UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE INSTITUTO METRÓPOLE DIGITAL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOINFORMÁTICA
EDEN SILVA E SOUZA
Análise do alvo predito da plumieridina em Cryptococcus neoformans
NATAL - RN 2020
EDEN SILVA E SOUZA
Análise do alvo predito da plumieridina em Cryptococcus neoformans
Defesa de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioinformática da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte.
Área de concentração: Bioinformática
Linha de Pesquisa: Biologia de Sistemas
Orientadora: Profa. Dra. Marilene Henning Vainstein
NATAL - RN 2020
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências
Souza, Eden Silva e.
Análise do alvo predito da plumieridina em Cryptococcus neoformans / Eden Silva e Souza. – Natal, RN, 2020.
57 f.
Orientadora: Profa. Dra. Marilene Henning Vainstein
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Biociências. Programa Regional de Pós-Graduação em Bioinformática.
1. Cryptococcus neoformans – Dissertação. 2. Plumieridina – Dissertação. 3. Antifúngico – Dissertação. 4. Bioinformática – Dissertaçao. I. Vainstein, Marilene Hennig. II. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. III. Título.
EDEN SILVA E SOUZA
Análise do alvo predito da plumieridina em Cryptococcus neoformans
Defesa de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioinformática da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Área de concentração: Bioinformática Linha de Pesquisa: Biologia de Sistemas
Orientadora: Profa. Dra. Marilene Henning Vainstein
Natal, 28 de fevereiro de 2020.
]
BANCA EXAMINADORA
___________________________________________ Profa. Dra. Marilene Henning Vainstein
(Presidente)
___________________________________________ Prof. Dr. Gustavo Antônio de Souza
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
___________________________________________ Euzebio Guimarães Barbosa
Universidade Federal do Rio Grande do Norte
___________________________________________ Charley Christian Staats
AGRADECIMENTOS
Agradeço à minha orientadora Marilene Vainstein pela oportunidade de participar de um projeto que tanto que me permitiu aprender; e ao meu coorientador, João Paulo por todo suporte e paciência durante estes dois anos.
Ao professor Euzebio por toda ajuda nos experimentos in silico.
Aos meus amigos do BioMe, Thiago, Themi, Felipe, Daniela, Raul, Diego, Karla, Maria Eduarda, Lucas e Tayrone, que riram e se desesperaram comigo durante o mestrado.
Aos integrantes do CBiot, Vanessa, Nicolau, Rafael, Júlia, Eamin, Ane e Matheus, pela disponibilidade de ajudar e ensinar. Agradecimento especial a Vanessa, Julia e Nicolau pelas contribuições durante a escrita do manuscrito.
Aos meus amigos, Riani, Herbeson e Jadilson, que mesmo de longe me aguentam falar sobre minhas aventuras acadêmicas e riem comigo dos problemas.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa concedida no período de abril de 2018 a fevereiro de 2020.
RESUMO
Criptococose é uma infecção fúngica causada por leveduras de Cryptococcus spp. A infecção inicia-se quando células dessecadas ou esporos são inalados e chegam aos pulmões. Se a doença não for propriamente tratada, a infecção pode evoluir, atingir o sistema nervoso central e resultar em meningite meningocócica e até em óbito. O tratamento da criptococose é realizado em três estágios e faz uso de três drogas: fluconazol, anfotericina B e 5-flucitosina. Embora eficaz, o uso destas drogas pode resultar no surgimento de resistência fúngica, efeito tóxico para os pacientes e fármacos com a flucitosina não são comerciados em todos os países. Desta forma, propõe-se investigar o modo de ação do composto antifúngico plumieridina bem como a identificação do seu alvo molecular em C. neoformans. Para isso, realizou-se uma série de experimentos in vitro e in silico. Inicialmente, frações cromatográficas do extrato aquoso das sementes de Allamanda polyantha foram submetidas a ensaios de atividade antimicrobiana. Submeteu-se a fração com atividade antifúngica a análise de ressonância magnética nuclear de carbono e hidrogênio afim de se identificar compostos presentes na amostra. Atividade antifúngica, avaliada através de ensaios antifúngicos, foi de 0.250 mg/mL e o componente majoritário na fração foi a plumieridina. Através da triagem virtual baseada na similaridade do ligante, quitinase foi identificada como alvo molecular da plumieridina. Modelos tridimensionais das quitinases de C. neoformans foram criados e, através do atracamento molecular, observou-se a interação com resíduos do sítio ativo. Ensaios de inibição da atividade quitinolítica mostraram que a atividade é significativamente reduzida na fração secretada e fração celular solúvel. No entanto, a atividade quitinolítica é pouco reduzida pela presença de plumieridina na fração celular insolúvel, onde são necessárias maiores concentrações do composto. Embora plumieridina seja capaz de inibir a atividade quitinolítica, o composto não parece estar relacionado aos níveis transcricionais das quitinases de C. neoformans, reduzindo apenas os níveis transcricionais do gene CHI22. Observou-se que extratos contendo quitinases de macrófagos de camundongo, Bacillus subitilis e de Tenebrio molitor também são inibidos na presença de plumieridina. O tratamento com plumieridina ainda altera o padrão de distribuição dos quitooligômeros na parece celular: de um padrão polarizado para um padrão difuso pela parede. Os resultados validam a predição da triagem virtual e mostram que a inibição da atividade quitinolítica pela plumieridina resulta em divisão celular incompleta e, consequente, atividade antifúngica. Finalmente, os resultados indicam que a plumieridina inibe quitinase e cause morte de C. neoformans, entrentanto, a inibição também ocorre em outros membros da família GH18, indicando que este é um potencial inibidor de GH18.
