Universidade Federal Fluminense
ANNA CAROLINA DE JESUS DONATO
ESTUDO TRANSVERSAL DE ASPECTOS REPRODUTIVOS
EM MICOS-DE-CHEIRO – SAIMIRI (VOIGT 1831) –
PRIMATES MANTIDOS EM AMBIENTE EX-SITU NO
SERVIÇO DE CRIAÇÃO DE PRIMATAS NÃO HUMANOS DA
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ (FIOCRUZ-RJ): AVALIAÇÃO
SÉRICA DE PROGESTERONA, COLPOCITOLOGIA
VAGINAL E OCORRÊNCIA DE STAPHYLOCOCCUS SPP NA
MICROBIOTA VAGINAL
Orientadora: Profª Drª Ana Maria Reis Ferreira
NITERÓI 2012
Universidade Federal Fluminense
ANNA CAROLINA DE JESUS DONATO
ESTUDO TRANSVERSAL DE ASPECTOS REPRODUTIVOS
EM MICOS-DE-CHEIRO – SAIMIRI (VOIGT 1831) –
PRIMATES MANTIDOS EM AMBIENTE EX-SITU NO
SERVIÇO DE CRIAÇÃO DE PRIMATAS NÃO HUMANOS DA
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ (FIOCRUZ-RJ): AVALIAÇÃO
SÉRICA DE PROGESTERONA, COLPOCITOLOGIA
VAGINAL E OCORRÊNCIA DE STAPHYLOCOCCUS SPP NA
MICROBIOTA VAGINAL
Orientadora: Profª Drª Ana Maria Reis Ferreira
NITERÓI 2012
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor.
Área de concentração: Patologia Veterinária
Donato, Anna Carolina de Jesus
ESTUDO TRANSVERSAL DE ASPECTOS REPRODUTIVOS EM MICOS-DE-CHEIRO –
SAIMIRI (VOIGT 1831) – PRIMATES MANTIDOS
EM AMBIENTE EX-SITU NO SERVIÇO DE CRIAÇÃO DE PRIMATAS NÃO HUMANOS DA FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ (FIOCRUZ-RJ): AVALIAÇÃO SÉRICA DE PROGESTERONA, COLPOCITOLOGIA VAGINAL E OCORRÊNCIA DE
STAPHYLOCOCCUS SPP NA MICROBIOTA
VAGINAL / Anna Carolina de Jesus Donato. Niterói, 2012.
123 f.
Tese de Doutorado – Programa de Pós-Graduação em Patologia Universidade Federal Fluminense, Faculdade de Medicina.
Orientadora: Prof. Dra. Ana Maria Reis Ferreira 1.Samiri spp. 2. Patologia reprodutiva. 3.Staphylococcus spp. 4. Citologia vaginal. 5. Progesterona.
I. Universidade Federal Fluminense.
II. Estudo transversal de aspectos reprodutivos em micos-de-cheiro – Saimiri (VOIGT 1831) – Primates mantidos em ambiente ex-situ no Serviço de Primatologia da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz-RJ): avaliação sérica de progesterona, colpocitologia vaginal e ocorrência de
ANNA CAROLINA DE JESUS DONATO
ESTUDO TRANSVERSAL DE ASPECTOS REPRODUTIVOS EM MICOS-DE-CHEIRO – SAIMIRI (VOIGT 1831) – PRIMATES MANTIDOS EM AMBIENTE
EX-SITU NO SERVIÇO DE CRIAÇÃO DE PRIMATAS NÃO HUMANOS DA
FUNDAÇÃO OSWALDO CRUZ (FIOCRUZ-RJ): AVALIAÇÃO SÉRICA DE PROGESTERONA, COLPOCITOLOGIA VAGINAL E OCORRÊNCIA DE
STAPHYLOCOCCUS SPP NA MICROBIOTA VAGINAL
Aprovada em 13 de dezembro de 2012.
BANCA EXAMINADORA:
Prof. Dr. André Luís Rios Rodrigues
(Avaliador prévio)
Universidade Federal Fluminense
Prof. Dra.Silvia Susana Bona de Mondino
(Avaliadora prévia)
Universidade Federal Fluminense
Dra. Eliane Pedra Dias
Universidade Federal Fluminense
Dra. Márcia Cristina Ribeiro Andrade
Fundação Oswaldo Cruz
Dra. Tatiana Kugelmeier
Fundação Oswaldo Cruz
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em Patologia da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para obtenção do Grau de Doutor. Área de concentração: Patologia Veterinária
AGRADECIMENTOS
À Deus, pelo Dom Supremo da vida e fonte inesgotável de força.
À professora Dra. Ana Maria Reis Ferreira, modelo de entusiasta, pela orientação em mais etapa profissional e pela paciência infindável, carinho, cuidado, persistência e, sobretudo, amizade. Obrigada por me fazer enxergar os bons e maus exemplos nessa estrada acadêmica durante todos esses anos. Obrigada por ter acreditado no meu potencial, e por continuar acreditando.
Ao PPG em Patologia e à coodenadora Prof. Dra. Karin Gonçalves pela oportunidade, carinho e atenção, e por ser um exemplo de excelência aos corpos docente e discente. Obrigada pela sua severidade, austeridade, honestidade e serenidade.
À Fundação Oswaldo Cruz e colegas da equipe de tecnologistas composta pelas médicas veterinárias Lynn Cysne, Mônica Calado, Márcia Andrade, Tatiana Kugelmeier, Carla Campos, Beatriz Goldschmidt e pelo biólogo Clênio Viana. Aos técnicos do SCPrim que auxiliaram na execução desse trabalho João Carlos Ribeiro, David Cabral e Antônio Américo. Um agradecimento especial à antiga chefe médica veterinária Cláudia Lopes e ao atual, biólogo Fábio Alves, ambos por terem acreditado em mim e na importância do e aperfeiçoamento profissional, muito obrigada por terem me dado total apoio para o prosseguimento do doutorado.
Ao Departamento de Endocrinologia da UNESP Botucatu e ao colega e amigo médico veterinário Mário Balaro pela contribuição inestimável no processo das análises de progesterona.
À professora e coordenadora do curso de Estatística da Universidade Federal Fluminense, Dra. Ana Beatriz Fonseca, pelo apoio fundamental no processamento dos dados, disponibilidade e paciência.
À técnica Ana Rodrigues do Laboratório de Histotécnica do HUAP pelo trabalho exemplar, carinho, dedicação e acima de tudo paciência para me passar um pouquinho do seu vasto conhecimento.
Obrigada às secretárias do PPG Thereza Fontana por me aturar durante esses anos de pós-graduação, e também pela sua serenidade e simpatia, e Anícia Pires pela paciência e competência.
Aos professores colaboradores André Luís Rios Rodrigues, Felipe Zandonadi, Silvia Mondino, José Antônio Ribas, Walter Lilenbaum e Bruno Penna pela ajuda durante a execução desta tese, pelos conselhos, considerações, conselhos e não menos importante apoio moral.
À minha mãe, Tania Donato, pelo seu exemplo de pessoa íntegra e cuja formação sempre foi uma referência. Por ter tido paciência comigo durante esses quase 30 anos, e por ter me ensinado a ler para me ocupar, mesmo antes de ter me colocado na escola. Obrigada por ter me ensinado, desde pequena, que o conhecimento é algo que ninguém pode tirar de mim. Ao meu pai, Miguel Donato, pelo seu exemplo de força e perseverança. Obrigada por ser uma figura incansável e dura na queda. Obrigada por me ensinar a cair e levantar quantas vezes for necessário.
À minha irmã Amanda Donato, pelo seu exemplo profissional como dentista habilidosa. Obrigada por suas palavras, pelo seu apoio e carinho.
Aos meus amigos de faculdade que me acompanham durante todos esses anos, Kátia Silva, Vanessa Gonçalves, Vanessa Duque, Rodrigo de Oliveira. Mesmo longe, vocês estão sempre por perto! Obrigada por compreenderem a minha ausência, meu nervosismo, minha ansiedade durante esses anos de doutorado!
Ao amigo e sensei Fredie Hidalgo, obrigada pelos ensinamentos da arte do “caminho das mãos vazias”. Obrigada por me mostrar que o karate é muito mais do que mãos e pés vazios, trajar um kimono e uma faixa colorida. Obrigada por cada treino seu ser uma lição e ao mesmo tempo, uma válvula de escape durante esses estressantes anos de doutorado.
