Desenvolvimento de uma Metodologia Computacional para Automatizar o Processo de Avaliação do Teste Cometa

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Daniel San Martin Pascal Filho

Desenvolvimento de uma Metodologia

Computacional para Automatizar o

Processo de Avalia¸

c˜

ao do Teste Cometa

Trabalho de conclusão de curso apresentado como parte dos requisitos para obten¸cão do grau Bacharel em Ciências da Computa¸cão.

Orientador:

Prof. Dr. rer.nat. Aldo von Wangenheim

Co-orientador:

Leandro Coser

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA

DEPARTAMENTO DE INFORM ´ATICA E ESTAT´ISTICA

BACHARELADO EM CI ˆENCIAS DA COMPUTA ¸C ˜AO

Florian´opolis – SC Junho / 2008

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Trabalho de conclus˜ao de curso sob o t´ıtulo “Desenvolvimento de uma Metodologia Computacional para Automatizar o Processo de Avalia¸c˜ao do Teste Cometa”, defendido

por Daniel San Martin Pascal Filho sob aprova¸c˜ao, em Florian´opolis, Santa Catarina, pela banca examinadora constitu´ıda:

Prof. Dr. rer.nat. Aldo von Wangenheim Departamento de Inform´atica e Estat´ıstica Orientador

Leandro Coser

Departamento de Inform´atica e Estat´ıstica Co-Orientador

Banca Examinadora

Leandro Coser

Departamento de Inform´atica e Estat´ıstica

Antonio Carlos Sobieranski

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“Perder dinheiro é perder pouco, Perder Confian¸ca é perder muito, Perder a Coragem é perder tudo. Portanto, mantenha a coragem como o bem mais precioso de sua vida.” Masutatsu Oyama

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Agradecimentos

Ao orientador Professor Aldo von Wangenheim por suas sugestões e cr´ıticas. Ao co-orientador e membro da banca Leandro Coser por sua paciência e dedica¸cão nestes ´

ultimos meses. Ao membro da banca Antonio Carlos Sobieranski por apontar caminhos que ajudaram no enriquecimento deste trabalho.

`

A Prof. Dra. Cláudia Maria Oliveira Simões por me receber em seu laboratório e fornecer o material necessário para iniciar meus estudos sobre o Teste Cometa. Além disso, agrade¸co a ela por me apresentar ao Mestrando Thiago Caon, quem sempre esteve pronto para esclarecer quaisquer dúvidas sobre o Teste Cometa.

Ao Grupo Cyclops, onde tive a oportunidade de contribuir e aprender ao longo destes ´

ultimos dois anos. Especialmente aos colegas Márcio Giovani Jasinski, Miguel Cartagena e Diego Garcia, que me presentearam com inúmeras li¸cões enquanto trabalhamos juntos. Ao Mestre Rafael Simon Maia por ser um gestor participativo, estar sempre disposto a ajudar e compreender quando as coisas não iam bem.

Aos meus amigos e colegas de curso, com os quais pude compartilhar esta maravilhosa fase de minha vida.

Aos meus pais por proporcionarem a infra-estrutura necessária para que eu pudesse ingressar, cursar e concluir o curso de Bacharelado em Ciências da Computa¸cão na Univer-sidade Federal de Santa Catarina. Agrade¸co a eles, também, por todo o apoio, incentivo, amor e carinho de que precisei ao longo destes anos.

Ao meu irmão Liber Alves San Martin que, mesmo sem tempo, sempre esteve ao meu lado disposto a conversar sobre os mais diversos assuntos e dar seu apoio quase incondicional nas decisões que tomei. À minha namorada Mônica Patr´ıcia Sequinatto pelo seu esfor¸co em prol de minha forma¸cão, amor, carinho e compreensão. Aos meus Avós que mesmo estando tão longe sempre estiveram tão perto.

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Resumo

O Processo de avalia¸cão da genotoxicidade do Teste Cometa pode ser auxiliado por ferramentas de análise computacional, dando mais rapidez e precisão às análises. No entanto, esses sistemas são importados e têm um pre¸co muito elevado, o que dificulta sua aquisi¸cão por parte dos laboratórios.

Este trabalho apresenta a proposta de uma metodologia computacional para automa-tizar o processo de avalia¸cão do teste cometa através de técnicas de processamento de imagens digitais(PDI). Com a aplica¸cão de técnicas de PDI é poss´ıvel extrair caracter´ıs-ticas geométricas dos cometas, por meio do qual são corretamente classificados.

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Abstract

The evaluation process of Comet Assay genotoxicity can be aided by computational analysis tools, providing faster and more accurate analysis. However, these systems have high prices, which difficults their acquisition by laboratories.

Aiming to be the basis for the construction of such a computational tool, this work presents a proposal for a methodology to automate the process of the Comet Assay eva-luation through Digital Image Processing techniques(DIP). With the application of DIP techniques it is possible to extract geometric characteristics of comets, through which they are classified.

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Sum´

ario

Lista de Figuras

Lista de Tabelas

Lista de acrˆonimos e abrevia¸c˜oes p. 14

1 Introdu¸c˜ao p. 16

1.1 Objetivo . . . p. 16 1.1.1 Objetivos Espec´ıficos . . . p. 16

2 Justificativa p. 18

3 Levantamento do Estado da Arte p. 19

3.1 Komet 5.5 . . . p. 19 3.2 Comet Assay IV . . . p. 20 3.3 CometScore . . . p. 22

4 Fundamenta¸c˜ao Te´orica p. 24

4.1 O Teste Cometa . . . p. 24 4.1.1 Como o Teste Cometa Funciona e o que ele Mede . . . p. 25 4.1.2 Varia¸cões do Teste Cometa . . . p. 26 4.1.3 Medi¸cões no Teste Cometa . . . p. 27 4.2 Conceitos Básicos de Processamento de Imagens Digitais . . . p. 28 4.3 Aquisi¸cão de Imagem . . . p. 28 4.4 Pré-processamento . . . p. 29

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4.4.1 Corre¸cão de Inclina¸cão . . . p. 29 4.4.2 Limiariza¸cão . . . p. 30 4.4.3 Subtra¸cão de Imagens . . . p. 31 4.4.4 Filtragem de Imagens . . . p. 31 4.4.5 Filtragem no Dom´ınio Espacial . . . p. 32 4.4.5.1 Filtros da Mediana . . . p. 33 4.4.5.2 Filtragem Gaussiana . . . p. 33 4.4.5.3 Filtro de Difusão Anisotrópica . . . p. 34 4.5 Segmenta¸cão de Imagens . . . p. 37 4.5.1 Deteçcão de Descontinuidades . . . p. 37 4.5.1.1 Transformada de Hough . . . p. 38 4.5.1.2 Deteçcão de Circunferências pela Transformada de Hough p. 38 4.5.1.3 Deteçcão de Bordas . . . p. 39 4.5.1.4 O Operador de Sobel . . . p. 40 4.5.2 Limiariza¸cão . . . p. 41 4.5.2.1 Limiariza¸cão Global . . . p. 42 4.5.2.2 Limiariza¸cão Global Iterativa . . . p. 42 4.6 Morfologia Matemática . . . p. 43 4.6.1 Operadores Mofológicos em Imagens Binárias . . . p. 44 4.6.1.1 Dilata¸cão e Erosão . . . p. 44 4.6.1.2 Abertura e Fechamento . . . p. 45 4.7 Reconhecimento e Interpreta¸cão . . . p. 45

5 Metodologia p. 46

5.1 Ferramenta de Desenvolvimento . . . p. 46 5.2 Passos no Dom´ınio do Processamento de Imagens . . . p. 46 5.3 Aquisi¸c˜ao de Imagem . . . p. 47

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5.4 Defini¸cão da Região de Interesse . . . p. 48 5.5 O Problema dos Cometas em Forma de Nuvem . . . p. 48 5.6 Pré-processamento . . . p. 50 5.7 Segmenta¸cão do Cometa através de Técnicas Baseadas em Limiariza¸cão

Adaptativa com Reconstru¸cão . . . p. 50 5.8 Método Baseado no Algoritmo CHARM para Segmenta¸cão da Cabe¸ca

do Cometa . . . p. 57 5.8.1 Algoritmo de Deteçcão de Circunferência pela Transformada de

Hough através do Vetor de Gradiente de Sobel Limiarizado . . . . p. 59 5.8.2 Algoritmo de Busca Radial para Delineamento da Borda da Cabe¸ca p. 60 5.9 Extra¸cão de Caracter´ısticas das Imagens Segmentadas . . . p. 62 5.10 Base de Conhecimento . . . p. 62 5.11 Classifica¸cão dos Cometas . . . p. 63 5.12 Deteçcão de Erros . . . p. 64

6 Resultados p. 66

7 Conclus˜ao p. 68

8 Trabalhos Futuros p. 70

Referˆencias Bibliogr´aficas p. 71

9 Anexo A - C´odigo Fonte do Prot´otipo p. 74

9.1 anisodiff2D . . . p. 74 9.2 cometGUI . . . p. 76 9.3 cometseg . . . p. 83 9.4 cycCometCVCore . . . p. 84 9.5 extremes searcher bw . . . p. 87 9.6 gray threshold . . . p. 88

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9.7 gray thresholding . . . p. 88 9.8 head segmentation . . . p. 89 9.9 is connectedpixel . . . p. 94 9.10 nonblack var . . . p. 95 9.11 radians . . . p. 96 9.12 threshold by range . . . p. 96 9.13 threshold with reconstruction . . . p. 97

(11)

Lista de Figuras

3.1 A esquerda, tela de apresenta¸c˜` ao de dados e `a direita est´a a tela da base

de dados. . . p. 19 3.2 Comet Assay IV . . . p. 21 3.3 Tela principal do CometScore. . . p. 22 3.4 Menu de informa¸cões que se deseja capturar na análise. . . p. 22 4.1 Exemplo do ciclo básico do teste cometa. As células são retiradas das

amostras para serem fixadas nas lâminas com agarose e, logo, levadas a um tampão de lise. Após serem lisadas, perdendo o citoplasma, mem-brana entre outras estruturas, elas são expostas a um campo eletrofore-tico. Algum tempo depois, as lâminas com DNA recebem um tratamento

e são levadas a um microscópio para serem analisadas. . . p. 24 4.2 Classifica¸cão visual sugerida por Collins et. al. (1995). Imagens de

cometas (a partir de linf´ocitos), coradas com DAPI. Representam 0-4

utilizados para as aulas escore visual. . . p. 25 4.3 Esquema de classifica¸c˜ao visual de cometas de Kobayashi et al. (1995).

