Aspectos imunológicos. Por Carlos Marcelo da Silva Figueredo, DDS, MDSc, PhD

(1)

Aspectos imunol

ó

_ó

gicos

_gicos

Por Carlos Marcelo da Silva Figueredo, DDS, MDSc, PhD

cmfigueredo@hotmail.com

www.periodontiamedica.com

(2)

por Carlos Marcelo da Silva Figueredo, DDS, MDSc, PhD

Nova ênfase da resposta do hospedeiro

na patogênese da doen

ç

a periodontal

•

• Uma grande varia

Uma grande varia

ç

ão na resposta inflamat

ó

ria de

um indiv

í

duo para o outro

(MOVIG et al.1988

, POCIOT et

al. 1992, SHAPIRA et al. 1994).

•

• Estudos epidemiol

Estudos epidemiol

ó

gicos em gêmeos

-

metade da

variabilidade da expressão da doen

ç

a periodontal

é

controlada por fatores gen

é

ticos

(MICHALOWICZ

1994 ).

(3)

por Carlos Marcelo da Silva Figueredo, DDS, MDSc, PhD www.periodontiamedica.com

Nova ênfase da resposta do hospedeiro

na patogênese da doen

ç

a periodontal

•

• Estudos epidemiol

Estudos epidemiol

ó

gicos demonstraram que

parâmetros microbiol

ó

gicos podem apenas

explicar uma pequena parte da prevalência e

incidência da doen

ç

a

(CRHISTERSSON et al. 1992,

BECK et al.1992, WHEELER et al. 1994).

(4)

O sistema imune e a destrui

ç

ão

tecidual

•

• A

A

ç

ão de neutr

ó

filos e mon

ó

citos/ macr

ó

fagos

atrav

é

s de suas enzimas lizossomiais.

•

• a indu

a indu

ç

ão de uma fun

ç

ão indesejada do sistema

inato pode ser parcialmente regulada pelo sistema

adaptativo, atrav

é

s da produ

ç

ão de opsinas

(anticorpos) e de citoquinas.

(5)

O sistema imune e a destrui

ç

ão

tecidual

•

• ATTSTR

ATTSTR

Ö

M & EGELBERG (1970) mostraram

que 95

-

97% das c

é

lulas eram neutr

ó

filos, 1.2%

linf

ó

citos, e 2

-

3% mon

ó

citos. Essa propor

ç

ão se

mant

é

m a mesma quando o n

ú

mero de c

é

lulas

aumenta.

(6)

Patógenos periodontais

Invasão bacteriana

Proteases bacterianas

Destruição tecidual

Neutrófilos

Monócitos

Linfócitos

Proteases

RLO

MMP

Ativação de osteoclastos

Epitélio

Endotélio

Fibroblastos

Sinais pró-inflamatórios

IL-1 TNF

(7)

(8)

Lesões histol

ó

gicas

(

Page & Schroeder, 1976)



Inicial



Precoce



Estabelecida



(9)

Gengiva Clinicamante sadia

neutr

ó

filos

Mon

ó

citos/

macr

(10)

Lesão inicial (1

-

4 dias)

coloniza

colonizaçção bacterianaão bacteriana

Neutr

ó

filos

Mon

ó

citos/macr

ó

fagos

Prote

í

nas plasm

á

ticas

Vasculite

Perda de col

á

geno

forma

(11)

Lesão precoce (4

-

7 dias

)

Coloniza

Colonizaçção bacterianaão bacteriana

Neutr

ó

filos

Mon

ó

citos/macr

ó

fagos

Linf

ó

citos (c

é

lulas B e T)

Aumento da vasculite

Prolifera

ç

ão de vasos

Aumento da perda

de col

(12)

Lesão estabelecida (7

-

14 dias)

Coloniza

Neutr

ó

filos

Mon

Monó

ó

citos/macr

ó

fagos

Linf

ó

citos (c

é

lulas B e T)

Aumento da vasculite

Prolifera

ç

ão de vasos

Aumento da perda

de col

(13)