Obrigada aos meus colegas e amigos karatekas Marcos Arruda, Renan Sadoyama, Caio França, Adriano Tamm e Caio Lois pelo companheirismo.
Obrigada ao queridíssimo amigo Diego Amaral pelo apoio durante todos esses anos de amizade. Obrigada pelo seu constante e inabalável bom humor!
Obrigada às amigas e colegas de profissão Alline Brasil, Dala Kezen e Daniela Martins pela amizade, compreensão e conselhos que só os que passaram pelo PPG sabem dar!
Obrigada às mais que amigas, minhas queridas comadres, Mariana Cazaux e Tatiana Gandelman, pelos longos aconselhamentos, pela paciência, pela compreensão das ausências e silêncio.
À querida amiga Monique Lima, um anjo caído do céu! Obrigada pela amizade e apoio técnico na reta final!
Obrigada a todos os animais, ressaltando os primatas não humanos, que são exemplo de vida, respeito e amor a todos nós. Um agradecimento especial a vocês, Malu (in memoriam) e Kika, salsichas queridas!
Obrigada ao meu amigo e marido, Mauro Fabri, pela sua paciência inesgotável. Obrigada por não ter desistido do nosso amor, mesmo separados pelo Oceano Atlântico durante esses intermináveis quatro anos. Obrigada por ter esperado, acreditando sempre que a distância verdadeira é a do lado de dentro. Obrigada por insistir e acreditar no nosso amor. Grazie d´esistere!
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO... 17 2. OBJETIVOS... 21 2.1 OBJETIVO GERAL... 21 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 21 3. MATERIAL E MÉTODOS... 22 3.1 ANIMAIS... 223.1.1 Descrição do Ambiente de Criação dos Animais no Centro de Criação de Animais de Laboratório - Serviço de Primatologia (CECAL – SCPRIM – Fiocruz) ... 22
3.1.2 Animais utilizados no estudo... 25
3.2 METODOLOGIA... 27
3.2.1 Contenção dos animais e coleta das amostras... 27
3.2.2 Análise microbiológica... 31
3.2.2.1 Isolamento e identificação bacteriana... 31
3.2.2.2.1 Teste da catalase ... 31
3.2.2.2.2 Teste da oxidação e fermentação da glicose (OF) ... 31
3.2.2.2.3 Teste da coagulase livre... 32
3.2.2.2.4 Teste de Disco-difusão ... 32
3.2.3 Análise colpocitológica... 33
3.2.4 Análise da progesterona ... 34
3.2.5 Análise Estatística ... 35
4. RESULTADOS... 37
4.1 ANÁLISE DOS PRONTUÁRIOS INDIVIDUAIS... 37
4.1.1 Perfil dos animais... 37
4.1.2 Análise do perfil reprodutivo dos animais... 41
4.2 ANÁLISE DAS AMOSTRAS BACTERIOLÓGICAS... 60
4.2.1 Análise do isolamento de Staphylococcus spp a partir dos swabs vaginais... 60
4.2.1.1 Avaliação do isolamento bacteriano... 60
4.2.2 Perfil de susceptibilidade aos agentes antimicrobianos... 68
4.2.3 Staphylococcus spp e resistência à meticilina ... 75
4.3 COLPOCITOLOGIA ... 75
4.3.1 Fases do ciclo estral ... 75
4.4 NÍVEIS SÉRICOS DE PROGESTERONA DURANTE O PERIODO DE COLETA ... 79
4.4.1 Concentração sérica geral ... 79
5. DISCUSSÃO ... 85
5.1 ASPECTOS SOBRE OS PRONTUÁRIOS INDIVIDUAIS ... 85
5.2 ASPECTOS SOBRE OS PERFIS REPRODUTIVOS ... 87
5.3 ASPECTOS SOBRE AS AMOSTRAS BACTERIOLÓGICAS ... 90
5.3.2 Considerações sobre Staphylococcus spp. resistentes à meticilina .. 95
5.4 ASPECTOS SOBRE COLPOCITOLOGIA E DOSAGEM DE PROGESTERONA ... 96
6. CONCLUSÕES ... 102
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 104
8. ANEXOS ... 119
8.1 ANEXO 1 Autorização do Comitê de Ética em Uso de Animais ... 119
8.2 ANEXO 2 Mapa de população GN ... 120
8.3 ANEXO 3 Mapa de população PN ... 121
8.4 ANEXO 4 Calendário do manejo do ano de 2011 da colônia de Saimiri spp. do SCPrim ... 122
8.5 ANEXO 5 Etapas da técnica de Papanicolaou para coloração de lâminas citológicas ... 123
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Comparação de peso dos recintos 1 e 2 (espécie Saimiri ustus - origem Fiocruz), considerando a divisão por faixa etária (Fiocruz, maio de 2011) ... 38 Tabela 2 – Comparação de peso dos recintos 3, 4, 5, 6 e 7 (espécie Saimiri
sciureus - origem Fiocruz), considerando a divisão por faixa etária (Fiocruz,
maio de 2011) ... 39 Tabela 3 – Comparação de peso (em g) dos recintos 8 a 22 (espécie Saimiri
sciureus - origem Cayenne), considerando a divisão por faixa etária (Fiocruz,
maio de 2011) ... 40 Tabela 4 – Número de fêmeas da espécie Saimiri ustus - origem Fiocruz, de acordo com a quantidade de parições (Fiocruz, maio de 2011)... 42 Tabela 5 – Tabela do número de fêmeas da espécie Saimiri sciureus - origem Fiocruz, de acordo com a quantidade de parições (Fiocruz, maio de 2011)... 42 Tabela 6 – Tabela da classificação das fêmeas da espécie Saimiri sciureus - origem Cayenne, de acordo com a quantidade de parições (Fiocruz, maio de 2011)... 43 Tabela 7 – Distribuição das fêmeas maduras da espécie Saimiri spp de acordo com a quantidade de parições (Fiocruz, maio de 2011) ... 44 Tabela 8 – Distribuição da quantidade de partos na espécie Saimiri ustus - origem Fiocruz de acordo com as faixas etárias (Fiocruz, maio de 2011)... 45 Tabela 9 – Distribuição da quantidade de partos na espécie Saimiri sciureus - origem Fiocruz de acordo com as faixas etárias (Fiocruz, maio de 2011) ... 45 Tabela 10 – Distribuição da quantidade de partos na espécie Saimiri sciureus - origem Cayenne de acordo com as faixas etárias (Fiocruz, maio de 2011) ... 46 Tabela 11 – Média e desvio-padrão do intervalo entre partos na espécie
Saimiri ustus - origem Fiocruz de acordo com as faixas etárias (Fiocruz, maio
de 2011) ... 47 Tabela 12 – Média e desvio-padrão do intervalo entre partos na espécie
Saimiri sciureus - origem Fiocruz de acordo com as faixas etárias (Fiocruz,
maio de 2011) ... 48 Tabela 13 – Média e desvio-padrão do intervalo entre partos na espécie
Saimiri sciureus - origem Cayenne de acordo com as faixas etárias (Fiocruz,
maio de 2011) ... 49 Tabela 14 – Frequência de fêmeas maduras da espécie Saimiri spp com intervalo após o último parto superior a 720 dias – ano reprodutivo de referência: 2011-2012 (Fiocruz, maio de 2011) ... 50 Tabela 15 – Ocorrência de abortamentos na espécie Saimiri ustus - origem Fiocruz de acordo com as faixas etárias (Fiocruz, maio de 2011) ... 51 Tabela 16 – Ocorrência de abortamentos na espécie Saimiri sciures - origem Fiocruz de acordo com as faixas etárias (Fiocruz, maio de 2011) ... 52
Tabela 17 – Ocorrência de abortamentos na espécie Saimiri sciureus - origem Cayenne de acordo com as faixas etárias (Fiocruz, maio de 2011) ... 53 Tabela 18 – Ocorrência de natimortos na espécie Saimiri ustus - origem Fiocruz de acordo com as faixas etárias (Fiocruz, maio de 2011)... 54 Tabela 19 – Ocorrência de natimortos na espécie Saimiri sciureus - origem Fiocruz de acordo com as faixas etárias (Fiocruz, maio de 2011) ... 55 Tabela 20 – Ocorrência de natimortos na espécie Saimiri sciureus - origem Cayenne de acordo com as faixas etárias (Fiocruz, maio de 2011)... 56 Tabela 21 – Índice de desfrute na espécie Saimiri ustus - origem Fiocruz (Fiocruz, maio de 2011) ... 57 Tabela 22 – Índice de desfrute na espécie Saimiri sciureus - origem Fiocruz (Fiocruz, maio de 2011) ... 58 Tabela 23 – Índice de desfrute na espécie Saimiri sciureus - origem Cayenne (Fiocruz, maio de 2011) ... 59 Tabela 24 – Ocorrência de colonização vaginal por Staphylococcus spp na espécie Saimiri ustus - origem Fiocruz, de acordo com as faixas etárias (Fiocruz, maio de 2011) ... 61 Tabela 25 – Ocorrência de colonização vaginal por Staphylococcus spp na espécie Saimiri sciureus - origem Fiocruz, de acordo com as faixas etárias (Fiocruz, maio de 2011) ... 62 Tabela 26 – Ocorrência de colonização vaginal por Staphylococcus spp na espécie Saimiri sciureus - origem Cayenne, de acordo com as faixas etárias (Fiocruz, maio de 2011) ... 63 Tabela 27 – Ocorrência da colonização vaginal por Staphylococcus spp na população de Saimiri ustus Fiocruz de acordo com o número de parições por fêmea por faixa etária (Fiocruz, maio de 2011) ... 64 Tabela 28 – Ocorrência da colonização vaginal por Staphylococcus spp na população de Saimiri sciureus Fiocruz de acordo com o número de parições por fêmea por faixa etária (Fiocruz, maio de 2011) ... 65 Tabela 29 – Ocorrência da colonização vaginal por Staphylococcus spp na população de Saimiri sciureus Cayenne de acordo com o número de parições por fêmea por faixa etária (Fiocruz, maio de 2011) ... 66 Tabela 30 – Frequência da colonização vaginal por Staphylococcus spp na população de Saimiri spp Fiocruz, dentro das categorias de número de parições por fêmea (Fiocruz, maio de 2011)... 67 Tabela 31 – Frequência de resistência a pelo menos um antimicrobiano na população de Saimiri spp que apresenta colonização vaginal por
