FACULDADE DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
ALINE WASEM ZANOTTO
ULTRAFILTRATION OF SURFACTIN PRODUCED BY Bacillus subtilis LB5a USING CASSAVA WASTEWATER WITH LOW PROTEIN CONTENT
ULTRAFILTRAÇÃO DA SURFACTINA PRODUZIDA POR Bacillus subtilis LB5a USANDO MANIPUEIRA COM BAIXO TEOR DE PROTEÍNA
CAMPINAS 2018
ULTRAFILTRATION OF SURFACTIN PRODUCED BY Bacillus subtilis LB5a USING CASSAVA WASTEWATER WITH LOW PROTEIN CONTENT
ULTRAFILTRAÇÃO DA SURFACTINA PRODUZIDA POR Bacillus subtilis LB5a USANDO MANIPUEIRA COM BAIXO TEOR DE PROTEÍNA
Dissertação apresentada à Faculdade de Engenharia de Alimentos da Universidade Estadual de Campinas como parte dos requisitos exigidos para a obtenção do título de Mestra em Ciência de Alimentos.
Dissertation presented to the Faculty of Food Engineering of the State University of Campinas in partial fulfillment of the requisites for the degree of Master in Food Science.
Orientadora: Profª. Drª. Glaucia Maria Pastore Coorientador: Dr. Cristiano José de Andrade
Este exemplar corresponde a versão final da dissertação defendida pela aluna Aline Wasem Zanotto e orientada pela Prof.ª Dr.ª Glaucia Maria Pastore.
CAMPINAS 2018
Ficha catalográfica
Universidade Estadual de Campinas
Biblioteca da Faculdade de Engenharia de Alimentos Márcia Regina Garbelini Sevillano - CRB 8/3647
Zanotto, Aline Wasem, 1994-
Z17u ZanUltrafiltration of surfactin produced byBacillus subtilisLB5a using cassava wastewater with lowprotein content / Aline Wasem Zanotto. – Campinas, SP : [s.n.], 2018.
ZanOrientador: Glaucia Maria Pastore. ZanCoorientador: Cristiano José de Andrade.
ZanDissertação (mestrado) – Universidade Estadual de Campinas, Faculdadede Engenharia de Alimentos.
Zan1. Manipueira. 2. Surfactina. 3. Ultrafiltração. I. Pastore, Glaucia Maria. II. Andrade, Cristiano José de. III. Universidade Estadual de Campinas.
Faculdade de Engenharia de Alimentos. IV. Título.
Informações para Biblioteca Digital
Título em outro idioma: Ultrafiltração da surfactina produzida por Bacillus subtilis LB5a usando manipueira com baixo teor de proteína
Palavras-chave em inglês: Cassava Wastewater Surfactin
Ultrafiltration
Área de concentração:Ciência de Alimentos Titulação: Mestra em Ciência de Alimentos Banca examinadora:
Glaucia Maria Pastore Eder da Costa dos Santos Marcus Bruno Soares Forte Data de defesa: 06-08-2018
Programa de Pós-Graduação:Ciência de Alimentos
____________________________________________ Prof.ª Dr.ª Glaucia Maria Pastore
(Orientador) FEA - UNICAMP
____________________________________________ Prof. Dr. Eder da Costa dos Santos
(Titular)
UTFPR – Francisco Beltrão
____________________________________________ Prof. Dr. Marcus Bruno Soares Forte
(Titular) FEA – UNICAMP
A ata da defesa com as respectivas assinaturas dos membros encontra-se no processo de vida acadêmica do aluno.
Qualquer caminho que você decida tomar
existe sempre alguém para te dizer que você está
errado. Existem sempre dificuldades surgindo
que tentam a acreditar que as críticas estão
corretas. Mapear um caminho de ação e
segui-lo até o fim requer coragem”.
A minha querida mãe e meu falecido irmão
Dedico
A toda minha família e amigos
.
À Michel Yudi Shinkai Kanemaru, pelo carinho, companheirismo, incentivo e principalmente paciência durante todo o mestrado.
À Deus, por todas as conquistas de minha vida.
À minha orientadora, Prof.ª Dr.ª Glaucia Maria Pastore por ter sido sempre tão atenciosa, em especial, pela confiança e oportunidade oferecida e por acreditar no desenvolvimento deste trabalho, minha eterna gratidão e admiração.