Lesão avan

ç

ada

coloniza

colonizaçção bacterianaão bacteriana

Neutr

ó

filos

Neutr

ó

filos

Mon

ó

citos/macr

ó

fagos

Linf

ó

citos (c

é

lulas B e T)

Aumento da vasculite

Prolifera

ç

ão de vasos

Aumento da perda

de col

á

geno

Prod. IgG

Atividade osteocl

á

stica

Migra

ç

ão do

epit

(14)

GCF

Coloniza

Neutr

ó

filos

Neutr

Neutró

ó

filos

Mon

ó

citos/macr

ó

fagos

Linf

ó

citos (c

é

lulas B e T)

Aumento da vasculite

Prolifera

ç

ão de vasos

Aumento da perda

de col

á

geno

Prod. IgG

Atividade osteocl

á

stica

Migra

ç

ão do

epit

(15)

Inflamed

site

IL

-

1

1 TNF

TNF

IL

-

8

8 Stimulation

Stimulation

of local cells

Neutrophils

L

-

selectin

_Spreading

up regulation

of adhesion molec.

IL

-

8

8 Activation of other cells:

Activation of other cells:

T cells: chemotaxis

Basophils:histamine release

Eosinophils:chemotaxis

Respiratory burst

LTB

₄

Phagocytosis

Lysosomal

enzyme release

(16)

L-selectin

SLex

P-selectin

L-selectin ligant

E-selectin

Rolling

Histamine

Thrombin

Oxidants

LPS

Leukotrienes

Cytokines (IL-1

and TNF)

Activation

Firm

adhesion

Leukocyte

Endothelial

Tissue

Cytokine

and chem.

receptors

IL-8

E-selectin

IL-5

IL-8

fMLP

C5a

integrins

(CD 11a, b, c

and VLA-1, 2)

ICAM-1, 2

VCAM-1

IL-1

TNF-

IL-4

IFN-

Trans

migration



integrins

ICAM-1

VCAM-1

Chemokines

Chemoattract

Migration



integrins

Extracellular

matrix

components

Chemokines

Chemoattract

Adhesive interactions

(from Carlos & Harlan, 1994)

Selectins Integrins and Ig-like

(17)

Visão geral do projeto de pesquisa

Micro organismos

Atividade de neutrófilos

D

eg

ra

d

aç

ão

t

ec

id

u

al

S

in

ai

s

p

ró

-i

n

fl

am

at

ó

ri

o

s

Al

te

ra

çõ

es

c

lí

n

ic

as

Citoquinas em

Plasma e GCF:

IL-1, TNF-,

IL-6, IL-8

IL-13, IL-10

IL-1 RA

Liberação in vitro:

Elastase, lactoferrina,

A1AT, citoquinas, e

RLO

No fluído:

Protease, elastase,

MMP-8, MMP-9,

lactoferrina

Degradação

No fluído:

Laminina

Elastina

Colágeno

(18)

IL-1

, TNF-,

IL-8

Elastase

Lactoferrina

RLO

MMP-9

Colágeno

Elastina

Laminina

Alterações

clínicas

Flu

(19)

Poss

í

veis explica

ç

ões para uma

resposta aberrante

•

• Mon

Mon

ó

citos hiperreativos com um aumento

da libera

ç

ão de PGE2, IL

-

1

1 



e TNF

-



.

•

• Aumento gen

Aumento gen

é

tico na produ

ç

ão de

IL

-

1

1 



e/ou outras substâncias pr

(20)

Poss

í

veis explica

ç

ões para uma

resposta aberrante

•

• Defeitos funcionais em neutr

Defeitos funcionais em neutr

ó

filos que

levem a um dano na quimiotaxia e

fagocitose.

•

• Neutr

Neutr

ó

filos hiperreativos com aumento na

libera

(21)

Neutr

ó

filos x bact

é

ria (Lindhe 1997)

Y

Developing

phagolysosome

NADPH NADP

-O

₂

O

₂

_H

2

O

2

Myeloperoxidase

Lactoferrin

Proteases

Phagosome

(22)

Neutr

ó

filos x Periodontite

Mecanismos de a

ç

ão:



Pico respirat

_{Pico respirat}

ó

rio



Apoptose

_Apoptose



(23)

Protease livre

Protease:

enzimas com potencial

destrutivo contra prote

í

nas (col

á

geno,

elastina, etc).

