Potencial de óleos essenciais de orégano, cravo e canela no controle fúngico in vitro e em milho

Texto

(1)TERESA CRISTINA DE CASTRO CAHETÉ MITCHELL. POTENCIAL DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE ORÉGANO, CRAVO E CANELA NO CONTROLE FÚNGICO IN VITRO E EM MILHO. RECIFE 2012.

(2) TERESA CRISTINA DE CASTRO CAHETÉ MITCHELL. POTENCIAL DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE ORÉGANO, CRAVO E CANELA NO CONTROLE FÚNGICO IN VITRO E EM MILHO. Tese apresentada ao Programa de PósGraduação em Nutrição do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal de Pernambuco, para obtenção do título de Doutor em Nutrição. Orientadora: Tânia Lúcia Montenegro Stamford. Co-Orientadora: Thayza Christina Montenegro Stamford.. RECIFE 2012.

(3) Mitchell, Teresa Cristina de Castro Caheté Potencial de óleos essenciais de orégano, cravo e canela no controle fúngico in vitro e em milho / Teresa Cristina de Castro Caheté Mitchell. – Recife: O Autor, 2012. 93 folhas: il., fig. E Graf.; 30 cm. Orientador: Tânia Lúcia Montenegro Stamford Tese (doutorado) – Universidade Federal de Pernambuco. CCS. Nutrição, 2012. Inclui bibliografia e anexos. 1. Fungos. 2. Antifúngico.. 3. Especiarias. 4.. Milho. 5. Óleos essenciais. I. Stanford, Tânia Lúcia Montenegro.. 589.2. II. Título.. CDD (20.ed.). UFPE CCS2012-065.

(4) TERESA CRISTINA DE CASTRO CAHETÉ MITCHELL. POTENCIAL DE ÓLEOS ESSENCIAIS DE ORÉGANO, CRAVO E CANELA NO CONTROLE FÚNGICO IN VITRO E EM MILHO. Tese aprovada em: 09 de março de 2012. BANCA EXAMINADORA _________________________________________________________ Profa. Dra. Roberta de Albuquerque Bento- CAV/UFPE Examinadora Externa ___________________________________________________________ Prof. Dr. Eduardo José Nepomuceno Montenegro- UFPE Examinador Externo _________________________________________________________ Profa. Dra. Thayza Chistina Montenegro Stamford- UFPB Examinadora Externa _________________________________________________________ Dra. Regina Ceres Torres da Rosa- IPA Examinadora Externa _________________________________________________________ Profa. Dra. Tânia Lucia Montenegro Stamford- UFPE Coordenadora da Banca Examinadora. RECIFE 2012.

(5) AGRADECIMENTOS Em primeiro lugar a Deus, poderoso e soberano em minha vida. Ele é minha rocha e minha salvação. Aos meus pais, que através de seus exemplos de honra e perseverança, com amor e carinho, sempre me ensinaram, incentivaram nos estudos e me educaram no caminho do bem. À minha filha Marina Clara, hoje com cinco meses de idade, pela qual tanto tempo esperei e tanto amo. Ao meu dedicado esposo Bruno, o qual acompanhou todo o meu percurso desde a graduação com muita compreensão, carinho e dedicação. A todos meus familiares, tios, irmãos (Nando, Victor e Lucas) e sobrinhos (João Victor e Fernanda) pela confiança em mim creditada. A todos da família Dornelas Mitchell, os quais acompanharam minha trajetória. Aos meus avós, em especial à vó Elza, exemplo de vida e que sempre acreditou na minha capacidade. Às minhas mestres e orientadoras, Dra. Tânia Lúcia e Dra. Thayza Chistrina Stamford, que me acolheram com um jeitinho especial e carinhoso. Pessoas de muito respeito, dedicadas e amigas. Obrigada pela orientação e execução desse projeto. Ao professor Dr. Marcos Lima, que muito contribuiu acompanhando e me orientando nos experimentos. A ele muito devo do meu aprendizado nesse caminho. À Dra Regina Rosa que depositou todo o seu empenho, verdadeiro símbolo de eficiência, inteligência e responsabilidade, pela ajuda e orientação na realização dos experimentos com o milho. À Universidade Católica de Pernambuco, e em especial à professora Dra. Galba Takaki, por ter aberto as portas do laboratório de microbiologia possibilitando desta forma a realização de parte dos experimentos. Ao Instituto de Agronomia de Pernambuco (IPA), pela recepção e acolhida no laboratório de análise de sementes. As minhas queridas estagiárias de PIBIC, Danielly Cordeiro e Iris Pimentel, pela ajuda na realização dos experimentos. Às técnicas do laboratório de análise de sementes do IPA, Aline e Cristina, pela ajuda no treinamento em análise de sementes. À engenheira agrônoma, Odácia, pelo apoio experimental inicial no IPA. Ao pessoal da Micoteca/UFPE, em especial à técnica Eliane Nogueira e Dra Cristina Maria Motta pelo treinamento recebido e aprendizado adquirido. A todo o pessoal do laboratório de microbiologia do LEAAL/UFPE, em especial aos técnicos Vivaldo e Viviane, aos quais me auxiliaram nos experimentos. Ao programa de Pós Graduação em Nutrição/UFPE, na pessoa da coordenadora Dra. Monica Osório, através da qual agradeço a todos os professores e às funcionárias Neci Nascimento, Franciene e Cecília Arruda. À FACEPE (Fundação de Amparo à Ciência e Tecnologia de Pernambuco ), pela concessão de bolsa de estudo no curso de doutorado. Aos amigos da turma de doutorado: Amanda Oliveira, Emanuella Paiva, Geyza Azeredo, Karina Silveira e Celso Caldas. À minha amiga Beth, hoje minha comadre, pela grande ajuda com Marina. E a todos aqueles que sempre depositaram credibilidade e confiança na minha capacidade e me incentivaram direta ou indiretamente por este caminho..