Palavras-chave: Cryptococcus neoformans, plumieridina, antifúngico, bioinformática, triagem virtual, alvo de drogas, quitinase, GH18.
ABSTRACT
Cryptococcosis is a fungal infection caused by yeast from Cryptococcus spp. The infection starts when desiccated cells or spores are inhaled and reach the lungs. If the disease is not properly treated, the infection can progress, reach the central nervous system and result in meningococcal meningitis and even death. Cryptococcosis treatment is carried out in three stages and uses three drugs: fluconazole, amphotericin B and 5-flucytosine. Although effective, the use of these drugs can result in the emergence of fungal resistance, a toxic effect for patients, and drugs as flucytosine are not commercialized worldwide. Thus, it is proposed to investigate the mode of action of the antifungal compound plumieridine as well as the identification of its molecular target in C. neoformans. For this, a series of experiments were carried out in vitro and in silico. Initially, chromatographic fractions of the aqueous extract of Allamanda
polyantha seeds were subjected to antimicrobial activity tests. The fraction with antifungal
activity was subjected to nuclear magnetic resonance analysis of carbon and hydrogen in order to identify compounds present in the sample. Antifungal activity, evaluated through antifungal tests, was 0.250 mg/mL and the major component in the fraction was plumieridine. Through virtual screening based on ligand’s similarity, chitinase was identified as the molecular target of plumieridine. Three-dimensional models of chitinases from C. neoformans were created and, through molecular docking, interaction with residues from the active site was observed. Chitinolytic activity inhibition assays showed that the activity is significantly reduced in the secreted fraction and soluble cell fraction. However, chitinolytic activity is little reduced by the presence of plumieridine in the insoluble cell fraction, where higher concentrations of the compound are needed. Although plumieridine is able to inhibit chitinolytic activity, the compound does not appear to be related to the transcriptional levels of chitinases of C.
neoformans, reducing only the transcriptional levels of the CHI22 gene. It was observed that
crude extracts containing chitinases from mouse macrophages, Bacillus subitilis and Tenebrio
molitor are also inhibited in the presence of plumieridine. The treatment with plumieridine still
alters the distribution pattern of the chitooligomers in the cell wall: from a polarized pattern to a diffuse pattern through the wall. The results validate virtual screening prediction and show that the inhibition of chitinolytic activity by plumieridine results in incomplete cell division and, consequently, antifungal activity. Finally, the results indicate that plumieridine inhibits chitinase and causes death of C. neoformans, however, the inhibition also occurs in other members of the GH18 family, indicating that this is a potential inhibitor of the GH18 family.
Keywords: Cryptococcus neoformans, plumieridine, antifungal, bioinformatics, virtual screening, drug target, chitinase, GH18.
LISTA DE ABREVIATURAS
MIC Concentração inibitória mínima, do inglês: Minimum inhibitory concentration MC Meningite meningocócica, do inglês: Meningococcal meningitis
GlcNAc N-acetilglicosamina GXM Glucoronoxilomanana GalXM Galactoxilomanana
RT-qPCR PCR quantitativa em tempo real, do inglês: Real time quantitative PCR AmB Anfotericina B
5-FC 5 Flucitocina FZ Fluconazol
GH Glicosil hidrolases, do ingles: Glycoside hydrolase
AMCase Quitinase ácida de mamíferos, do inglês Acidic mammalian chitinase VS Triagem virtual, do inglês: Virtual screening
SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ... 10 2 REVISÃO DE LITERATURA ... 11 2.1 Criptococose ... 11 2.2 Cryptococcus neoformans ... 12 2.3 Tratamento da criptococose ... 15
2.4 Predição de alvos moleculares ... 17
2.5 Quitinases ... 18 2.6 Inibidores de quitinases ... 20 2.7 Allamanda polyantha ... 21 2.8 Justificativa do estudo ... 22 3 OBJETIVO ... 23 3.1 Geral ... 23 3.2 Específicos ... 23 4 CONCLUSÕES ... 24 REFERÊNCIAS ... 25 CAPÍTULO I ... 32
1 INTRODUÇÃO
As variedades de leveduras que compõe o complexo de espécies Cryptococcus
neoformans e Cryptococcus gattii são os agentes etiológicos da criptococose (KWON-CHUNG et al., 2014). Cryoptococcus neoformans é uma espécie ubíqua, comumente encontrada em
fezes de pombos, que tende a infeccionar indivíduos imunocomprometidos, como recém-transplantados e portadores do vírus HIV/AIDS (LIN, 2009). As estruturas na superfície envolta das células (membrana plasmática, cápsula polissacarídica e parede celular) destas leveduras garantem sucesso na entrada de células hospedeiras, sem que sejam destruídas por componentes do sistema imunológico, e estão relacionadas a patogenicidade das cepas (AGUSTINHO et al., 2018). Determinantes de virulência, como por exemplo, a proteína antifagocítica (App1) e lacases (Lac1 e Lac2), que estão relacionadas à parede celular, atuam como fatores de virulência e de resistência a antifúngicos (ORNER et al., 2019).