Staphylococcus spp (Fiocruz, maio de 2011) ... 69 Tabela 32 – Frequência de susceptibilidade a antimicrobianos em
Staphylococcus spp isolados em ambiente vaginal na população de Saimiri
spp (Fiocruz, maio de 2011)... 69 Tabela 33 – Frequência susceptibilidade a antimicrobianos em
Staphylococcus spp isolados em ambiente vaginal na população de Saimiri
spp considerando as faixas etárias (Fiocruz, maio de 2011) ... 70
Tabela 34 – Frequência susceptibilidade a dez agentes antimocrobianos testados em Staphylococcus spp isolados em ambiente vaginal na população de Saimiri ustus Fiocruz (recintos 1 e 2) e Saimiri sciureus (recintos 3, 4, 5, 6 e 7) considerando as faixas etárias (Fiocruz, maio de 2011)... 71 Tabela 35 – Frequência de resistência a cinco agentes antimicrobianos testados em Staphylococcus spp isolados em ambiente vaginal na população de Saimiri sciureus Cayenne considerando as faixas etárias (Fiocruz, maio de 2011) – Parte 1 de 2... 73 Tabela 36 – Frequência de resistência a cinco agentes antimicrobianos testados em Staphylococcus spp isolados em ambiente vaginal na população de Saimiri sciureus Cayenne considerando as faixas etárias (Fiocruz, maio de 2011) – Parte 2 de 2... 74 Tabela 37 – Fases do ciclo estral na população de Saimiri spp Fiocruz, durante o período de coleta de material para colpocitologia em maio de 2011 e fêmeas paridas paridas durante a época de partos (entre setembro de 2011 e
abril de 2012) no ano reprodutivo
2011/2012... 76 Tabela 38 – Fases do ciclo estral nos recintos da população de Saimiri ustus Fiocruz de acordo com as faixas etárias, durante o período de coleta de material para colpocitologia em maio de 2011, considerando o ano reprodutivo 2011/2012... 77 Tabela 39 – Fases do ciclo estral nos recintos da população de Saimiri
sciureus Fiocruz de acordo com as faixas etárias, durante o período de coleta
de material para colpocitologia em maio de 2011, considerando o ano reprodutivo 2011/2012... 77 Tabela 40 – Fases do ciclo estral nos recintos da população de Saimiri
sciureus Cayenne de acordo com as faixas etárias, durante o período de
coleta de material para colpocitologia em maio de 2011, considerando o ano reprodutivo 2011/2012... 78 Tabela 41 – Concentração sérica de progesterona (média e desvio padrão, em ng/mL) na espécie Saimiri ustus - origem Fiocruz de acordo com as faixas etárias (Fiocruz, maio de 2011)... 82 Tabela 42 – Concentração sérica de progesterona (média e desvio padrão, em ng/mL) na espécie Saimiri sciureus - origem Fiocruz de acordo com as faixas etárias (Fiocruz, maio de 2011)... 83 Tabela 43 – Concentração sérica de progesterona (média e desvio padrão, em ng/mL) na espécie Saimiri sciureus - origem Cayenne de acordo com as faixas etárias (Fiocruz, maio de 2011)... 84
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – A: vista aérea dos Gaiolões Neotropicais (GN). B: Unidade de recinto do tipo GN em detalhe. C: Recinto do tipo GN, detalhe para a área descoberta (externa), com poleiros. D: Visão geral do Pavilhão Neotropical (PN). E: Visão da área interna do PN, em que estão localizados 14 recintos. Fonte: Arquivo SCprim... 24 Figura 2 - Exemplares de Saimiri ustus (A) e Saimiri sciureus (B) (Fonte: Arquivo SCPrim)... 26 Figura 3 – A: contenção física de exemplar de mico-de-cheiro. B: confecção de tatuagem durante manejo médico anual. C: coleta de sangue por venopunção femoral. D: coleta de material para análise bacteriológica utilizando swab. E: coleta de material para colpocitologia com auxílio de escova Bitufo®. F: técnica de rolamento em lâmina para análise colpocitológica. (Fotos: Fiocruz/SCPrim – maio/2011)... 30
Figura 4 – Aspectos citológicos em Saimiri spp. - A: Fase de estro, com predominância de células superficiais (400X, negativo). B: Fase de diestro, ilustrando células parabasais (400X, negativo) (Fotos: Faculdade de Veterinária/UFF – setembro/2012)... 34
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1 – Representação gráfica em Box-plot da distribuição de valores da concentração sérica de progesterona da população de Saimiri spp (Fiocruz, maio de 2011)... 80 Gráfico 2– Representação gráfica em Box-plot da distribuição de valores da concentração sérica de progesterona, segundo as faixas etárias da população de
Saimiri spp (Fiocruz, maio de 2011)... 80 Gráfico 3 - Representação gráfica em Box-plot da concentração sérica de progesterona, segundo origem (Fiocruz ou Cayenne) da população de Saimiri spp (Fiocruz, maio de 2011)... 81 Gráfico 4 - Representação gráfica em Box-plot da concentração sérica de progesterona, segundo a espécie (Saimiri sciureus e S. ustus) da população de
RESUMO
O Brasil abriga a maior fauna primatológica do planeta e esse patrimônio encontra-se ameaçado de extinção devido a destruição ambiental. Além do aspecto conservacionista, a manutenção em cativeiro apresenta outra faceta relevante: a utilização como modelos biológicos em pesquisas biomédicas e fornece dados importantes, contribuindo na literatura científica. O objetivo do presente estudo foi avaliar aspectos da fisiopatologia da reprodução de fêmeas reprodutivas, não reprodutivas e nulíparas durante o início da temporada reprodutiva de micos-de-cheiro (Saimiri spp) pertencentes à colônia da Fundação Oswaldo Cruz. Visamos também determinar a ocorrência de Staphylococcus spp. na microbiota vaginal da colônia de Saimiri spp da Fiocruz; avaliar o perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos das amostras isoladas, verificando a ocorrência de Staphylococcus spp resistentes à meticilina; descrever os achados colpocitológicos em fêmeas de micos-de-cheiro (Saimiri spp) e determinar as concentrações séricas de progesterona em fêmeas de micos-de-cheiro (Saimiri spp). Foram avaliadas 177 fêmeas (Saimiri sciureus e S. ustus) com idade de três a 22 anos, quanto a colonização vaginal por Staphylococcus spp, a dosagem de concentração sérica de progesterona por radio-imunoensaio e avaliação colpocitológica (foram excluídas aquelas com menos de 4 anos, por serem imaturas sexualmente). Como resultados, foi observado média de concentração sérica de progesterona de 14,076±11,304 ng/mL no âmbito geral. Das 177 fêmeas, 56,5% foram classificadas como cíclicas após avaliação colpocitológica. Foi observada colonização vaginal por
Staphylococcus spp, em 54,2% das fêmeas e em 18,1% com menos de 4 anos,
30,9% entre 4 e 10 anos e 51,1% com mais de 10 anos (p<0,05). Considerando fêmeas nulíparas, a colonização foi de 45,3%, de 16,8% em primíparas e 37,9% nas pluríparas. Houve colonização por Staphylococcus spp. em 10,5% das fêmeas com históricos de abortamento e igual percentual para natimortos (p>0,05). A gentamicina mostrou-se mais eficaz (100%) e a tetraciclina a menos indicada, com resistência em 28,4%. Em 13,7% das amostras foram evidenciadas cepas resistentes à meticilina. Concluiu-se que diante do percentual de isolamento de
Staphylococcus spp em 54,2% das amostras vaginais dos animais estudados; foi
apontada uma maior frequência de colonização vaginal por Staphylococcus spp. em faixa etária de micos-de-cheiro com mais de dez anos; não foi observada relação entre a a colonização vaginal estafilocócica com maior experiência reprodutiva materna e tampouco com a ocorrência de abortamentos e natimortos; cepas de
Staphylococcus spp. coagulase-negativas isoladas em amostras vaginais são mais
frequentes que as coagulase-positivas; a gentamicina foi o antibiótico de maior susceptibilidade, enquanto que a tetraciclina teve a maior taxa de resistência; o isolamento de cepas resistentes à meticilina reforça os cuidados com biossegurança na colônia; Saimiri spp apresentam achados colpocitológicos semelhantes àqueles descritos em primatas humanos e não humanos, sendo uma ferramenta útil para a avaliação de ciclicidade em Saimiri spp.