Cada cometa pode pertencer a uma dos cinco tipos de classes. . . p. 28 4.4 Etapas mais comuns no processamento de imagens. . . p. 29 4.5 Exemplo de binariza¸cão como pré-processamento . . . p. 30 4.6 Distribui¸cão de Gauss em 2-D com média (0,0) e σ = 1 (IMAGE

PRO-CESSING LEARNING RESOURCES, ) . . . p. 34 4.7 Deteçcão de circunferências por meio da transformada de Hough. . . p. 40 4.8 Histograma bimodal. . . p. 42 4.9 Representa¸cão de uma imagem binária. . . p. 43 5.1 Diagrama simplificado da metodologia. . . p. 47

(12)

5.2 Microsc´opio Olympus BX40. . . p. 48 5.3 Uma t´ıpica an´alise mostrando o cometa com sua cabe¸ca( head), cauda(

tail) e o fundo( background) da região de interesse. . . p. 49 5.4 Cometa da classe 4. Não possui cabe¸ca. . . p. 50 5.5 Imagens com contrastes diferentes . . . p. 51 5.6 Imagens em n´ıvel de cinza de linfócitos humanos cometas capturados

com uma cˆamera de intensidade. Esquerda: Controle amostra. Direita:

irradiados com 2 Gy. . . p. 52 5.7 Distribui¸c˜ao Gaussiana do ru´ıdo no fundo da imagem do Teste Cometa

(BOCKER et al., 1999) . . . p. 53 5.8 Dependência do número de objetos(NO) dentro da imagem binária sobre

limiar selecionado.(BOCKER et al., 1999). O decrescimento no NO para

baixos limiares é resultado da fusão dos objetos. . . p. 54 5.9 Metodologia para segmenta¸cão do cometa. . . p. 54 5.10 Resultado final da segmenta¸cão dos cometas pelo método desenvolvido

por Rivest et al.(1996) . . . p. 55 5.11 Fun¸cão de Limiariza¸cão com Reconstru¸cão. Esta fun¸cão utiliza

uma imagem em n´ıveis de cinza f com dimensões M x N. No final do processamento, produz-se uma imagem binária g. O n´ıvel de limiariza¸cão superior t1 deve ser passado à fun¸cão. t1 é o n´ıvel para a limiariza¸cão

superior. . . p. 56 5.12 Exemplo de cometa com cabe¸ca dif´ıcil de ser segmentada. . . p. 58 5.13 Trˆes exemplos de cometas dif´ıceis de terem suas cabe¸cas segmentadas. A

borda branca mostra o resultado da segmenta¸c˜ao via algoritmo CHARM.

(VOJNOVIC et al., ) . . . p. 58 5.14 Sentido da busca radial. . . p. 60 5.15 Localiza¸c˜ao de pontos extremos na imagem do cometa produzida pela

etapa de segmenta¸cão. . . p. 62 6.1 Classifica¸cão do especialista x usuário através do protótipo. . . p. 67 6.2 Tempo de resposta do protótipo. . . p. 67

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Lista de Tabelas

4.1 Máscara 3x3 freqüentemente usada no filtro de mediana . . . p. 33 5.1 A ocorrência de p´ıxeis ruidosos é usado para calcular o limiar ótimo. . . . p. 55 5.2 Principais passos para a segmenta¸cão do cometa inteiro . . . p. 57

(14)

14

Lista de acrˆ

onimos e abrevia¸

c˜

oes

A

API - Application Programming Interface AIFF - Audio Interchange File Format

B

BSD - Berkeley Software Distribution

G

GNU - Gnu is not unix

H

HU - Hospital Universit´ario

I

IDE (Integrated Development Environment)

L

LIRC - Linux Infrared Remote Control

LGPL - GNU LESSER GENERAL PUBLIC LICENSE

P

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Lista de acrˆonimos e abrevia¸c˜oes 15

PDI Processamento Digital de Imagens

R

ROI - Region of interest

S

SGI - Silicon Graphics, Inc

SR - Speech Recognition ou Structured Report (de acordo com o contexto)

T

TAG- Do inglˆes, etiqueta

U

(16)

16

1 Introdu¸

c˜

ao

O Teste Cometa, também conhecido como Ensaio Cometa, é utilizado como um m´ e-todo para medir o dano no DNA das células. Por ser de fácil execu¸cão e de baixo custo, foi largamente adotado tanto nos meios acadêmicos quanto fora dele. Contudo, o processo de classifica¸cão de centenas de células presentes nas lâminas é visual e repetitivo, tornando-se um tanto cansativo para os especialistas envolvidos.

Essa situa¸cão motivou a cria¸cão de diversos sistemas de visão computacional para a quantifica¸cão do Teste Cometa. No entanto, o alto custo desses sistemas ainda torna sua aquisi¸cão inviável para a maioria dos laboratórios brasileiros.

Através de um estudo detalhado sobre o Teste Cometa e das técnicas mais comuns utilizadas para sua automatiza¸cão por computador, este trabalho buscou desenvolver uma metodologia para classificar cada núcleo de célula, a partir da qual seja poss´ıvel imple-mentar um sistema computacional eficiente e de baixo custo.

1.1 Objetivo

Este trabalho visa o desenvolvimento de uma metodologia computacional capaz de automatizar o processo de classifica¸c˜ao dos n´ucleos celulares, em imagens oriundas de Testes Cometa, quanto aos danos em seus DNAs.

1.1.1 Objetivos Espec´ıficos

• Estudo das t´ecnicas utilizadas em Processamento de Imagens Digitais; • Apresenta¸c˜ao dos princ´ıpios do Teste Cometa;

• Aplica¸c˜ao de t´ecnicas de processamento digital de imagem para melhoramento das caracter´ısticas das imagens dos cometas;

(17)

1.1 Objetivo 17

• Levantamento, desenvolvimento e/ou aplica¸cão de técnicas de processamento digital de imagem para segmenta¸cão das cabe¸cas e caudas dos cometas;

• Levantamento, desenvolvimento e/ou aplica¸cão de técnicas de processamento digital de imagem para classifica¸cão das imagens dos cometas conforme as cinco classes tradicionais de acordo com o dano no DNA;

• Extra¸cão de caracter´ısticas das imagens dos cometas como comprimento da cauda do cometa e diâmetro da cabe¸ca, baseada na análise computacional das caracter´ısticas da imagem.

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18

2 Justificativa

O Teste Cometa foi introduzido por Östling e Johanson em 1984 (OSTLING; JOHAN-SON, 1984), sendo uma técnica desenvolvida para detectar a quebra de DNA (ácido de-soxirribonucléico), produzida por altera¸cão genética nas células. Devido ao baixo custo envolvido em sua execu¸cão, ele é hoje um dos testes mais populares para a análise de genotoxicidade.

Cada lâmina a ser analisada por um especialista possui mais de 100 cometas distri-bu´ıdos de forma desuniforme em sua superf´ıcie. Dentre os cometas dispostos sobre cada lâmina, em média, 50 são selecionados e classificados visualmente por um especialista. Na classe zero o cometa não possui cauda, contendo pouca danifica¸cão no material genético. Nas classes um, dois e três, os cometas apresentam uma cauda formada pelo escorrimento do material genético sobre a lâmina. O comprimento dessa cauda em rela¸cão ao diâmetro da cabe¸ca, entre outras caracter´ısticas, é usado para classificar o cometa visualmente pelos especialistas em uma dessas três classes(Fig.4.3). Já cometas da classe 4 não apresentam uma cabe¸ca bem definida, formando uma nuvem (Fig.4.2).

A análise de um grande número lâminas é considerado um processo cansativo, além disso, como o processo tradicional de sele¸cão e classifica¸cão dos cometas é visual.

Nesta pesquisa, procura-se desenvolver uma metodologia de baixo custo computacio-nal que automatize o processo de classifica¸cão dos danos do DNA de cada cometa presente nas imagens das lâminas, capturadas por uma câmera digital convencional acoplada ao microscópio.

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19

3 Levantamento do Estado da

Arte

Nas próximas se¸cões há uma breve descri¸cão dos sistemas computacionais mais uti-lizados para avalia¸cão da genotoxicidade do Teste Cometa dispon´ıveis no mercado. Os cometários sobre os mesmos são feitos com base nas informa¸cões disponibilizadas pelas empresas responsáveis.

3.1 Komet 5.5

O software Komet 5, segundo a empresa ANDOR Technology, sua fabricante, é, sim-plesmente, a mais avan¸cada e completa solu¸cão em software para análise, manuseio de dados e apresenta¸cão de amostras do Teste Cometa. O Komet 5 introduziu o uso de Base de Dados, armazenando a imagem de cada célula junto com sua respectiva análise.