Criptococose, a infecção causada por Cryptococcus spp., inicia-se quando propágulos são inalados (VELAGAPUDI et al., 2009). Uma vez nos pulmões, as células podem permanecer latentes, evitando fagocitose por conta de componentes da cápsula. Quando fagocitadas, as células conseguem sobreviver e se multiplicar dentro dos fagócitos; a evasão das células de C. neoformans ocorre sem que o sistema imune seja ativido (ZARAGOZA et al., 2009). Nos pulmões estes fungos desenvolvem o quadro de criptococose pulmonar, que se manifesta na forma de tosse crônica, com presença de sangue, dificuldade respiratória e febre (LAM et al., 2001). Ainda nos macrófagos alveolares, as células de C. neoformans se reproduzem e conseguem evadir sem matar as células de defesa e, consequentemente, gerar resposta imunológica (ALVAREZ; CASADEVALL, 2006). Caso não haja diagnóstico precoce ou tratamento adequado, células de C. neoformans podem migrar para o sistema nervoso central, onde desencadeiam o quadro mais comum da infecção, a meningite meningocócica (COLOMBO; RODRIGUES, 2015).
O tratamento recomendado da criptococose faz uso de três medicamentos em um regime de três etapas (MOURAD; PERFECT, 2018). A primeira etapa, chamada de indução, faz uso da anfotericina B (AMB) ou AMB lipossomal (LAMB), em conjunto com 5-flucitosina, esta etapa dura de duas a quatro semanas (PERFECT et al., 2010). A LAMB tem mostrado maior atividade antifúngica do que AMB (CHEN, 2002). A etapa de consolidação faz uso de cerca de 800 mg por dia de fluconazol e dura oito semanas (PAPPAS et al., 2009). Por fim, a etapa de manutenção utiliza 200 mg por dia de fluconazol e pode durar de seis a 12 meses (PERFECT
et al., 2010). Embora esse seja o tratamento ideal, adequações são feitas em países onde não se
O tratamento citado é mundialmente utilizado, porém estas drogas apresentam efeitos adversos. A AMB, por exemplo, quando utilizada por longos períodos, pode resultar em hepato e nefrotoxicidade, além de náusea, febre e hipóxia (LANIADO-LABORÍN et al., 2009; OSTROSKY-ZEICHNER et al., 2010). O surgimento de linhagens resistentes também é observado durante o uso de AMB (ELLIS, 2002). A monoterapia com fluconazol ou 5-FC também pode resultar no surgimento de cepas resistentes e até desencadear outras infecções fúngicas, o que torna o tratamento com estas drogas combinadas o mais eficaz (SHEEHAN; HITCHCOCK; SIBLEY, 1999; CHEN; SORRELL, 2007). Além do mais, a administração de AMB é feita por via intravenosa, o que demanda pessoal e ambiente adequado para realização do tratamento (HO et al., 2017).
Diante do que foi exposto, drogas mais acessíveis, menos tóxicas e que não resultem em resistência são urgentemente necessárias para o tratamento da criptococose. Neste contexto, Bresciani (2013) identificou no extrato aquoso das sementes de Allamanda polyantha iridoides com atividade anti-Cryptococcus spp. Dentre estes iridoides encontra-se a plumieridina. Sabendo que a plumieridina tem atividade fungicida contra C. neoformans, o presente trabalho objetivou a identificação do alvo molecular da plumieridina no fungo e, consequentemente, melhor entendimento da sua atividade anti-Cryptococcus.
2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Criptococose
Criptococose, uma doença reportada em todo mundo, acomete cerca de 1 milhão de pessoas e causa mais de 600,000 mortes por ano (PARK et al., 2009), sendo que, 80% dos casos estão relacionados a pacientes portadores do HIV (JARVIS et al., 2010). Para exemplificar estes dados, estima-se que em 2014, 278 000 portadores do HIV possuíam anticorpos
anti-Cryptococcus, destes casos 223 100 resultaram em meningite meningocócica (CM - cryptococcal meningitis) apenas no ano em questão (RAJASINGHAM et al., 2017). Casos de
meningite em indivíduos não portadores do vírus HIV geralmente estão associados a transplantes recentes, por exemplo, estima-se que nos Estados Unidos 15% dos casos de CM ocorre nesta coorte de pacientes (PYRGOS et al., 2013)
A infecção causada por Cryptococcus spp. pode variar desde uma infecção cutânea (WANG et al., 2015) até infecções sistêmicas fatais (HAYASHIDA et al., 2017). Leveduras de
C. neoformans podem ser encontradas no trato respiratório de indivíduos saudáveis sem causar
o quadro de infecção, onde hipotetiza-se que o fungo pode ser comensal, residente passageiro ou causador de lesões no epitélio (RANDHAWA; PAL, 1977). O processo infeccioso inicia-se
com a inalação dos propágulos que, por conta do tamanho pequeno (1.5 –3.5 µm), alcançam os macrófagos nos alvéolos pulmonares (GEORGE et al., 2017). Porém, indivíduos portadores do HIV/AIDS, em uso de supressores da imunidade celular ou que sofrem de cirrose hepática, são grupos de risco para CM e criptococcemia, que é o quadro sistêmico da doença (LIN; SHIAU; FANG, 2015).
Quando a criptococose pulmonar não é tratada, as leveduras podem atingir o sistema nervoso central, onde desenvolve-se a CM. Por conta dos determinantes de virulências de C.
neoformans, estas leveduras tem tropismo ao tecido do sistema nervoso central (CNS)
(COELHO; BOCCA; CASADEVALL, 2014). Esta doença frequentemente se manifesta na forma de dores de cabeça, febre e vômito e náusea, se não tratada, os sintomas evoluem para confusão mental, perda de consciência e até coma (MOODLEY et al., 2012). Meningite meningocócica é a causa mais comum da doença em pacientes portadores do HIV e frequentemente é fatal (WILLIAMSON et al., 2017).
