte de luz Colimador Fenda Monocromador
Amostra Fenda
Monocromador Detector
3. OBJETIVOS E JUSTIFICATIVAS
3.1. Objetivos
3.1.1. Objetivo geral
Desenvolver e validar um novo método analítico para determinação de polifenóis totais em vinhos tintos e brancos por espectrofluorimetria.
3.1.2. Objetivos específicos
Estudar as características fluorescentes da molécula do ácido gálico para obtenção de condições experimentais que proporcionem uma melhor sensibilidade ao método espectrofluorimétrico;
Validar o método analítico para a determinação do índice de polifenóis totais; Aplicar o método analítico desenvolvido na determinação do índice de polifenóis
totais em diferentes amostras de vinhos tintos e brancos.
3.2. Justificativas
A presença de compostos fenólicos em vinhos caracteriza aspectos importantes da sua qualidade. Além disso, estes também podem agir como antioxidantes combatendo a degeneração de células prevenindo doenças. Por isso, existe a necessidade de serem feitos testes analíticos de determinação dos mesmos.
Os métodos existentes são eficientes, porém, com algumas desvantagens, em relação ao proposto por este trabalho. O método aqui descrito propõe inovação através da determinação de compostos fenólicos por meio da espectrofluorimetria de forma simplificada, sem a necessidade de reações de derivatização.
4. MATERIAIS, REAGENTES, SOLUÇÕES, INSTRUMENTAÇÃO E MÉTODOS
Este trabalho foi realizado no Instituto de Química da Universidade Federal Fluminense (UFF), no laboratório de Química Analítica Fundamental e Aplicada (LaQAFA). Todos os reagentes, materiais e equipamentos necessários foram cedidos pelo mesmo.
4.1. Materiais, reagentes e soluções
A água ultrapura (18,2 MΩcm) utilizada para o preparo de todas as soluções aquosas foi obtida a partir do sistema de purificação de água Arium Bagtanks, Sartorius, Alemanha. Padrão de ácido gálico hidratado (Sigma-Aldrich, EUA), ácido clorídrico P.A. (Vetec, Brazil), hidróxido de sódio (Merck, Brasil), etanol (Vetec, Brasil) e metanol (J.T.Baker, EUA) foram utilizados na otimização do método espectrofluorimétrico. Ácido bórico (Vetec, Brasil), ácido fosfórico (Vetec, Brasil) e ácido acético (Vetec, Brasil) foram utilizados no preparo do tampão Britton-Robinson aplicado no estudo do pH.
Para a otimização do método espectrofluorimétrico foi utilizada solução padrão de ácido gálico 0,06 mg L-1, obtida a partir da diluição de solução estoque 1 mg L-1 em água ultrapura, HCl 0,1 mol L-1, NaOH 0,1 mol L-1 e tampão Britton-Robinson em diferentes valores de pH.
O tampão Britton-Robinson foi preparado com a mistura de partes iguais das soluções de ácido fosfórico 0,04 mol L-1, ácido acético 0,04 mol L-1 e ácido bórico 0,04 mol L-1 com adições de volume adequado de NaOH 0,1 mol L-1 para atingir o pH desejado com o auxílio de um pHmetro (DM-22, Digimed, Brasil).
O estudo do efeito da radiação ultravioleta foi realizado com a solução aquosa de ácido gálico 1,0 mg L-1. Esta solução foi colocada em tubos de quartzo (1,9 cm de diâmetro e 13,7 cm de altura) e posicionada no centro do reator fotoquímico por 15 e 30
carcaça de forno elétrico e está muito bem descrito na referência de Gouvêa e colaboradores (GOUVÊA et al, 2014).
Após a otimização do método, a partir da solução estoque 1,0 mg L-1 preparada em água ultrapura a cada dia de análise, foram feitas diluições em água ultrapura: solução tampão Britton-Robinson pH 8,5 1:1 % v/v, e soluções de 0,01; 0,02; 0,04; 0,06; 0,08; 0,1; 0,2; 0,3 mg L-1 foram utilizadas na construção das curvas analíticas.