Ao meu coorientador, Dr. Cristiano José de Andrade, por sempre me incentivar, por suas correções, por ser tão paciente e generoso, por acreditar em mim em todos os momentos.
Aos membros da banca, pela disponibilidade e auxílio nas correções. A Plaza Indústria e Comércio Ltda por doar a manipueira usada neste trabalho.
A todos os colegas do Laboratório de Bioaromas, Compostos Bioativos e Biotecnologia de Alimentos.
A Angélica, Débora, Dora e Nadir, que são fundamentais para o funcionamento dos laboratórios.
Ao laboratório de apoio central (FEA) pelo uso de alguns equipamentos, em especial Bianca Wopereis.
A todos os técnicos e funcionários do Dempster Mass Spectrometry Lab, em especial Bruno Labate Vale da Costa e Dr.ª Lidiane Maria de Andrade pela colaboração nas análises cromatográficas.
A todos os técnicos e funcionários da FEA.
Seria impossível listar todos os nomes a que devo gratidão. Por isso, a todas as pessoas que contribuíram no desenvolvimento desse trabalho, direta ou indiretamente, o meu muito obrigado e os deixo aqui um abraço.
A crescente preocupação com problemas ambientais relacionada ao uso de surfactantes derivados do petróleo, não-biodegradáveis, ecotóxicos, dependentes da indústria petroquímica (fonte finita), instiga o estudo de surfactantes de origem microbiana (biossurfactantes), como a surfactina. Em relação aos custos globais para obtenção de biossurfactantes, a produção e recuperação de biossurfactante ainda são os maiores empecilhos que inviabilizam a aplicação desses compostos em larga escala. O processo de recuperação dos biossurfactantes representa aproximadamente 60% dos custos de produção, enquanto que o meio de cultura entre 30-50%. Deste modo, buscam-se alternativas para reduzir os custos de produção (meio de cultura e técnicas de purificação), a fim de tornar viável economicamente a produção de biossurfactantes em escala industrial. Neste contexto, uma das estratégias mais promissoras é o uso de resíduos agroindustriais como meio de cultura associado a sistemas filtrantes (purificação); por exemplo a manipueira (resíduo da produção de farinha de mandioca) que pode ser utilizada para a produção de surfactina e associada ao processo de ultrafiltração. Portanto, essa estratégia (manipueira + ultrafiltração) representa uma alternativa para a produção e purificação da surfactina de forma potencialmente viável e econômica. Porém, o uso da manipueira como meio de cultura dificulta o processo de ultrafiltração (incrustação e/ou polarização na membrana), principalmente devido as proteínas da própria manipueira bem como as sintetizadas inerentemente pelo micro-organismo produtor de biossurfactante. Portanto, este trabalho objetiva avaliar o efeito de diferentes tratamentos de remoção das proteínas da manipueira, bem como o efeito desses tratamentos na produção e purificação (ultrafiltração) da surfactina. Os tratamentos usados para remoção das proteínas foram: HCl pH2 e HCl pH3, (NH4)2SO4 e C2HCl3O2 (TCA). A manipueira tratada com (NH4)2SO4 e
C2HCl3O2 (TCA) não possibilitou o crescimento do Bacillus subtilis LB5a e
consequente produção de surfactina. Os tratamentos com HCl pH2 e pH3 apresentaram produção de 749,80 mg/L e 625,82 mg/L com 72 horas de fermentação, valores de produtividade maiores que o controle (manipueira sem tratamento) – 598,56 mg/L. Considerando os resultados dos experimentos anteriores apenas o tratamento HCl pH2 foi submetido a purificação por ultrafiltração. A etapa de ultrafiltração consistiu em duas etapas com membranas de 100 e 50 kDa, respectivamente. As duas etapas de ultrafiltração proporcionaram uma recuperação superior a 72% e pureza de 51,49%. Portanto, foi possível observar que o tratamento da manipueira com HCl pH2 aumentou a produção de surfactina e foi possível recuperar e purificar utilizando a ultrafiltração diretamente o meio de cultura obtendo bons rendimentos de recuperação e pureza.
