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(1)UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS/ ÁREA DE CONCENTRAÇÃO EM PRODUTOS NATURAIS BIOATIVOS MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS. Milene Evelyn da Silva. Avaliação da atividade antiviral do extrato de Mikania glomerata Sprengel (guaco). Juiz de Fora 2015.

(2) Milene Evelyn da Silva. Avaliação da atividade antiviral do extrato de Mikania glomerata Sprengel (guaco). Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas/ área de concentração em produtos Naturais Bioativos, da Universidade Federal de Juiz de Fora como requisito parcial a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Área de concentração: Produtos Naturais Bioativos.. Orientadora: Profa. Dra. Maria da Penha Henriques do Amaral Co-orientadora: Profa. Dra. Fernanda Maria Pinto Vilela.. Juiz de Fora 2015.

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(4) Milene Evelyn da Silva. Avaliação da atividade antiviral do extrato de Mikania glomerata Sprengel (guaco). Dissertação apresentada ao Programa de Pós- graduação em Ciências Farmacêuticas, da Universidade Federal de Juiz de Fora como requisito parcial a obtenção do grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Área de concentração: Produtos Naturais Bioativos..

(5) Dedico a minha família, pelo apoio, compreensão, carinho e incentivo para vencer as dificuldades e conquistar mais este objetivo..

(6) AGRADECIMENTOS À Deus por me proporcionar viver e realizar meus objetivos; À Professora Doutora e orientadora Maria da Penha Henriques do Amaral pelo enorme profissionalismo, carinho, amizade e atenção; À Professora Doutora e co-orientadora Fernanda Maria Pinto Vilela pela amizade, ajuda e orientações durante a realização deste projeto; Aos Técnicos do Laboratório de Farmacologia da Universidade Federal de Juiz de Fora, Jésus de Paula, Éder e Carolina Miranda por toda a atenção e ajuda na coleta do material botânico e produção de meu material de estudo; Ao Farmacêutico e Técnico da Universidade Federal de Juiz de Fora, João Pablo Fortes, pela atenção e boa vontade em ajudar; À Professora Doutora Maria Teresa Villela Romanos do Instituto de Microbiologia Paulo de Góes, Universidade Federal do Rio de Janeiro, pela atenção e colaboração em nossos experimentos; À professora e amiga Fernanda Aparecida da Silva, por toda ajuda e profissionalismo no processo de revisão deste trabalho; À minha cunhada Michelle e seu marido Jesemiel, por toda hospitalidade e ajuda durante o período de realização dos experimentos; Aos meus pais e companheiros, Cida e Juscelino, e meu irmão, Filipe, por todo amor, dedicação e constante apoio; Ao meu noivo Amaro, pelo amor, companheirismo e incentivo para realização deste trabalho. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo apoio financeiro..

(7) “A tarefa não é tanto ver aquilo que ninguém viu, mas pensar o que ninguém ainda pensou sobre aquilo que todo mundo vê.” (Arthur Schopenhauer).

(8) RESUMO O herpes é uma doença infecciosa, transmitida pelo vírus herpes simplex tipo I (HSV-1) e tipo II (HSV-2). A doença é caracterizada pelo aparecimento de lesões labiais (HSV-1) e genitais (HSV-2). A espécie Mikania glomerata Sprengel (guaco) é uma planta pertencente à família Asteraceae e muito utilizada na medicina popular. A cumarina, presente nas folhas de guaco, apresentam atividades biológicas decritas, tais como broncodilatadora, antiedematogênica e efeitos espasmolíticos. Este estudo teve como objetivo avaliar o efeito antiviral de extrato de M. glomerata contra o HSV-1 e HSV-2. Vale ressaltar o potencial promissor do uso do extrato seco de guaco e da cumarina 1,2-benzopirona no tratamento de infecções herpéticas, uma vez que não foi encontrado na literatura nenhum trabalho mostrando a atividade da Mikania glomerata Sprengel frente aos herpesvírus HSV-1 e HSV-2. As avaliações da citotoxicidade do extrato seco de guaco e do padrão cumarina (1,2benzopirona) foram realizadas em culturas de células Vero (células de rim de macaco verde Africano) mediante a observação das alterações da morfologia e da viabilidade. A partir deste teste, determinou-se a concentração máxima não tóxica (CMNC). Foram utilizadas as concentrações subtóxicas do extrato seco de guaco e da cumarina 1,2-benzopirona para avaliar as atividades anti-HSV-1 e HSV-2 mediante observação da redução do título viral. Os resultados foram expressos em porcentagem de inibição (PI). O extrato seco de guaco apresentou atividade inibitória contra o vírus HSV- 1 (PI= 87,7%) e HSV-2 (PI= 92,7%). O padrão cumarina 1,2-benzopirona foi inativo contra o vírus HSV-2, mas apresentou atividade antiviral frente ao vírus HSV-1 (PI= 68,4%). Esses resultados evidenciaram a presença de outros metabólitos presentes no extrato seco de guaco que, isoladamente ou em sinergismo, contribuíram para a maior atividade antiviral. Sugere-se a incorporação deste extrato em formulações tópicas com a finalidade de proporcionar um tratamento alternativo para as infecções herpéticas.. Palavras-chave: Mikania glomerata. Extrato seco. Antiviral..

(9) ABSTRACT Herpes is an infectious disease transmitted by type I (HSV-1) and type II (HSV-2) herpes simplex virus. The disease is characterized by the appearance of cold sores (HSV-1) and genital lesions (HSV-2). Mikania glomerata Sprengel (guaco) specie is a plant belonging to the Asteraceae family and is widely used in folk medicine. Coumarin, present in guaco leaves, have biological activity, such as decritas, antiedematogênica and bronchodilator effects spasmolytics. This study aimed to evaluate the antiviral effect of M. glomerata extract against the HSV-1 and HSV-2. It is noteworthy the promising potential of using guaco extract in the treatment of herpesvirus infections, since no published reports showing the activity of Mikania glomerata Sprengel against HSV-1 and HSV-2 herpesviruses were found. Cytotoxicity assessments of guaco dry extract and coumarin (2H-1-benzopyran-2one) standard were performed in Vero cells culture (African green monkey‘s kidney cells) by observing morphology and viability. Based on this test, the maximum nontoxic concentration (MNTC) was determined. Subtoxic concentrations of guaco dry extract and 2H-1-benzopyran-2-one coumarin were employed to assess the antiHSV-1 and HSV-2 activity by observing the reduction of viral titer. The results were expressed as percentage inhibition (PI). Guaco dry extract showed inhibitory activity against HSV-1 (PI=87.7%) and HSV-2 (PI=92.7%) viruses. The 2H-1-benzopyran-2one coumarin standard was inactive against HSV-2 virus, but showed antiviral activity against HSV-1 virus (PI=68.4%). These results demonstrated the presence of other metabolites in the guaco dry extract that, either alone or in synergism, contributed to the higher antiviral activity. It is suggested to incorporate this extract in topical formulations for the purpose of provide an alternative treatment for herpetic infections. Keywords: Mikania glomerata. Dry extract. Antiviral..

(10) LISTA DE ILUSTRAÇÕES. Figura 1A -. Estruturas químicas das cumarinas sesquiterpênicas da espécie Ferula assa-foetida: badrakemin................................................... 18. Figura 1B -. Estruturas químicas das cumarinas sesquiterpênicas da espécie Ferula assa-foetida: kellerin............................................. 18. Figura 1C -. Estruturas químicas das cumarinas sesquiterpênicas da espécie Ferula assa-foetida: samarcandin diastereomer........................... 18. Figura 2 -. Estrutura viral do Herpes simplex.................................................. 21. Figura 3A -. Lesão labial decorrente de infecção por HSV-1............................ 23. Figura 3B -. Lesão de gengiva decorrente de infecção por HSV-1................... 23. Figura 4 -. Mecanismos de ação dos fármacos anti-HSV................................ 24. Figura 5 -. Espécie Mikania glomerata Sprengel......................................... 26. Figura 6A -. Estrutura química da cumarina ..................................................... 29. Figura 6B -. Estrutura química do ácido o-cumárico......................................... 29. Figura 6C -. Estrutura química do ácido caurenóico......................................... 29. Figura 6D -. Estrutura química do siringaldeído................................................ 29. Figura 6E -. Estrutura química da dihidrocumarina........................................... 29. Figura 7 -. Compostos sintetizados a partir de 3-fenilcumarina...................... 30. Figura 8 -. Equipamento. Liofilizador Terroni. LS. 3000. (São. Carlos,. Brasil)............................................................................................ 36 Figura 9 -. Representação esquemática do teste de triagem......................... 42. Figura 10-. Extrato liofilizado de Mikania glomerata........................................ 46. Figura 11 -. Perfil. cromatográfico. do. extrato. liofilizado. de. Mikania. glomerata....................................................................................... 49 Figura 12 -. Efeito citotóxico do extrato seco de Mikania glomerata e da cumarina 1,2-benzopirona em cultura de células Vero................. 51. Figura 13A -. Células Vero: célula sem alteração morfológica........................... 52. Figura 13B -. Célula Vero: célula com alteração da morfologia devido à infecção por HSV (efeito citopático).............................................. 52.