ABSTRACT
Brazil is home to the largest primatological fauna of the planet and this heritage is threatened with extinction due to environmental destruction. Besides the aspect of conservation, maintenance in captivity presents another facet relevant: use as models in biological and biomedical research provides key data, contributing to the scientific literature. The aim of this study was to evaluate aspects of the pathophysiology of reproduction of female reproductive and non-reproductive gilts during early reproductive season Saimiri spp colony belonging to the Oswaldo Cruz Foundation. We aim also to determine the occurrence of Staphylococcus spp. vaginal microbiota in the colony of Saimiri spp Oswaldo Cruz Foundation; evaluate the profile of antimicrobial susceptibility of isolates, verifying the occurrence of methicillin-resistant Staphylococcus spp; colpocytologic describe findings in female squirrel monkey (Saimiri spp) and determine serum concentrations of progesterone in female squirrel monkey (Saimiri spp.) We evaluated 177 females (Saimiri sciureus and S. ustus) aged three to 22 years, as vaginal colonization by Staphylococcus spp, the dosage of progesterone concentration by radioimmunoassay and colpocytologic evaluation (excluded were those with less than 4 years because they are sexually immature). As results, observed mean serum concentration of progesterone 14,076 ± 11,304 ng / mL in general. Of the 177 females, 56,5% were classified as cyclical after colpocytologic evaluation. It was observed vaginal colonization by Staphylococcus spp in 54,2% of females and 18,1% with less than 4 years, 30,9% between 4 and 10 years and 51,1% over 10 years (p<0,05). Considering females, colonization was 45,3%, 16,8% and 37,9% in nulliparous, primiparous and pluriparous, respectively. There were colonization by Staphylococcus spp. 10,5% of females with histories of miscarriage and stillbirth for equal percentage (p>0,05). Gentamicin was more effective (100%) and tetracycline unless indicated with resistance at 28,4%. In 13,7% of the samples were found methicillin-resistant strains. It was concluded that given the percentage of isolation of staphylococci in 54,2% of vaginal samples of the animals studied, was appointed an increased frequency of vaginal colonization by
Staphylococcus spp. in aged squirrel monkey with more than ten years; no
relationship was observed between a vaginal staphylococcal colonization with higher maternal reproductive experience, nor with the occurrence of miscarriages and stillbirths; Staphylococcus spp. Coagulase-negative bacteria isolated from vaginal samples are more frequent than the coagulase positive; gentamicin was the antibiotic susceptibility greater, whereas tetracycline had the highest rate of resistance; the isolation of strains resistant to methicillin enhancing the biosafety care in colony;
Saimiri spp colpocytologic present findings were similar to those described in human
and nonhuman primates, being a useful tool for the evaluation of cyclicity in Saimiri spp.
Keywords: comparative pathology, neotropical primates, squirrel monkey, reproduction physiopathology.
17
1. INTRODUÇÃO
O Brasil abriga a maior fauna primatológica do planeta, entretanto, grande parte deste patrimônio encontra-se ameaçado de extinção a curto, médio ou longo prazo em decorrência, principalmente, da destruição ambiental. A manutenção de populações estáveis das diferentes espécies de primatas em cativeiro nos permitirá compreender de forma mais ampla os diversos aspectos de sua biologia, além de proporcionar à comunidade científica um maior conhecimento sobre a diversidade de nossa fauna. Tanto o aprendizado científico quanto o reconhecimento e admiração populares, conseguidos com a manutenção destes símios, são fundamentais para a preservação de suas espécies, não apenas ex-situ, mas também em seus ambientes naturais (DINIZ, 1997).
Além do aspecto conservacionista, a manutenção das diferentes espécies de primatas não humanos em cativeiro apresenta outra faceta relevante: a utilização como modelos biológicos em pesquisas biomédicas que direta ou indiretamente favorecem o bem estar humano (MITTERMEIER et al., 1994).
Apesar da possibilidade de extinção, os pesquisadores das áreas biomédica e comportamental têm demonstrado grande interesse na utilização dos primatas do Novo Mundo como modelos experimentais. Entre as vantagens apontam o pequeno tamanho, a produção regular de gêmeos e maturidade atingida em aproximadamente 24 meses
18
de idade. Além disso, os calitriquídeos (primatas de pequeno porte e cauda não preênsil) produzem gêmeos fraternos e desenvolvem uma placenta vascular com anastomose entre os fetos permitindo o quimerismo hematopoiético, tornando-os bastante interessantes para os estudos imunológicos (COIMBRA-FILHO et al., 1983; DINIZ, 1997).
Apesar disto, observam-se poucos estudos referentes à patologia, particularmente em símios do Novo Mundo e, consequentemente, pouco se sabe sobre as possibilidades que cada uma das formas de platirrino (designação para primata do Novo Mundo, ou seja, aqueles que apresentam narinas afastadas) possa ser um bom modelo à Patologia Experimental. Do estudo aprofundado dos processos mórbidos que espontaneamente acometem estes animais, poderão surgir novas linhas de pesquisas, que visem à saúde, o bem-estar e assim a conservação desses animais, bem como para o benefício humano. Sem tais projetos de uso de símios para benefício da humanidade, o conhecimento sobre estes mamíferos dificilmente será ampliado no ritmo necessário, inviabilizando a conservação de um grande número (MONTALI et al., 1993; MONTALI et al., 1995; PISSINATTI et al., 1987).
O processo de transição do ambiente selvagem para o cativeiro implica na exposição dos animais a uma grande variedade de causas de estresse, relacionada com o ambiente, a alimentação e as condições sociais, entre outras. A submissão contínua ao estresse por erros no manejo (como por exemplo, temperatura ambiental inadequada, dieta não balanceada), perturbações ambientais (por exemplo, ruídos excessivos, introdução de novos animais), ou ainda, uma combinação entre as possíveis causas supracitadas podem provocar a estes animais um aumento na suscetibilidade a diversos agentes infecciosos, além da queda no seu rendimento reprodutivo (DINIZ, 1997).