4.2. Amostras
Amostras de vinho tinto (A, B, C, D, E), vinho branco (F, G, H, I) de diferentes fabricantes foram adquiridas em estabelecimentos comerciais localizados nas cidades do Rio de Janeiro e Niterói.
Nenhum preparo de amostra foi necessário. Somente uma diluição na razão 1:2000, utilizando a mistura água ultrapura:solução tampão Britton-Robinson pH 8,5 1:1 % v/v, foi realizada para que a concentração obtida estivesse dentro da faixa linear da curva analítica.
4.3. Instrumentação e condições para as medidas espectrofluorimétricas
O estudo da fluorescência do ácido gálico foi realizado no espectrofluorímetro da marca VARIAN, modelo Cary Eclipse (Figura 6), tendo como fonte de excitação uma lâmpada pulsátil do tipo descarga de xenônio, com 80 Hz e 12 watts. O equipamento apresenta abertura de fenda (banda espectral de passagem) variando de 1,5 a 20 nm e seu detector, um fotomultiplicador PMT R928, tem resposta que detecta radiação até 900 nm. A aquisição de dados e controle do equipamento foi feita com o sistema operacional SWEclipse® Bio Pack V 1.1 (XP WIN2000) software.
Neste trabalho, bandas espectrais de passagem de 10 ou 20 nm com velocidade de varredura de 1200 nm s-1 e cubetas de quartzo com caminho óptico de 1 cm foram usadas para as medições espectrofluorimétricas.
As medidas foram sempre realizadas nos comprimentos de onda máximos de excitação ( exc = 280 nm) e emissão ( em = 360 nm) do ácido gálico. Os valores dos sinais dos brancos também foram medidos para que fossem feitos os cálculos dos valores líquidos referentes ao sinal fluorescente do analito.
Figura 6: Espectrofotômetro de fluorescência da Varian, modelo Cary Eclipse.
4.4. Tratamento de rejeitos
Como foram apenas usados solventes e analitos não nocivos ao meio ambiente, não foi necessário nenhum tratamento de rejeitos.
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nesta Seção serão mostrados os resultados encontrados em todas as etapas do desenvolvimento do método.
Foram realizados estudos para otimização do sinal analítico, através da avaliação de parâmetros como solvente, pH do meio e irradiação ultravioleta, com o objetivo de verificar a influência destes no sinal fluorescente do ácido gálico e garantir maior seletividade e sensibilidade ao método.
5.1. Estudo da influência do solvente
As características do solvente afetam diretamente a fluorescência de uma molécula, e os solventes com maior polaridade tendem a estabilizar os luminóforos no estado excitado, desfavorecendo a perda de energia por processos não radiativos como relaxação vibracional e cruzamento interssistemas, favorecendo a fluorescência (HURTUBISE, 1990).
A escolha do melhor solvente deve levar em consideração a solubilidade do analito no solvente a ser utilizado, o sinal de fundo (branco do solvente), custo e toxicidade. O primeiro solvente estudado foi a água ultrapura, no qual o ácido gálico apresentou excelente solubilidade e ótimo sinal fluorescente, como mostra a Figura 7.
Figura 7: Espectros de excitação e emissão fluorescente de (a) solução aquosa de ácido gálico 2,0 mg L-1 em pH 7 e (b) água ultrapura (branco). Medições feitas em fenda de 10
200 300 400 500 0 100 200 300 Comprimento de onda (nm) In te n si d ad e d e si n a l f lu o re sc en te ( u .a .) (a) (b)
Sendo assim, considerando a alta intensidade de sinal fluorescente obtida (Figura 7), além de todas as vantagens que o uso da água ultrapura como solvente traria para o método, tais como nenhuma toxicidade, baixo custo e alta solubilidade, optou-se por continuar em meio aquoso (e não mais estudar outros possíveis solventes) e investigar a influência do pH (Seção 5.2) na intensidade do sinal fluorescente.
5.2. Estudo da influência do pH
A forma como uma molécula se apresenta (com carga positiva, negativa ou neutra) está diretamente relacionada ao pH do meio. Portanto, este é um parâmetro muito importante na fluorescência, visto que geralmente moléculas eletricamente carregadas tendem a apresentar maior fluorescência devido à maior rigidez molecular (SKOOG, 2002).