(11) LISTA DE TABELAS. Tabela 1. Detalhes da preparação, processos de extração e metabólitos encontrados em extratos de M. glomerata Sprengel......................... 27. Tabela 2. Atividade antiviral expressos em Porcentagem. de inibição. (PI)..................................................................................................... 54 Tabela 3. Valores da concentração capaz de inibir em 50% a replicação viral (EC50) e o índice de seletividade (IS = CC50/EC50)............................. 55.

(12) LISTA DE ABREVIATURAS. µg. Micrograma. µL. Microlitro. ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. CC50. Concentração citotóxica 50%. CE50. Concentração capaz de inibir em 50% a replicação viral. CLAE. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência. CO2. Dióxido de carbono. DMSO. Dimetilsulfóxido. DNA. Ácido desoxirribonucléico. DO. Densidade óptica. EC. Concentração efetiva. ECP. Efeito citopático. HIV. Vírus da Imunodeficiência Humana. HSV. Vírus herpes simplex. HSV-1. Vírus herpes simplex tipo 1. HSV-2. Vírus herpes simplex tipo 2. IS. Índice de seletividade. Kg. Quilograma. MEM. Meio mínimo essencial. Mg. Miligrama. mL. Mililitros. mmHg. Milímetro de mercúrio. MNTC. Concentração máxima não tóxica. Nm. Nanômetro. PCR. Reação em cadeia de polimerase. PI. Percentual de inibição. RPM. Rotações por minuto. SFB. Soro fetal bovino. TCID50. Dose infectante para 50% da cultura do tecido. UV-DAD Detector ultravioleta acoplado a arranjo de diodo.

(13) SUMÁRIO. 1. INTRODUÇÃO......................................................................................... 14. 2. REVISÃO DA LITERATURA................................................................... 16. 2.1. ATIVIDADE ANTIVIRAL DE PLANTAS MEDICINAIS E DE SEUS METABÓLITOS SECUNDÁRIOS............................................................ 16. 2.2. VÍRUS HERPES SIMPLEX...................................................................... 20. 2.3. Mikania glomerata Sprengel.................................................................... 25. 2.3.1. Estudos fitoquímicos de Mikania glomerata Sprengel...................... 27. 2.3.2. Propriedades farmacológicas da Mikania glomerata Sprengel......... 31. 3. OBJETIVOS............................................................................................ 33. 3.1. OBJETIVO GERAL.................................................................................. 33. 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS.................................................................... 33. 4. MATERIAIS E MÉTODOS....................................................................... 34. 4.1. MATERIAL VEGETAL............................................................................. 34. 4.2. PREPARO DA AMOSTRA...................................................................... 34. 4.3. PREPARO DO EXTRATO FLUIDO ........................................................ 35. 4.4. OBTENÇÃO DO EXTRATO SECO......................................................... 35. 4.5. DETERMINAÇÃO. DO. TEOR. DE. UMIDADE. DO. EXTRATO. SECO....................................................................................................... 36 4.6. DETERMINAÇÃO. DO. TEOR. DE. CUMARINA. POR. ESPECTROFOTOMETRIA UV/VIS ........................................................ 37 4.7. DETERMINAÇÃO DO TEOR DA CUMARINA 1,2-BENZOPIRONA POR CLAE............................................................................................... 37. 4.8. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DO EXTRATO SECO DE GUACO.................................................................................................... 38. 4.8.1. Preparo das amostras........................................................................... 38. 4.8.2. Cultura celular........................................................................................ 39. 4.8.3. Amostras virais..................................................................................... 39. 4.8.4. Ensaio de Citotoxicidade...................................................................... 39. 4.8.4.1 Morfologia celular..................................................................................... 40 4.8.4.2 Viabilidade celular.................................................................................... 41 4.8.5. Ensaio de Atividade Antiviral............................................................... 41.

(14) 4.8.5.1 Triagem..................................................................................................... 41 4.8.5.2 Titulação dos vírus................................................................................... 43 4.8.5.3 Redução do título viral ............................................................................. 43 4.8.6. Determinação da curva dose-resposta................................................ 44. 4.8.7. Análise estatística.................................................................................. 45. 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................... 46. 5.1. OBTENÇÃO DO EXTRATO SECO.......................................................... 46. 5.2. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE UMIDADE............................................ 47. 5.3. DETERMINAÇÃO. DOS. TEOR. DE. CUMARINA. POR. ESPECTROFOTOMETRIA UV/VIS ......................................................... 48 5.4. DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CUMARINA POR CLAE...................... 48. 5.5. AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL................................................ 49. 5.5.1. Ensaio de Citotoxicidade....................................................................... 49. 5.5.2. Ensaio de Atividade Antiviral................................................................ 52. 5.5.2.1 Triagem..................................................................................................... 52 5.5.2.2 Redução do título viral.............................................................................. 53 6. CONCLUSÃO........................................................................................... 57 REFERÊNCIAS........................................................................................ 58.

(15) 14 1 INTRODUÇÃO. O herpes é uma doença infecciosa de etiologia viral, tendo o herpes simplex virus (HSV) como agente etiológico. As infecções causadas por este vírus estão entre as mais prevalentes no mundo, sendo portanto, relevantes em saúde pública (CLEMENS, FARHAT, 2010). Os herpesvírus tipo 1 (HSV-1) e tipo 2 (HSV-2) são os maiores causadores de infecções humanas e possuem características biológicas particulares. Tais vírus causam diferentes tipos de doenças, podem estabelecer infecções latentes ou persistentes por toda a vida dos hospedeiros e possuem a capacidade de reativação causando lesões que podem se localizar no sítio da infecção primária inicial ou próxima a ele (LAZARINI et al., 2006). Tipicamente, o HSV-1 é contraído na infância e adolescência através de contato direto por via oral. Os sintomas da infecção viral caracterizam-se pelo aparecimento de pequenas vesículas amareladas na face, que são geralmente agrupadas e que se rompem rapidamente formando úlceras que podem coalescer (MERTZ, ROSENTHAL, STANBERRY, 2003; STANBERRY et al., 1999). A doença ocasionada por HSV-2 é quase sempre genital, ocorrendo em adolescentes e adultos sexualmente ativos (SCHOMOGYI, WALD, COREY, 1998). O Aciclovir é a droga de primeira escolha para o tratamento das lesões herpéticas devido a sua ação efetiva contra os vírus, entretanto, há relatos de isolamento de estipes virais resistentes a esse medicamento (BACHE et al., 2014; TAGLIARI et al. 2012). Este fator complicador dificultou e redirecionou o tratamento para drogas alternativas como valaciclovir, ganciclovir, penciclovir e foscarnet, porém, problemas de toxicidade e desenvolvimento de resistência viral a estas drogas também já foram registrados (GERSHENGORN, BLOWER, 2000; SCHMIDT et al., 2015). Atualmente, para o tratamento das lesões herpéticas há uma necessidade de novas terapias antivirais de baixo custo e toxicidade chamando atenção para a pesquisa de substâncias naturais provenientes de plantas com valor medicinal e que já são empregadas para o tratamento de infecções na farmacoterapia popular (ASTANI, NAVID, SCHNITZLER, 2014). Muitas substâncias com propriedades antivirais têm sido identificadas e seus mecanismos de ação elucidados. No entanto, poucas têm sido utilizadas para.