2.2 Cryptococcus neoformans
Cryptococcus neoformans é uma espécie de levedura encapsulada que forma estrutura
vegetativa do tipo basídio. Esta espécie é patogênica para humanos e muito utilizada como modelo para o estudo de fatores de virulência em fungos (HULL; DAVIDSON; HEITMAN, 2002). As variedades de C. neoformans junto com as de C. gatti, formam o complexo de espécies patogênicas dentro de Cryptococcus spp. e podem ser diferenciadas através de ensaios bioquímicos (CHANG et al., 2015) e genéticos (BILLMYRE et al., 2002).
C. neoformans é uma espécie cosmopolita e o principal agente causador da criptococose.
A presença de C. neoformans é historicamente relacionada a presença de aves, em especial, pombos (EMMONS, 1955). No entanto, estas leveduras foram primeiramente isoladas de uma infecção (BUSSE, 1894) e, posteriormente, no mesmo ano foram encontradas no suco de pêra (SANFELICE, 1894). Em 1895 um caso de úlcera epidérmica foi relacionado a presença de
Cryptococcus spp., onde, neste paciente, leveduras de também foram encontradas em órgãos,
que veio a óbito (MADA; JAMIL; ALAM, 2019). Desde então a comunidade científica tem realizado esforços a fim de entender os mecanismos da virulência de C. neoformans (ESHER; ZARAGOZA; ALSPAUGH, 2018; CUOMO; RHODES; DESJARDINS, 2018; LIU; PERLIN; XUE, 2012)
Estudos moleculares, utilizando técnicas como amplified fragment length
polymorphisms (AFLP) (HAGEN et al., 2010) e multilocus sequence typing (MLST) (MEYER et al., 2009), tem proposto diferentes classificações a respeito da diversidade de taxa dentro
Cryptococcus spp. Hagen e colaboradores (2015) classificam, com base na genotipagem
utilizando as ténicas MLST e PCR-fingerprinting, o complexo de espécies Cryptococcus
gatti-Cryptococcus neoformans em sete espécies propostas.
O Quadro 1 apresenta o nome usado antes desta classificação, a posição dos clados gerados com base no sequenciamento multilocus (MLST) e o nome específico proposto, porém ainda há debate em relação a quantidade de clados de Cryptococcus spp. Dados indicam que o tipo molecular de C. neoformans mais abundante na América Latina é o VNI (FIRACATIVE; LIZARAZO; ILLNAIT-ZARAGOZÍ; CASTAÑEDA, 2018). No entanto, um estudo realizado no Brasil mostrou que o tipo molecular mais identificado no Sul país é o VNII (WIRTH; AZEVEDO; GOLDAN, 2018).
Quadro 1. Classifição do complexo de espécies Cryptococcus gattii-Cryptococcus neoformans.
Nome específico antigo Clado MLST Tipo molecular Nome específico proposto Cryptococcus neoformans var. grubii Clado F, AFLP1 Clado G, AFLP1A/VNB Clado H, AFLP1B VNI VNII VNII Cryptococcus neoformans Cryptococcus neoformans var. neoformans
Clado I, AFLP2 VNIV Cryptococcus
deneoformans
Cryptococcus neoformans variedade híbrida
AFLP3 VNIII Híbrido
Cryptococcus neoformans x Cryptococcus deneoformans
Cryptococcus gattii Clado D, AFLP4 Clado C, AFLP5 Clado A, AFLP6 Clado E, AFLP7 VGI VGIII VGII VGIV Cryptococcus gattii Cryptococcus bacillisporus
Clado B, AFLP10 VGIV/VGIIIc Cryptococcus deuterogattii Cryptococcus tetragattii Cryptococcus decagattii Cryptococcus neoformans var. neoformans x Cryptococcus gattii hibrido
AFLP4/VGI AFLP8 NA Híbrido Cryptococcus deneoformans x Cryptococcus gattii Cryptococcus neoformans var. grubii x Cryptococcus gattii híbrido AFLP4/VGI
AFLP9 NA Híbrido Cryptococcus neoformans x Cryptococcus gattii Cryptococcus neoformans var. grubii x Cryptococcus gattii híbrido AFLP6/VGII
AFLP11 NA Híbrido
Cryptococcus neoformans x Cryptococcus deuterogattii
Os tipos moleculares NA não foram descritos na literatura até o momento. (Adaptado de Hagen et al., 2015).
Para que um fungo tenha sucesso na patogênese são necessárias certas adaptações a resposta imune do hospedeiro, como tolerância a altas temperaturas e variação de pH, alterações na disponibilidade de nutrientes (ORNER et al., 2019). Além disso, os fatores de virulência contribuem para o quadro infeccioso e resistência a drogas. A melanina é um dos fatores de virulência mais estudados em C. neoformans, sua síntese ocorre a partir de compostos fenólicos,
como a epinefrina, que se encontram em altas concentrações no sistema nervoso central e contribuem para o tropismo deste fungo neste tecido (WILLIAMSON, 1994; POLACHECK; HEARING; KWON-CHUNG, 1982) e para defesa contra antifúngicos (ALP, 2010).