O conhecimento da microbiota vaginal normal é de suma importância para estabelecer o diagnóstico e tratamento adequados para afecções do trato reprodutor (DOYLE et al., 1991). Foram descritos em macaco rhesus o isolamento de estafilococos
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em casos de piometra (LANG & BENJAMIN, 1969), infecções vaginais toxigênicas (POLLACK et al., 1983) e infecções uterinas ascendentes (SWINDLE et al., 1982). Assim, uma melhor compreensão sobre as espécies de estafilococos que ocorrem na microbiota vaginal e a sua susceptibilidade a agentes antimicrobianos pode contribuir para o manejo correto de vaginites e outras afecções reprodutivas.
A maioria dos casos de infecção relatados em primatas não humanos na literatura é atribuída à espécie S. aureus. Porém, alguns estudos não realizam identificação completa, e, portanto, a importância de certas espécies estafilocócicas não está clara (ASPIS et al., 2003).
Em primatas não humanos, a composição da microbiota vaginal é pouco conhecida, e há hipóteses que afirmam que espécies filogeneticamente próximas tendem a apresentar microbiota semelhante, ao contrário do que acontece em espécies com menor filogenia (NOGUCHI et al., 2003). Dessa forma, primatas não humanos podem exibir microbiota similar àquela dos seres humanos (RIVERA et al., 2011).
Bactérias do gênero Staphylococcus spp foram descritas como integrantes da microbiota vaginal normal de primatas não humanos, tais como chimpanzés (Pan
troglodytes) [BONCYK & KALTER, 1972], babuínos (Papio anubis) [SKANGALIS et al.,
1979; RIVERA et al., 2011], bugio (Alouatta caraya) [CLAVER et al., 1984], macaco rhesus (Macaca mulatta) [DOYLE et al., 1991], macaco rabo-de-porco (Macaca nemestrina) [LICHTENWALNER et al., 2000], mico-leão-dourado (Leontopithecus
rosalia), cara-dourada (Leontopithecus chhrysomelas) e
mico-leão-da-cara-preta (Leontopithecus caissara) [LILENBAUM et al., 2004]. Não há na literatura descrição de ocorrência de Staphylococcus spp na microbiota vaginal de Saimiri spp.
Assim como na espécie humana, uma das alterações mais comuns do trato genital em todos os primatas é a vaginite, causada por uma variedade de microrganismos que podem atuar, em certas situações, como oportunista. Também podem provocar complicações como abortamento séptico (ISENBERG & D´AMATO,
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1995). Esta e outras infecções tais como cervicite, metrite e piometra podem influenciar na reprodução destes animais. Portanto, é importante detectar as populações bacterianas de ocorrência contínua ou ocasional destes animais, a fim de compreender seu potencial como fonte endógena de infecção (LILENBAUM et al., 2004).
Com isso, este estudo pioneiro visa contribuir nas áreas de microbiologia, criação e reprodução ex-situ de micos-de-cheiro, importante modelo experimental em várias áreas, incluindo estudos sobre doenças tropicais, etologia, neurologia, entre outros, além de ser considerado modelo experimental padrão-ouro para pesquisas sobre malária. Diante destes fatos, a avaliação hormonal de progesterona atrelada aos achados colpocitológicos e à pesquisa de Staphylococcus spp. da microbiota vaginal em micos-de-cheiro são dados importantes que auxiliam no preenchimento da lacuna de conhecimento da área de primatas não humanos.
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2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
• Avaliar aspectos da fisiologia da reprodução de fêmeas reprodutivas, não reprodutivas e nulíparas durante o início da temporada reprodutiva de micos-de-cheiro (Saimiri spp) pertencentes à colônia da Fundação Oswaldo Cruz.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Determinar a ocorrência de Staphylococcus spp. na microbiota vaginal da colônia de
Saimiri spp da Fundação Oswaldo Cruz;
• Avaliar o perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos das amostras isoladas, verificando a ocorrência de Staphylococcus spp resistentes à meticilina;
• Descrever os achados colpocitológicos em fêmeas de micos-de-cheiro (Saimiri spp); • Determinar as concentrações séricas de progesterona em fêmeas de micos-de-cheiro (Saimiri spp).
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3. MATERIAL E MÉTODOS
Este estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais (CEUA) da Fundação Oswaldo Cruz sob o número L-069/08 e é válido até 17 de dezembro de 2012, e posteriormente foi submetido e aprovado pelo Comitê de Bioética da Universidade Federal Fluminense sob o protocolo 00152-12 (Anexo 1).
3.1 ANIMAIS
3.1.1 Descrição do Ambiente de Criação dos Animais no Centro de Criação de Animais de Laboratório - Serviço de Criação de Primatas não Humanos (CECAL – SCPRIM – Fiocruz)
A obtenção das amostras para a condução dos diversos estudos foi realizada no SCPrim da Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz), localizado no bairro de Manguinhos (Rio de Janeiro – RJ), que reproduz um ambiente semelhante àquele de origem dos animais. Neste local a visitação é restrita e o acesso é exclusivo aos técnicos e veterinários do Setor por questões de biossegurança.
Os recintos onde os animais são mantidos estão localizados ao ar livre dentro do
campus da Fiocruz, e foram construídos em disposição tal que evita o estresse visual
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de reprodução são mantidos nestes recintos que dispõem de poleiros de madeira posicionados horizontalmente.
Os animais da colônia de micos-de-cheiro da Fiocruz estão divididos em dois tipos de recinto: Gaiolões Neotropicais (GN) e Pavilhão Neotropicais (PN).
Os GN são recintos contendo uma parte coberta (refúgio) e outra parte descoberta, que se encontram na área externa, nos quais os animais têm uma visão do ambiente natural. Desta forma, através das grades, os animais têm contato constante com a fauna e flora adjacente, tanto visualmente quanto auditivamente. Os GN são identificados com números de um a seis e cada um deles subdividido em compartimento A e B (por exemplo: GN1A, GN1B) totalizando 12 recintos cobertos (Figura 1: A, B e C). Em anexo (anexo 1), encontra-se a distribuição dos animais no mapa de população por recinto GN. É importante ressaltar ainda, conforme o anexo 1, que dos 12 recintos GN, cinco abrigavam S. sciureus da colônia Fiocruz, e dois deles,
S. ustus da colônia Fiocruz. Os cinco recintos restantes foram excluídos do estudo, pois
os grupos sociais eram formados somente por machos, sendo dois deles de animais da colônia Fiocruz (um recinto com S. ustus e o outro de S. sciureus), enquanto que os três recintos restantes continham S. sciureus oriundos de Cayenne.
O outro tipo de recinto - PN é constituído por uma unidade térrea totalmente coberta; os recintos são isolados por grades de ferro e encontram-se ladeados por corredores (dois laterais e um central), impossibilitando a visão dos animais para o ambiente externo. Os PN são numerados de um a 14 (PN1 a PN14), localizados dentro do Pavilhão de Neotropicais (Figura 1: D e E). No anexo 2, encontra-se a distribuição dos animais no mapa de população por recinto PN, onde se nota que 100% dos animais abrigados eram da espécie S. sciureus provenientes de Cayenne.
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Figura 1 – A: vista aérea dos Gaiolões Neotropicais (GN). B: Unidade de recinto do tipo GN em detalhe.C: Recinto do tipo GN, detalhe para a área descoberta (externa), com poleiros. D: Visão geral do Pavilhão Neotropical (PN). E: Visão da área interna do PN, em que estão localizados 14 recintos. Fonte: Arquivo SCprim.
D C
B A
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Todos os recintos contam com bebedouro automático do tipo chupeta em aço inox, como os usados em suinocultura, e garante consumo ad libitum sempre com as condições de potabilidade. A alimentação foi feita em sistema de duas vezes ao dia, sendo oferecido pela manhã ração peletizada para primatas (Nuvital®). No início da tarde, depois de retiradas as sobras de alimentos da primeira refeição eram fornecidas frutas diversas, além de ovos de codorna e larvas de tenébrio, obedecendo a um esquema de cardápio diário balanceado. Outra informação relevante é que, durante o período de coleta do estudo (de 02/05/2011 até 07/06/2011), o fotoperíodo médio foi de 12 horas, devido à localização geográfica no hemisfério sul (-22º 52´ S).
3.1.2 Animais utilizados no estudo
O presente estudo utilizou 177 fêmeas da colônia de mico-de-cheiro da Fiocruz com idade entre três e 22 anos de idade, sendo 95,5% (169 animais) da espécie Saimiri
sciureus, e apenas 4,5% (oito animais) da espécie Saimiri ustus.