(16) 15 tratamentos de infecções virais devido à alta toxicidade, espectro de ação limitado ou falta de evidências para garantir sua aplicação específica (EFFERTH, 2009). A espécie Mikania glomerata Sprengel, popularmente conhecida como guaco, é uma planta pertencente à família Asteraceae e amplamente utilizada na medicina popular brasileira no tratamento de afecções respiratórias devido às suas propriedades broncodilatadora e expectorante (NAPIMOGA, YATSUDA, 2010). Os extratos de M. glomerata apresentam uma composição química diversificada. Estudos fitoquímicos dessa espécie resultaram na identificação de diferentes metabólitos, destacando-se: cumarina, saponinas, taninos, esteróides e óleos essenciais. Outros constituintes químicos também foram identificados como, ácido. caurenóico,. estigmasterol.. ácido. Alguns. o-cumárico,. destes. lupeol,. compostos. ácido. possuem. cinamoilgrandiflórico comprovada. e. atividade. farmacológica: o lupeol apresenta propriedade anti-inflamatória; o ácido caurenóico é um potente antimicrobiano,. hipotensor; e o estigmasterol possui atividade. hipocolesterolêmica (GASPARETTO, 2013). A cumarina 1,2-benzopirona é um dos principais constituintes químicos da M. glomerata e está relacionada com a atividade broncodilatadora da espécie (CELEGHINI et al., 2001). Alguns estudos também relatam a atividade antiviral das cumarinas (GHANNADI et al., 2014; HWU et al., 2015; VENUGOPALA et al. 2013; YANG et al., 2015). Apesar da presença de compostos com potencial atividade antiviral no extrato de guaco, ainda não foram encontrados na literatura relatos de atividade de Mikania glomerata contra os vírus HSV-1 e HSV-2. Diante da necessidade de novos medicamentos de menor custo, baixa toxicidade e maior eficácia para o tratamento do herpes, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a atividade antiviral do extrato seco de Mikania glomerata Sprengel contra os herpesvírus HSV-1 e HSV-2..

(17) 16 2 REVISÃO DA LITERATURA. 2.1 ATIVIDADE. ANTIVIRAL. DE. PLANTAS. MEDICINAIS. E. DE. SEUS. METABÓLITOS SECUNDÁRIOS. Há mais de 60 anos os virologistas travam uma luta incessante com o principal objetivo de desenvolver fármacos que possam parar a replicação viral sem danificar as células do hospedeiro (RINCÃO, 2012). A toxicidade de muitos compostos antivirais é uma das principais barreiras para a realização de um tratamento efetivo, pois implica em sua utilização por períodos relativamente curtos. Uma alternativa para o desenvolvimento de novos fármacos antivirais são os produtos de origem natural com baixa toxicidade (KAZIYAMA, FERNANDES, SIMONI, 2012). Há milhares de anos produtos derivados de plantas medicinais são utilizados na medicina popular no tratamento de várias doenças, inclusive as infecciosas. Sua ampla diversidade estrutural e atividade biológica, além de serem reconhecidas pela indústria farmacêutica, caracterizam as plantas medicinais como fonte de moléculas ou modelos para o desenvolvimento de fármacos. Apesar de se caracterizarem como excelente fonte para biomoléculas com propriedades terapêuticas, inclusive para o tratamento de doenças infecciosas, uma ínfima parte de toda biodiversidade foi analisada com este fim até o momento (SIMÕES, 2010). Produtos do metabolismo secundário das plantas como alcalóides, proteínas, saponinas, flavonóides, cumarinas têm sido descritos, na literatura, como compostos com potencial atividade antiviral (PADILLA, 2011; KAZIYAMA, FERNANDES, SIMONI, 2012). Estudo realizado por Cecílio et al. (2012) avaliaram a atividade de plantas medicinais brasileiras, tradicionalmente utilizadas no tratamento da diarréia, contra o rotavírus símio SA11. As espécies estudadas (Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville; Psidium guajava L.; Myracrodruon urundeuva (Allemão) Engl; Luehea paniculata Mart; Hymenaea courbaril L.; Eugenia uniflora L.; Eugenia dysenterica DC.; Curatella americana L.; Campomanesia pubescens (DC.) O. Berg.; Byrsonima verbascifolia (L.) DC.; Byrsonima coccolobifolia Kunth; Astronium fraxinifolium Schott; Annona crassiflora Mart; Anacardium humile A. St. -Hil.) foram coletadas no cerrado mineiro. Os resultados dos estudos de avaliação da atividade antiviral.

(18) 17 demonstraram que os extratos etanólicos das plantas Byrsonima verbascifolia, Myracrodruon urundeuva, com elevado teor de taninos, flavonóides, saponinas, cumarinas e terpenos, inibiram o rotavírus, em células MA-104. A espécie Eugenia dysenterica também apresentou atividade antiviral, porém não foi encontrada à presença de cumarinas em sua constituição, apenas taninos, flavonóides e saponinas. Esquenazi et al. (2002) estudaram o extrato de Cocos nucifera L. (Palmae), uma espécie da região nordeste do Brasil, normalmente utilizada na medicina popular contra diarréia e artrite. O extrato aquoso bruto, obtido a partir da fibra da casca de coco, e uma fração metanólica do extrato, rica em catequinas, foram avaliados quanto à sua atividade contra o vírus HSV-1 resistente ao aciclovir (HSV1-ACVr). Ambos apresentaram atividade contra o HSV-1-ACVr. A catequina e a epicatequina,. em. conjunto. com. os. taninos. condensados. (procianidinas),. demonstraram ser os componentes do extrato aquoso responsáveis pelo efeito inibitório. Em estudo desenvolvido por Fritz (2006) as frações de n-hexano, diclorometano e metanol, os extratos bruto aquosos e hidroetanólico das partes aéreas e raízes da espécie Hypericum connatum (Guttiferae), assim como as substâncias isoladas dessas preparações, foram testadas frente ao vírus HSV-1 (cepas KOS e ATCC-VR733). A fração n-hexano e o extrato bruto das raízes inibiram a replicação viral das cepas KOS e ATCC-VR733. Os demais extratos testados não apresentaram atividade antiviral. Dentre as substâncias analisadas, hiperbrasilol B (fração n-hexano), amentoflavona (fração metanólica) e HCN3 (um flavonol de estrutura ainda não definida isolado da fração metanólica) foram ativos frente às duas cepas. As demais substâncias isoladas da fração metanólica, os flavonóides hiperosídeo e guaijaverina, não apresentaram atividade anti-HSV-1. Gescher et al. (2011) analisaram o extrato acetônico obtido das partes aéreas de Myrothamnus flabellifolia, rico em proantocianidinas, taninos hidrolisáveis e flavonóides, contra a infecção de HSV-1 e mostraram a atividade virucida do extrato e a interferência na penetração do vírus em células Vero, supostamente, pela interação dos compostos polifenólicos com alguns aminoácidos das glicoproteínas virais, principalmente a glicoproteína gD, necessária para entrada do vírus na célula. Silva et al. (2010) verificaram a atividade antiherpética da fração de n-butanol (n-BuOH) e da fração enriquecida de C-glicosilflavonóide (MeOH (AMB)).

(19) 18 provenientes do extrato bruto aquoso das folhas de Cecropia glaziovii. As amostras foram testadas contra os vírus HSV-1 e HSV-2 por ensaio de redução de placas. Os resultados mostraram que a fração MeOH (AMB) apresentou atividade contra os dois vírus testados através da redução de infectividade viral (apenas contra o HSV2); pela inibição da entrada do vírus nas células e através da redução dos níveis de glicoproteínas do envelope (para HSV-1). A fração n-BuOH não apresentou atividade. Os resultados sugeriram que composto C-glicosilflavonóide pode ser o responsável pela atividade anti- HSV. Ghannadi et al. (2014) no estudo das cumarinas sesquiterpênicas, avaliou a atividade anti-HSV-1 da espécie Ferula assa-foetida, em cultura de células Vero. Três cumarinas sesquiterpênicas foram isoladas do extrato metanólico obtido a partir da goma resina de Ferula assa-foetida: as cumarinas badrakemin, kellerin e samarcandin diastereomer (Figuras 1A, 1B e 1C). Os compostos foram identificados através da técnica de RMN 1D e 2D e comparação com dados da literatura. A atividade antiviral dos compostos isolados foi determinada por ensaio de redução de placas. Os resultados mostraram que, nas concentrações testadas: 10; 5 e 2,5 µg/mL, o composto Kellerin inibiu a replicação de HSV-1 com uma taxa de inibição de 98 ± 5,2%; 80 ± 3.8% e 65 ± 2.2%, respectivamente. Kellerin apresentou uma EC50 de 38 µg/mL. As demais cumarinas isoladas não apresentaram atividade antiHSV-1. Figura 1 - Estruturas químicas das cumarinas sesquiterpênicas da espécie Ferula assa-foetida: badrakemin (A); kellerin (B) e samarcandin diastereomer (C).. Fonte: ADAPTADO DE GHANNADI et al.(2014)..