(6) RESUMO A ação conservante de óleos essenciais de especiarias em alimentos tem se destacado como alternativa natural para a substituição de aditivos químicos. Objetivou-se avaliar a efetividade dos óleos essenciais de plantas em diferentes concentrações em inibir o crescimento de fungos (Aspergillus flavus- 4540; Fusarium moniliforme- 4542; Penicillium vaiabil- 4534; Penicillium funiculosum- 4511; Penicillium pinhophill4546) “in vitro” e incidência de Aspergillus flavus em milho (Zea mays L). As técnicas adotadas foram: determinação das atividades antifúngicas em discos de papel de filtro em meio sólido, determinação da Concentração Inibitória Mínima- CIM e Concentração Fungicida Mínima- CFM através da técnica de diluição em caldo bem como do crescimento micelial radial em Agar e a visualização do efeito do óleo essencial de orégano na morfologia de A. flavus através da microscopia óptica e eletrônica. Sementes de milho previamente desinfetadas foram tratadas com diferentes concentrações dos óleos essenciais e inoculadas com A. flavus, sendo avaliadas quanto à incidência do fungo e percentual de germinação de sementes, de acordo com o Regulamento de Análise de Sementes- RAS (2009). Os resultados demonstraram que as cepas foram mais sensíveis aos óleos essenciais de orégano, cravo e canela. A CIM variou de 0,062,0 µL. mL -1 e a CFM variou de 0,12- 4,0 µL. mL -1, de acordo com o fungo e o óleo em estudo. O óleo essencial de orégano retardou o crescimento micelial radial até o 8º dia. Os óleos de cravo e canela tiveram menor eficiência, apresentando o crescimento dos fungos a partir do 2º dia. As principais alterações morfológicas do A. flavus foram hifas curtas, largas e deformadas apresentando dilatações ao longo de sua estrutura, bem como a formação de clamidósporos. Na Microscopia Eletrônica de Varredura, o efeito mais drástico foi observado com 0,12 µL.mL-1 do óleo de orégano, o qual inibiu o processo de germinação, verificando-se esporos sem germinar ou apresentando apenas os tubos germinativos. Na germinação de sementes de milho, observou-se que o tratamento com óleo de orégano apresentou 94,9% de germinação, não diferindo dos controles (p>0,05). Já com os óleos de cravo e canela apresentaram uma redução acima de 25% do percentual de germinação, quando comparado com os demais tratamentos. Em sementes de milho, o A. flavus se mostrou mais sensível quando em contato com o óleo essencial de orégano, onde se utilizou concentrações bem inferiores (0,12-1,0 µL.mL-1) aos dos óleos de canela e cravo (2,0-16,0 µL.mL-1). Conclui-se que o óleo essencial de orégano exerce significante efeito fungicida, sendo mais eficiente na inibição do crescimento fúngico in vitro e em milho, podendo ser usado racionalmente na conservação de alimentos. Palavras Chaves: Fungos, antifúngico, especiarias, milho..