Além da melanina, a cápsula polissacarídica é uma estrutura amplamente estudada, majoritariamente composta por glucoronoxilomanana (GXM), que compõe cerca de 90% do seu conteúdo, e galactoxilomanana (GalXM), que correspode a cerca de 5%. Dentre os outros componentes da cápsula estão as manoproteínas (1%) e substâncias semelhantes a quitina (RODRIGUES et al., 2008; ZARAGOZA et al., 2009). Em C. neoformans, a cápsula sofre alterações em decorrência de condições ambientais (PIERINI; DOERING, 2001) e mutantes de
C. neoformans com defeito na cápsula apresentam células viáveis, porém, avirulentos
(CHANG; KWON-CHUNG, 1994), o que reforça o papel da cápsula no processo infeccioso. Os mecanismos que o fungo utiliza para evitar fagocitose e “fuga” do sistema imune também estão relacionados à cápsula polissacarídica (ZARAGOZA, 2019).
2.3 Tratamento da criptococose
O tratamento da criptococose é usualmente realizado numa combinação de três drogas: AMB, 5-FC e FZ. A meningite meningocócica, que é a forma mais comum da infecção (WILLIAMSON et al., 2017), é tratada em três etapas. Inicialmente, a terapia de indução leva duas semanas de tratamento com AMB aplicado sozinho ou em conjunto com 5-FC, seguido por 8 semanas de terapia de consolidação com doses elevadas de FZ, e por fim, a terapia de manutenção que é realizada com dose menores de fluconazol e pode durar até 12 meses (PERFECT et al., 2010).
Os azóis são moléculas orgânicas cíclicas que são classificadas em duas classes: os imidazóis e os triazóis, esta última inclui o fluconazol (ROEMER; KRYSAN, 2014). Em casos onde não é possível realizar o tratamento citado acima, a Sociedade Americana de Doenças Infecciosas - IDSA (Infectious Diseases Society of America) e a Organização Mundial de Saúde - WHO (World Health Organization) recomendam a monoterapia com fluconazol. A monoterapia dura de 10 a 12 semanas onde são administradas altas doses da droga (1200 mg por dia) (PERFECT et al. 2010, WHO 2011).
Anfotericina B foi primeiro identificada como um subproduto da fermentação de
Streptomyces nodosus. Este antifúngico tem, na maioria, atividade fungistática, e a relação
fungicida/fungistática dependa da dose e pH e sensibilidade do microrganismo (GALLIS et al., 1990). Com o passar dos anos desenvolveu-se a anfotericina B lipossomal (LAmB) que apresenta maior eficácia e menor toxicidade (JARVIS et al., 2017; LEENDERS et al., 1997;
HAMILL et al., 2010). Observou-se que a administração de AmB em conjunto com 5-FC aumenta a sobrevivência em pacientes com criptococose meningocócica em relação ao tratamento apenas com AmB. O mesmo não acontece quando AmB é administrada com fluconazol (DAY et al., 2013).
Flucitosina (5-FC) é um análogo fluorado sintético da citosina desenvolvida inicialmente como antitumoral (HEIDELBERGER et al., 1958). O uso deste antifúngico é recomendado em conjunto com AmB, uma vez que a monoterapia apenas com 5-FC pode levar a resistência fúngica em aproximadamente 50% dos casos (HOSPENTHAL; BENNETT, 1998; PERFECT et al., 2010). Atualmente a 5-FC não está disponível em alguns países da África, Ásia e Brasil (AGUIAR et al., 2017; ABASSI et al., 2015).
Equinocandinas, os antifúngicos mais recentes na indústria farmacêutica, inibem a síntese de 1,3-β-glucano sintase, que sintetiza um dos principais componentes da parede celular fúngica (KURTZ; DOUGLAS, 1997). Estes antifúngicos são divididos em duas classes de compostos: os lipopeptídeos e as papulacandinas (ONISHI et al., 2000). Caspofungina foi a primeira aquinocandina aprovada pela Administração de Alimentos e Medicamentos dos Estados Unidos da América (FDA– Food and Drug Administration) no tratamento da candidíase e aspergilose. Embora a maioria das equinocandinas é de composição peptídica, terpenos já foram identificados com propriedades semelhantes (LEET et al., 1996). Esta classe de antifúngicos ainda não teve atividade observada contra C. neoformans, o que pode estar associado a uma variação na ligação da glucano sintase nesta espécie (MALIGIE; SELITRENNIKOFF, 2005).
No Quadro 2 são apresentadas as principais características das drogas utilizadas no tratamento da criptococose.
Quadro 2. Antifúngicos usados no tratamento da criptococose.
Classe do antifúngico Polienos Análogos de nucleosídeo Azóis Antifúngico Anfotericina B (AMB) Flucitosina (5-FC) Fluconazol Vantagens Eficiência farmacológica e baixas taxas de resistência Disponível para administração oral e alta eficiência farmacológica
Baixo custo, disponibilidade e administração oral
Desvantagens Administração intravenosa e necessidade de hospitalização, nefrotoxicidade severa, custo e disponibilidade Hepatotoxicidade severa, disponibilidade limitada, custo e resistência (quando administrado em monoterapia) Fungistático e desenvolvimento de resistência Mecanismo de ação Liga-se ao ergosterol e inibe a síntese de membrana, resulta em morte celular por dano oxidativo
Interfere a síntese de DNA e proteínas Inibe o citocromo p450, consequentemente síntese de ergosterol e integridade da membrana
Adaptado de Santos-Gandelman; Machado-Silva (2019)
2.4 Predição de alvos moleculares
O processo de descoberta de novos fármacos é custoso e pode levar até 14 anos e custo aproximado de U$ 800 000 (SONG; LIM; TONG, 2009; LAVECCHIA; DI GIOVANNI, 2013). Porém, avanços nas técnicas de cristalografia e na computação de alta performance permitiram o surgimento da triagem de em alta vazão de alvos e ligantes (High-Throughput
screening), por exemplo. Nesta abordagem uma molécula específica, um receptor, por exemplo,
é cruzada com um banco de estruturas de ligantes, afim de se obter moléculas com maior probabilidade de interação (PINZI; RASTELLI, 2019). A eficiência de abordagens computacionais na descoberta de alvos moleculares pode ser demonstrada pelo aumento do seu uso na academia e indústria farmacêutica nas pesquisas que envolvem genômica, proteômica, quimio e bioinformática (LAVECCHIA; DI GIOVANNI, 2013; BLEICHER et al., 2003; KALYANARAMAN; BERNACKI; JACOBSON, 2005).