Figura 3.1: À esquerda, tela de apresenta¸cão de dados e à direita está a tela da base de dados.

Separadamente ao Komet 5.5, há o Komet Database View(DBV), com o qual se pode visualizar os dados da base de dados, além de ser poss´ıvel realizar análises sobre o mesmo. O DBV permite apresentar os resultados na forma de Dose Response curves e de outros

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3.2 Comet Assay IV 20

tipos de gr´aficos.

Principais Caracter´ısticas:

• Captura de cometas por um só clique do “mouse”(“one click capture”), garantindo uma rápida pontua¸cão(“scoring”);

• Computa¸c˜ao completamente autom´atica e interativa da porcentagem de DNA da cabe¸ca e cauda, momento Olive da cauda, porcentagem de intensidade da cauda, comprimento da cauda, etc.;

• Base de dados de captura e armazenamento das imagens e dados das células; • Visualiza¸cão da base de dados permite a apresenta¸cão de dados, decodifica¸cão e

sum´arios de dados para an´alise estat´ıstica;

• O modo “Experience” guia o usuário pela análise, lâmina por lâmina;

• O “scoring”(pontua¸cão) pode ser suspenso e reiniciado em múltiplas sessões. Atualmente, o Komet 5.5 é vendido por USD$6440,00.

3.2 Comet Assay IV

O Comet Assay IV possui o lema:“O sistema de classifica¸cão de teste cometa mais consistente e mais rápido do mundo”. Desenvolvido pela Perseptive Instruments, destaca-se pelo destaca-seu método de classifica¸cão de apenas um clique e pela imagens de v´ıdeo ao vivo, caracter´ısticas que, segundo a empresa, tornam seu software o mais simples de ser utilizado.

Caracter´ısticas de Comet Assay IV

• Marca automaticamente as células avaliadas para prevenir que os usuários classifi-quem a mesma célula duas vezes;

• Suporte a cˆamera colorida para obter imagens de v´ıdeo ao vivo;

• Facilidade de importa¸cão e classifica¸cão de imagens capturadas com qualquer câmera digital;

• A classifica¸cão automática por um só clique permite uma melhor velocidade e re-produtibilidade;

(21)

3.3 CometScore 21

Figura 3.2: Comet Assay IV

• Suas ferramentas de administra¸c˜ao de estudos flex´ıveis colaboram na realiza¸c˜ao de um trabalho personalizado;

• A conectividade com o banco de dados Oracle aumenta a seguran¸ca dos resultados; • Possui diversas macros de Excel para a an´alise e compara¸c˜ao de dados;

• Armazena as imagens automaticamente dados da an´alise para garantir mais quali-dade;

O funcionamento básico do software é relativamente simples. Com o acoplamento uma câmera ao microscópio, o Comet Assay IV pode capturar as imagens em tempo real, ou seja, o que se pode observar na tela do computador é um v´ıdeo do que está acontecendo sob as lentes do microscópio. Isto permite que o microscópio possa ser calibrado e as altera¸cões apare¸cam no monitor. Logo, a classifica¸cão de cada cometa é feita no momento em que se clica sobre o mesmo, que aparece no v´ıdeo. O cometa clicado recebe uma marca para evitar reclasisifica¸cões e os dados podem ser armazenados tanto em um arquivo no formato do “Excel” quanto num armazenados no banco de dados, ou nos dois.

(22)

3.3 CometScore 22

Figura 3.3: Tela principal do CometScore.

3.3 CometScore

O CometScore é um software gratuito para quantificar os resultados do teste cometa. O software produzido pela Tritek Corporation roda apenas na plataforma Windows. Ele aceita unicamente imagens de 8-bit em tons de cinza ou 24-bit coloridas, ambas no formato BMP. Além disso, a disposi¸cão dos cometas nas imagens deve ser horizontal, da esquerda-para-direita ou da direita-para-esquerda.

Caso as imagens não estejam nesse padrão, a empresa fabricante aconselha que sejam usados softwares de processamento de imagem para corrigi-las. Um software aconselhado pela empresa é o GIMP, cuja licen¸ca de uso é livre.

Estando a imagem pronta para ser analisada, ela deve ser carregada no CometScore. Uma vez carregada, o usuário deve, ainda, separar os cometas do fundo da imagem. Essa tarefa é realizada através de um componente localizado no lado direito da tela. Com isso, é aplicada uma limiariza¸cão simples sobre a imagem inteira.

Figura 3.4: Menu de informa¸c˜oes que se deseja capturar na an´alise.

Para escolher o cometa que se deseje classificar, é preciso clicar e arrastar o mouse em volta do cometa para formar um retângulo ao seu redor. Feito isso, o usuário deve tra¸car uma linha entre a cabe¸ca do cometa e a cauda usando o próprio “mouse”. Uma vez

(23)

3.3 CometScore 23

feito o retˆangulo, um linha passa a acompanhar o ponteiro do “mouse”. Tra¸cada a linha divisora, o programa faz o processamento para extrair as informa¸c˜oes do cometa escolhido finalmente.

Dentre as 17 informa¸cões que o CometScore é capaz de capturar estão: comprimento da cauda, área da cauda, porcentagem de DNA na cauda, momento da cauda e momento Olive da cauda. As informa¸cões que se deseje extrair devem ser escolhidas em uma janela de configura¸cão.

Ap´os haver quantificado os cometas desejados, as informa¸c˜oes podem ser visualizadas em um software de planilhas, como o Microsoft Excel.

(24)

24

4 Fundamenta¸

c˜

ao Te´

orica

4.1 O Teste Cometa

O teste cometa foi introduzido por Östling e Johanson em 1984 (OSTLING; JOHAN-SON, 1984), sendo uma técnica desenvolvida para detectar a quebra de DNA (ácido desoxirribonucléico), produzida por altera¸cão genética nas células.

Figura 4.1: Exemplo do ciclo básico do teste cometa. As células são retiradas das amostras para serem fixadas nas lâminas com agarose e, logo, levadas a um tampão de lise. Após serem lisadas, perdendo o citoplasma, membrana entre outras estruturas, elas são expostas a um campo eletroforetico. Algum tempo depois, as lâminas com DNA recebem um tratamento e são levadas a um microscópio para serem analisadas.

O princ´ıpio no qual o teste cometa se baseia é que danos no DNA reduzem o tamanho de seus fragmentos. Este efeito é detectado ao se aplicar um campo eletroforético 1 para separar os fragmentos genéticos do núcleo de acordo com seus tamanhos. Antes de serem

1

A eletroforese é uma técnica utilizada para separar macromoléculas tais como ácidos nucléicos ou prote´ınas com base no tamanho, na carga elétrica e em outras caracter´ısticas f´ısicas. Tal propriedade, atribui-lhe um papel fundamental na separa¸cão dos fragmentos de DNA durante a execu¸cão do teste cometa.

O uso deste método possibilita a migra¸cão das moléculas através da extensão do gel, impulsionadas por uma corrente elétrica. Nas extremidades do gel estão os elétrodos que fornecem a for¸ca dirigida. Em alguns casos, o formato da moléculas também influencia na facilidade de migra¸cão pelo gel.

(25)

4.1 O Teste Cometa 25

expostas a tal campo, as células já foram devidamente lisadas com o tampão de lise. O padrão migratório formado pelos fragmentos de DNA formam um padrão t´ıpico da cauda de um cometa.

Por ser simples, sens´ıvel, versátil, rápido e econômico ele têm atra´ıdo muitos adeptos, sendo que sua cita¸cão em trabalhos acadêmicos e utiliza¸cão em laboratórios cresce a cada ano. Conseqüentemente, vem sendo aplicado em testes genotóxicos, biomonitoramento humano, epidemiologia molecular, ecotoxicologia, assim como em pesquisas em danos e reparo de DNA.

4.1.1 Como o Teste Cometa Funciona e o que ele Mede

Na década de 1970, Cook et. al.(1976) desenvolveram uma abordagem para a inves-tiga¸cão de estruturas nucleares baseada na lise de células com detergente não-iônico e de cloreto de sódio em alta concentra¸cão. Este tratamento remove membranas, citoplasma e nucleoplasma, e desintegra os nucleossomos. Quase todas as histonas são diluidas pelo alto cloreto de sódio (COLLINS, 2004). As histonas são prote´ınas fortemente associadas com moléculas de DNA. Elas são responsáveis pela estrutura da cromatina e desempenham um importante papel na regula¸cão da expressão gênica.

Figura 4.2: Classifica¸c˜ao visual sugerida por Collins et. al. (1995). Imagens de cometas (a partir de linf´ocitos), coradas com DAPI. Representam 0-4 utilizados para as aulas escore visual.

Assim, apenas o nucléolo é deixado, consistindo de uma matriz nuclear ou “scaffold”( esqueleto) composta por ácido ribonucleico( RNA) e prote´ınas, juntamente com o DNA, o qual é negativamente supercoloidado 2 como conseqüência dos giros feitos pela

dupla-2

(26)

h´elice em volta das histonas do nucleossomos.

O que sobra do “supercoils” sugere que a rota¸cão livre do DNA não é mais poss´ıvel. Cook et. al.(1976) propuseram um modelo com o DNA unindo a matriz em intervalos para que seja distribu´ıdo eficientemente em uma série de “loops”, mais que uma molécula linear. Quando o “supercoil” negativo estiver desenrolado pelo intercalamento com o brometo de et´ıdio, os “loops” expandidos do centro do nucleóide formarão uma mancha. Um efeito similar foi visto quando uma radia¸cão ionizante foi usada para relaxar os “loops” - uma quebra de fita simples é suficiente para relaxar o “supercoil” num dado “loop”.