(20) 19 Os extratos das espécies Pterocaulon alopecuroides (Lamark) e Bidens segetum Mart. ex Colla foram estudados por Silveira et al. (2009) quanto às suas propriedades citotóxica e antiviral. Diferentes partes da espécie Bidens (flores, folhas e caule) e as partes aéreas de Pterocaulon alopecuroides, foram submetidas a um processo de extração com solvente etanol, à temperatura ambiente. A partir do extrato etanólico bruto de P. alopecuroides foi possível isolar a cumarina 7- (2 ', 3'dihidroxi-3'-metilbutiloxi) -6-metoxicumarina. Os ensaios de atividade antiviral foram determinados por redução dos títulos virais contra os vírus HSV-1 e HSV-2 resistentes ao aciclovir e os resultados expressos em percentual de inibição (PI) e índice de inibição viral (IIV). Todos os extratos analisados apresentaram citotoxidade muito alta contra linhagens de células RBL-2H3. Nenhum dos extratos etanólicos totais de B. segetum mostraram atividade significativa contra os HSV-1 e HSV-2. O extrato etanólico de P. alopecuroides também foi inativo contra HSV-1-ACVr. Entretanto, este extrato apresentou atividade inibitória contra HSV-2-ACVr (PI = 77,6;. IIV=. 0,65).. A. cumarina. isolada. 7-(2‘,3‘-dihidroxi-3‘-metilbutiloxi)-6-. metoxicumarina, testada nas mesmas condições, demonstrou um índice de inibição superior (IIV=1,24 ; PI= 94,2) a da amostra de P. alopecuroides para HSV-2ACVr. A cumarina também foi ativa contra HSV-1-ACVr (PI=84,1 ; IIV=0,8). Kaziyama et al.(2012) pesquisou a atividade antiviral de plantas medicinais disponíveis comercialmente (Mikania glomerata, Cymbopogon citratus, Equisetum arvense, Peumus boldus, Solanum paniculatum, Malva sylvestris, Piper umbellatun e Solidago microglossa) sobre herpesvírus suíno (SuHV-1) e bovino (BoHV-1), em cultura de células MDBK. Foram preparados extratos aquosos (EA) de todas as espécies. Apenas para a planta Peumus boldus foi preparado também o extrato etanólico (EE). A atividade antiviral foi realizada com os extratos liofilizados em suas respectivas CMNT e determinada com base na redução do título viral. Os resultados foram expressos em percentual de inibição. A atividade contra o vírus SuHV-1 foi observada nas seguintes espécies:. Malva sylvestris (PI= 86%), Mikania glomerata. (PI= 68%), Peumus boldus (EA) (PI=98%), Piper umbellatun (PI=2%), Solanum paniculatum (PI= 98%) e Solidago microglossa (PI=44%). Já para o vírus BoHV-1, somente as plantas: Cymbopogon citratus (PI=43%), Equisetum arvense (PI= 82%), Mikania glomerata (PI= 43%), Peumus boldus (PI= 98%(EA); PI= 68% (E)), Solanum paniculatum (PI=90%), Solidago microglossa (PI=43%) apresentaram atividade antiviral..

(21) 20 2.2 VÍRUS HERPES SIMPLEX. O vírus herpes simplex (HSV) foi o primeiro herpesvírus humano a ser descoberto e estudado. O HSV apresenta características peculiares importantes, tais como, a capacidade de causar uma variedade de infecções, estabelecer latência por toda a vida do hospedeiro e reativar-se causando lesões no local inicial da infecção ou próximas a este (LAZARINI et al., 2006). Em humanos, as infecções herpéticas podem ser causadas por dois tipos de vírus: herpes simplex tipo 1 (HSV-1) e tipo 2 (HSV-2). O HSV-1 está tipicamente associado às infecções não-genitais, acometendo face, lábios, boca e a pele da parte superior do corpo. O HSV-2 está relacionado com as lesões genitais. Atualmente sabe-se que tanto o tipo 1 como tipo 2 podem provocar infecções em ambas as localizações (AZAMBUJA, BERCINI, FURLANETTO, 2004; REGGIORI et al., 2008). Os vírus HSV-1 e HSV-2 pertencem à família Hespesviridae, subfamília alfaHerpesvirinae e gênero Simplexvirus. Apesar de serem estruturalmente semelhantes e possuírem um considerável grau de neutralização cruzada, eles podem ser distinguidos sorologicamente pela diferença antigênica das glicoproteínas do envelope (FATAHZADEH, SCHWARTZ, 2007; HATTORI, 2011; ROIZMAN, KNIPE, WHITLEY, 2007). O herpes simplex é um vírus DNA fita dupla linear, transcrito e replicado no núcleo da célula hospedeira. O material genético viral fica protegido no interior de uma capa protéica chamada capsídeo, este é composto por 162 capsômeros arranjados em simetria icosaédrica. O espaço entre a superfície do capsídeo e a superfície interna do envelope é designado como tegumento, o qual é em grande parte não-estruturado, e composto por proteínas virais (ROIZMAN, KNIPE, WHITLEY, 2007) (Figura 2)..

(22) 21 Figura 2 - Estrutura viral do Herpes simplex. Fonte: ADAPTADO DE HATTORI, 2011.. O princípio fundamental da patogênese da doença causada por HSV é a capacidade desse vírus estabelecer infecção lítica na superfície das mucosas ou da pele e se tornar latente em células neuronais sensoriais. Durante a infecção lítica todos os seus genes virais são expressos e o genoma é replicado. Já a infecção latente é caracterizada por um desligamento das funções de replicação e pela incapacidade de detectar o vírus infeccioso (MUYLAERT, TANG, ELIAS, 2011). Após estabelecerem infecção lítica nas células do sítio da primeira infecção, os vírus penetram pelas terminações nervosas e são transportados pelos axônios, em um sentido retrógrado ao estímulo nervoso, para os gânglios onde a latência pode ser estabelecida. Uma vez latente, o HSV pode ser reativado, periodicamente, com migração dos vírus dos gânglios sensoriais para ocasionar a lesão oral ou genital recorrente (LOPES, 2012). O processo de reativação da latência é desencadeado por um estímulo local, tal como injúria ao tecido enervado por neurônios infectados pelo vírus ou por estímulo sistêmico como estresse físico ou emocional, febre, exposição à luz ultravioleta, menstruação, desequilíbrio hormonal, assim como por outros sinais que possam reativar o vírus simultaneamente em neurônios de diversos gânglios. A reativação periódica da infecção permite a posterior transmissão a outros hospedeiros (SANTOS, ROMANOS, WIGG, 2008)..

(23) 22 A transmissão do HSV depende do contato íntimo entre um indivíduo suscetível e o infectado que esteja excretando o vírus. Após a infecção oral, geralmente causada pelo HSV-1, o gânglio trigêmeo se torna colonizado, sendo o local de manutenção do vírus em estado de latência. A infecção pelo HSV-2 é geralmente consequência da transmissão pelo contato genital e o vírus estabelece latência nos gânglios sacrais. O HSV também pode ser transmitido por gotículas de secreções respiratórias ou exposição às secreções mucocutâneas de uma pessoa com infecção assintomática (FATAHZADEH, SCHWARTZ, 2007). O. herpesvírus. determina. quadros. clínicos. de. intensidade. variável,. dependendo do estado imunológico do hospedeiro. A primoinfecção herpética, primeiro contato infeccioso com HSV-1 ou HSV-2, pode ser subclínica, passar despercebida e o indivíduo tornar-se portador do vírus sem apresentar sintomas. Em outros indivíduos, a infecção pode ser grave e prolongada perdurando por algumas semanas. Quando sintomática, geralmente o primeiro ataque caracteriza-se pelo desenvolvimento de febre, irritabilidade, artralgia, mal-estar, cefaléia e linfadenopatia cervical. Em poucos dias iniciam-se as manifestações bucais ou gengivoestomatite herpética primária (REGGIORI et al., 2008) O quadro de lesões oral e labial é o mais comum caracterizando-se por pequenas vesículas (1 mm ou menos de diâmetro) agrupadas, que podem romper deixando pequena ulceração vermelha com ligeiro halo eritematoso que tem duração de sete a quatorze dias (AZAMBUJA, BERCINI, FURLANETTO, 2004; SHAFER, HINE, LEVY, 1987). Em pacientes imunocompetentes, o herpes simples recorrente ocorre principalmente no dorso lingual, lábios e gengiva (Figuras 3A e 3B). Os pacientes referem dor durante a higienização oral, devido à sensibilidade local que a lesão herpética provoca nos tecidos bucais (NERI et al., 2014)..