A idade inferior a três anos foi considerado um fator de exclusão neste estudo, pois de acordo com COE, SMITH & LEVINE (1985), somente ao redor de três anos de idade, as fêmeas jovens da espécie Saimiri sciureus apresentam variações hormonais similares às observadas em fêmeas adultas, e a puberdade ocorre ao redor de dois anos e meio de idade. Outro critério de exclusão foi o uso de qualquer tipo de fármaco ou agente antimicrobiano nos últimos seis meses.
Para determinar o perfil etário dos animais em estudo, foram divididos nas seguintes categorias etárias: imaturas (menos de quatro anos de idade, correspondendo a 14,1% dos animais), adultas (entre quatro e 10 anos de idade, abrangendo 22% dos animais) e idosas (mais de 10 anos de idade, totalizando 59,3% das fêmeas estudadas). Em oito dos 177 animais em estudo não havia informação da idade no prontuário individual, correspondendo a 4,5% dos animais em estudo. Entretanto, esses animais não foram excluídos do estudo, já que todos em questão eram maduros (mais de quatro anos).
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A colônia de mico-de-cheiro do SCPrim-Fiocruz é composta por duas espécies atualmente disponíveis em cativeiro: Saimiri ustus e Saimiri sciureus (Figura 2). A colônia da espécie S. ustus foi estabelecida na Fiocruz em meados dos anos 80, através da introdução de animais capturados na região amazônica, durante a mesma época da fundação da colônia de S. sciureus e está distribuída em grupos sociais em dois recintos do tipo GN (anexo 2).
Já a espécie S. sciureus é dividida em duas populações: uma estabelecida na Fiocruz, de exemplares capturados na região amazônica em meados dos anos 80 e (distribuídos em cinco recintos do tipo GN, conforme anexo 2), e a de Cayenne, cujos animais são oriundos da criação ex-situ do Instituto Pasteur da Guaiana Francesa, doados à Fundação Oswaldo Cruz no início do ano de 2009, e estão abrigados em 14 recintos do tipo PN (anexo 3).
Com relação à origem dos animais, 73,4% (130 fêmeas) são oriundos de Cayenne, através da importação em 2009 em convênio entre Brasil (Fundação Oswaldo Cruz) e Guiana Francesa (Instituto Pasteur). Os 26,6% restantes, correspondentes a 47 fêmeas, são oriundas da colônia Fiocruz, constituída em 1988 por apreensão na região da Bacia Amazônica.
Figura 2 - Exemplares de Saimiri ustus (A) e Saimiri sciureus (B) Fonte: Arquivo SCprim.
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No SCPrim, cada animal é registrado por meios de prontuário individual, no qual constam dados como data de nascimento, histórico reprodutivo (número de partos, intervalo entre partos, abortamentos e outros problemas reprodutivos) e clínicos (peso, aplicação de medicamentos, realização de procedimentos cirúrgicos, entre outros).
Com relação à quantidade de partos por fêmeas, estas foram classificadas em nulíparas, primíparas e pluríparas, totalizando, respectivamente, 41,2%, 39,0% e 19,2%. Das 177 fêmeas em estudo, apenas o histórico de um animal (0,6%) não continha registro de número de partos, porém não foram excluídos do estudo. Deve-se ressaltar que, quando importados, os registros dos animais oriundos de Cayenne estavam incompletos. Para evitar problemas nos dados destes animais, foram computados os anos de 2009 (ano de importação) até 2011 (momento da coleta de material), os quais foram devidamente registrados.
Na Fiocruz, a identificação dos animais é feita através de uma numeração própria alfanumérica determinada pelo sistema de registro da colônia e que consta na tatuagem existente na face interna da coxa direita, além do microchip implantado na parte subcutânea do dorso por exigência do IBAMA por se tratar de espécie da fauna nacional.
3.2 METODOLOGIA
3.2.1 Contenção dos animais e coleta das amostras
Os animais foram capturados pelos técnicos do SCPrim – Fiocruz no interior dos recintos com a utilização de puçás de malha fina (Figura 3: A) . Uma vez fora dos recintos, mantendo-os dentro da malha, foram contidos manualmente para aplicação de contenção farmacológica, que consistiu na associação de ketamina (15mg/kg) e midazolam (0,1 mg/kg) em administração intramuscular, para então proceder com a colheita de amostras dos diferentes materiais biológicos necessários.
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A coleta de amostras de sangue para obtenção de soro para as dosagens hormonais, de swabs vaginais para análise bacteriológica e de amostras para estudo citológico foi realizada durante o manejo médico anual, realizado entre 02/05/2011 e 07/06/2011 (conforme Anexo 4), no qual cada indivíduo da colônia foi examinado clinicamente, além de receber medicação para prevenção parasitária. Os animais nascidos no último ano reprodutivo foram tatuados (Figura 3: B).
A amostra de sangue foi coletada para determinação da concentração sérica de progesterona. Foi realizada através da punção da veia femoral com seringa de 3 mL e agulha 25 X 7 estéreis (Figura 3: C), e transferida para tubos de 5 mL com vácuo sem anticoagulante (EDTA). Foi realizada antissepia do local da punção com algodão embebido em álcool 70% antes da coleta. Após a coleta as amostram foram acondicionadas em recipiente isotérmico (5ºC) e imediatamente levadas ao laboratório para o processamento. As amostras foram centrifugadas sob refrigeração (5ºC) a 894 x g por 20 minutos, e o soro foi acondicionado a –20°C até o momento da determinação da concentração de progesterona.
A partir dos 177 animais envolvidos no estudo, foram coletados 165 swabs das três populações de micos-de-cheiro. Nos 12 animais restantes, não foi possível a coleta de amostra microbiológica, pois os mesmos apresentavam abertura vaginal muito estreita, o que poderia ter causado trauma. De acordo com a divisão das fêmeas por categorias etárias, foram coletadas 28 swabs de animais imaturos (menos de quatro anos), 37 de adultos (entre quatro e 10 anos) e 100 de idosos (mais de 10 anos).
Foi realizada prévia higienização da região genital com gaze estéril embebida em água destilada estéril; para a coleta de material vaginal foram utilizados dois tipos diferentes de swabs estéreis, de acordo com a idade do animal. Nas fêmeas que ainda não atingiram idade reprodutiva (menos de quatro anos de idade) e, portanto, apresentam anatomicamente canal vaginal mais estreito, foi usado swab mais fino (MEUS S.R.L®, Piove di Sacco, Pádua, Itália) enquanto que em fêmeas maduras sexualmente, o acesso ao canal vaginal foi feito com auxílio de swab com corpo maior (Copan Italia S.P.A®, Brescia, Itália).
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Para a análise colpocitológica (Figura 3: D), prosseguiu-se com introdução da escova interdental Bitufo® (Itupeva, São Paulo, Brasil) no canal vaginal (Figura 3: E), e a técnica de rolamento do material sobre lâminas de microscopia para deposição do material (Figura 3: F). A utilização desta escova foi utilizada por apresentar tamanho adequado à genitália dos animais em estudo, além de ter sido testada em estudos anteriores (ANDRADE et al., 2010), verificando-se uma maior colheita de material de mucosa vaginal em primatas não humanos.
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Figura 3 – A: contenção física de exemplar de mico-de-cheiro. B: confecção de tatuagem durante manejo médico anual. C: coleta de sangue por venopunção femoral. D: coleta de material para análise bacteriológica utilizando swab. E: coleta de material para colpocitologia com auxílio de escova Bitufo®. F: técnica de rolamento em lâmina para análise colpocitológica. (Fotos: Fiocruz/SCPrim – maio/2011). F C B D A E
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3.2.2 Análise microbiológica
3.2.2.1 Isolamento e identificação bacteriana
As amostras vaginais foram acondicionadas em caixas térmicas até o Laboratório de Bacteriologia (Instituto Biomédico – Universidade Federal Fluminense – Niterói), onde foram realizadas as análises microbiológicas. O material foi inoculado em caldo BHI (Brain Heart Infusion, Merckâ®, Darmstadt, Alemanha) e incubadas a 37ºC durante 24 a 48 horas.