Origem:

externa (bact

_{externa (bact}

é

_é

rias) ou interna

_{rias) ou interna}

(produto da degranulacão de c

é

lulas

inflamat

(24)

Como agem?

migração de células

inflamatórias

Agente irritante

Liberação extra celular de enzimas

causam destruição tecidual

(25)

Como controlar?

•

• O organismo produz inibidores de protease

O organismo produz inibidores de protease

que a inativa em milisegundos.

•

• Por

Por

é

m, acredita

-

se que na periodontite este

equil

í

brio

é

quebrado por uma parcial

inativa

ç

ão dos inibidores.

(Weiss, 1989)

(26)

Como controlar ?

Proteases livres

Produção de inibidores

(A1AT e A2MG)

Formação de complexos

inibidores-proteases

Controle da destruição

tecidual.

(27)

Inibidores de proteases



Estão presentes tanto na corrente

_{Estão presentes tanto na corrente}

sang

üí

nea quanto no espa

ç

o

intracelular.



Principais: alpha 1 antitripsina e

_{Principais: alpha 1 antitripsina e}

alpha 2 macroglobulina.

(28)

Inibidores de proteases

• A1AT:

Uma molécula muito

menor que o A2MG, o que o torna

principal inibidor de proteases no

fluido gengival, porém não inibe

proteases bacterianas.

(29)

Protease

Anti protease

Protease - inhibitor complex

Ativo

Ativa

Inativado

(30)

Protease

Inativo

Ativa

Anti protease

Destrui

(31)

Protease livre

•

• Sendo assim, a presen

_{Sendo assim, a presen}

ç

_ç

a de

_{a de}

proteases livres poderia ser um

importante indicador de doen

ç

_ç

a

_a

periodontal ativa.

(32)

Protease activity in gingival

crevicular fluid

Presence of free protease

Figueredo, CMS & Gustafsson, A.

Journal of

Clinical Periodontology

(33)

Aim

•

• To determine the presence of free

To determine the presence of free

protease activity in GCF from

inflamed sites with or without

tissue destruction.

(34)

Material and methods



12

12 GG.

GG.



19

19 GP and d PP.

GP and d PP.



FITC

-

conjugated casein.

conjugated casein



Transferrin.



A1AT

-

to

analyze if the

protease

activity

(35)

Results

Test/ site

GG

GP

PP

Protease activity (ng)

25

52

230 Residual activity

1.2

1.0

6.4 Transferrin

729

266

590 Inhibition %

89

96

88

(36)

0

0.05

0.1

0.15

Fig 1. Ratio between protease activity and transferrin

Results

(37)

Conclusion

Free protease can be found in GCF

Higher concentration in sites with deep

pockets.

The contribution from proteases

insensitive to inhibition by A1AT is limited.

(38)

Neutrophil elastase

•

• Degrades

Degrades

collagen

, proteoglycans and

basement membranes components.

•

• Normally

Normally

inhibited

within milliseconds

by

(39)

Activity and inhibition of

elastase

Figueredo, CMS & Gustafsson, A.

Journal Clinical Periodontology

1998;

(40)

Material and methods

•

• Chromogenic granulocyte elastase

Chromogenic granulocyte elastase

substrate.

•

• E

E

-

A1AT.

•

• E

E

-

A2MG.