Sendo assim, foi realizado um estudo das características fluorescentes de solução de ácido gálico 1,0 mg L-1 (pKa = 4,40) na faixa de pH compreendida entre 2 e 12, utilizando para isto solução tampão Britton-Robinson (Seção 4.1), mas as soluções de pH abaixo de 7 apresentaram um sinal não significativo e por isso não foram representadas.
Conforme pode ser visto na Figura 8, o analito apresentou os melhores sinais nos valores de pH 8,0; 8,5 e 9,0, sendo estes sinais muito similares, mostrando que o método pode apresentar boa robustez neste intervalo de pH. Sendo assim, o pH 8,5 (meio do intervalo entre 8,0 e 9,0) foi selecionado para prosseguir com o trabalho por se encontrar no meio desta faixa robusta. Vale ressaltar que os resultados das medições das soluções de ácido gálico em valores de pH menores que 7,0 não foram mostrados na Figura 8 porque apresentaram sinais próximos ao do branco.
Figura 8: Espectros de excitação e emissão fluorescentes da solução aquosa de ácido gálico 1,0 mg L-1 preparada em tampão Britton-Robinson em diferentes valores de pH: (a) 7,0; (b) 8,0; (c) 8,5; (d) 9,0; (e) 10,0; (f) 11,0. Medições feitas em fenda de 10 nm e λexc/λem = 280/ 360 nm.
5.3. Estudo da influência do tratamento fotoquímico
Apesar de já terem sido alcançados sinais analíticos bastante satisfatórios após o estudo do pH (Seção 5.2), neste trabalho também foi realizado um estudo do efeito da radiação UV sobre o sinal do ácido gálico com o intuito apenas de explorar um pouco mais as suas características luminescentes.
O uso da incidência de radiação UV sobre a solução do analito é um artifício bastante útil para tentar produzir derivados fotoquímicos com fluorescência maior do que a molécula original (ganho de sensibilidade para o método) e/ou tentar reduzir/ eliminar o sinal de potenciais interferentes. Por outro lado, o efeito contrário também pode ocorrer, ou seja, a irradiação por UV pode produzir derivados com menor eficiência quântica (SKOOG & HOLLER, 2002).
As soluções aquosas de ácido gálico 1,0 mg L-1 preparadas em tampão Britton-Robinson pH 8,5 foram condicionadas em tubos de quartzo e submetidas a diferentes
200 300 400 500 50 100 150 (a) (b) (d) (e) (f) Comprimento de onda (nm) In te n si d ad e d e si n al fl u o re sc en te (u .a .) 0 (c)
próprio laboratório (GOUVÊA, 2014). Os resultados obtidos estão na Tabela 1, na qual é possível observar uma queda considerável na intensidade do sinal fluorescente do analito quando exposto à irradiação por UV.
Tabela 1: Efeito da irradiação UV no sinal fluorescente do ácido gálico 1,0 mg L-1. Medições realizadas em fenda de 10 nm e λexc/λem = 280/ 360 nm.
Tempo na câmara de UV (min)
Sinal líquido fluorescente (u.a.)
0 220
15 0
30 0
Portanto, estes estudos demonstraram que o uso da irradiação por UV não foi vantajoso para o método, pois o sinal foi eliminado, conforme também pode ser visto nos espectros de excitação e emissão fluorescentes mostrados na Figura 9.
Figura 9: Espectros de excitação e emissão fluorescente (λexc = 280 nm e λem = 360 nm, fenda de 10 nm) da solução aquosa de ácido gálico 1,0 mg L-1, após diferentes tempos de irradiação por UV: (a) 0 min; (b) 15 min; (c) 30 min, sendo os espectros da água
200 300 400 500 0 100 200 300 Comprimento de onda (nm) In te n si d ad e d e si n a l f lu o re sc en te ( u .a .) (a) (b) (c) (d)
5.4. Estudo da influência da proporção água ultrapura:tampão Britton Robinson
Com o objetivo de uniformizar a porporção de água ultrapura e solução tampão Britton Robinson pH 8,5 que seria utilizada nas soluções de cada ponto das curvas analíticas, soluções de ácido gálico 1,0 mg L-1 foram preparadas em diferentes proporções (100% tampão; 1:1; 3:7; 7:3 e 9:1) de água ultrapura:tampão Britton Robinson pH 8,5 (% v/v).