The growing concern with environmental problems related to the use of non-biodegradable petroleum-based surfactants, which are ecotoxic and dependent on the petrochemical industry (finite source), instigates the study of surfactants of microbial origin (biosurfactants), as to surfactin. In relation to the global costs to obtain biosurfactants, the production and recovery of biosurfactant are still the major obstacles that prevent the application of these compounds on a large scale. The recovery process of the biosurfactants represents approximately 60% of the costs of production, while the medium of culture between 30-50%. In this way, alternatives to reduce production costs (culture medium and purification techniques) in order to make the production of biosurfactants economically feasible on industrial scale are pursued by researches and industry. In this context, one of the most promising strategies is the use of agro-industrial residues as a culture medium associated with filtering systems (purification); for example, cassava wastewater (CWW) a residue from cassava flour production, that can be used for the production of surfactin and associated with the ultrafiltration process. Therefore, this strategy (CWW + ultrafiltration) represents an alternative for the production and purification of surfactina in a potentially viable and economical way. However, the use of cassava wastewater as a culture medium hampers the process of ultrafiltration (fouling and/or polarization in the membrane), mainly due to the proteins of the cassava wastewater itself as well as those inherently synthesized by the microorganism producing biosurfactant. Therefore, this work aims to evaluate the effect of different treatments in cassava wastewater for proteins removal, as well as the effect of these treatments on the production and purification (ultrafiltration) of surfactin. The treatments used to remove the proteins were: HCl pH2 and HCl pH3, (NH4) 2SO4 and C2HCl3O2 (TCA).
The CWW treated with (NH4)2SO4 and C2HCl3O2 (TCA) did not allow the growth of
Bacillus subtilis LB5a and consequent production of surfactin. On the other hand, treatments with HCl pH2 and pH3 presented a 749.80 mg/L and 625.82 mg/L production with 72 hours of fermentation, higher productivity values than the control (cassava wastewater without treatment) - 598.56 mg/L. Considering the results of the previously experiments only the HCl pH2 treatment was subjected to ultrafiltration purification. The ultrafiltration step consisted of two steps with membranes of 100 and 50 kDa, respectively. The two-ultrafiltration steps provided a recovery of greater than 72% and purity of 51.49%. Therefore, it was possible to observe that the handling of the cassava wastewater with HCl pH2 increased the surfactin production and enabled the ultrafiltration of the surfactin directly from the culture medium presenting with good yields of recovery and purity.
INTRODUÇÃO GERAL
Figure 1. Principal isoforma da surfactina. ... 18 CHAPTER I
Figure 1. Forms of self-aggregation of biosurfactants and their respective denomination of phase. Adapted from (HOLMBERG et al., 2002). ... 32 Figure 2. Chemical structure of surfactin. ... 34 CHAPTER II
Figure 1. CWW pretreatments, surfactin production and ultrafiltration (UF); an overview. ... 62 Figure 2. Bacillus subtilis LB5a growth kinetics in control CWW (not treated), CWW-2 and CWW-3 conditions (treated with HCl). ... 69 Figure 3. Kinetics of surfactin production (○), glucose (■), fructose (△) and sucrose (▲) consumption by Bacillus subtilis LB5a in the control CWW (A), CWW-2 (B) and CWW-3 (C). ... 71
CHAPTER I
Table 1. Agro-industrial residues applied on surfactin production with different strains
of Bacillus, yields and recovery and purification techniques. ... 36
CHAPTER II Table 1.CWW treatments - protein removal – effects on B. subtilis LB5a growth and surfactin production. ... 67