(24) 23 Figura 3 - Lesões causadas por HSV: A: Lesão labial decorrente de infecção por HSV-1; B: Lesão de gengiva decorrente de infecção por HSV-1.. Fonte: RICÃO, 2012.. O HSV-2 é o principal responsável pelo herpes genital sendo transmitido predominantemente por contato sexual ou no momento do parto (PENELLO et al., 2010). As lesões herpéticas genitais são precedidas por um período prodrômico de dor localizada, formigamento ou sensação de queimação, com duração de até 24 horas. Após alguns dias do ato sexual, aparecem vesículas de tamanhos variados nos. órgãos. genitais,. que. se. rompem. formando. ulcerações. com. crosta. (FATAHZADEH, SCHWARTZ, 2007) As lesões herpéticas orolabiais e genitais podem ser contaminadas, secundariamente, por bactérias estafilococos e estreptococos advindos do ar, da saliva ou das mãos. Nesses casos, as vesículas e bolhas transformam-se em pústulas, ou seja, seu conteúdo seroso transforma-se em exsudato purulento. No caso do herpes genital, podem ocorrer casos de fimose ou parafimose nos homens. Essas transformações alteram a forma de tratamento (NERI et al, 2014; PENELLO et al., 2010). A fim de reduzir a carga viral, fármacos antivirais como o aciclovir, valaciclovir, penciclovir, famciclovir, ganciclovir, valganciclovir, foscarnet e cidofovir são utilizados. Os fármacos penciclovir e docosanol são utilizados no tratamento tópico (TAGLIARI, KELMANN, DIEFENTHALER, 2012). O fármaco aciclovir pode ser administrado de forma tópica ou sistêmica, conforme a gravidade da infecção. Quando as lesões são acometidas de invasão bacteriana, a antibioticoterapia deve ser instituída (CONSOLARO, CONSOLARO, 2009; MILAGRES et al., 2007)..

(25) 24 O aciclovir, desenvolvido na década de 70, é atualmente o fármaco de primeira escolha para o tratamento das infecções causadas por HSV. Seu mecanismo de ação está relacionado à inibição da enzima DNA-polimerase viral (DADALTI et al., 2004). No interior da célula infectada pelo HSV-1 ou HSV-2, o aciclovir é fosforilado por uma enzima viral chamada timidina quinase, o que o torna uma substância com toxicidade seletiva. A segunda e a terceira fosforilação são feitas por timidinas quinases celulares (BILLAUD et al., 2003). Após as etapas de fosforilação, o aciclovir interferirá na polimerização do DNA viral por competir com o nucleotídeo trifosfatado endógeno, 2-deoxiguanosina trifosfatada (SCHLEISS, 2009). Com a incorporação do aciclovir na cadeia de DNA recém sintetizada a síntese fica interrompida e a cadeia não pode ser terminada (GOLANKIEWICZ, OSTROWSKI 2006; SUZUKI et al., 2006). Mutações na timidina quinase ou DNA polimerase virais podem selecionar cepas mutantes resistentes ao aciclovir, o que pode ser observado, principalmente, em pacientes imunocomprometidos que fazem uso constante da droga. Além do aciclovir, outros fármacos são utilizados para o tratamento das infecções herpéticas. A figura 4 ilustra os diferentes tipos de mecanismos de ação dos fármacos antivirais. Figura 4 - Mecanismos de ação dos fármacos anti-HSV.. Fonte: ADAPTADO DE BILLAUD et al., 2003..

(26) 25 Devido à ampla distribuição das infecções herpéticas, facilidade de transmissão e o aumento do número de cepas virais resistentes às drogas comercialmente disponíveis para o controle da doença, grandes esforços têm sido feitos para o desenvolvimento de estratégias para a identificação de novos compostos com atividade antiviral (MILAGRES et al., 2007). A cumarina 1,2-benzopirona é um dos principais constituintes químicos da M. glomerata e estudos já relataram a atividade antiviral de cumarinas. Diante disso, a proposta deste trabalho foi investigar a atividade antiviral do extrato seco de M. glomerata contra os vírus HSV-1 e HSV-2, uma vez que ainda não foram encontrados na literatura dados de atividade desta planta contra esses vírus.. 2.3 Mikania glomerata Sprengel. A Mikania glomerata Sprengel é uma espécie vegetal pertencente à família Asteraceae. e. conhecida. vulgarmente. por. ―guaco‖,. ―coração-de-jesus‖,. ―guacoliso‖, ―cipó-caatinga‖ e ―erva-de-cobra‖. É uma planta nativa da América do Sul e facilmente encontrada no Brasil (SANTANA et al., 2014). O guaco é cultivado em quase todo o território brasileiro, ocorre desde o sul da Bahia até o Rio Grande do Sul e na Argentina, Uruguai e Paraguai (TALEB CONTINI et al., 2006). Na época da floração torna-se uma planta muito procurada pelas abelhas melíferas. Reproduz-se por sementes ou pelo plantio de estacas do caule, de preferência em terrenos arenosos e úmidos, adaptando-se bem ao cultivo doméstico (CZELUSNIAK et al., 2012). A planta possui porte subarbustivo trepador provido de caule cilíndrico, bastante ramificado de superfície glabra. As partes jovens caulinares apresentam coloração verde clara que se torna arroxeada ao cinza escuro nas partes suberificadas (DOS SANTOS, 2006). As folhas são pecioladas, cordiformedeltoides, oval-lanceoladas, tri ou pentanervadas e agudas no ápice (Figura 5) (SIMÕES et al., 1988)..

(27) 26 Figura 5 - Espécie Mikania glomerata Sprengel.. Fonte: A AUTORA.. A Foi identificada por Sprengel em 1826 e oficializada na 1ª edição da Farmacopéia Brasileira (AMARAL et al., 2009; BRASIL, 1926). As demais edições da Farmacopéia Brasileira não possuem atualizações da monografia do guaco, porém, a 1º edição do Formulário Nacional de Plantas Medicinais atualiza com a adição de uma formulação oral extemporânea (BRASIL, 2011). Preparações farmacêuticas tais como o xarope, solução oral, tintura e cápsulas obtidas a partir das partes aéreas de M. glomerata foram incluídas no elenco de referência de medicamentos e insumos complementares para a assistência farmacêutica na atenção básica em saúde, conforme anexo II da Portaria nº. 3.237 de 24 de dezembro de 2007 (BRASIL, 2007). Dessa forma, os medicamentos fitoterápicos a base de guaco vem sendo utilizados em larga escala na rede de saúde pública, através da implantação de programas de fitoterapia em vários municípios de alguns estados brasileiros, tais como, Rio de Janeiro, São Paulo, Goiás, Alagoas, Amapá, Ceará, Pernambuco, Espírito Santo, Distrito Federal, Pará, Paraíba, Paraná, Santa Catarina e Rio Grande do Sul (BRASIL, 2006; BRASIL, 2008). Vale ressaltar também que a espécie M. glomerata está citada na lista de registro simplificado de fitoterápicos, publicada pela ANVISA (BRASIL. ANVISA. RE n 89, de 16 de março de 2004), o que significa que medicamentos obtidos a.

(28) 27 partir do guaco não requerem estudos de segurança e eficácia, uma vez que o uso terapêutico seguro dessa planta já foi amplamente descrito em diversas bases de dados como COCHRANE, PUBMED, BVS-Medline, BVS-Lilacs, e CAPES. Portanto, a obtenção de produtos fitoterápicos a partir dessa espécie se torna um processo mais rápido devido à isenção de testes clínicos e pré -clínicos.. 2.3.1 Estudos fitoquímicos de Mikania glomerata Sprengel. O aumento do interesse da população por fitoterápicos, a maior preocupação com a segurança e eficácia dos mesmos, além da busca por novos protótipos, têm-se constituído os pilares do estudo fitoquímico de plantas medicinais nos últimos anos. Entre as plantas estudadas quimicamente, as espécies do gênero Mikania têm um grande destaque, principalmente por apresentarem uma composição química diversificada (OSORIO, 2002). Muitos estudos têm sido realizados para avaliar a composição química de Mikania glomerata (Tabela 1). Através de diferentes procedimentos de extração, uma variedade de compostos tem sido encontrados em partes distintas desta planta. Os detalhes dos procedimentos de extração e metabólitos encontrados nos extratos de guaco são mostrados na tabela 1. Tabela 1 - Detalhes da preparação, processos de extração e metabólitos encontrados em extratos de M. glomerata Sprengel. Tipo de Extrato. Proporçã o Droga: solvente. Procedimento extrativo. Método analítico. Componentes. Referências. Extrato aquoso. 1:12. Maceração de partes aéreas frescas com água ou NaOH 1%. HPLC-DAD. Cumarina. CABRAL et al., (2001). Extrato aquoso. 1:10. Infusão de folhas secas. HPLC-DAD. Cumarina. CELEGHINI et al. (2001). Extrato aquoso. 1:100. Infusão de folhas. HPLC-DAD. Cumarina e ácido ocumárico. SANTOS (2005). TLC. Ácido caurenóico, ácido cinamoilgrandiflórico, sigmasterol e cumarina. OLIVEIRA et al. (1993). Extrato hidroalcoólico. 1:1. Processo de percolação das folhas. Obtenção das seguintes frações: hexânica, etanólica, clorofórmio e de ac.etila.