(41)

Elastase in GCF

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180 GG

GP

PP

Free elastase

Elastase-A2MG

Elastase-A1AT

n=12 n=19 n=19

Cell

equivalents

x 10

3

(42)

Correlation between the elastase

Alpha-1-antitrypsin complex and

free elastase

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 20 40 60 80 100 Elastase-A1AT complex %

Free elastase %

n=50 samples

(43)

Conclusion

•

• The elevated levels of

The elevated levels of

free elastase

in sites

with

tissue destruction

seem to be a

combination

of

increased

release of

elastase

(44)

Hiperatividade celular

–

evidências

cient

í

ficas e poss

í

veis causas

• Parece não haver diferença no número total

de neutrófilos presentes em uma lesão de

gengivite crônica e outra de periodontite

(45)

Hiperatividade celular

–

evidências

cient

í

ficas e poss

í

veis causas

A hiperatividade de neutrófilos, uma das

principais hipóteses para a destruição

tecidual em inflamações crônicas, baseia-se

na teoria de que essas células existem em

três estágios:

(46)

Hiperatividade celular

–

evidências

cient

í

ficas e poss

í

veis causas

• Entre as substâncias com capacidade de pré-ativar

neutrófilos estão a IL-1, IL-6, IL-8 e TNF.

• Tem sido convincentemente demonstrada in vitro,

não apenas para a

periodontite

, como também para

a

síndrome da angústia respiratória aguda

(ARDS)

(LEE et al. 1981),

e

enfisema pulmonar

(JANOFF 1985),

entre outras doenças crônicas

(47)

Hiperatividade celular

–

evidências

cient

í

ficas e poss

í

veis causas

• Produção de radicais livres de oxigênio como

marcadores de atividade celular

(GUSTAFSSON &

ÅSMAN 1996, FREDRIKSSON et al. 1998)

• Liberação excessiva de elastase por neutrófilos

periféricos:



Periodontite Juvenil

(ÅSMAN 1988)

(48)

Increased release of elastase

from in vitro activated

peripheral neutrophils in

patients with periodontitis

Figueredo CMS, Gustafsson A, Åsman B & Bergström K.

(49)

Introduction

•

• Gustafsson et al. (1994)

Gustafsson et al. (1994)

-

Increased

activity per cell in GCF.

•

• Results demonstrated in Juvenile

Results demonstrated in Juvenile

periodontitis.

•

(50)

Material and Methods

•

• 15 patients with periodontitis and 15

15 patients with periodontitis and 15

-

-sex

sex

-

and age

-

matched healthy controls

•

• Leukocyte preparation.

Leukocyte preparation.

•

• Degranulation:

Degranulation:

1.0 x 10

6

6 neutrophils +IgG opsonized

neutrophils +IgG opsonized

Staphylococcus aureus

(1:75) incubated in

HBSS for 1h at +37

(51)

Material and Methods

•

• Elastase activity.

Elastase activity.

•

• E

E

-

A1AT

•

• A1AT

A1AT

•

• Lactoferrin.

Lactoferrin.

•

(52)

por Carlos Marcelo da Silva Figueredo, DDS, MDSc, PhD C0 CB P0 PB 0 200 400 600 800 1000

Elastase in the pellet Elastase Released Cel ls eq u ival en ts X 10 3

(53)

por Carlos Marcelo da Silva Figueredo, DDS, MDSc, PhD www.periodontiamedica.com 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 Controls Patients Cell eq u iv a len ts x10 3

(54)

Results

C0

P0

CB

PB

Elastase released (cellsx10

3

)

252 (87)

328 (127)

445 (165)

650(267)

E-A1AT complex (a.u)

21.7 (2.1)

22.9 (2.5)

35.4 (2.8)

39.1 (4.0)

Total A1AT (mol/L)

57.1 (59.8)

53.6 (29.4)

88.3 (29.1)

81.2 (21.2)

Lactoferrin (ng/mL)*

194 (32)

168 (43)

822 (198)

558 (88)

(55)

Results

C0 - CB*

P0 - PB*

C0 - P0**

Elastase released

0.002

0.001

0.024 Total elastase

NS

0.013 NS

Total A1AT (mol/L)

0.041

0.002 NS

E-A1AT complex (a.u)

0.007

0.002 NS

(56)

Conclusion

•

• Neutrophils from AP release more

Neutrophils from AP release more

elastase after

in vitro

activation.

•

• This higher activity is not due to

This higher activity is not due to

impared inhibiton by A1AT.