Table 2. Quantification of sugars in control CWW and after acid treatments ... 70
Table 3. Surfactin production yield during the fermentation process. ... 74
(NH4)2SO4 Sulfato de amônio Ala Alanina Asp Asparagina C/N Carbono/Nitrogênio CAN Acetonitrila Cf Concentração de surfactina
Cpp Concentração de surfactina no permeado Cpf Concentração de surfactina no retido CFU Unidades formadoras de colônias Cp Concentração de proteína total Cs Concentração de surfactina total
CWW Manipueira
CWW-2 Manipueira tratada com pH2 CWW-3 Manipueira tratada com pH3
EtOH Etanol
FEA Faculdade de Engenharia de Alimentos
Glu Glutamina
HCl Ácido clorídrico
HFLC Cromatografia líquida de ultra-alta performace
HPAEC-PAD Cromatografia de troca aniônica de alto desempenho acoplada a um sistema de detecção amperométrica pulsado
Ile Isoleusina
lb Libra
Leu Leucina
MF Microfiltração
Ms Massa de surfactina
Msi Massa de surfactina no retentado Msii Massa de surfactina na alimentação MWCO Corte de peso molecular
NaOH Hidróxido de sódio
Rp Coeficiente de rejeição para proteína Rs Coeficiente de rejeição para surfactina TCA Ácido tricloroacético
TFA Ácido tricloroacético
TRS Recuperação total de surfactina
TRSi Recuperação total de surfactina na UF-1 TRSii Recuperação total de surfactina na UF-2 UF Ultrafiltração
UF-1 Primeira etapa de ultrafiltração UF-2 Segunda etapa de ultrafiltração
US$ Dólar
Val Valina
w/o Água em óleo
α Alfa
1. INTRODUÇÃO GERAL... 16 1.1 SURFACTINA ... 17 1.2 MANIPUEIRA ... 20 2. OBJETIVOS ... 23 2.1 OBJETIVO GERAL ... 23 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ... 23 REFERÊNCIAS ... 24 CHAPTER I ... 29 ABSTRACT ... 30 1. INTRODUCTION ... 31
1.1 MAIN EVENTS AFTER THE DISCOVERY OF SURFACTIN ... 33
2. PRODUCTION OF SURFACTIN USING AGRO-INDUSTRIAL RESIDUES AS CULTURE MEDIUM ... 35
2.1 STARCH RICH RESIDUES ... 38
2.2 VEGETABLE OILS RESIDUES ... 39
2.3 RESIDUES OF WHEY AND PROTEIN SUBSTRATES ... 40
2.4 OTHER RESIDUES ... 40
3. RECOVERY AND PURIFICATION OF LIPOPEPTIDE: SURFACTIN ... 42
3.1 ACID PRECIPITATION ... 42
3.3 ADSORPTION ... 43
3.4 EXTRACTION LIQUID-LIQUID ... 44
3.5 ULTRAFILTRATION ... 44
4. SURFACTIN PRODUCTION AT INDUSTRIAL SCALE – AN STRATEGY .. 46
5. CONCLUSION ... 46 REFERENCES ... 48 CHAPTER II ... 56 ABSTRACT ... 57 GRAPHICAL ABSTRACT... 58 1. INTRODUCTION ... 59
2. MATERIAL AND METHODS ... 61
2.3.1. Cassava wastewater treatments ... 62
2.3.2. The best culture medium treatment ... 63
2.4. DETERMINATION OF PROTEIN CONCENTRATION AND CELL GROWTH ... 63
2.5 FERMENTATION KINETICS ... 63
2.5.1 Inoculum; surfactin production and microbial growth kinetics ... 63
2.5.2 Consumption of sugars ... 64
2.6 SURFACTIN PURIFICATION BY THE TWO-STAGE ULTRAFILTRATION PROCESS ... 65
2.7 QUANTIFICATION OF SURFACTIN ... 66
2.8 STATISTICAL ANALYSIS ... 66
3. RESULTS AND DISCUSSION ... 67
3.1 CASSAVA WASTEWATER TREATMENTS; PROTEIN REMOVAL ... 67
3.2 FERMENTATION KINETICS, CONSUMPTION OF SUGARS AND SURFACTIN PRODUCTION ... 69
3.3. SURFACTIN PURIFICATION BY THE TWO-STAGE ULTRAFILTRATION PROCESS ... 74 4. CONCLUSIONS ... 76 REFERENCES ... 78 DISCUSSÃO GERAL ... 83 CONCLUSÃO GERAL ... 85 PERSPECTIVAS FUTURAS ... 86 REFERÊNCIAS GERAIS ... 87 ANEXOS ... 99
1. INTRODUÇÃO GERAL
A maioria dos surfactantes empregados nos diversos setores industriais: indústria de alimentos, formulação de pesticidas e produtos de limpeza ainda é derivada da indústria petroquímica (KARSA, 1999; MAKKAR; CAMEOTRA; BANAT, 2011). O principal impacto causado pelo uso desses compostos são os efeitos negativos gerados para o meio ambiente, pois os surfactantes derivados da indústria petroquímica não são biodegradáveis, apresentam ecotoxicidade e capacidade de bioacumulação. Logo, há a necessidade de pesquisas/aplicações por surfactantes mais sustentáveis, como os surfactantes de origem microbiana, assim denominados biossurfactante (SOBERÓN-CHÁVEZ, 2010).