(29) 28 Tabela 1 - Continuação Extrato hidroalcoólico. Extrato hidroalcoólico. 1:10. Não especificado. Maceração por sonicação de secas folhas e caules Maceração das folhas frescas. O extrato bruto foi fracionado em diclorometano, e as duas fases (aquosa e orgânica) foram avaliadas.. HPLC-DAD. Cumarina. PEREIRA et al. (1998). GC-MS. Cumarina, ácido ocumárico, dihidrocumarina, fitol, ácido hexanóico, hexadecanoato de etila, dimetoxibenzaldeido, caurenol e ácido caurenóico. MOURA et al.(2002). Extrato hidroalcoólico. 1:5. Maceração das folhas secas. O extrato foi concentrado sob pressão reduzida e liofilizado. Frações de hexano foram obtidas e o resíduo foi utilizado para preparar fração de acetato de etila.. Extrato etanólico. 1:12. Refluxo das partes aéreas (frescas e secas). HPLC-DAD. Cumarina. CABRAL et al.(2001). Extrato etanolico. 0,1:25. Percolação e refluxo das folhas secas.. CCD e HPLC. Cumarina, esteróides, triterpenos e flavonóides. BOLINA et al.(2008). Extrato metanólico. Não especificado. Maceração das folhas. HPLC-DAD. Cumarina. RADUNZ (2004). VILEGAS et al. (1997). SANTOS et al. (1999). CCD e CG-MS. Cumarina, dihidrocumarina, espatulenol, ácido hexadecanóico, ácido YATSUDA et caurenóico, ácido al. (2005) isopropiloxigrandiflórico, 2-5-ciclohexadieno-1,4diona,2,6-bis9. Extrato Hexânico. 1:10 e 5:200. Maceração; maceração com sonicação; soxhlet; fuido supercrítico de folhas secas. CG-FID e CGMS. CG-FID: ácido caurenóico e cumarina; CG-MS: cumarina, lupeol, ácido caurenóico, sesquiterpenos, acetato de lupeol, ácido 11metilbutanóico e germacreno. Extrato diclorometânico. Não especifi cado. Maceração com sonicação e posterior liofilização. CCD, HPLC e CG-FID. Campesterol, sigmasterol, β-sitosterol e cumarina.. Fonte: ADAPTADO DE GASPARETTO et al., 2013.. No óleo essencial de guaco, é observada a presença de muitos compostos, incluindo α-cadinol, α-copaeno, α-humuleno, α-muurolol, α-pineno, α-terpinol, βpineno, β-farneseno, β-bourboneno, β-cubebeno, β-cariofileno, β- elemeno, (E)β-ocimene, (E)- nerolidol, p-cimeno e TAU- caudinol, epi- α-bisabolol, epi- αmuurolol, aromadendreno, biciclogermacreno, óxido de cariofileno, acetato de.

(30) 29 citronelal, cubebeno, elemol, germacreno-B, germacreno-D, globulol, limoneno, linalol, mirceno, nonanal, sabineno, espatulenol, terpinen 4-ol, trans-ocimene, trans-cariofileno e 1,4-dimetoxibenzeno (CAPPELARO, YARIWAKE, 2015; SILVA JUNIOR, 2015; REHDER et al., 2006). Os extratos hidroalcoólicos são as preparações à base de guaco comumente utilizadas em estudos fitoquímicos e comercializadas para fins terapêuticos (GASPARETTO et al., 2013). Baseados em estudos quantitativos utilizando extratos hidroalcoólicos, os metabólitos mais prevalentes nessas preparações são: a cumarina 1,2-benzopirona (SILVA et al., 2008; BUENO, BASTOS, 2009) (Figura 6A), o ácido o-cumárico (SANTOS, 2005) (Figura 6B), o ácido caurenóico (YATSUDA et al., 2005; BERTOLUCCI et al., 2009) (Figura 6C), o siringaldeído (AMARAL et al., 2009) (Figura 6D) e a dihidrocumarina (MOURA et al., 2002) (Figura 6E).. Figura 6 – Estruturas químicas: (A) cumarina; (B) ácido o-cumárico; (C) ácido caurenóico; (D) siringaldeído e (E) dihidrocumarina.. Fonte: ADAPTADO DE GASPARETTO et al., 2013..

(31) 30 A cumarina simples 1,2-benzopirona ocorre em abundância nas folhas da espécie, sendo considerada o principal marcador químico para controle de qualidade de formulações à base de guaco, conforme a Lista de Registros Simplificado de Fitoterápicos da ANVISA, Resolução RE n° 89, de 16 de março de 2004 (BRASIL, 2004; SILVA et al., 2008). Diversos trabalhos têm citado as cumarinas como responsáveis por muitas atividades terapêuticas importantes, tais como, anti-inflamatória (BRONIKOWSKA et. al.,. 2012;. KONTOGIORGIS. et. al.,. 2015),. citotóxica. e. antitumoral. (MONTAGNER, 2007; VIANNA, 2011), inibição da replicação do vírus HIV-1 (KOSTOVA, 2006), propriedades antifúngica (MARCONDES et al., 2015), antibacteriana (KOUSAR, ARSHAD, 2015), antioxidante (YU et al., 2005) e atividade contra os herpesvírus HSV-1 e HSV-2 (GHANNADI et al., 2014; SILVEIRA et al., 2009; ZAVRŠNIK et al., 2011). Olmedo et al. (2012) sintetizaram 14 estruturas químicas derivadas do composto 3-fenilcumarina e avaliaram suas atividades contra dois alvos moleculares do vírus HIV-1. Para a realização dos procedimentos, foram avaliadas as ações das cumarinas sintetizadas sobre as funções da proteína de transcrição Tat e NF-kB (fator nuclear kappa B), em cultura de células transfectadas. Foi observado que as cumarinas de número 10, 11, 13, 15, 16 e 17 mostraram atividade anti-HIV no teste de NF-kB. As cumarinas 10, 11 e 17 mostraram atividade anti-Tat (Figura 7). Figura 7 – Compostos sintetizados a partir de 3-fenilcumarina.. o. Para os compostos 7- 15: X,Y=H, Z=OH; (i) diciclohexilcarbodiimida (DCC) em DMSO a 100-110 C por 24- 28h. Para os compostos 16-17: Z=Cl; (i) acetona, K2CO3, refluxo. Autor: ADAPTADO DE OLMEDO et al.(2012). Algumas cumarinas com atividade anti-HIV foram identificadas a partir de fontes vegetais. Como exemplo citam-se os calanolídeos A e B, isolados das folhas.

(32) 31 de. uma. árvore. de. floresta. tropical,. Calophyllum. lanigenum. Miq.. var.. austrocoriaceum, família Guttiferae, encontrada na Malásia. Essas substâncias inibiram a replicação in vitro do HIV-1, provavelmente por inibição da atividade enzimática da DNA-polimerase dependente de DNA e da DNA-polimerase dependente de RNA presentes no vírus (VLIETINCK et al., 1998).. 2.3.2 Propriedades farmacológicas da Mikania glomerata Sprengel. O guaco é utilizado na cultura popular há séculos devido às suas propriedades terapêuticas, que incluem ação tônica, depurativa, antipirética e broncodilatadora, além de estimulante do apetite e antigripal (LORENZI, MATOS, 2008). É ainda empregada no tratamento da asma, bronquite e adjuvante no combate à tosse (AGRA et al., 2008; SILVA et al., 2006; SOARES et al., 2006; TESKE, TRENTINI, 1997). Apesar de possuir várias indicações terapêuticas populares, somente a ação expectorante sobre as vias respiratórias foi indicada na Farmacopéia Brasileira (BRASIL, 1926). Outros estudos mostraram potencial atividade antialergênica (FIERRO et al., 1999), antimicrobiana (PESSINI et al., 2003), analgésica (RUPPELT et al., 1991), anti-inflamatória (FALCÃO et al., 2005), antioxidante (VICENTINO, MENEZES, 2007) e antidiarréica (SALGADO et al., 2005). As propriedades terapêuticas do guaco são atribuídas a alguns dos seus principais metabólitos secundários, tais como o ácido o-cumárico, ácido caurenóico e a cumarina (CHOI et al., 2011; DOS SANTOS et al. 2006). Embora os resultados obtidos com os ácidos o-cumárico e caurenóico sejam promissores, a maioria dos trabalhos disponíveis na literatura atribui os efeitos benéficos do guaco à cumarina (CZELUSNIAK et al., 2012; GASPARETTO, 2013; SANTOS, 2005). Estudos realizados por Yatsuda et al. (2005) avaliaram a atividade antimicrobiana dos extratos etanólico, e das frações hexânicas e de acetato de etila obtidos das folhas de Mikania glomerata. As frações do extrato foram testados contra a cepa de Streptococcus mutans. A atividade antibacteriana foi avaliada. pela. determinação. da. concentração. inibitória. mínima. (CIM),. concentração bactericida mínima (CBM) e a inibição da aderência celular a uma.