Conforme pode ser visto na Figura 10, o maior sinal fluorescente foi obtido na solução preparada em 100% tampão pH 8,5. A Figura 10 também mostrou que quanto maior a diluição da solução tampão, menor o sinal. No entanto, a proporção 1:1 % v/v de água ultrapura:tampão Britton Robinson pH 8,5 foi selecionada, pois desta forma ficariam uniformes todas as soluções de cada ponto da curva analítica com relação a proporção de solução tampão e água ultrapura. Vale ressaltar que, apesar de o sinal analítico nesta condição não ser o maior, isto não é um problema porque a quantidade de polifenóis totais é extremamente alta nas amostras estudadas neste trabalho.
Figura 10: Espectros de excitação e emissão fluorescente (λexc = 280 nm e λem = 360 nm, fenda de 10 nm) de soluções de ácido gálico 1,0 mg L-1 preparadas em água ultrapura:tampão Britton Robinson pH 8,5 nas seguintes proporções (% v/v): (a) 100%
200 300 400 500 50 100 150 (a) (f) Comprimento de onda (nm) In te n si d ad e d e si n a l f lu o re sc en te ( u .a .) 0 200
5.5. Condições finais experimentais otimizadas para a determinação espectrofluorimétrica do ácido gálico
Após os estudos de otimização dos parâmetros principais para obtenção do melhor sinal analítico e, consequentemente, melhor sensibilidade, realizados nas Seções de 5.1 a 5.4, a Tabela 2 apresenta as condições finais obtidas.
Tabela 2: Resumo das condições experimentais selecionadas para determinação espectrofluorimétrica do ácido gálico.
Tipo de Varredura Normal
λexc/λem 280/360
pH 8,50
Solvente Água ultrapura: tampão Britton-Robinson (1:1 % v/v)
Como pode ser visto, o método desenvolvido apresenta condições experimentais que são extremamente simples, sendo esta uma grande vantagem que favorece a sua aplicação para a determinação dos compostos fenólicos totais em vinhos em equivalentes de ácido gálico (EAG).
5.6. Obtenção dos parâmetros analíticos de mérito
Os parâmetros analíticos de mérito foram obtidos de acordo com as condições estabelecidas na Tabela 2 e com o documento DOQ-CGCRE-008 ( O ien çã s e v id çã de m d s n í ic s”) d I METRO (BRASIL, 2011).
Para a obtenção dos parâmetros relacionados com a resposta linear, foram construídas três curvas analíticas e, para cada ponto da curva três medições foram
médio como resultado. Este estudo permitiu verificar uma faixa de resposta linear que se estendeu de 0,01 mg L-1 a 0,3 mg L-1, caracterizada pelo valor de R2 igual a 0,9995 (Figura 11).
Figura 11: Curva analítica para as soluções de ácido gálico em água ultrapura: tampão Britton-Robinson pH 8,5 (1:1 % v/v). Medições em λem = 360 nm; fenda de 10 nm.
A detectabilidade do método foi avaliada pelos valores de limite de detecção (LD) e de quantificação (LQ). No caso do LQ, foi considerado o primeiro ponto da curva analítica (0,01 mg L-1). Já o LD foi calculado dividindo-se o LQ por 3,33 (10/3). Foram obtidos os valores bastante satisfatórios de 0,003 mg L-1 e 0,01 mg L-1 para LD e LQ, respectivamente (MAGNUSSON et al, 2014).
A precisão foi avaliada em termos de repetitividade e precisão intermediária. A repetitividade é definida como a concordância entre os resultados de medições sucessivas efetuadas sob as mesmas condições de medição em um curto intervalo de tempo (BRASIL, 2011). Neste trabalho, a repetitividade foi avaliada através de 7 medições consecutivas, usando solução de ácido gálico de 0,1 mg L-1 (centro da curva
0 200 400 600 800 1000 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0.35 Intensidade do si na l fluor esc ente (u.a .)
analítica) em água ultrapura: tampão Britton-Robinson pH 8,5 (1:1 % v/v). O resultado obtido produziu um desvio padrão relativo de 1,2%, sendo este valor considerado satisfatório, pois é menor que o valor máximo permitido (5%).