Dentre os biossurfactantes mais conhecidos (produção e purificação), a surfactina destaca-se sendo produzida por Bacillus sp. A surfactina apresenta estrutura heptapeptídica cíclica ligada à um ácido graxo β-hidróxi carbônica (12 a 16 carbonos) (KAKINUMA; TAMURA; ARIMA, 1968). A surfactina apresenta excepcional capacidade de reduzir a tensão superficial e interfacial de sistemas óleo em água (o/w em inglês) e água em óleo (w/o) de 72 para 27 mN/m (ARIMA; KAKINUMA; TAMURA, 1968; SOBERÓN-CHÁVEZ, 2010).
Além das características químicas (estrutura excepcional) e biodegradabilidade, a produção de biossurfactantes de origem microbiana é interessante, pois não é sazonal, tem-se controle das condições de produção e quantidade produzida, os biossurfactantes possuem resistência a variações de temperatura, pH e salinidade, podendo ser realizada utilizando resíduos agroindustriais como substrato, como a manipueira derivada do processamento da mandioca (ANDRADE et al., 2016; BARROS; PONEZI; PASTORE, 2008; NITSCHKE; FERRAZ; PASTORE, 2004). Deste modo a produção de biossurfactantes usando resíduos agroindustriais como meio de cultura pode contribuir de maneira indireta para a gestão de resíduos (MARÓSTICA; PASTORE, 2007).
A produção de biossurfactante em escala industrial ainda apresenta elevados custos envolvidos no processo de recuperação desses compostos, que representam aproximadamente 60% do custo de produção (ANDRADE et
al., 2016b; BARROS et al., 2007). Neste contexto, as abordagens mais utilizadas para recuperação e purificação desses compostos envolvem fracionamento da espuma e precipitação ácida (ácido clorídrico) (NITSCHKE; FERRAZ; PASTORE, 2004), extração sólido-liquido, extração líquido-líquido (hexano e acetato de etila) (CHEN; JUANG, 2008), cristalização, cromatografia por adsorção, precipitação e diafiltração (DESAI; BANAT, 1997), extração assistida por ultrasom (YUAN et al., 2012) e UF (ANDRADE et al., 2016). O uso da maioria dessas técnicas acaba gerando grandes quantidades de resíduos ou empregam solventes orgânicos, com exceção a UF que não gera resíduo (COUTTE et al., 2017).
Assim, a ultrafiltração (UF) seria uma alternativa viável e de fácil aplicação para os processos de recuperação de biossurfactantes. Porém o uso de manipueira como substrato aumenta o efeito de incrustação da membrana (foulling), ou seja, reduz drasticamente o fluxo e consequentemente a produtividade (ANDRADE et al., 2016). Portanto, uma alternativa seria a remoção de proteínas da manipueira previamente a fermentação.
1.1 SURFACTINA
A surfactina é produzida por Bacillus sp., foi descoberta por Arima, Kakinuma e Tamura (1968). A surfactina possui estrutura cíclica (polar) - heptapeptídeo (L -Glu- L -Leu- D -Leu- L -Asp- L -Asp- D -Leu- L –Leu) é ligado a
uma cadeia ácido graxo β-hidróxi de cadeia carbônica variável (12 a 16 C), algumas modificações na sequência quiral dos resíduos de aminoácidos na cadeia peptídica é observada, a qual pode apresentar aminoácidos do grupo alifático como, Val, Leu e Ile nas posições 2, 4 e 7 (KAKINUMA; TAMURA; ARIMA, 1968; SOBERÓN-CHÁVEZ, 2010), surfactina com Ala na posição 4 também foi relatada (SOBERÓN-CHÁVEZ, 2010). A principal isoforma da surfactina está apresentada na Figura 1.
Figura 1. Principal isoforma da surfactina.
O mecanismo responsável pela síntese da surfactina é realizado por proteínas multi-enzimáticas chamadas de peptídeo sintetases não ribossômicas (NRPS), capazes de utilizar substratos não proteicos. A família da surfactina compreende aproximadamente 20 lipopetídeos distintos, essas variações podem estar associadas às condições da cultura como exemplo, as fontes de nutrientes (SOBERÓN-CHÁVEZ, 2010). Em geral, compostos biológicos de base proteica possuem resíduos de aminoácidos estereoisômeros L, enquanto que os resíduos de aminoácidos estereoisômero D não são comumente produzidos, sendo encontrados em apenas alguns peptídeos (NELSON; COX, 2014). A presença de D-aminoácidos na estrutura da surfactina pode influenciar as diferentes propriedades biológicas que ela possuiu.