(7) ABSTRACT The preservative action of essential oils in food spices has emerged as a natural alternative to replace chemical additives. The objective of the study was to evaluate the effectiveness of plant essential oils at different concentrations to inhibit fungi (Aspergillus flavus-4540, 4542, Fusarium moniliforme, Penicillium vaiabil-4534, 4511, Penicillium funiculosum, Penicillium pinhophill-4546) growth "in vitro" and the incidence of Aspergillus flavus in maize (Zea mays L). The techniques adopted were: determination of antifungal activity in filter paper discs on solid medium. After this test we determined the minimum inhibitory concentration, MIC and minimum fungicidal concentration-CFM through the broth dilution technique as well as the radial mycelial growth on agar and the visualization of the effect of oregano essential oil on the morphology of A. flavus by light and electron microscopy. Corn seeds, previously disinfected, were treated with different concentrations of essential oils and inoculated with A. flavus and evaluated for incidence of fungus and percentage of seed germination, in accordance to the Rules of Seeds Analysis-RAS (2009). The results showed that the strains were more sensitive to oregano, cloves and cinnamon essential oil. The MIC ranged from 0.06 to 2.0 mL. CFM mL -1 and ranged from 0.12 to 4.0 mL. mL -1, according to the fungus and the oil under study. Oregano essential oil retarded radial mycelial growth until the 8th day. Oils of cloves and cinnamon had a lower efficiency, with the fungi growth starting on the 2nd day. The main morphological changes in A. flavus hyphae were short, broad, deformed dilatations showed throughout its structure, as well as the formation of chlamydospores. In Scanning Electron Microscopy, the more drastic effect was observed with a 0.12-μL.mL of oregano oil, which inhibited the germination process, resulting on non germinating spores or on spores showing the germ tube only. In the germination of corn, it was observed that treatment with oregano oil, showed 94.9% germination, not differing from controls (p> 0.05) while treatment with cloves and cinnamon oils presented a reduction above 25%, the percentage of germination when compared with other treatments. In maize, A. flavus was more sensitive when in contact with the oregano essential oil, with which we used much lower concentrations (0.12 to 1.0 μL.mL-1) then those used with cinnamon and clove oils (2.0 to 16.0 μL.mL-1). It is concluded that oregano essential oil has significant fungicidal effect, being more efficient in inhibiting fungal growth in vitro and in maize, proving that it can be rationally used food preservation. Keywords: fungi, antifungal, spices, corn..

(8) LISTA DE ILUSTRAÇÕES ARTIGO 1 Figura 1-. Figura 2-. Figura 3-. Figura 4-. Figura 5-. Efeito do óleo essencial de orégano (O. vulgare L.) sobre o crescimento micelial radial de cepas de Penicillium funiculosum, Fusarium moniliforme e Aspergillus flavus em função de diferentes concentrações: (■): controle (0 mL / mL); () (CIM/2: ); (▲) (CIM:); () (CFM:). Efeito do óleo essencial de canela (Cinnamomum zeylanicum L.) sobre o crescimento micelial radial de cepas de Penicillium funiculosum, Fusarium moniliforme e Aspergillus flavus em função de diferentes concentrações: (■): controle (0 mL / mL); () (CIM/2: ); (▲) (CIM:); () (CFM:). Efeito do óleo essencial de cravo (Caryophyllus aromaticus L.) sobre o crescimento micelial radial de cepas de Penicillium funiculosum, Fusarium moniliforme e Aspergillus flavus em função de diferentes concentrações: (■): controle (0 mL / mL); () (CIM/2: ); (▲) (CIM:); () (CFM:). Microscopia óptica do micélio de Aspergillus flavus cultivado em caldo Sabouraud com e sem óleo essencial de orégano durante 2 dias a 28ºC sob agitação orbital de 150 rpm. Micélio controle de A. flavus (a). Micélio tratado com 0,03 µL.mL-1 de óleo de orégano (b). Alterações morfológicas do micélio induzido por 0,06 µL.mL-1 (c), 0,09 µL.mL-1 (d) e 0,12 µL.mL-1 de óleo de orégano (e-f). Barras 10µM. Microscopia Eletrônica de Varredura de Aspergillus flavus cultivado em caldo Sabouraud com e sem óleo essencial de orégano durante 2 dias a 25-28ºC sob agitação orbital de 150 rpm. A) Micélio controle de A. flavus, Barras 5µm. B-D) Efeitos de 0,03; 0,06 e 0,09 µL.mL-1 de óleo de orégano, Barras 5µm. E-F) Alterações ultraestruturais do micélio induzido por 0,12 µL.mL-1 de óleo de orégano, Barras 10µm e 5µm, respectivamente.. 49. Percentagem de Germinação de sementes de milho inoculadas com Aspergillus flavus, e submetidas a diferentes concentrações dos óleos essenciais de canela, cravo e orégano. Incidência de Aspergillus flavus em sementes de milho após a aplicação de diferentes dosagens de óleos essenciais (orégano, canela e cravo).. 86. 52. 54. 56. 58. ARTIGO 2 Figura 1-. Figura 2-. 87.