Outra abordagem amplamente utilizada na predição de moléculas ativas baseia-se na comparação de estruturas de ligantes, tendo como princípio que estruturas semelhantes podem apresentar atividades biológicas semelhantes (KUBINYI, 2002). Neste escopo, a técnica de
fingerprint (assinatura) molecular considera os fragmentos da molécula como bits e os descritos
utilizada se baseia no coeficiente de similaridade de Jaccard (BAJUSZ; RÁCZ; HÉBERGER, 2015). Por exemplo, pharmACOphore é uma ferramenta que se baseia no molecular fingerprint e pode criar alinhamentos múltiplos ou comparações entre duas estruturas (KORB et al., 2010) No contexto de descoberta de alvos, o atracamento (ou docking) molecular é definido como simulação da energia de ligação e modo de ligação entre determinado alvo (proteína) e seu ligante (drogas, por exemplo) (BROOIJMANS; KUNTZ, 2003; GRINTER; ZOU, 2014). O virtual screening (VS) utiliza o docking molecular na triagem de alvos para um ligante o qual não se sabe o modo de interação (CHEN; ZHI, 2001). Para realização de VS baseado no docking molecular, a interação de determinado ligante será simulada com o sítio ativo de todas as proteínas de um banco de dados, por fim, os complexos são classificados de acordo com a energia de ligação (XU; HUANG; ZOU, 2018). Metodologias para esta abordagem estão bem estabelecidas na literatura (VASSEUR; BAUD; VIGOUROUX, 2014; XU; HUANG; ZOU, 2018; CHEN; UNG, 2001; PINZI; RASTELLI, 2019.).
Uma vez que o genoma, bem como as proteínas, de Cryptococcus neoformans está disponível nos bancos de dados (GERIK; LAM; LODGE, 2014), a busca virtual de alvos é possível.
2.5 Quitinases
A parede celular de fungos é a mais exposta da célula e é majoritariamente constituída pelos biopolímeros quitina e glicanos (LATGÉ, 2007). Estes polímeros contribuem para manutenção da integridade e rigidez da parede celular (BANKS et al., 2005), enquanto os monômeros de quitina estão mais relacionados à arquitetura da cápsula polissacarídica (RODRIGUES et al., 2008).
Quitina, um biopolímero de poli-β-1,4-N-acetilglicosamina, é o composto natural mais abundante na natureza depois da celulose e está presente no exoesqueleto de crustáceos e parede celular de fungos (AZUMA et al., 2015; MUZZARELLI, 1977). Este polímero também pode ser encontrado na sua forma desacetilada, chamada de quitosano. Este, forma uma estrutura co-polimérica composta por resíduos de D-glucosamina e N-acetilglucosamina (ARANAZ et al., 2009).
A remodelagem de quitina, um processo essencial para a célula fúngica, é mantido por um balanço entre a atividade de quitina sintases (2.4.1.16), responsáveis pela síntese de quitina (RONCERO, 2002), e quitinases (3.2.1.14), responsáveis pela degradação da mesma (HARTL
et al., 2012). Enzimas quitinolíticas podem ser classificadas em endoquitinases e exoquitinases.
produtos são oligômeros de N-acetilglicosamina. Por outro lado, as exoquitinases se dividem em quitobiosidades (EC 3.2.1.29) e β-(1,4) N-acetilglucosaminidases (EC 3.2.1.30). A primeira atua na extremidade não reduzida e libera diacetilquitobiose (GlcNAc)2, enquanto a última hidrolisa os oligômeros gerados pelas outras enzimas e seus produtos são monômeros de GlcNAc (HARMAN et al., 1993; SEIDL, 2008; OYELEYE; NORMI, 2018) (Figura 1).
Enzimas envolvidas na hidrólise de ligação glicosídica fazem parte do grupo de enzimas glicosil hidrolase (GH) (EC 3.2.1.-) (www.cazy.org). Com base na similaridade de sequência as enzimas com atividade quitinolítica foram agrupadas nas famílias GH18, 19 e 20. As GH18 são amplamente encontradas na natureza, com registros em bactérias, fungos, vírus e animais; as GH19 por sua vez, são majoritariamente encontradas em plantas; e as GH20 são encontradas em humanos e bactérias (HENRISSAT, 1991; OYELEYE; NORMI, 2018).
Figura 1. Padão de clivagem das enzimas com atividade quitinolítica. As subunidades de quitina são mostradas em azul claro, o açúcar terminal reduzido em azul escuro. As linhas tracejadas indicam que o polímero é maior do que o ilustrado. Figura traduzida de Seidl (2008).