O teste cometa, portanto, em sua forma mais freqüente de uso, envolve a lise de detergente em alta concentra¸cão salina, seguida de fixa¸cão em agarose para que o DNA fique imobilizado com a subseqüente eletroforese.

A primeira demonstra¸cão de “cometas” foi realizada por Östling e Johanson(1984), que descreveram as caudas em fun¸cão do DNA com “supercoil” relaxado e referenciaram ao modelo de nucleóide de Cook et. al.(1976). Essencialmente, a cauda do cometa parece uma simples mancha dos “loops” relaxados arrastados para um lado pelo campo eletroforético.

¨

Ostling e Johanson(1984) empregaram um pH menor que dez. Este fato mostra que, apesar da varia¸cão mais comum atual do teste cometa empregar o SCGE alcalino, um alto pH não é essencial para detectar a quebra de fita simples.

4.1.2 Varia¸

c˜

oes do Teste Cometa

O Teste Cometa apresenta algumas varia¸c˜oes, contudo as mais comuns s˜ao:

• Alkaline Single Cell Gel Electrophoresis

O procedimento de Östling e Johanson não foi largamente adotado. Alguns anos mais tarde, dois grupos de pesquisadores (SINGH et al., 1988) desenvolveram de forma independente métodos que envolviam o tratamento usando um alto pH. Esta alcaliniza¸cão torna as caudas dos cometas mais pronunciadas e melhora a resolu¸cão do teste, não afetando a sensibilidade( isto é, detecta a pequenas doses de dano).

no sentido contrário ao de rota¸cão da hélice, diminuindo o número de ligamentos, temos o “supercoil” negativo. O “supercoil” é positivo quando ele aumenta o número de ligamento. O estado super enrolado é menos estável que o estado relaxado. Para desfazer o “supercoil” é necessário uma quebra em uma das cadeias de DNA. Essa quebra é usada no teste cometa e faz com que o “supercoil” seja diretamente responsável pela mancha em forma de cometa resultante dos testes.

(27)

• Neutral Single Cell Gel Electrophoresis

Foi desenvolvido por Olive et. al. para facilitar a deteçcão da quebra de fita dupla sem a interferência da quebra de fita simples. Seu procedimento emprega um tra-tamento extensivo de quebra das células em agarose a cinqüenta graus célcios. Sob essas condi¸cões é provável que a matriz nuclear esteja descontinuada de modo que será verdadeiramente poss´ıvel verificar o comportamento dos segmentos provenientes da quebra de fita dupla.

4.1.3 Medi¸

c˜

oes no Teste Cometa

Kumaravel et. al(2007) detalha os métodos usados para avaliar as imagens do Teste Cometa. As principais técnicas descritas em seu artigo são apresentadas a seguir.

Sing et. al(1988) desenvolveram uma versão alcalina do Teste Cometa. no qual eles usaram o comprimento da migra¸cão do DNA( comprimento da cauda) para quantificar a extensão de seu dano. Subseqüentemente, outros grupos de pesquisadores publicaram artigos no qual novos parâmetros do Teste Cometa foram usados. Contudo, a maior parte desses novos parâmetros encontrados ca´ıram em desuso.

Olive et. al(1990) fez uma notável publica¸cão, onde é usado o conceito de “tail mo-ment” (momento da cauda) para descrever a migra¸cão do material genético. O “tail moment” calculado por Olive et. al(1990) se tornou conhecido como “Olive tail mo-ment”(OTM). Este parâmetro é particularmente útil na descri¸cão da heterogeneidade em uma popula¸cões celulares, pois o OTM pode pegar varia¸cões na distribui¸cão do DNA na cauda.

Collins et. al(1995) publicaram um método de pontua¸cão visual(”visual scoring”) através do qual se pontua cada cometa, classificando-os em graus que vão de 0 a 4( Fig. 4.2). Dessa forma, se 100 cometas são classificados em uma lâmina, o seu “score” total ficará entre 0 e 400 unidades arbitrárias.

Outra publica¸cão de destaque sobre a classifica¸cão visual foi a de Kobayashi et al.(1995). O sistema de “scoring” usado por eles agrupou os cometas em cinco estágios(Fig. 4.3). No entanto, eles não calculam o “score” total para cada lâmina.

A quantifica¸cão visual é um método rápido e simples, ao qual se deve recorrer para explorar a utilidade do Teste Cometa, sem a necessidade de investir em equipamentos e caros softwares de análise de imagens(COLLINS, 2004).

(28)

4.2 Conceitos B´asicos de Processamento de Imagens Digitais 28

Figura 4.3: Esquema de classifica¸c˜ao visual de cometas de Kobayashi et al. (1995). Cada cometa pode pertencer a uma dos cinco tipos de classes.

Cabe salientar que o “scoring” visual baseado em Collins et. al(1995) se tornou muito popular em estudos de biomonitoramento e estudos de repara¸cão de DNA. Mais de 70 estudos de biomonitoramento se reportam ao dano de DNA usando o critério de quanti-fica¸cão visual (MOLLER, 2006).

4.2 Conceitos B´

asicos de Processamento de Imagens

Digitais

As imagens são facilmente digitalizadas com as tecnologias existentes. Seja através de uma simples câmera fotográfica digital ou de aparelhos de tomografia computadorizada, pode-se capturar sinais cont´ınuos e digitalizá-los para fins, como análise, arquivamento, uma posterior visualiza¸cão ou qualquer outro tipo de processo.

Nesse contexto, tem-se destacado o processamento digital de imagens(PDI). Apli-cando opera¸cões de PDI, consegue-se não apenas melhorar a qualidade da imagem para a visão humana como também adaptá-las para a análise de suas caracter´ısticas e estru-turas presentes segundo Russ (1998). Como, normalmente, o processamento de imagens envolve procedimentos que podem ser expressos de forma algor´ıtmica, a maior parte de suas fun¸cões podem ser implementadas via software (FILHO, 1999).

A divis˜ao das principais etapas do processamento de imagens segundo Gonzalez(2002) s˜ao apresentadas na figura 4.4.

4.3 Aquisi¸

c˜

ao de Imagem

A aquisi¸cão de uma imagem é a primeira etapa no processamento de imagens. Para realizá-la, necessita-se de um sensor e um digitalizador. A fun¸cão do sensor será o de converter a imagem em sinal elétrico enquanto o digitalizador converterá a imagem ainda no formato analógico para um sinal digital.

(29)

4.4 Pr´e-processamento 29

Figura 4.4: Etapas mais comuns no processamento de imagens.

Para obter uma imagem de qualidade deve-se escolher de forma adequada os sensores, o conjunto de lentes, as condi¸cões de ilumina¸cão da cena, estabelecer os requisitos de velocidade de aquisi¸cão, a resolu¸cão, a quantidade de cores, entre outros. No final desta etapa, tem-se a imagem digitalizada(FILHO, 1999).

4.4 Pr´

e-processamento

Nem sempre a imagem digitalizada é uma representa¸cão precisa da cena capturada ou mesmo útil para uma análise. Essa imagem pode possuir p´ıxeis ruidosos, contraste e brilho inadequados, fusão de objetos da cena com o fundo, inclina¸cão inadequada, etc. Assim, o principal objetivo nesta etapa é preparar a imagem para futuras opera¸cões sobre a mesma, aplicando melhoramentos em sua qualidade, como o realce de caracter´ısticas relevantes, corre¸cão de inclina¸cão e corre¸cão de defeitos que possam ter ocorrido. Este trabalho é realizado em baixo n´ıvel, ou seja, diretamente nos valores de intensidade dos p´ıxeis(FILHO, 1999).

4.4.1 Corre¸

c˜

ao de Inclina¸

c˜

ao

O algoritmo classificador de cometas depende da correta orienta¸c˜ao das caudas dos cometas dentro das imagens adquiridas. Neste caso, ele espera que os cometas tenham suas caudas voltadas para a direita. Dessa forma, se a imagem possuir seus cometas com as

(30)

caudas voltadas para a esquerda, poderá fatalmente ocorrer um grave erro, gerando uma classifica¸cão inadequada. Uma corre¸cão da inclina¸cão da imagem poderá ser necessária nessa etapa.

4.4.2 Limiariza¸

c˜

ao

Quando a imagem é adquirida em n´ıveis de cinza, ela pode conter muitas informa¸cões desnecessárias para a etapa de segmenta¸cão. Logo, pode-se aplicar a técnica de Limia-riza¸cão para reduzir a quantidade de dados existentes na imagem e minimizar o ru´ıdo, tendo como resultado uma imagem mais limpa.

A forma mais simples de Limiariza¸cão, a qual usa apenas um valor de limiar é conhe-cida como Limiariza¸cão Global(GORMAN, 1995).

B(x, y) =    0 se f (x, y) ≤< T 1 se f (x, y) > T (4.1)

De forma sucinta, pode-se dizer que a Limiariza¸cão Global( 4.1 ), conhecida também por Binariza¸cão, gera uma imagem binária B(x, y), a partir de, por exemplo, uma imagem em tons de cinza f (x, y), usando um tom T para decidir qual p´ıxel passará para 0 e qual passará para 1.

No exemplo a seguir, utiliza-se Limiariza¸c˜ao para reduzir a quantidade de informa¸c˜oes na imagem.