A precisão intermediária diz respeito à concordância obtida entre resultados utilizando o mesmo método e laboratório podendo-se variar uma ou mais condições de análise (BRASIL, 2011). Neste trabalho, a precisão intermediária foi avaliada através de 7 medições independentes de solução de ácido gálico 0,1 mg L-1 em água ultrapura: tampão Britton-Robinson pH 8,5(1:1 % v/v), realizadas pelo mesmo analista em dias diferentes. O teste t-Student (nível de confiança de 95%) foi usado para comparar as médias do sinal líquido fluorescente obtidas em dias diferentes. O valor de tcalculado (0,775) obtido foi menor que o valor de tcrítico (2,780), sendo assim, pode-se concluir que não existe diferença entre as médias dos sinais fluorescentes obtidos em dias diferentes, e, portanto, o método apresenta boa precisão intermediária.
A viabilidade do método foi verificada através de ensaios de recuperação. Amostras de vinho tinto e branco em triplicatas foram fortificadas com concentração conhecida de ácido gálico (0,06 mg L-1) e as recuperações foram obtidas através da seguinte equação: Recuperação (%) = [(C1-C2)/C3]*100, em que C1 é a concentração do analito na amostra fortificada; C2 é a concentração dos analito na amostra não fortificada e C3 é a concentração dos analito adicionado na amostra. A recuperação média do ácido gálico nas amostras variou de 98% a 101% (Tabela 3), representando um resultado satisfatório aferindo viabilidade ao método desenvolvido (BRASIL, 2011).
Tabela 3: Recuperações obtidas na amostras de vinhos branco e tinto. Amostraa Média (n = 3) da intensidade sinal fluorescente (u.a.) Desvio-padrão Índice de polifenóis totais (EAG mg L-1)b Recuperação média (%) Vinho branco 79 0,5 0,026 Fortificada com 0,06 mg L-1 241 0,4 0,086 101 Vinho tinto 133 0,7 0,046 Fortificada com 0,06 mg L-1 292 0,6 0,105 98
aApós diluição de 2000 vezes em água ultrapura: tampão Britton-Robinson pH 8,5(1:1 % v/v) b
Expresso em equivalentes de ácido gálico (EAG)
A Tabela 4 apresenta os parâmetros analíticos de mérito calculados para o método desenvolvido neste trabalho.
Tabela 4: Parâmetros analíticos de mérito do método desenvolvido por espectrofluorimetria.
Parâmetros analíticos de mérito Ácido gálico
Equação da curva analítica Y = 2700,8*X + 3,1548
Coeficiente de determinação (R2) 0,9995
Faixa linear (mg L-1) 0,01 – 0,3
LD(mg L−1) 0,003
LQ(mg L−1) 0,01
Repetitividade(DPR%, n = 7) 1,2%
Precisão Intermediária (teste t-Student; 95% confiança; n = 14 , 2 dias)
tcalculado (0,775) < tcrítico (2,780)
Recuperação média (n = 3) 98 -101%
5.7. Aplicação do método analítico
O método analítico espectrofluorimétrico desenvolvido neste trabalho nas condições otimizadas mostradas na Tabela 2, foi aplicado para determinar o índice de polifenóis totais (expresso em EAG) das amostras de vinhos, conforme descrito na Seção 4.2.
Vale ressaltar que o índice de polifenóis totais nos vinhos foi expresso em equivalentes de ácido gálico, pois há uma grande variedade de polifenóis neste tipo de amostra, impedindo que sejam quantificados individualmente, já que a fluorimetria não é um método seletivo. Portanto, é comum o uso de um composto fenólico como padrão de quantificação (como o ácido gálico) e que represente o total de polifenóis na amostra. (ARCHELA, 2013).
De acordo com a literatura, o índice de polifenóis totais em vinhos pode variar de 60 a mais de 1000 mg L-1 em equivalentes de ácido gálico. Este valor pode variar em larga escala de acordo com o tipo de uva, solo, meios de produção e clima da região em que a uva foi cultivada (STRATIL et al, 2008; ZHU et al, 2014).