As quitinases de fungo pertencem a família GH18, salvo um registro para o fungo
Nosema bombycis, que possui quitinase da família GH19 (Han et al., 2016; KARLSSON;
STENLID, 2018). As quitinases fúngicas participam de processos como expansão celular e divisão ramificação das hifas, germinação de esporos e formação de septos, ou seja, processos envolvidos a crescimento e desenvolvimento morfológico que necessitam da remodelagem da parede celular e geralmente são encontradas em quantidade (SEIDL, 2008; ADAMS, 2004).
Observou-se que quitinases de Saccharomyces cerevisiae são necessárias durante a para divisão celular (KURANDA; ROBBINS, 1991). Porém, apesar do papel essencial das quitinases e importância do balanço quitinase/quitinase sintase, estas duas enzimas tem regulação independente em S. cerevisiae e Candica albicans (SELVAGGINI et al., 2004). A deleção em genes de quitinase pode resultar em falha na maturação da estrutura reprodutiva do tipo asco em S. cerevisiae (GIAEVER et al., 2002). Já em C. albicans, o gene de quitinase CHT2 está envolvido em citocinese, enquanto a deleção do gene CHT3 resulta cadeias de células com divisão incompleta (DÜNKLER; SPECHT; ROBBINS, 1995; DÜNKLER et al., 2005). A essencialidade destas proteínas em espécies de fungos sugere que podem ser bons alvos para drogas antifúngicas (RUSH et al., 2010).
2.6 Inibidores de quitinases
Inibição da atividade quitinolítica tem aplicações desde o controle de pragas agrícolas ao tratamento de doenças humanas (NAGPURE; CHOUDHARY; GUPTA, 2014; SAGUEZ; VINCENT; GIORDANENGO, 2008). Um número de compostos naturais tem sido descrito como inibidores de quitinase, sendo que, alosamidina foi o primeiro deles (SAKUDA; ISOGAI; SUZUKI, 1987). Alosamidina foi identificado em cultura de Streptomyces sp., é um pseudotrisacarídeo que mimetiza um dos intermediários da quitina e tem atividade inibitória para quitinases da família GH18 devido a sua ação competitiva em relação ao substrato (SAKUDA; ISOGAI; SUZUKI, 1987; BLATTNER; GERARD; SPINDLER-BARTH, 1997; SAKUDA; SAKURADA, 1998). Desde a descoberta desde inibidor, análogos foram criados (HUANG; SHU; CHENG, 2013; HUANG, 2015) e seu potencial como antifúngico, inseticida e na saúde humana tem sido explorado (HUANG; HUANG, 2019).
Moléculas de origem peptídica também são relatadas como inibidores de quitinases, como é o caso da argifina e argadina, que foram isolados de espécies de fungos (OMURA et
al., 2000; ARAI et al., 2000). Argifina teve sua estrutura caracterizada como um
ciclopentapeptídeo. Este composto mostrou atividade inibitória in vivo em larvas de barata, afetando o processo de montagem do exoesqueleto, onde quitinases são essenciais. Mais
recentemente, observou-se que mesmo o monopeptídeo dimetilguanil uréia, que é parte da argifina, apresenta atividade, portanto pode ser sintetizado em larga escala (ANDERSEN, et al. 2008). Argadina, também um ciclopentapeptídeo, mostrou atividade inibitória contra quitinases de uma espécie de mosca (Lucilia cuprina) de forma dependente da dose e mais acentuada que argifina (ARAI et al., 2000).
Mamíferos não sintetizam quitina, no entando, apresentam quitinases, as quitinases ácidas de mamíferos (acidic mammalian chitinase - AMCase) e seu papel na resposta de doenças respiratórias foi observado em humanos (BOOT et al., 2001; ZHU et al., 2004). Inibição de AMCase em humanos mostrou redução da resposta inflamatória em pacientes asmáticos (ZHU et al., 2004), isso sugere que estes inibidores podem ser usados no tratamento de infecções fúngicas sem causar danos ao paciente.
Estudos fitoquímicos já foram realizados com cerca 20% da flora conhecida (NACZK; SHAHIDI, 2006). Isto reforça o papel de plantas na busca de composto biologicamente ativos.
2.7 Allamanda polyantha
Apocynaceae é uma das dez famílias de planta mais diversas com 424 gêneros e 4600 espécies (BHADANE, 2018; ENDRESS; LIEDE‐SCHUMANN; MEVE, 2014). Seus membros podem ser encontrados por todo mundo, no entanto, a maior diversidade desta família é encontrada nos trópicos e subtrópicos. Os estudos em Apocynaceae se concentram na polinização, interação planta-inseto e estudos fitoquímicos (FISHBEIN et al., 2018). Dentre os compostos encontrados nesta família pode-se citar os flavonoides, alcaloides, terpenóides e glicosídeos (BHADANE, 2018) e as atividades biológicas incluem anti-inflamatória, antimicrobiana, citotóxica e antioxidante (HÖFLING et al., 2010; BHADANE, 2018).
No Brasil ocorrem 95 gêneros de Apocynaceae, dentre eles Allamanda spp. Este gênero, que é endêmico da América do Sul, é amplamente estudado em relação aos seus metabólitos secundários (SAKANE; SHEPHERD, 1986). As flores de A. cathartica tem atividade anti-inflamatória e antioxidante (Góes, 2011) e também apresentam atividade antibacteriana, antifúngica e hepatoprotetora observada in vitro (OMONHINMIN; IJEOMA; UCHE, 2013). A caracterização fitoquímica desta espécie já foi realizada e dentre os constituintes descritos para o caule, folhas, flores e raízes encontram-se: saponinas, compostos fenólicos, carotenoides (para detalhes ver as revisões PETRICEVICH; ABARCA-VARGAS, 2019; AMIN; HEGD, 2016). Embora essa seja uma espécie muito estudada, pouco se sabe sobre as propriedades farmacológicas das suas sementes.