(a) imagem original (b) Limiariza¸c˜ao com T = 65

(31)

4.4.3 Subtra¸

c˜

ao de Imagens

A subtra¸cão de duas imagens f (x, y) e g(x, y) é considerada uma opera¸cão ponto-a-ponto e pode ser denotada por

h(x, y) = f (x, y) − g(x, y) (4.2)

e é obtida pelo cálculo da diferen¸ca entre todos os pares de p´ıxeis de localiza¸cões correspondentes de f e g.

4.4.4 Filtragem de Imagens

As t´ecnicas de filtragem de imagens digitais tˆem como objetivos(PEDRINI; SCHWARTS, 2008)

• Melhorar a qualidade de uma imagem( nitidez); • Eliminar ru´ıdos;

• Pr´e-segmentar imagens;

• Eliminar ou provocar distor¸c˜oes; • Criar efeitos art´ısticos.

Em resumo, a filtragem de imagem é usada para produzir imagens mais apropriadas do que a imagem original para determinada aplica¸cão. Ela pode se dar tanto no dom´ınio espacial quanto no dom´ınio da freqüência.

As filtragens no dom´ınio espacial trabalham no próprio plano da imagem, isto é, sobre seus p´ıxeis diretamente. Por outro lado, as técnicas no dom´ınio da freqüência são baseadas nas transformadas de Fourier das imagens(GONZALEZ; WOODS, 2002).

Apesar das filtragens no dom´ınio da freqüência apresentarem uma boa resposta, os algor´ıtmos de PDI contidos na metodologia desenvolvida durante este trabalho pertencem ao dom´ınio espacial. Por conseguinte, concentrar-se-á a fundamenta¸cão teórica no mesmo, a fim de proporcionar um melhor entendimento da metodologia desenvolvida.

(32)

4.4.5 Filtragem no Dom´ınio Espacial

No dom´ınio espacial, o valor do p´ıxel resultante de uma filtragem depende do seu valor original e do valor de sua vizinhan¸ca. Os pontos mais próximos são os que possuem maior influência sobre o ponto a ser modificado.

Fun¸c˜oes de processamento de imagens no dom´ınio espacial podem ser expressas como

g(x, y) = T [ f (x, y)] (4.3)

onde f (x, y) é a imagem de entrada, g(x, y) é a imagem processada, e T é um operador sobre f , definido sobre alguma vizinhan¸ca de (x, y).

O principal meio de realizar o processamento no dom´ınio espacial é através da apli-ca¸cão de matrizes conhecidas como máscaras, cuja forma normalmente é quadrada, em todos os p´ıxeis da imagem.

Assim, o novo valor para um p´ıxel na posi¸cão (x, y) após a aplica¸cão de uma máscara com centro na mesma posi¸cão, depende dos valores de seus p´ıxeis vizinhos e dos coeficientes da máscara.

Se os n´ıveis de cinza de uma imagem sob a m´ascara forem denotados por z_i= f (x, y), 1 ≤ i ≤ 9, tem-se uma resposta da m´ascara

R= 9

∑

i=1

w_iz_i (4.4)

em que wi representa os coeficientes da m´ascara.

Na filtragem no dom´ınio espacial há dois conceitos que merecem destaque: a correla¸cão e a convolu¸cão. Os filtros lineares, ou máscaras, são geralmente descritos por matrizes de convolu¸cão.

Seja w o filtro de correla¸cão. Em geral, seleciona-se um filtro com número ´ımpar de elementos, tal que, durante seu deslocamento sobre a imagem, o centro do filtro esteja localizado sobre o p´ıxel em considera¸cão na imagem.

A correla¸c˜ao de uma imagem f de tamanho m × n por um filtro w pode ser expressa como w(x, y) · f (x, y) = m/2

∑

i=[−m/2] n/2

∑

j=[−n/2] w(i, j) f (x + i, y + j) (4.5)

(33)

De forma similar a correla¸cão, a convolu¸cão se baseia na aplica¸cão de um filtro w0 sobre a imagem. O filtro w0 é resultado uma reflexão, ou seja, uma rota¸cão de 180 graus, do filtro w. Dessa forma, a convolu¸cão de uma imagem bidimensional f por um filtro w0 é expressa por w(x, y) ∗ f (x, y) = m/2

∑

i=[−m/2] n/2

∑

j=[−n/2] w(i, j) f (x − i, y − j) (4.6)

Em caso de simetria no filtro, a correla¸cão e a convolu¸cão são idênticas. A seguir, serão apresentados alguns dos filtros mais importantes pertencentes ao dom´ınio espacial, como o filtro de Mediana e filtro de Gauss.

4.4.5.1 Filtros da Mediana

Os filtros de mediana, ou filtros passa-baixa, são freqüentemente usados para suavizar imagens, reduzindo a varia¸cão de intensidades entre um p´ıxel e seu sucessor. Isso, também, ocasiona uma redu¸cão no ru´ıdo.

1/9 1/9 1/9

Tabela 4.1: M´ascara 3x3 freq¨uentemente usada no filtro de mediana

A idéia deste filtro é substituir o p´ıxel atual pelo valor médio de intensidades de sua vizinhan¸ca, incluindo ele próprio(IMAGE PROCESSING LEARNING RESOURCES, ). Ele tem o efeito de eliminar p´ıxeis com valores muito diferentes da média de sua vizinhan¸ca, reduzindo, assim, o ru´ıdo impulsivo( sal-e-pimenta).

4.4.5.2 Filtragem Gaussiana

O filtro de Gauss ´e um operador de convolu¸c˜ao bidimensional, muito similar ao filtro de mediana, usado para suavizar as imagens e remover ru´ıdos.

Nesse tipo de filtro, os coeficientes da máscara são derivados a partir de uma fun¸cão Gaussiana bidimensional. A fun¸cão Gaussiana isotrópica( circularmente simétrica) com média zero e desvio padrão σ é definido como

G(x, y) = 1 2πσ2e

(−(x2+y2)

(34)

que é usada como um filtro de suaviza¸cão. Um exemplo de gráfico da distribui¸cão gaussiana é mostrado na figura 4.4.5.2.

Figura 4.6: Distribui¸c˜ao de Gauss em 2-D com m´edia (0,0) e σ = 1 (IMAGE PROCES-SING LEARNING RESOURCES, )

O filtro de Gauss tem algumas propriedades matem´aticas interessantes:

• Ele é um filtro isotrópico, ou seja, produz a mesma resposta em todas as dire¸cões na imagem;

• Quanto maior o valor de σ , maior a largura do filtro Gaussiano e maior ser´a a suaviza¸c˜ao;

• Fun¸cões Gaussianas são separáveis, logo, uma convolu¸cão Gaussiana pode ser reali-zada processando a imagem com um filtro unidirecional e então processando o resul-tado com o mesmo filtro unidirecional orienresul-tado ortogonalmente ao filtro Gaussiano usado na primeira etapa. Esse processo causa uma grande redu¸cão no número de opera¸cões feitas na convolu¸cão(PEDRINI; SCHWARTS, 2008).

Apesar do filtro Gaussiano ser capaz de suavizar as imagens, ele também borra as bor-das bor-das imagens. Esse problema é minimizado se for usado o filtro de Difusão Anisotrópica ao invés do filtro de Gauss.

4.4.5.3 Filtro de Difus˜ao Anisotr´opica `

As vezes deseja-se suavizar uma imagem digital preservando o máximo poss´ıvel as bordas das estruturas presente na mesma. No caso da suaviza¸cão das imagens do Teste Cometa, essa propriedade é fundamental, uma vez que desde de sua aquisi¸cão as estru-turas internas do cometas, como a cabe¸ca e a cauda, já possuem bordas mal definidas. Um dos filtros mais destacados quando se procura suavizar uma imagem preservando as

(35)

inter-regiões, é o filtro de Difusão Anisotrópica. Chung e Shapiro(2000) aplicaram-no para segmentar lesões de pele em imagens digitais, cujas bordas deveriam sofrer a menor degrada¸cão poss´ıvel.

Perona e Marlik( 1990) desenvolveram um filtro anisotrópico formulado matematica-mente como um processo de difusão, que privelegia a suaviza¸cão intra-regional em vez da inter-regional.

Assim, a suaviza¸cão é vista como um processo de difusão que é suprimido ou parado nas bordas pela sele¸cão local de for¸cas de difusão adaptativa. Este processo pode ser expresso por:

∂

∂ tu( ¯x,t) = div(c( ¯

x,t)∇u( ¯x,t)) (4.8)

A for¸ca da difusão é controlada por c( ¯x,t). O ¯x representa as coordenadas espaciais (x, y) para um filtro em 2-D. Numa implementa¸cão discreta, a variável t é responsável por enumerar as itera¸cões. A imagem de intensidades I( ¯x,t) é denotada por u( ¯x,t). A fun¸cão c( ¯x,t) depende da magnitude do gradiente da imagem de intensidade. Ela é uma fun¸cão monotonicamente decrescente c( ¯x,t) = f (|∇I( ¯x,t)|), a qual basicamente torna as regiões difusas e não afeta os per´ımetros das localiza¸cões de alto gradiente.

Uma das equa¸c˜oes de difus˜ao propostas e adotadas utilizada nesta pesquisa foi:

c( ¯x,t) = e

|∇I( ¯x,t)| κ

!!

(4.9) O coeficiente de difusão decresce com o aumento do gradiente. Se o gradiente adquire um valor grande, supõe-se uma descontinuidade e a difusão é parada. O parâmetro κ é escolhido de acordo com a quantidade de ru´ıdo e o brilho da borda. Para entender o parâmetro κ e a o valor de descontinuidade 5I, definiu-se Φ(5I) como o produto c ∗ 5I, conhecido como fluxo. O maior fluxo é gerado em locais com o gradiente 5I igual a κ. Quando abaixo de κ, o fluxo se reduz para zero porque em regiões homogêneas um fluxo m´ınimo ou inexistente tem lugar. Acima de κ a fun¸cão de fluxo é mais uma vez decremen-tada à zero, parando a difusão em locais de alto gradiente. Uma escolha correta da fun¸cão de difusão não apenas preserva as bordas como traz estabilidade numérica(CHUNG; SA-PIRO, 2000).

