Mesentério Glândulas de insetos Membranas fetais

M

M

É

É

TODOS DE ESTUDO EM BIOLOGIA

TODOS DE ESTUDO EM BIOLOGIA

CELULAR

CELULAR

Célula

Tecido

Órgão

Análises

in situ

Sistemas de estudos

in vitro

Cultura

Fertilização

Manipulações

Extrações/Purificações

Centrifugações

Diálises

Eletroforeses

Tecnologia do DNA/RNA

Estudos

bioquímicos

Preparações citológicas

Citoquímica

Autorradiografia

Imunocitoquímica

O estudo do material biológico ao Microscópio requer alguns

procedimentos prévios que vão desde a escolha e coleta do

material até a montagem final do preparado histológico

Princípios da

Citoquímica

Métodos de Estudos in situ

Preparações Citológicas e Técnicas Citoquímicas

Que os elementos a ser

analisados

não

sejam

difusíveis;

Que o produto da reação

seja

visível

(cor

ou

precipitado);

Que

a

reação

seja

específica/seletiva para o que

se pretende analisar

O sucesso de uma reação citoquímica depende principalmente

dos passos anteriores ao da reação de coloração:

Coleta do material

Fixação e agentes fixadores

Agentes desidratantes

Métodos de Estudos in situ

Mesentério

Glândulas de insetos Membranas fetais

Preparado permanente

Células preservadas para melhor demonstração de sua estrutura

Ideal = sejam mantidos estrutura e composição química quando in vivo

Coleta do Material

1) Montagem total:

•Material fino / transparente – na lâmina • Fixação e coloração

Glândulas Salivares de Rhodnius prolixus

Montagem total Glândula Principal Ducto Principal Glândula Acessória Ducto Acessório

2) Esfregaço: consistem em promover o espalhamento de células livres sobre a lâmina com o auxílio de outra lâmina

• Células livres: sangue, linfa, sêmen, líquor • Fixação e coloração

• Vantagem: obtenção de células inteiras (medidas e quantificadas)

3) Espalhamento:

• Erroneamente esfregaço

• Raspagem (espátula / palitos) de camadas superficiais (mucosas) Mucosas: bucal, anal, vaginal

• Fixação e coloração

• Vantagem: obtenção de células inteiras (medidas e quantificadas)

Cromossomos Núcleo/Nucléolo

4) Esmagamento:

• Esmagar, o material entre lâmina e lamínula, • Coloração concomitante ou posterior

• Vantagem: estudo de divisões celulares

5) Decalque ou Imprint:

• Coleta de núcleos de tecidos moles – fígado, baço, rim. timo

• Retira-se órgão – face cortada lavada com salina – seca com papel – pressiona contra a lâmina (carimbo)

Resultado: núcleos impressos • Fixação e coloração

• Vantagem: - simples

- estudo da quantidade de DNA

T

T

T

TÉ

É

ÉCNICA DE MICROSCOPIA DE

É

CNICA DE MICROSCOPIA DE

CNICA DE MICROSCOPIA DE

CNICA DE MICROSCOPIA DE

LUZ PARA O ESTUDO DAS

LUZ PARA O ESTUDO DAS

LUZ PARA O ESTUDO DAS

LUZ PARA O ESTUDO DAS

C

C

C

INIBIR A AUTÓLISE

PRESERVAR A

MORFOLOGIA E A

COMPOSIÇÃO QUIMICA

DO TECIDO

COAGULAR E

ENDURECER O

TECIDO

FACILITAR A

COLORAÇÃO

FIXAÇÃO

Fixação por imersão

: o fixador entra em

contato com o material biológico após a retirada

do organismo.

Fixação por perfusão

: o fixador é injetado na

corrente sangüínea, possibilitando a fixação em

nível pericelular e celular.

CONDUTA PARA BOA

FIXAÇÃO

CRIOSTATO

:

objetivo é utilizar para o

estudo da distribuição dos

lipídeos.

FIXAÇÃO QUÍMICA

: uso de

substâncias que reagindo com as

biomacromoléculas estabilizam as

mesmas.



FORMOL

(ALDEÍDO FÓRMICO a 40%)



BOUIN

(ÁCIDO PÍCRICO, FORMALDEÍDO

E ÁCIDO ACÉTICO)



KARNOVSKY

( PARAFORMALDEÍDO E

FATORES QUE ATUAM NO PROCESSO

DE FIXAÇÃO

Tamponamento

Temperatura

Espessura da peça

Volume de fixador

Tempo de fixação

DESIDRATAÇÃO

: retirada da água dos

tecidos e a sua substituição por álcool.

DIAFANIZAÇÃO

: substituição do álcool

presente nos tecidos pelo óleo de cedro.