(33) 32 superfície de vidro. Observou-se que a fração hexânica foi eficaz na inibição do crescimento bacteriano e na aderência dos microrganismos a uma superfície de vidro. Os dados indicam que os compostos biologicamente ativos estão presentes principalmente na fração hexânica de extratos obtidos da espécie de Mikania glomerata Sprengel. O tratamento com guaco também está indicado em casos de infecções fúngicas. Freitas et al. (2014) ao avaliar a atividade antifúngica do extrato hidroalcoólico de Mikania glomerata contra isolados clínicos de Candida albicans constatou que não houve crescimento fúngico nas concentrações testadas. Portanto, o extrato bruto de guaco apresentou atividade contra 80% dos isolados de C. albicans, sugerindo a presença de compostos ativos e a possibilidade de desenvolvimento de um agente antifúngico. Kaziyama et al. (2012), na pesquisa de fitoterápicos com potencial antiviral, avaliaram a atividade de M. glomerata e das espécies Cymbopogon citratus, Equisetum arvense, Peumus boldus, Solanum paniculatum, Malva sylvestris, Piper umbellatun e Solidago microglossa contra os herpesvírus bovino (BoHV-1) e suíno (SuHV-1). Os testes foram realizados com base na redução do título viral e os resultados expressos em porcentagem de inibição. O extrato aquoso de guaco apresentou um baixo percentual de inibição para SuHV-1 (PI = 68%) e BoHV-1 (PI = 43%) quando comparado às demais espécies testadas. Embora a espécie Mikania glomerata Sprengel possua muitas propriedades farmacológicas descritas ainda não foi encontrado na literatura relato de atividade desta espécie contra os vírus HSV-1 e HSV-2, sendo este estudo inovador..

(34) 33 3 OBJETIVOS. 3.1 OBJETIVO GERAL. Avaliar a atividade antiviral do extrato seco de Mikania glomerata Sprengel (guaco) frente aos herpesvírus HSV-1 e HSV-2.. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS . Obter o extrato fluido de Mikania glomerata Sprengel;. . Obter o extrato seco liofilizado de Mikania glomerata Sprengel;. . Caracterizar o extrato seco liofilizado de M. glomerata Sprengel quanto ao teor. de. cumarina. por. espectrofotometria. em. ultravioleta-visível. e. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE); . Determinar o teor de umidade do extrato seco;.  Avaliar a citotoxicidade do extrato seco em cultura celular da linhagem Vero e avaliar a atividade antiviral frente aos herpesvírus HSV-1 e HSV-2..

(35) 34 4 MATERIAIS E MÉTODOS. 4.1 MATERIAL VEGETAL. As folhas de Mikania glomerata Sprengel (guaco) foram coletadas no Horto da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF) no mês de janeiro de 2014 no período da manhã relacionados com uma maior incidência da radiação UV. Uma exsicata de número 42054 está depositada no Herbário Leopoldo Krieger na Universidade Federal de Juiz de Fora. A escolha do mês de janeiro para a realização da coleta baseou-se em estudos anteriores que demonstraram o efeito da sazonalidade nos teores de cumarina em M. glomerata. Há uma relação entre a intensidade luminosa e a produção de metabólitos secundários tais como a cumarina, uma vez que todas as substâncias produzidas pela planta estão envolvidas, direta ou indiretamente, com a fotossíntese. Já foi demonstrado que maiores teores de cumarina em Mikania glomerata foram encontrados em folhas de plantas jovens cultivadas em locais com maior incidência solar (CASTRO et al., 2006). As cumarinas são derivadas do ácido chiquímico, via orto-hidroxilação catalisada pela enzima trans-cinamato 4- hidroxilase, isomerização cis-trans da dupla ligação da cadeia lateral e lactonização do ácido cinâmico. A isomerização cis trans da dupla ligação da cadeia lateral é catalisada pela luz UV ocasionando a lactonização espontânea. Portanto, maiores teores de cumarina são encontrados em plantas coletadas no período de maior incidência da radiação UV (DEWICK, 2009).. 4.2 PREPARO DA AMOSTRA. As folhas frescas, após processo de triagem, foram submetidas à pré-secagem sob temperatura de 22 ± 3 °C por 48 h. Posteriormente, foram transferidas para a estufa de ar circulante para a desidratação, mantidas em temperatura controlada de 35 ± 1 ºC até que as folhas estivessem secas e quebradiças. Em seguida, efetuouse a trituração utilizando máquina tipo picadeiro e moinho de martelo (marca Junqueira - modelo 10 JC6), obtendo-se um pó passado no tamis malha 20.

(36) 35 (AMARAL et al., 2009). Esse pó, após resfriamento em temperatura ambiente, foi devidamente embalado em sacos plásticos e envolvido em papel craft.. 4.3 PREPARO DO EXTRATO FLUIDO. O extrato fluido de guaco foi obtido empregando-se as técnicas de maceração e percolação, conforme o método de preparação A preconizado na Farmacopéia Brasileira 1ª edição (BRASIL, 1926). Foram utilizados 1 kg de folhas trituradas da planta e solvente etanol/água (70:30 v/v) na proporção de 1:1. A escolha do solvente etanol/água (70:30 v/v) foi feita baseada em estudos realizados por Rocha et al. (2008) que avaliou diferentes proporções do solvente no processo extrativo de M. glomerata para a preparação de tinturas. Foram preparadas tinturas utilizando misturas etanol: água nas seguintes proporções: 0:100, 10:90, 20:80, 30:70, 40:60, 50:50, 60:40, 70:30, 80:20 e 94:6. Após determinação do teor de cumarina das amostras por CLAE, os resultados mostraram que uma mistura hidroalcoólica a 70% é capaz de produzir tintura com maior teor em cumarina.. 4.4 OBTENÇÃO DO EXTRATO SECO. O método de secagem escolhido foi a liofilização. Esse processo possui a vantagem de não provocar o rompimento das estruturas moleculares e a perda das propriedades organolépticas originais do material vegetal (TSINONTIDES et al., 2004). O solvente alcoólico foi evaporado em estufa antes de ser submetido ao processo de liofilização. O processo de remoção do solvente alcoólico procedeu-se vertendo 50 mL do extrato fluído de Mikania glomerata Sprengel em béquer graduado de 100 mL. Levou-se o béquer em estufa (Estufa de Cultura Fanem 002CB) mantendo a temperatura controlada entre 45°C e 50 ºC, durante o período de 48 h. Optou-se pelo processo de secagem em estufa, uma vez que o processo de rotaevaporação resultou em perdas do extrato, que fica aderido ao balão e o processamento de evaporação de cada porção foi lento (SILVA et al., 2012)..

(37) 36 O extrato seco liofilizado foi preparado adicionado de 5% de Aerosil® como adjuvante para reduzir a higroscopicidade e o efeito de caramelização (SILVA et al., 2012). A liofilização foi realizada no Laboratório de Análise Instrumental da Faculdade de Nutrição da Universidade Federal de Juiz de Fora utilizando-se o equipamento Liofilizador Terroni LS 3000 (São Carlos, Brasil) (Figura 8). As amostras foram pré-congeladas à -80 ºC e o tempo total do processo foi de aproximadamente 50 horas, sob pressão inicial de -475 mmHg e temperaturas entre -52 ºC e -49 ºC (SILVA et al., 2012). O extrato seco foi utilizado nos ensaios de atividade antiviral, uma vez que o extrato fluido possui etanol em sua composição, que provavelmente interferiria na viabilidade celular das células Vero, podendo comprometer os resultados. Figura 8 - Equipamento Liofilizador Terroni LS 3000 (São Carlos, Brasil).. Fonte: A AUTORA.. 4.5 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE UMIDADE DO EXTRATO SECO. O teor de umidade no extrato seco foi determinado em balança de infravermelho (GEHARA, modelo IV2000) do Laboratório de Análises de Alimentos e Águas da Faculdade de Farmácia da UFJF..