(36)

dos fluxos entre a intensidade dos p´ıxeis vizinhos.

Para exemplificar, pode-se rescrever a equa¸c˜ao 4.8 para coordenadas de duas dimen-s˜oes como:

I_t= div(c(x, y;t)∇u(x, y;t)) = c(x, y;t)∇I + ∇c · ∇I (4.10)

Onde div é o operador divergente, 5 e 4 representam os operadores gradiente e Laplaciano, respectivamente, com respeito à variável espacial. A equa¸cão (4.10) se reduz `

a equa¸cão isotrópica de difusão do calor It= c · 4I se c(x, y;t) for uma constante.

Assim, a difusão na qual o coeficiente de condu¸cão é escolhido localmente como uma fun¸cão de magnitude do gradiente da fun¸cão de brilho preservará e delineará o brilho das bordas se a fun¸cão g(·) for escolhida apropriadamente(MIRANDA; NETO, 2007).

c(x, y,t) = g(||5I(x, y;t)||) (4.11)

A equa¸cão (4.10) pode ser discretizada em um reticulado quadrado, ou vizinhan¸ca-4, com valores de brilho (p´ıxels) associados aos vértices e os coeficientes de condu¸cão aos arcos. Uma discretiza¸cão dos 4-vizinhos do operador Laplaciano pode ser usado:

I_{i, j}t+1= I_{i, j}t + λ [cN· δNI+ cS· δSI+ cL· δLIcO· δOI]ti, j (4.12)

onde 0 ≤ λ ≤ 1₄ para fornecer estabilidade ao esquema numérico. N, S, L, O são os mnemônicos para Norte, Sul, Leste e Oeste. os sobrescritos e super-escritos nos colchetes são aplicados a todos os termos que eles circunscrevem, e o s´ımbolo δ indica as diferen¸cas dos vizinhos mais próximos, dadas por:

                 δNIi, j≡ Ii, j+1− Ii, j+1 δSIi, j≡ Ii, j+1− Ii, j+1 δLIi, j ≡ Ii, j+1− Ii, j+1 δOIi, j≡ Ii, j+1− Ii, j+1 (4.13)

O valor do gradiente pode ser calculado em diferentes estruturas de vizinhan¸ca, con-seguindo diferentes resultados entre precis˜ao e localidade. A escolha mais simples consiste em aproximar a norma do gradiente a cada localiza¸c˜ao de arco com o valor absoluto de

(37)

4.5 Segmenta¸c˜ao de Imagens 37

sua proje¸c˜ao ao longo da dire¸c˜ao do arco:

                 ct_{i, j}= g ∇NI t i, j ct_{i, j}= g ∇SI t i, j ct_{i, j}= g ∇LI t i, j ct_{i, j}= g ∇OI t i, j (4.14)

Segundo Miranda et al(2007), esse esquema não é a discretiza¸cão exata de (4.10), mas da equa¸cão de difusão similar na qual o tensor de condu¸cão é diagonal com valores de entrada g(|I_x|) e g( I_y) em vez de g(||I_x||) e g( I_y

). Esse esquema de discretiza¸cão preserva a propriedade das equa¸cões cont´ınuas (4.10) de que a quantidade total de brilho na imagem é preservada.

4.5 Segmenta¸

c˜

ao de Imagens

Um dos primeiros no processamento de uma imagem digital é o de criar parti¸cões da mesma através de seus elementos consitu´ıntes (GONZALEZ; WOODS, 2002). Esses elementos são caracterizados por propriedades intr´ınsecas da imagem como intensidade média dos p´ıxeis, contraste ou textura. Tal processo é conhecido como segmenta¸cão e representa o menor n´ıvel no qual o entendimento de uma imagem possa ser baseado. A segmenta¸cão é capaz de resumir todos os objetos distintos que compõem uma imagem, o que a torna muito valiosa para extra¸cão de informa¸cões.

Os algoritmos de segmenta¸cão para imagens monocromáticas são geralmente baseados em uma das seguintes propriedades básicas de valores de n´ıveis de cinza: descontinuidade e similaridade. Na descontinuidade a abordagem é particionar a imagem baseado em mudan¸cas bruscas nos n´ıveis de cinza. As principais áreas de interesse são a deteçcão de pontos isolados, deteçcão de linhas e bordas na imagem(BASTOS, ). Na similaridade as principais abordagens baseiam-se em limiariza¸cão e crescimento de regiões.

4.5.1 Detec¸

c˜

ao de Descontinuidades

Em PDI, a deteçcão de descontinuidades são métodos utilizados para salientar a loca-liza¸cão de bordas ou objetos dentro das imagens. A transformada de Hough, por exemplo, foi aplicada para localizar o ponto central das cabe¸cas dos cometas neste trabalho5.8.1.

(38)

4.5.1.1 Transformada de Hough

A forma original da transformada de Hough foi desenvolvida por Paul Hough, em 1962. A transformada é muito usada na deteçcão e um conjunto de pontos na imagem que perten¸cam a uma curva espec´ıfica, tal como segmentos de retas, circunferências, elipses, entre outros objetos parametrizáveis. Essas curvas constituem uma fam´ılia representada por:

f(v, p) = 0 (4.15)

em que v é um conjunto de coordenadas e p é um vetor de parâmetros caracter´ısticos da curva.

Atrav´es de um conjunto de procedimentos, a transformada de Hough busca encontrar um subconjunto de pontos que perten¸cam a curva especificada.

O conceito básico é computar a localidade, no espa¸co de parâmetros, para um con-juntos de curvas passando através de cada elemento de borda candidato na dada imagem. O espa¸co de parâmetros é quantificado em células, e um acumulador é associado a cada célula.

O conteúdo do acumulador de cada célula referenciado por cada locus é incrementado por 1. Os acumuladores a que forem atribu´ıdos os maiores valores representam a localiza-¸cão mais provável da curva procurada. Os acumuladores com o maior conteúdo resultante determinar a existência e a localiza¸cão das curvas mais provável, a partir de determinada classe, no dada imagem (SKLANSKY, 1978).

4.5.1.2 Deteçcão de Circunferências pela Transformada de Hough

A transformada de Hough para Circunferˆencias consiste em encontrar um conjunto de pontos que perten¸cam a uma mesma circunferˆencia.

Num sistema de coordenadas cartesianas, uma circunferˆencia pode ser descrita pela equa¸c˜ao 4.16

(x − a)2+ (y − b)2= r2 (4.16)

(39)

Para cada p´ıxel (x, y), a célula de acumula¸cão (a, b, r) é incrementada se o ponto (a, b) estiver a distância r do ponto (x, y). Se um centro espec´ıfico (a, b) de uma circunferência de raio r é freqüentemente encontrado no espa¸co de parâmetros, há uma grande probabilidade de existir uma circunferência de raio r e centro (a, b) na imagem(PEDRINI; SCHWARTS, 2008). Os tons elevados no espa¸co de parâmetros mostrarão a localiza¸cão dos centros das circunferências no plano da imagem.

Para calcular todos os valores de (x,y) para um determinado ponto(a,b) a equa¸cão 4.16 não é muito utilizada, pois sua parametriza¸cão em fun¸cão de (a,b) não produz, diretamete, implementa¸cões eficientes(PISTORI; PISTORI; COSTA, 1998).

Também é poss´ıvel descrever uma circunferência através de equa¸cões paramétricas usando fun¸cões trigonométricas.

   x= a + rcosθ y= b + rsenθ (4.17)

A forma de coordenada polar ´e a mais usada( eq. 4.17) e a resolvendo para os parˆ a-metros da circunferˆencia tem-se

   a= x − rcosθ b= y − rsenθ (4.18)

Assim, se o raio da circunferência for previamente conhecido, então é necessário in-crementar o acumulador para o ponto (a, b) dado pelas equa¸cões 4.17 e 4.18. Nesse caso, circunferências de raio r poderão ser detectadas a cada aplica¸cão do algoritmo.

4.5.1.3 Detec¸c˜ao de Bordas

A deteçcão de bordas é uma técnica que procura real¸car os pontos de uma imagem digital em que a intensidade luminosa muda abruptamente. Uma borda pode ser des-crita como uma descontinuidade nos n´ıveis de cinza entre duas regiões suficientemente homogêneas de uma imagem.

As técnicas mais utilizadas para a deteçcão de bordas são baseadas na aplica¸cão de operadores de deriva¸cão, como os operadores de gradiente. Isso porque o cálculo da média dos p´ıxels sobre uma região tende a borrar uma imagem. Assim como o cálculo da média é análogo à integra¸cão, pode-se esperar que a diferencia¸cão tenha o efeito oposto, ou seja,

(40)

(a) dados originais no espa¸co (x,y) (b) correnspondente c´elulas de acu-mula¸c˜ao no espa¸co (a,b)

Figura 4.7: Deteçcão de circunferências por meio da transformada de Hough.

ele agu¸ca a imagem(GONZALEZ; WOODS, 2002).

4.5.1.4 O Operador de Sobel

O operador de Sobel, ou filtro Sobel como também é conhecido, calcula o gradiente da intensidade da imagem em cada ponto, dando a dire¸cão da maior varia¸cão de claro para escuro e a quantidade de varia¸cão nessa direçcão.