INCLUSÃO

: o tecido é colocado em caixas

com parafina e então solidificados.

IMPREGNAÇÃO

: o óleo é substituído

por parafina a 60°C.

PROCESSAMENTO HISTOL

PROCESSAMENTO HISTOL

INCLUSÃO EM PARAFINA E

RESINAS HISTOLÓGICAS

INCLUS

Micrótomo Leica RM2155

Cortes blocos parafina e resina - lâminas

Navalha parafina

Navalha resina

DESPARAFINIZAÇÃO

HIDRATAÇÃO

Corte histológico

Área da biologia celular e estrutural dedicada

aos estudos dos métodos de coloração dos

tecidos e constituintes celulares e subcelulares

Células x Tecidos

Elementos químicos de Baixo P.M. (C, O, N, H, etc.)

↓ Matéria Orgânica

Baixo Contraste

Material a ser examinado ao M.L.

- Fino

- Transparente (→

→

→

→

luz →

→

→

→

formação da imagem)

↓

Material Biológico

Métodos de coloração

Princípios químicos das reações de coloração

Procedimentos protocolares

Componentes químicos que podem ser avaliados pela

técnica citoquímica

Ácido Nucléicos

Proteínas

Polissacarídeos

Lipídios

Íons (Complexos moleculares)

Vitaminas e Enzimas

• Pesquisa científica

• Diagnóstico patológico

Sucesso da reação citoquímica:

Elementos avaliados → Não difusíveis no processamento

Produto da reação

Reação específica para o composto celular analisado

Passos anteriores à reação:

cor

insolúvel

Coleta

Fixação

Corante

_Substrato

Ligações eletrostáticas

Ligações covalentes

Interações hidrofóbicas

Reações Citoquímicas

Substrato

catiônico

Substrato

aniônico

Corante

aniônico

Corante

catiônico

Acidofilia

Basofilia

Afinidade eletrostática: um corante ionizado em uma

solução reage com um substrato de carga iônica oposta.

Reações Citoquímicas Mediadas por Ligações Eletrostáticas

-+

+

-Basofilia

Corantes Básicos (Catiônicos +)

Azul de metileno

Azul de toluidina

Azul de alcian

Substrato

carregado

negativamente

(aniônico)

reage

eletrostaticamente com um corante carregado positivamente

(catiônico).

Corantes catiônicos reagem com grupamentos ionizáveis na

célula

/ no tecido, que apresentam cargas negativas

(aniônicos)

Fosfatos

(ácidos nucléicos)

Sulfatos

(Glicosaminoglicanos sulfatados)

Carboxilas

(Proteínas e açúcares ácidos)

Grupamentos

negativos

Corante interage com um componente tissular,

corando-o com cor diferente da sua cor original.

O azul de toluidina é um corante básico que interage

com compostos poliméricos ricos em grupamentos

sulfato.

Alguns corantes básicos, devido à natureza planar de suas moléculas, podem promover um empilhamento ordenado ao ligarem-se a substratos polianiônicos: Fenômeno - metacromasia

Metacromático Ortocromático

Corantes ácidos (Aniônicos)

Xilydine Ponceau Amarelo de Naftol Sírius Red Orceína Fast green

Esses corantes reagem com os elementos que possuem cargas positivas na célula, como por exemplo, as proteínas, que podem apresentar radicais básicos de seus aminoácidos ionizados (NH3+).

Orceína lacto-acética Testículo de gafanhoto

Orceína lacto-acética

• Corante se liga à proteínas histônicas ou totais, complexadas ao DNA da cromatina;

• Diferenciação entre eucromatina e heterocromatina (corante mais forte);

• Heterocromatina: Mais compacta e menor número de proteínas.

Orceína lacto-acética

Espermatogênese em testículo

de triatomíneos

Hematoxilina (+)

⇓

⇓

⇓

⇓

Substratos (-)

⇓

⇓

⇓

⇓

Núcleos

(grupam/os fostato do DNA)

⇓

⇓

⇓

⇓

Azul

Eosina (-)

⇓

⇓

⇓

⇓

Substratos (+)

⇓

⇓

⇓

⇓

Citoplasma

(grupam/o NH

₂+

₎

⇓

⇓

⇓

⇓

Rosa

Hematoxilina Eosina

Coloração de rotina para análise geral da

morfologia dos túbulos seminíferos

(Mus muscullus) (ASSIS & AZEREDO-OLIVEIRA, 2002)

Hematoxilina Eosina

C

R

G

(Peruquetti, 2004)

HE

• Estrutura dos túbulos seminíferos

• Formação do grânulo pré-acrossomal

Corantes ácidos

Coram estruturas básicas do

tecido.