Dentre os compostos encontrados em A. cathartica, o plumierídeo é um dos encontrados em maior quantidade (VILJOEN; MNCWANGI; VERMAAK, 2012). Plumierídeo é um iridoide com atividade antifúngica observada para os fungos dermatófiticos Epidermophyton
floccosum e Microsporum gypseum sem causar toxicidade em células da linhagem P388
(TIWARI; PANDEY; DUBEY, 2012). Outro estudo também observou que não há efeito citotóxico, mutagênico, tóxico ou hemolíticos no extrato das folhas de A. cathartica
(BONOMINI et al., 2017). No entanto, outros iridoides já foram isolados de extratos de Allamanda spp., como plumiericina, isoplumiericina, plumierídeo, e plumierídeo coumarato
(PETRICEVICH; ABARCA-VARGAS, 2019). Não há na literatura relatos do isolamento da forma aglicona do plumierídeo, chamada plumieridina, de espécies de Allamanda spp.
Allamanda polyantha Müll. Arg., também um membro da família Apocynaceae, tem o
porte de arbusto e encontra-se distribuída no Brasil principalmente nas regiões Norte e Nordeste (ABDEL-KADER et al., 1997). Iridoides presentes do extrato aquoso das sementes de A.
polyantha foram avaliados e identificados através de ressonância magnética nuclear e a sua
atividade anti-Cryptococcus foi avaliada. Plumierídeo, plumieridina, plumiericina, isoplumiericina e protoplumiericina foram identificados no extrato aquoso, porém observou-se atividade antifúngica apenas para plumieridina e plumierídeo (BRESCIANI, 2013). Observou-se também que, dentre os compostos identificados, a plumieridina é o mais ativo contra os fungos patogênicos Cryptococcus gattii e C. neoformans. Até então, este composto não tinha sido identificado no gênero Allamanda, embora a literatura relate sua presença no extrato metanólico de Plumeria obtusa, outra Apocynaceae (SALEEM et al., 2011).
2.8 Justificativa do estudo
Sem o tratamento adequado a criptococose pode resultar em óbito (COELHO; CASADEVALL, 2016). O tratamento desta infecção fúngica utiliza anfotericina B, fluconazol e 5-flucitosina (PERFECT et al., 2010). No entanto, o uso prolongado destes medicamentos pode ter efeito tóxico e levar a resistência fúngica.
Tendo em vista a necessidade no desenvolvimento de fármacos que melhorem o tratamento da criptococose, Bresciani (2013) buscou identificar iridoides com atividade antifúngica em frações do extrato aquoso das sementes de Allamanda polyantha, onde foram identificados o plumierídeo, plumieridina, protoplumiericina e plumieridcina/isoplumiericina. Estes compostos fazem parte dos iridoides, que são monoterpenos com diversas atividades biológicas descritas.
3 OBJETIVO
3.1 Geral
Identificar, por meio da triagem virtual, alvos moleculares da plumieridina em
Cryptococcus neoformans, realizar simulações computacionais que expliquem a atividade
antifúngica e realizar experimentos in vitro afim de se validar os resultados de predição do alvo.
3.2 Específicos
• Extração, purificação e ressonância magnética nuclear (RMN) da plumieridina. • Triagem virtual contra o Protein Data Bank na busca de alvos.
• Simular a interação proteína-ligante utilizando as abordagens de docking e dinâmica molecular.
• Determinar a concentração inibitória mínima da plumieridina em C. neoformans var. grubbii H99.
• Realizar ensaios de inibição da atividade do alvo predito.
• Verificar através de PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR) se os níveis transcricionais dos alvos preditos se alteram na presença da plumieridina.
• Microscopia confocal afim de se avaliar alterações morfológicas na parede celular de
C. neoformans.
• Verificar se a plumieridina tem ação inibitória apenas para o alvo predito em C.
4 CONCLUSÕES
Atribuiu-se a atividade antifúngica identificada em uma fração cromatográfica do extrato de sementes de Allamanda polyantha a plumieridina, o composto majoritário na fração, identificado por meio de ressonância magnética nuclear. A abordagem de triagem virtual baseada na similaridade dos ligante, utilizada para identificar quitinase como alvo putativo da plumieridina, se mostrou efetivo uma vez que os resultados in vitro mostram que a presença do composto reduz a atividade da enzima. Ensaios de inibição da atividade quitinolítica mostraram que a plumiridina é capaz de reduzir a atividade enzimática na fração secretada e fração celular solúvel de forma dose-dependente. Entretanto, a fração celular insolúvel sofre pouca redução, indicando que maiores concentrações do composto podem ser necessárias. Por meio da análise de interação proteína-ligante, observou-se que a plumieridina tem potencial inibitório para quitinases da família glicosil hidrolase 18 (GH18), por conta da interação com o motivo catalítico. Esta hipótese foi suportada pela redução da atividade quitinolítica observada em sobrenadante de Bacillus subtilis, Tenebrio molitor e macrófagos de camundongos.
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CAPÍTULO I
Manuscrito: A plumieridine-rich fraction from Allamanda polyantha inhibits chitinolytic activity and exhibits antifungal properties against Cryptococcus neoformans