Para uma imagem f (x, y) define-se o gradiente f nas coordenadas (x, y) como o vetor:

5 f = " G_x G_y # (4.19) 5 f = "_{∂ f} ∂ x ∂ f ∂ y # (4.20)

Sabe-se a partir da análise vetorial que o vetor gradiente aponta na dire¸cão de mudan¸ca mais rápida de f na posi¸cão (x, y). Em deteçcão de bordas, a magnitude desse vetor é uma quantidade importante, geralmente chamada simplesmente de gradiente e denotada por 5 f , em que:

5 f = mag(5 f ) = [G2_x+ G2_y]12 _(4.21)

(41)

na dire¸c˜ao de 5 f . Normalmente, aproxima-se o gradiente com valores absolutos:

5 f = |Gx| + |Gy| (4.22)

que ´e muito mais simples de ser implementada(GONZALEZ; WOODS, 2002).

Já as máscaras que definem o operador de Sobel são implementadas como:

Gx=     −1 0 1 −2 0 2 −1 0 1     (4.23) G_y=     −1 −2 −1 0 0 0 1 2 1     (4.24)

Matematicamente este operador utiliza duas matrizes 3 x 3 que são convolu´ıdas com a imagem original para calcular aproxima¸cões das derivadas - uma para as varia¸cões horizontais e uma para as verticais.

A magnitude(G) e o ângulo de orienta¸cão do gradiente(θ ) são dados respectivamente por: G= q G2 x+ G2y (4.25) e θ (x, y) = arctan Gy G_x (4.26) As máscaras são deslocadas ao longo da imagem. Assim, tem-se como resultado uma imagem de gradiente com o mesmo tamanho da imagem original.

4.5.2 Limiariza¸

c˜

ao

Uma das técnicas mais simples de segmenta¸cão de imagens digitais é a limiariza¸cão. Ela consiste em utilizar um ou mais limiares para classificar os p´ıxeis da imagem. A maior parte das técnicas de limiariza¸cão é baseada no uso de histogramas.

(42)

Figura 4.8: Histograma bimodal.

4.5.2.1 Limiariza¸c˜ao Global

Se uma imagem em tons de cinza f (x, y) apresentar dois picos bem definidos em seu histograma(histograma bimodal), a limiariza¸cão será trivial, pois se procurará repartir os p´ıxeis no valor T encontrado no vale entre os picos. Assim, cada ponto de f (x, y) > T é denominado ponto de objeto, enquanto os outros são ditos pontos de fundo. Neste caso, onde a imagem é dividida em apenas duas classes, o processo é conhecido como binariza-¸

cão. A imagem binária resultante B(x, y) pode ser definida como em 4.1. Normalmente, os valores usados para o fundo e para o objeto são 0 e 1 respectivamente.

Ainda, pode-se utilizar diversos valores de limiares, atribuindo um tom de cinza para cada classe de objetos( intervalo de limiar). Esse processo de segmentar a imagem inteira apenas com um valor de limiar ´e conhecido como limiariza¸c˜ao global.

4.5.2.2 Limiariza¸c˜ao Global Iterativa

Quando não há informa¸cões claras do comportamento de determinado objeto a ser segmentado na imagem, uma abordagem de limiariza¸cão adaptativa pode ser utilizada.

Algumas técnicas determinam o valor do limiar por meio da otimiza¸cão de certas medidas de separa¸cão entre as classes de objetos na imagem. A minimiza¸cão de erros na segmenta¸cão entre as classes é uma técnica bastante utilizada nesses casos. Assim, um método para selecionar iterativamente o valor de limiar é reduzi-lo, contando o número de p´ıxeis ru´ıdosos iterativamente, até encontrar uma quantidade de p´ıxeis ru´ıdosos próxima a esperada. Essa técnica foi utilizada por Bocker et al.(BOCKER et al., 1999) para segmentar imagens de cometas em imagens digitais de ensaios cometas.

Ridler e Calvard(1978) propuseram um método para selecionar iterativamente o valor do limiar baseado na combina¸cão de duas distribui¸cões Gaussianas. Partindo de um valor de limiar inicial, o método busca melhorar esse valor com base na média de tons de cinza do objeto (µ1) e do fundo(µ2). O processo de refinamento pára quando não houverem

(43)

4.6 Morfologia Matem´atica 43

mais altera¸cões significativas entre as itera¸cões, ou seja, quando a diferen¸ca |Ti− Ti+1| entre os limiares T nas itera¸cões i e i + 1 torna-se muito pequena.

4.6 Morfologia Matem´

atica

A morfologia matemática é uma metodologia para análise de imagens digitais nascida na década de 60, na Fran¸ca, na Escola de Minas de Paris. Foi concebida para tratar somente imagens binárias mas ao londo do tempo foi estendida para imagens em n´ıveis de cinza.

Ela permite a constru¸cão de operadores morfológicos úteis para a descri¸cão de objetos em imagens. Além disso, os operadores morfológicos são utilizados em uma série de aplica¸cões como extra¸cão de bordas de objetos, delimita¸cão de fecho convexo, busca de padrões espec´ıficos na imagem entre muitas outras.

A idéia central por trás da morfologia matemática é extrair as informa¸cões relati-vas à geometria e a topologia de um de uma imagem, que é visto como um conjunto desconhecido, pela transforma¸cão através de elementos estruturantes.

Os elementos estruturantes são bem-definidos e conhecidos( forma e tamanho). O ele-mento estruturante é comparado por meio de uma transforma¸cão ao conjunto em análise. Os resultados obtidos pela transforma¸cão permitem avaliar o conjunto desconhecido.

Figura 4.9: Representa¸c˜ao de uma imagem bin´aria.

A teoria dos conjuntos é usada para representar a forma dos objetos em uma ima-gem. Convencionalmente, os p´ıxeis pretos são representados por 0 e os brancos, por 1. Assim, uma imagem binária pode ser vista como uma cole¸cão de coordenadas discretas que perten¸cam aos objetos na imagem. Pode ser expressa por {(x, y)| f (x, y) = 1}.

Esse conjunto é definido no espa¸co bidimensional dos inteiros. A imagem binária exemplificada pela figura 4.9 é representada pelo conjunto

(44)

4.6 Morfologia Matem´atica 44

4.6.1 Operadores Mofol´

ogicos em Imagens Bin´

arias

Alguns operadores morfológicos básicos serão mostrados a seguir, os quais servem de base para operadores mais complexos usados em diversos algoritmos em processamento de imagens.

4.6.1.1 Dilata¸c˜ao e Eros˜ao

A dilata¸cão nada mais é do que a combina¸cão de dois vetores por meio da soma vetorial de seus elementos, como na adi¸cão de Minkowski, ou seja:

D(A, B) = AMB= [ b∈B

(A + B) (4.27)

Onde, tipicamente, A ´e uma imagem e B, um elemento estruturante, que representa alguma caracter´ıstica de forma que se deseja avaliar.

A dilata¸cão é capaz de encolher uma imagem. Por exemplo, seja A = {(1, 2), (3, 2)} e B= {(0, 0), (4, 1)} então o resultado de uma opera¸cão de dilata¸cão é:

AL

B= {A + {(x1∈ B)}SA+ {x2∈ B} AL

B= (1, 2), (7, 2), (3, 3)

Já a erosão binária tem a propriedade de encolher uma imagem. Ela pode ser vista como uma opera¸cão de subtra¸cão vetorial entre os elementos de dois conjuntos, desde que o resultado continue contido em um desses conjuntos. A dilata¸cão e a erosão não são opera¸cões inversas uma da outra. Para conjuntos A e B, a erosão de A por B(A B), define-se como

A B = {x|(B)x⊆ A} (4.28)

A equa¸cão 4.28 mostra que a erosão de A por B nada mais é do que a transla¸cão(eq. 4.29) de todos os pontos x tais que B, quando transladado por x, fique contido em A. A transla¸cão, por sua vez, é denotada por (A)x e é definida como

(A)x= {c|c = a + x, para a ∈ A} (4.29)

sendo A e B conjuntos de Z2, como componentes a = (a1, a2) e b = (b1, b2), respecti-vamente.(GONZALEZ; WOODS, 2002)

(45)

4.7 Reconhecimento e Interpreta¸c˜ao 45

4.6.1.2 Abertura e Fechamento

Apesar da dilata¸cão e da erosão não serem opera¸cões inversas, enquanto a primeira expande uma imagem a segunda a diminui. As duas opera¸cões combinadas dão lugar a outras opera¸cões morfologicas como a abertura e o fechamento.

Em geral, a abertura é usada quando se procura suavizar os contornos de uma imagem. Ela consiste em aplicar uma erosão seguida de uma dilata¸cão através do mesmo elemento estrutural. Sua principal aplica¸cão, como seria de se esperar, é criar espa¸co( abertura) entre objetos de uma imagem e remover p´ıxeis ru´ıdosos do fundo.