Ex: aminoácidos básicos

(lisina, arginina, histidina)

Corantes básicos

Coram estruturas ácidas do

tecido. Ex: ácidos nucleicos,

aminoácidos

ácidos

(aspártico, glutâmico).

Impregnação pelo Nitrato de Prata

A técnica de impregnação pela prata é utilizada para marcar:

Nucléolos de núcleos interfásicos

CF

CF

CF

CFD

CFD

CFD

CG

CG

CG

Nucléolo (ME)

Durante a intérfase, a impregnação pela prata ocorre

largamente no Centro Fibrilar (CF) e no Componente Fibrilar

Denso (CFD);

Testes citoquímicos e análises químicas indicaram que a prata

tem afinidade pelas proteínas acídicas (B

₂₃

, C

₂₃

)

Identificação de proteínas nucleolares (B23 e C23)

(nucléolos e corpúsculos nucleolares)

(Mus muscullus)

(ASSIS & AZEREDO-OLIVEIRA, 2002)

Impregnação por íons prata

Prata

• Proteínas nucleolares – B₂₃ e C₂₃

A) Pesquisas citogenéticas



Bandamento cromossômico

Indicar atividades de transcrição do DNAr

Estudo da atividade nucleolar durante a gametogênese B) Diagnósticos patológicos

Leucemias

Tumores: ovário mama útero tireóide

Aplicações

↑ Proteínas AgNOR ↑ Taxa de proliferação ↑ Grau de malignidade

Regiões cromossômicas com as quais os nucléolos se associam

e que são responsáveis pela reorganização destes, no final da

divisão celular, onde os genes de DNAr estão localizados

Muitas reações citoquímicas são mediadas por ligações

covalentes, principalmente aquelas que precisam ser

facilitadas por mordentes (componentes metálicos). Estas

reações são chamadas de reações Tricrômicas.

Tricômico de Masson

Tricrômico de Gömöri

Tricômico de Mallory

São técnicas específicas para fibras do tecido

conjuntivo e selecionam compostos celulares dos

compostos fibrosos

Métodos Tricrômicos de Coloração

Composição básica

- Dois ou + corantes aniônicos

- Mordentes (moléculas de componentes metálicos): ácido fosfofúngstico / ácido fosfomolibdico

Resultados

- Coloração seletiva para os componentes do tecido conjuntivo - Histopatologia

Epitélio intestinal (roxo); fibras colágenas (azul)

Tecido conjuntivo (azul esverdeado) Células: pigmentos de fucsina

Núcleos: escuros

Língua

Fibras musculares (lilás) Fibras colágenas (azul)

Núcleos (azul escuro)

Outro exemplo clássico deste tipo de reação são as reações

intermediadas pelo

Reativo de Schiff:

Reação de Feulgen

(DNA); Teste do PAS (polissacarídeos neutros)

Leucoderivado

da Fucsina básica Restauração do grupo cromofórico (2 fórmulas prováveis)

2(R-CHO)

Aldeídos livres

Verificar a influência da ação de drogas, hormônios e do

envelhecimento sobre o conteúdo do DNA;

Detectar a presença de aneuploidias e poliploidias em vários

tipos de tumores.

DNA – Feulgen +

RNA – Feulgen -

Controle da reação: Extração do DNA

Feulgen

Mecanismo da Reação de Feulgen

Duas etapas

A) Hidrólise ácida (HCl) – remove bases púricas

Depurinação do DNA

⇒

⇒

⇒

⇒

Ácido apurínico

B) Exposição do material hidrolisado ao reativo de Schiff

( cora somente aldeídos livres)

Ligação do corante à molécula

Reativo de Schiff

Disponibilidade de substrato a ser corado

Influência da fixação

Variações na etapa hidrolítica: molaridade do ácido / tempo

/ temperatura

Ex.:

HCl a 1N - 60o

HCl 5N - temperatura ambiente

Influência da composição e de outras características do

Reativo de Schiff

Fatores modificadores da resposta à

Reação de Feulgen

C G R

Reação de Feulgen

Túbulos seminíferos • Áreas nucleolares (-) (espermatócitos I → Espermátides) • Heterocromatina (Peruquetti, 2004)

JUNQUEIRA, L. C. & CARNEIRO, J., 2005. Biologia Celular e Molecular. 8. ed., Guanabara Koogan, Rio de Janeiro.

MICHALANY, J., 1980. Técnica Histológica em Anatomia Patológica. São Paulo: Editora Pedagógica e Universitária.

REFERÊNCIAS

DE ROBERTIS JR. E.M.F. 2006. Bases da Biologia Celular e Molecular. 4ª. Edição. Guanabara Koogan.

MELLO, R.C.N. 2002. Células & Microscopia: princípios básicos e práticas. Juiz de Fora: Editora UJFJ.