Obviamente, para a obtenção do valor do índice de polifenóis totais na amostra é necessário considerar a diluição realizada. Neste trabalho, a diluição foi na razão de 1:2000, de forma que cada valor de fluorescência obtido foi multiplicado por 2000 para obter-se o valor real do índice de polifenóis totais. Os resultados obtidos estão descritos nas Tabelas 5 e 6.
Tabela 5: Determinação de polifenóis totais em vinhos tintos em equivalentes de ácido gálico.
Amostras de vinho tinto
Índice de polifenóis totais na amostra diluída (EAG mg L-1) *
Índice de polifenóis totais na amostra inicial (EAG mg L-1)
A 0,046 91
B 0,052 103
C 0,055 110
D 0,039 79
E 0,035 71
Tabela 6: Determinação de polifenóis totais em vinhos brancos em equivalentes de ácido gálico.
Amostras de vinho branco
Índice de polifenóis totais na amostra diluída (EAG mg L-1) *
Índice de polifenóis totais na amostra inicial (EAG mg L-1) F 0,029 59 G 0,030 60 H 0,029 58 I 0,029 59
* Diluído por um fator de 2000 vezes.
As Tabelas 5 e 6 mostram os resultados obtidos para o índice de polifenóis totais em equivalentes de ácido gálico nas amostras diluídas e nas amostras originais pelo método proposto neste trabalho. Pôde-se observar que mesmo diluindo-se a amostra em 2000 vezes é possível se fazer uma determinação eficaz. Reafirma-se também pelas Tabelas 5 e 6 a boa escolha do ácido gálico como padrão na análise visto sua proeminência na amostra.
Como esperado, o índice de polifenóis totais em vinhos tintos é maior do que o índice de polifenóis totais em vinhos brancos. Conforme citado na Seção 2, isso se deve ao fato de na casca se encontrar a maior parte dos compostos fenólicos, que também se fazem presente no corpo da uva em si (RIZZON et al, 2009). A medida que a casca fica em contato com o suco na etapa de fermentação, durante a produção do vinho tinto, os compostos fenólicos passam da casca para o suco deixando neste um alto índice de polifenóis totais (Ribéreau-Gayon et al, 2006).
Além desse fator principal, este índice pode variar de acordo com a origem da uva e com o tratamento que esta recebeu durante a produção de vinho. Determinar o índice de polifenóis totais em vinhos é importante para combater fraudes na produção dos mesmos e para controlar o processo fermentativo conferindo uma boa qualidade ao produto.
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Com o intuito de determinar o índice de polifenóis totais em amostras de vinhos tinto e branco em equivalentes de ácido gálico, um método baseado na espectrofluorimetria foi desenvolvido e validado com sucesso. Estudos das características fluorescentes do ácido gálico foram realizados e as condições finais mostraram que o método apresentou sensibilidade, precisão e exatidão adequadas. Além disso, o método foi aplicado em diferentes amostras de vinho e as concentrações encontradas (Tabelas 5 e 6) estão em coerência com o esperado, segundo informações da literatura (STRATIL et al, 2008; ZHU et al, 2014).
Vale ressaltar que este trabalho permitiu a determinação do índíce de polifenóis totais de forma direta, ou seja, sem a necessidade de reações de derivatização. E isto é uma grande vantagem quando comparado ao método de Folin-Ciocalteau, que tem sido usado como método oficial na determinação de compostos fenólicos totais em vinhos. Outra vantagem considerável é que não foi necessário nenhum tratamento de amostra, mas apenas uma etapa de diluição.
Como continuação e trabalho futuro, para uma validação mais completa pretende-se ainda realizar ensaios para comparação do método desenvolvido com o método oficial (Folin-Ciocalteau), além de analisar um número bem maior de amostras de vinhos tinto e branco e também de sucos de uva integral de diferentes procedências, assim como determinar a atividade antioxidante dos mesmos.
Enfim, o método desenvolvido neste trabalho pode ser uma ótima alternativa para análise de rotina no controle de qualidade de vinhos.
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