Por outro lado, o fechamento consiste em aplicar uma erosão uma dilata¸cão seguida de uma erosão, mantendo, também, o mesmo elemento estrutural para as duas opera¸cões sucessivas. O fechamento também tende a suavizar os contornos mas, em oposi¸cão a abertura, geralmente funde as quebras em vãos finos, elimina pequenos buracos e preenche fendas em um contorno. (GONZALEZ; WOODS, 2002)

A abertura de um conjunto A por um elemento estruturante B, A ◦ B, ´e definida como:

A◦ B = (A B) ⊕ B (4.30)

e o fechamento do conjunto A pelo elemento estruturante B , denotado por A • B, define-se como

A• B = (A ⊕ B) B (4.31)

4.7 Reconhecimento e Interpreta¸

c˜

ao

A cada um dos objetos gerados pela etapa de segmenta¸cão é assignado um rótulo, o que caracteriza o processo de reconhecimento. A interpreta¸cão, por outro lado, tenta atribuir um significado a cada um, ou mesmo, ao conjunto de objetos segmentados. No caso das imagens do Teste Cometa, poder-se-ia diferenciar as estruturas dizendo que os objetos menores do que três p´ıxeis são ru´ıdo, enquanto os objetos maiores e próximo da localiza¸cão central da cabe¸ca fazem parte do cometa, sendo apenas fragmentos de DNA. Essa diferencia¸cão é um exemplo de interpreta¸cão.

(46)

46

5 Metodologia

5.1 Ferramenta de Desenvolvimento

O prot´otipo funcional para testar a m´etodologia foi desenvolvido utilizando a ferra-menta MATLAB, da empresa The Mathworks (http://www.mathworks.com/).

O MATLAB (MATrix LABoratory) é um software interativo de alta performance especializado para o cálculo numérico. O MATLAB integra análise numérica, cálculo com matrizes, processamento de sinais e constru¸cão de gráficos em ambiente um fácil de usar onde problemas e solu¸cões são expressos somente como eles são escritos matematicamente, ao contrário da programa¸cão tradicional.

O MATLAB é um sistema interativo cujo elemento básico de informa¸cão é uma matriz que não requer dimensionamento. Esse sistema permite a resolu¸cão de muitos problemas numéricos em apenas uma fra¸cão do tempo que se gastaria para escrever um programa semelhante em linguagem Fortran, Basic ou C. Além disso, as solu¸cões dos problemas são expressas quase exatamente como elas são escritas matematicamente(WIKIPEDIA, ).

Sua escolha se deve ao fato do MATLAB conter um robusta biblioteca de processa-mento de imagens e estat´ısticas. Com isso, a velocidade de implementa¸c˜ao do prot´otipo foi reduzida substancialmente.

5.2 Passos no Dom´ınio do Processamento de Imagens

A metodologia desenvolvida seguiu os passos clássicos de um sistema de processamento de imagens (PDI) do dom´ınio espacial(GONZALEZ; WOODS, 2002). Utilizaram-se fil-tros, opera¸cões morfológicas, além de técnicas segmenta¸cão de imagem com o intuito de extrair informa¸cões relevantes para classificar os cometas através de informa¸cões geom´ e-tricas.

(47)

5.3 Aquisi¸c˜ao de Imagem 47

e do cometa se dá deforma separada. Isso permite que o algoritmo seja implementado de forma paralela em alguns trechos. As principais etapas estão ilustradas na figura 5.1 e serão suas descri¸cões serão aprofundadas nas próximas sessões.

Figura 5.1: Diagrama simplificado da metodologia.

5.3 Aquisi¸

c˜

ao de Imagem

As imagens utilizadas neste trabalho são imagens microscópicas de culturas celulares de fibroblastos( macaco Resus) cedidas pelo Laboratório de Virologia Aplicada da UFSC. Para a aquisi¸cão das imagens, utilizou-se um microscópio de fluorescência Olympus BX40 com filtro de excita¸cão 515-560nm e filtro de barreira de 590nm. Inicialmente, efetuou-se uma varredura da lâmina com um aumento de 400x. Para a classifica¸cão dos cometas, segundo Silva et AL.(1996) as imagens foram visualizadas com aumentos de 1000x e 4000x. As imagens digitais foram capturadas em amostras de 2048x1536 p´ıxeis no formato JPEG e espa¸co de cor RGB.

(48)

5.4 Defini¸c˜ao da Regi˜ao de Interesse 48

Figura 5.2: Microsc´opio Olympus BX40.

5.4 Defini¸

c˜

ao da Regi˜

ao de Interesse

O algoritmo desenvolvido recebe uma imagem como parâmetro. Contudo, o usuário do protótipo pode abrir uma imagem e dentro dela selecionar uma região que contenha o cometa a ser classificado. A região selecionada é conhecida como região de interesse(ROI). Assim, fica a cargo do usuário definir a região de interesse dentro da imagem original, a qual pode conter vários cometas( normalmente mais de 50) onde está localizado o cometa a ser classificado. Esse processo envolve a sele¸cão manual de uma área retangular ou através de um clique do mouse sobre a zona a ser classificada, a qual sofrerá diversos melhoramentos a fim de realizar a classifica¸cão.

Se o usuário optar pelo método de clicar sobre o cometa a área de interesse será definida como um retângulo como canto superior esquerdo localizado em 2 vezes o diˆ ame-tro da cabe¸ca(D_cabeca), o diâmetro é o dobro do raio especificado, à esquerda do centro da cabe¸ca(Ccabeca)e 2 × Dcabeca acima de Ccabeca. Seu canto inferior direito localiza-se a 4 × Dcabeca para a direita de Ccabeca e 2 × Dcabeca para baixo.

5.5 O Problema dos Cometas em Forma de Nuvem

A cabe¸ca do cometa é caracterizada por uma distribui¸cão circular de material genético altamente concentrado. Por sua vez, a cauda é formada pelo padrão migratório dos fragmentos de DNA ao longo da lâmina.

(49)

5.5 O Problema dos Cometas em Forma de Nuvem 49

Na análise visual, os cometas são classificados pelos especialistas com base na rela¸cão de propor¸cão entre a cabe¸ca e a cauda, e pela concentra¸cão de material genético na cabe¸ca do cometa. Se houver uma baixa concentra¸cão de DNA na região da cabe¸ca, ou seja, se o cometa apresenta a forma de uma nuvem, ele será classificado como classe 4 (COLLINS; AG; SJ, 1995).

Pela análise exclusivamente geométrica, o que se faz é ver, por exemplo, quantas vezes a cauda do cometa é maior do que a cabe¸ca. Com essa informa¸cão, classifica-se o mesmo em uma das cinco clasclassifica-ses já apresentadas. A figura 5.3 mostra como o software Komet(TM) define o cometa e suas estruturas(INDUSTRIAL TOXICOLOGY RESEARCH CENTRE, ).

Figura 5.3: Uma t´ıpica an´alise mostrando o cometa com sua cabe¸ca( head), cauda( tail) e o fundo( background) da regi˜ao de interesse.

Do ponto de vista de computacional, o que se deseja é saber onde está a cabe¸ca do cometa e qual é o seu diâmetro, uma vez que este nem sempre é igual a duas vezes o raio estimado pelo usuário. Também, é preciso localizar os pontos extremos das caudas dos cometas. Contudo, a classe quatro (Fig. 5.4) não possui uma cabe¸ca, o que torna dif´ıcil sua caracteriza¸cão muito dif´ıcil dentro dessa abordadem.

Esses problemas colocam os cometas em forma de nuvem fora da capacidade de medi-¸cão dos sistemas baseados em análise de imagem ou, quando analisadas por eles, podem gerar medi¸cões inadequadas. Nuvens são, portanto, classificadas apenas pela análise vi-sual, i.e., por especialistas.

Segundo eles, a identifica¸cão precisa das nuvens vem com a prática e experiência; por conseguinte, é importante que as nuvens sejam identificadas corretamente, enquanto o “scoring”(pontua¸cão) das lâminas seja feita utilizando sistemas de análise de imagens.

O ideal é que a classifica¸cão dos cometas da classe 4 seja feita de forma visual e contabilizada pelo sistema de análise de imagens(KUMARAVEL et al., 2007).

Em sua pesquisa, que envolveu a avalia¸cão genotoxicidade em células mamárias, Maria et al.(2007) contaram o número de nuvens manualmente(visualmente) em cada lâmina.

(50)

Figura 5.4: Cometa da classe 4. N˜ao possui cabe¸ca.

A porcentagem de nuvens foi usada como um parˆametro potencial de medida de genoto-xicidade, possivelmente representando c´elulas mortas.

5.6 Pr´

e-processamento

As imagens microscópicas são ruidosas e freqüentemente têm muita varia¸cão no fundo, tornando dif´ıcil sua análise. Por isso é necessário limpá-las antes da etapa de segmenta¸cão. A aplica¸cão de um filtro Gaussiano reduz significativamente o ru´ıdo.(NANDY; GUDLA; LOCKETT, 2007).

A fim de realizar a suaviza¸cão e elimina¸cão de parte do ru´ıdo da imagem de entrada, denotada por I_source, passou-se um filtro Gaussiano com kernel de 7 e σ = 5 na mesma, gerando uma nova imagem(Igauss f iltered). Com isso houve uma grande redu¸cão do ru´ıdo. Contudo, perdeu-se parte das informa¸cões de borda das cabe¸cas dos cometas.

Sendo assim, como somente a segmenta¸cão da cabe¸ca do cometa depende da redu¸cão do ru´ıdo e suaviza¸cão da imagem de entrada, optou-se por inserir um filtro de difusão anisotrópica nesta etapa do algoritmo de busca radial usado para segmentar a cabe¸ca, cujo detalhamento será dado mais adiante.

5.7 Segmenta¸

c˜

ao do Cometa atrav´

es de T´

ecnicas

Ba-seadas em Limiariza¸

c˜

ao Adaptativa com

Recons-tru¸

c˜

ao

Para obter resultados mais confi´aveis, a medi¸c˜ao dos danos de DNA deve ser restrita unicamente aos cometas; quaisquer outros tipos de objetos (denominados artefatos), como peda¸cos de cometas anexados por engano, artefatos coloridos no gel, etc., devem ser rejeitados(BOCKER et al., 1999).