Os caldos positivos foram repicados em meio ágar manitol salgado (Himedia®, Mumbai, Índia) e incubados a 37ºC por 48h. A identificação bacteriana foi realizada fenotipicamente com base nas características coloniais (colônias normalmente lisas, butirosas, algumas convexas, com coloração variando de brancacenta a amarelada, com borda contínua, com 1 a 2 mm de diâmetro), morfotintoriais (coloração de Gram). Com relação às provas bioquímicas, foram realizados os seguintes testes: produção da catalase, capacidade de fermentação e oxidação da glicose (prova OF), produção de coagulase livre (MAC FADDIN, 1997; BANNERMAN, 2003), além do teste de disco-difusão para avaliar a resistência bacteriana.
3.2.2.2.1 Teste da catalase
Em uma lâmina de vidro, foi depositada uma colônia da amostra bacteriana crescida em Ágar Tripticase Soja (Himedia®, Mumbai, India) a 37º C por 24 horas e adicionada a uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%. Os estafilococos formam bolhas devido à degradação do peróxido de hidrogênio pela ação da enzima catalase. Como controles positivos, foram utilizadas cepas S. aureus ATCC 29213.
3.2.2.2.2 Teste da oxidação e fermentação da glicose (OF)
A fim de determinar a capacidade de fermentação e/ou oxidação a partir da glicose, uma colônia das amostras bacterianas foi semeada em dois tubos com o meio E
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de Hugh & Leifson contendo 1% de Glicose (Himedia®, Mumbai, India), e foram posteriormente incubados a 37° C por 48 horas. Após a semeadura, foi adicionado em um dos tubos óleo mineral a fim de gerar uma atmosfera de anaerobiose. A capacidade de realizar metabolismo fermentativo e oxidativo foi observada a partir da mudança de cor do meio de verde para amarelo no tubo com óleo e sem óleo, respectivamente. Uma vez que o gênero Staphylococcus apresenta metabolismo fermentativo e oxidativo, a cor do meio de cultura fica amarela em ambos os tubos. Como controles positivo e negativo, foram utilizadas as cepas S. aureus ATCC 29213 e Pseudomonas
aeruginosa ATCC 25853, respectivamente. 3.2.2.2.3 Teste da coagulase livre
Em tubo contendo plasma de coelho liofilizado (New Prov®, Paraná, Brasil) diluído em solução salina a 0,85%, foram adicionadas cinco colônias da amostra bacteriana. A leitura foi realizada com 4 horas e 24 horas de incubação a 37° C, na qual observou-se que as amostras produtoras de coagulase formam um coágulo. Neste teste foram utilizados como controle positivo e negativo, respectivamente, as cepas de S.
aureus ATCC 29213 e S. epidermidis ATCC 12228. 3.2.2.2.4 Teste de Disco-difusão
Todas as amostras bacterianas de Staphylococcus spp obtidas no estudo foram avaliadas quanto à resistência aos agentes antimicrobianos pelo método de difusão de disco, segundo as recomendações do Clinical and Laboratory Standards Institute para amostras isoladas de animais (CLSI, 2008) e de humanos (CLSI, 2011).
A partir do crescimento em Ágar Tripticase Soja (Himedia®), a 37º C durante 24 horas em aerobiose, foram preparadas suspensões bacterianas em solução salina 0,9%, ajustadas em turvação equivalente ao grau 0,5 da escala de McFarland. Posteriormente, as suspensões foram semeadas em placas contendo o meio Ágar Mueller Hinton (Difco®, New Jersey, EUA) e discos de antimicrobianos (Cefar®, São
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Paulo, Brasil) foram depositados com auxílio de uma pinça estéril. As placas foram incubadas à 35º C por 18 a 24 horas em aerobiose.
Os agentes antimicrobianos testados foram: cefoxitina (30 µg), clindamicina (2 µg), cloranfenicol (30 µg), enrofloxacina (5 µg), eritromicina (15 µg), gentamicina (10 µg), oxacilina (1 µg), penicilina G (10 UI), sulfametoxazol-trimetoprim (23,75µg) e tetraciclina (30 µg). Foi avaliada também a resistência induzida à clindamicina pelo teste posicionando os discos de eritromicina e clindamicina a uma distância de 15 a 26 mm.
Após o período de incubação, os diâmetros dos halos de inibição de crescimento foram medidos para interpretação dos resultados. Foram consideradas resistentes à meticilina as amostras com os resultados obtidos com o uso do disco de cefoxitina e oxacilina para Staphylococcus coagulase negativos (CLSI, 2011) e com o disco de oxacilina para as espécies do grupo Staphylococcus intermedius (SCHISSLER et al, 2009). As amostras bacterianas foram identificadas como resistentes de forma induzida à clindamicina quando formaram um halo em forma da letra “D”.
3.2.3 Análise colpocitológica
Após a deposição das amostras de esfregaço vaginal em lâminas contendo a identificação de cada animal, estas foram acondicionadas em potes de plástico com divisórias, também previamente identificados, contendo álcool etílico a 95º em volume suficiente para recobrir as lâminas por completo e promover fixação adequada do material. Todas as lâminas foram coradas pela técnica de Papanicolaou (anexo 4). Na análise das amostras foi identificada a frequência das células do epitélio vaginal de acordo com a classificação estabelecida por GOMPEL E KOSS (1997) para a análise da citologia vaginal de humanos. Com base nas características morfológicas, foram contadas 200 células em aumento de 400X, em microscópio óptico de campo claro, conforme metodologia descrita na literatura de primatas não humanos por WRIGHT & BUSH (1977), e posteriormente identificadas e classificadas de acordo com a sua
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origem em células do epitélio superficial e células do epitélio profundo. Foram consideradas como células do epitélio superficial aquelas identificadas como: anucleadas, com núcleo em lise ou em picnose e como de epitélio profundo as células intermediárias pequenas, médias ou grandes, parabasais e basais.
A fase de proestro foi caracterizada por um predomínio de células intermediárias, poucas hemácias e células superficiais; o estro, por uma maior visualização de células superficiais e restos celulares; o diestro, por uma predominância de células parabasais e intermediárias pequenas, além da visualização de leucócitos, podendo apresentar traços de muco. O anestro foi identificado por uma maior observação de células parabasais e intermediárias, e ausência de células superficiais.
Figura 4 – Aspectos citológicos em Saimiri spp., em coloração de Papanicolaou- A: Fase de estro, com predominância de células superficiais (400X, negativo). B: Fase de diestro, ilustrando células parabasais (400X, negativo) (Fotos: Faculdade de Veterinária/UFF – setembro/2012).
3.2.4 Análise da progesterona
As análises da concentração sérica de progesterona foram realizadas em aparelho de radioimunoensaio de fase sólida utilizando-se kits comerciais de análise por iodo radiotivo (I125) (Coat-a-Count, Medlab), no Laboratório de Endocrinologia da
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Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, UNESP campus de Botucatu – SP (matrícula CNEN 14542).
O princípio do método do imunoensaio baseia-se em uma reação imunológica in
vitro entre antígeno e anticorpo. Com a introdução do hormônio marcado com isótopo
radioativo, este irá competir pelo mesmo anticorpo, em igualdade de condições com o hormônio natural. Praticamente todas as técnicas de imunoensaio utilizam o mesmo princípio básico, onde a quantidade de reagente marcado (antígeno ou anticorpo) quantifica o antígeno ou anticorpo não marcado na amostra (VOET & VOET, 1995).
O kit é composto por tubos de plástico aonde na sua parede há anticorpos anti-progesterona. Além dos tubos há o iodo 125 ligado à anti-progesterona. O ensaio consiste em colocar nos tubos 100 microlitros de plasma ou soro, em seguida adiciona-se 1 mL de iodo e a solução é incubada por uma hora a 37ºC. Após este tempo, descarta-se o conteúdo do tubo. Todo conteúdo do tubo deve ser drenado. Posteriormente este tubo é levado ao contador gama. O iodo emite radiação gama, assim, durante um minuto é realizada a contagem de toda a radiação gama emitida por este tubo. Para a determinação da concentração é feita comparação com o resultado com a curva padrão do kit, no qual há amostras de soro com concentrações de progesterona conhecidas, gerando a curva padrão.
Como base na quantificação, uma curva padrão é desenvolvida com quantidades fixas de hormônio marcado e proteína ligada, incubados juntos na presença de hormônio não marcado em concentração gradual e conhecida.