(9) LISTA DE TABELAS. ARTIGO 1 Tabela 1Tabela 2-. Screening da atividade antifúngica de óleos essenciais de especiarias sobre fungos filamentosos. Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM) dos óleos essenciais de orégano, cravo e canela sobre fungos filamentosos.. 46. Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM) dos óleos essenciais de orégano, cravo e canela sobre cepa de Aspergillus flavus. Efeitos dos óleos essenciais na germinação das sementes de milho, cultivar BRS-Caatingueiro, e na incidência de Aspergillus flavus.. 85. 47. ARTIGO 2 Tabela 1-. Tabela 2-. 85.

(10) LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS . ADE: Água Destilada Estéril. . A. flavus: Aspergillus flavus.. . A. niger: Aspergillus niger.. . A. parasiticus: Aspergillus parasiticus.. . BDA: Batata Dextrose Agar.. . BRS: Fornecido pela Embrapa (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária).. . CESM-PB: Comissão Estadual de Sementes e Mudas da Paraíba.. . CFM: Concentração Fungicida Mínima.. . CIM: Concentração Inibitória Mínima.. . °C: Graus Celsios.. . FAO: Food and Agriculture Organization.. . Fig.: Figura.. . F. moniliforme: Fusarium moniliforme.. . Ltda: Limitada.. . mg: miligramas.. . mL: mililitro.. . mm: milimetros.. . MEV: Microscopia Eletrônica de Varredura.. . μL: microlitros.. . µg: microgramas. . O. vulgare L.: Origanum vulgare Lineu.. . Penicillium funiculosum: P. funiculosum.. . pH: potencial Hidrogenionico.. . ppm: parte por milhão.. . RAS: Regulamento de Análise de Sementes.. . rpm: Rotação por minuto.. . T1, T2, T3, T4: Tratamentos.. . URM: University Recife Mycology.. . US$: United States (Moeda Americana - Dólar).

(11) SUMÁRIO 1. Apresentação....................................................................................................... 11. 2. Objetivos.............................................................................................................. 14. 2.1. Objetivo Geral.................................................................................................. 14. 2.2. Objetivos Específicos....................................................................................... 14. 3. Revisão da Literatura......................................................................................... 15. 4. Metodologia......................................................................................................... 33. 4.1. Screening……………………………………………………………………... 33. 4.2. Determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) e Concentração Fungicida Mínima (CFM)............................................................. 34. 4.3. Interferências dos óleos essenciais de orégano, cravo e canela sobre a cinética de crescimento fúngico............................................................................. 35. 4.4. Efeito dos óleos essenciais sobre a morfogênese de cepas de fungos filamentosos............................................................................................................. 36. 4.5. Efeito dos óleos essenciais sobre a germinação de sementes de milho. 37. inoculadas artificialmente com esporos fúngicos................................................ 4.6. Análises estatísticas …………………………………………………………. 38. 5. Resultados- Artigos Originais……………………………………………….... 39. 5.1. Artigo 1............................................................................................................. 39 5.2. Artigo 2............................................................................................................. 68 6. Considerações Finais………………………………………………………….. 88 Referências……………………………………………………………………….. 89 7. Anexos.................................................................................................................. 92. Anexo A: Submissão do Artigo de Revisão.......................................................... 92. Anexo B: Submissão do Artigo 2........................................................................... 93.

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