(38) 37 Amostras de 1,0 g do extrato seco foram submetidas ao aquecimento máximo de 108 °C em balança de infravermelho pelo período de 2 minutos. A análise foi realizada em duplicata (BORGES et al., 2005).. 4.6 DETERMINAÇÃO DO TEOR DE CUMARINA POR ESPECTROFOTOMETRIA UV/VIS. Primeiramente, foi construída uma curva de calibração a partir do padrão da cumarina 1,2-benzopirona (Fluka, Sigma - Aldrich, São Paulo, Brasil, potência de 99,9%) diluído em metanol/água (80:20 v/v) obtendo-se sete concentrações: 4,8; 5,76; 6,72; 7,68; 8,64; 9,6 e 10,56 μg/mL. As leituras das absorbâncias foram realizadas em espectrofotômetro (Modelo Biochoron Libra S12) no comprimento de onda de 275 nm (AMARAL et al., 2009). A determinação do teor de cumarina presente no extrato seco de guaco consistiu em diluir a amostra em metanol/água (80:20 v/v) obtendo-se a concentração final do extrato de 156,16 μg/mL. A leitura foi realizada em comprimento de onda igual a 275 nm e os teor de cumarina foram calculados a partir da curva de calibração. Os procedimentos foram realizados em triplicata.. 4.7 DETERMINAÇÃO DO TEOR DA CUMARINA 1,2-BENZOPIRONA POR CLAE. As análises cromatográficas para determinação da concentração da cumarina 1,2- benzopirona no extrato seco de guaco foram realizadas na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto – Universidade de São Paulo. Foi utilizado cromatógrafo Shimadzu equipado com controlador SCL-10Avp, três bombas LCF-10AD, detector de UV-DAD modelo SPD-M10Avp, software Shimadzu Class-VP versão 5.02 e coluna cromatográfica Zorbax SB-C18 (250 x 4.6 mm) (Agilent). As separações cromatográficas foram realizadas a temperatura de 25 oC, sob eluição isocrática usando como fase móvel os solventes acetonitrila/água (40:60 v/v) sob o fluxo de 1 mL/min. O volume de injeção foi de 20 μL e a detecção realizada em comprimento de onda de 274 nm. O tempo de corrida para cada análise foi de 15 min (CELEGHINI et al. 2001; SILVA et al., 2012)..

(39) 38 A determinação da cumarina 1,2-benzopirona presente no extrato seco de guaco consistiu em diluir a amostra em acetonitrila/água (40:60 v/v) obtendo-se a concentração final do extrato de 500 μg/mL. O teor de 1,2-benzopirona foi calculado a partir da curva de calibração construída com cinco concentrações (20, 40, 60, 80 e 100 μg/mL) do padrão primário 1,2-benzopirona (Fluka, Sigma-Aldrich). O padrão foi diluído em acetonitrila/água (40:60 v/v). Todas as soluções foram previamente filtradas em filtro Millex® antes da injeção no equipamento.. 4.8 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIVIRAL DO EXTRATO SECO DE GUACO. Para a avaliação da atividade antiviral do extrato seco de guaco os testes foram divididos em duas etapas. A primeira etapa consistiu na realização do ensaio de citotoxicidade e teve os seguintes parâmetros analisados: alterações da morfologia celular, análise e cálculo da viabilidade celular e o cálculo da Concentração Citotóxica para 50% das células (CC50). Posteriormente, na segunda etapa realizou-se o ensaio de atividade antiviral, composto por avaliação preliminar da atividade antiviral, teste de titulação e avaliação da redução do título viral. Os ensaios de citotoxicidade e de atividade antiviral foram realizados no Instituto de Microbiologia Paulo de Góes da Universidade Federal do Rio de Janeiro.. 4.8.1 Preparo das amostras. Foram preparadas soluções estoque do padrão de cumarina 1,2-benzopirona e do extrato seco de M. glomerata a fim de se obter concentrações de 1000 µg/mL. A solução estoque do padrão de cumarina foi obtida a partir da diluição de 20 mg em 400µL de DMSO e posteriormente o volume foi completado para 20 mL com água destilada. Para o preparo da solução estoque do extrato seco na concentração de 1000 µg/mL de 1,2-benzopirona, foram pesados 291,54 mg do extrato, adicionou-se 400µL de DMSO e posteriormente o volume foi completado para 20 mL com água destilada. O preparo da solução estoque utilizando o extrato seco foi baseado no teor de cumarina encontrado na análise espectrofotométrica (68,6 mg de cumarina/g extrato seco), que está relacionado com a cumarina e o precursor ácido o-cumárico. As soluções foram filtradas em membrana Millipore (0,22 µm), divididos em.

(40) 39 pequenos volumes e armazenados a temperatura de –20 ºC até o momento de utilização.. 4.8.2 Cultura celular. Para a realização dos estudos de citotoxicidade e avaliação da atividade antiviral foi utilizada cultura de células Vero (fibroblastos de rim de macaco Cercopitheccus aethiops) fornecidas pelo Laboratório Experimental de Drogas Antivirais e Citotóxicas (LEDAC) da Universidade Federal do Rio de Janeiro. As células foram mantidas em meio mínimo essencial de Eagle (MEM-Eagle) (Cultilab, Campinas, São Paulo, Brasil) acrescido de 0,03 mg/mL de L- glutamina (Sigma, St. Louis, Missouri, USA), 50 µg/mL de garamicina, 2,5 mg/mL de fungizona (BristolMyers-Squibb, New York, USA), solução de bicarbonato de sódio a 0,25% (Merck, Darmstadt, Germany) tampão HEPES 10 mM (Sigma, St. Louis, Missouri, USA) e 10% de soro fetal bovino (SFB) (meio de crescimento) ou sem soro fetal bovino (meio de manutenção) (Cultilab, Campinas, São Paulo, Brasil) e incubadas a 37 ºC em ambiente com 5% de CO2. 4.8.3 Amostras virais. As amostras de vírus herpes simplex humano tipos 1 (HSV-1) e 2 (HSV-2) utilizadas neste trabalho, fazem parte da coleção do Laboratório Experimental de Drogas Antivirais e Citotóxicas (LEDAC) da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Estas cepas virais foram isoladas a partir do fluido de vesículas orais e genitais humanas com características de herpes oral e genital, respectivamente. A caracterização destes vírus foi realizada no Laboratório de Viroses Respiratórias, Entéricas e Oculares (LAVIREO), da UFRJ, através da reação em cadeia da polimerase (PCR), empregando primers específicos para a identificação de HSV-1 e HSV-2 (MARKOULATOS et al., 2001).. 4.8.4 Ensaio de Citotoxicidade. O ensaio de citotoxicidade foi realizado com o objetivo avaliar a toxidez do extrato em células Vero e estabelecer as concentrações a serem utilizadas no.

(41) 40 ensaio de avaliação da atividade antiviral. A análise da citotoxicidade foi realizada a partir da observação de alterações morfológicas das células (DE CLERCQ et al., 1980), assim como da viabilidade das mesmas após o tratamento com soluções contendo diferentes concentrações do extrato seco e do padrão de cumarina 1,2benzopirona (BORENFREUND, PUERNER, 1985).. 4.8.4.1 Morfologia celular. Foram realizadas diluições seriadas das soluções estoque do extrato seco e do padrão de cumarina a fim de se obter soluções nas seguintes concentrações de cumarina: 500; 250; 125; 62,5; 31,2; 15,6; 7,8 µg/mL. O diluente utilizado nessas diluições foi o MEM-Eagle sem adição do SFB. Em uma microplaca de 96 poços, as Células Vero foram distribuídas em meio MEM suplementado e incubadas em estufa a 37 ºC até a formação de monocamada confluente. Após a formação da monocamada confluente, o meio MEM suplementado com SFB foi removido e foram adicionadas 100 μL das soluções de diferentes concentrações do extrato e do padrão diluídos em MEM sem adição do SFB. Cada concentração das soluções foi testada em quadruplicata. Nas células utilizadas como controle foram adicionadas 100 μL de meio MEM sem SFB. As células foram incubadas por 48 h a 37 °C, em ambiente com 5% de CO2. Após o tempo de incubação, a morfologia celular foi examinada em microscópio óptico invertido (Leitz-Germany 633456) e as células tratadas foram comparadas ao grupo controle (células tratadas apenas com MEM, sem a presença do extrato ou do padrão) e células tratadas com o composto antiviral padrão Aciclovir (Sigma Chemical 212 Company, EUA ). A maior concentração observada de cada amostra, que não provocou alteração morfológica das células, foi denominada Concentração Máxima Não Tóxica (CMNT). Os resultados obtidos na avaliação da morfologia celular, juntamente com os resultados obtidos no ensaio de viabilidade celular foram avaliados para determinar as concentrações a serem utilizadas nos estudos de atividade antiviral..