3.2.5 Análise Estatística
Os dados obtidos foram organizados em planilha Excel na forma de banco de dados, e o tratamento estatístico foi executado utilizando o SPSS versão 11 for
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Foi realizada uma análise exploratória sobre as variáveis quantitativas e qualitativas, representada através de estatísitica descritivas ou de gráficos. Para variáveis qualitativas foram utilizados os testes Exato de Fisher ou qui-quadrado para comparação de grupos. Para as variáveis quantitativas foram usados os testes de Mann-Whitney para comparação de duas amostras independentes, o teste de Kruskal-Wallis na comparação de duas ou mais amostras independentes.
Foi realizada uma análise de correlação entre as variáveis quantitativas, com teste de significância para as mesmas. Foi adotado nas análises um nível de significância de 5%. Em relação ao tratamento estatístico de dados, deve-se ressaltar que não há possibilidade de comparação estatística entre os recintos 1 e 2 , uma vez que os mesmos possuem menos de cinco indivíduos. Esse é considerado o número mínimo dentro de um grupo para gerar dados com significância.
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4. RESULTADOS
4.1 ANÁLISE DOS PRONTUÁRIOS INDIVIDUAIS
4.1.1 Perfil dos animais
Um dos parâmetros avaliados no estudo foi o peso dos animais. Em geral, média e o desvio padrão foram de 674,35 ± 91,576 g. Considerando as faixas etárias, esses valores foram de 598,40 ± 59,69 g (menos de quatro anos de idade), 695,90 ± 86,22 g (idade entre quatro e dez anos), e 684,57 ± 92,12 g (mais de dez anos de idade). Foram realizadas avaliações quanto ao peso separadamente entre os grupos (S.ustus Fiocruz,
S. sciureus Fiocruz e S. sciureus Cayenne), considerando, individualmente, os
respectivos recintos. Dentro de cada recinto, foram avaliadas as categorias em relação às faixas etárias e à hierarquia (tabelas 1, 2 e 3).
A tabela 2 mostra o peso da espécie S. sciureus (origem Fiocruz), não foi possível estabelecer nenhum tipo de comparação com nível de significância envolvendo individualmente o recinto 1, pois o mesmo abrigava quatro animais. Sendo o número inferior a cinco, nesse caso, não é possível gerar dados com significância. Em relação aos demais recintos (2, 5, 6 e 7), não houve nenhuma correlação significativa (p>0,05) dentro do parâmetro de peso. Entretanto, quando os recintos de S. sciureus (origem Fiocruz) foram analisados em maneira conjunta pelos testes de Kruskall Wallis e Mann
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Whitney, houve diferença significativa de peso (p<0,05). Pelo mesmo motivo citado anteriormente (n<5) nos recintos da espécie S. ustus (origem Fiocruz), não há correlação significativa no parâmetro peso entre essa espécie e S. sciureus (origem Fiocruz).
De acordo com os dados mostrados na tabela 3, ocorreu diferença significativa de peso entre os recintos da espécie Saimiri sciureus (origem Cayenne), seja quando analisados individualmente pelo teste de qui-quadrado de Pearson. Quando analisados em conjunto, foi apontada também diferença significativa de peso entre as faixas etárias dos micos-de-cheiro oriundos de Cayenne (destacada com a letra “a” em sobrescrito nas tabelas 3).
Foi também realizado tratamento estatístico com todos os animais estudados, considerando a faixa de corte de peso mínimo de 680 g. Foram observados abaixo dessa faixa de peso 92% dos animais com menos de quatro anos, e 47,2% daqueles com mais quatro anos, tidos como maduros sexualmente.
Tabela 1 – Comparação de peso dos recintos 1 e 2 (espécie Saimiri ustus - origem Fiocruz), considerando a divisão por faixa etária (Fiocruz, maio de 2011). (p<0,05)
Categorias Recintos 1 (n=3) 2 (n=5) Média ± Desvio padrão (em gramas) Geral do recinto 600,00 ± 105,83 756,00 ± 35,77
Entre 4-10 anos de idade -- 753,33 ± 46,18
>10 anos de idade 640,00 ± 113,13 760,00 ± 28,28 Geral da espécie S. ustus Fiocruz 697,50 ± 102,22
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Tabela 2 – Comparação de peso dos recintos 3, 4, 5, 6 e 7 (espécie Saimiri sciureus - origem Fiocruz), considerando a divisão por faixa etária (Fiocruz, maio de 2011). (p<0,05) Categorias Recintos 3 (n=4) 4 (n=5) 5 (n=7) 6 (n=6) 7 (n=16) Média ± Desvio padrão (em gramas)
Geral do recinto 720,00 ± 97,98 712,00 ± 102,56 685,71 ± 123,13 696,67 ± 82,38 675,00 ± 101,85 <4 anos de idade -- -- -- 606,67 ± 50,33 606,67 ± 50,33 Entre 4-10 anos de idade
800,00 ± 56,57 780,00 ± 52,91g -- 724,00 ± 88,34 709,09 ± 97,31 >10 anos de idade -- -- 640,00 ± 20,00 580,00 ± 87,18 550,00 ± 98,99 Geral da espécie S. sciureus
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Tabela 3 – Comparação de peso (g) dos recintos 8 a 22 (espécie Saimiri sciureus - origem Cayenne), considerando a divisão por faixa etária (Fiocruz, maio de 2011). (p<0,05)
a
p<0,05 comparando peso entre faixas etárias
Categorias Recintos 8 (n=10) 9 (n=5) 10 (n=7) 11 (n=7) 12 (n=11) 13 (n=15) 14 (n=14) 15 (n=9) 16 (n=6) 17 (n=12) 18 (n=7) 19 (n=9) 20 (n=9) 21 (n=8) 22 (n=2) Média ± Desvio Padrão (em gramas)
Geral do recinto 612,00 ± 85,99 700,00 ± 64,81 685,71 ± 35,99 797,14 ± 153,37 632,73 ± 49,21 610,67 ± 72,05 612,86 ± 43,40 673,33 ± 61,64 756,67 ± 32,04 668,33 ± 83,75 711,43 ± 72,90 675,56 ± 93,69 726,67 ± 74,83 687,50 ± 64,97 620,00 ± 41,42 <4 anosa 573,33 ± 94,52 -- -- -- 580,00 ± 28,28 560,00 ± 54,16 580,00 ± 40,00 -- -- -- 650,00 ± 14,14 -- 690,00 ± 98,99 -- -- 4-10 anosa -- -- -- -- 644,44± 45,58 570,00± 98,99 -- -- -- -- -- -- -- -- -- >10 anosa 628,57 ± 83,95 700,00 ± 64,80 690,00 ± 37,42 797,14 ± 153,37 ± 640,00 ± 66,33 614,00 ± 34,06 685,00 ± 54,25 756,67 ± 32,04 672,50 ± 79,24 736,00 ± 72,66 671,43 ± 103,83 743,33 ± 77,37 687,50 ± 64,97 -- Geral da espécie S. sciureus Cayenne 685,40 ± 95,99 40
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4.1.2 Análise do perfil reprodutivo dos animais
Na avaliação do perfil reprodutivo dos animais do presente estudo, foram abordadas as seguintes variáveis: classificação das fêmeas quanto ao número de parições, quantidade de partos por fêmea, intervalo entre partos, ocorrência de abortamentos e natimortos. No tratamento estatístico dessas variáveis, os animais foram divididos por espécie e sua origem, tal qual realizado no estudo da variável peso.
Com relação à quantidade de parições por fêmeas, estas foram classificadas em nulíparas, primíparas e pluríparas. Sendo assim, temos a classificação das fêmeas da espécie S. ustus (origem Fiocruz), S. sciureus (origem Fiocruz) e S. sciureus (origem Cayenne), respectivamente, nas tabelas 4, 5 e 6.
O tratamento estatístico dos dados sobre o número de partos por fêmea revelou diferença significativa (p<0,05) nos testes de Kruskall Wallis e Mann Whitney quando os recintos da espécie S. sciureus com origem Fiocruz foram avaliados conjuntamente (destacado em sobrescrito com a letra “a” na tabela 5). O mesmo ocorreu para o mesmo tipo de análise com S. sciureus com origem Cayenne (destacado em sobrescrito com a letra “a” na tabela 6). Também foi apontado p<0,05 de números de partos por fêmea quando comparada a origem Fiocruz X Cayenne, bem como entre as espécies S. sciureus e S. ustus através dos testes de Kruskall Wallis e Mann Whitney (destacado em sobrescrito com a letra “b” nas tabelas 4, 5 e 6).