Conhecida pela sua excepcional capacidade de formar emulsão e espuma, a surfactina é capaz de reduzir a tensão superficial da água de 72 para 27 mN.m-1 em uma concentração de aproximadamente 10 mg/L (ARIMA;
KAKINUMA; TAMURA, 1968; SOBERÓN-CHÁVEZ, 2010). Além de alterar as propriedades físicas/químicas de interfaces, a surfactina possui algumas atividades bioativas, como: atividade hemolítica (DUFOUR et al., 2005), antibacteriana, antiviral (KRACHT et al., 1999), antifúngica, anticancerígena, anti-inflamatória (ZHAO et al., 2017) e antimicoplasma (VOLLENBROICH; PAULI; MUHSIN, 1997).
A produção da surfactina ainda apresenta elevado custo de produção, dificultando sua aplicação em larga escala. Os custos para produção de um surfactante derivado da indústria petroquímica foi estimado em aproximadamente R$ 3,30 por kg (ANDRADE; PASTORE, 2017; MAKKAR; CAMEOTRA; BANAT, 2011). Atualmente o preço da surfactina comercializada pela Sigma Chemical Company é de aproximadamente R$ 184,40 por mg, ou seja, composto de alto valor agregado. A seleção de um meio de cultura para otimizar sua produção com baixos custos continua sendo um desafio (ISA; FRAZIER; JAUREGI, 2008). Uma alternativa para minimizar esses custos seria o emprego de resíduos agroindustriais que são uma rica fonte de nutrientes (BARROS et al., 2007). Além da redução dos custos de produção esses resíduos seriam aproveitados, podendo contribuir para a redução do impacto ambiental e a melhora da gestão de resíduos. A aplicação de processos que reduzam ou eliminem o uso de substâncias nocivas favorece o desenvolvimento de uma produção mais sustentável (green chemistry concept).
A surfactina produzida por B. subtilis LB5a utilizando manipueira como meio de cultivo foi relatada inicialmente por Nitschke et al., (2004). A produção foi realizada em pequena escala (erlenmeyer 250 mL) com 150 mL de volume de trabalho, biossurfactante foi recuperado por precipitação ácida com HCl 6 N (pH 2) overnight, onde foi observada uma produção de 2000 mg/L de biossurfactante bruto (NITSCHKE; PASTORE, 2004). Posteriormente uma produção em escala piloto (biorreator 80 L) com 40 L volume de trabalho foi descrita por Barros et al., (2008), o biossurfactante foi recuperado pela espuma (foam overflow) seguido de precipitação ácida e extração com solventes a concentração de biossurfactante obtida foi 680 mg/L. Além disso, foi reportado por Simiqueli (2014) a produção de surfactina usando manipueira como meio de cultura em modo contínuo. O bioprocesso contínuo foi realizado em biorreator de 7,5 L (volume de trabalho 4 L, 120 horas de fermentação), onde obteve-se uma produção de 1300 mg/L, após precipitação ácida e extração com solvente. Todas as determinações da concentração de surfactina foram realizadas indiretamente pela medida da tensão superficial. Recentemente, outra produção em biorreator 7,5 L (volume de trabalho de 3 L) reportou que a surfactina foi coletada pela espuma (foam overflow), posteriormente semi-purificada por precipitação ácida. O biossurfactante semi-purificado passou por
duas estratégias de UF e obteve-se um rendimento de 360 mg/L com 72 horas de fermentação (ANDRADE et al., 2016b).
Os estudos a serem desenvolvidos ainda visam o aumento de produtividade e melhorias nos processos de recuperação e purificação para que se possa tornar viável o emprego de manipueira para produção de biossurfactantes em escala industrial.
1.2 MANIPUEIRA
A mandioca (Manihot esculenta Crantz), pertence à família Euphorbiaceae, originária na América do Sul, popularmente conhecida como aipim ou macaxeira na região norte e nordeste e mandioca na região sul do Brasil (EMPRAPA, 2017). A família da Manihot esculenta Crantz é composta por cerca de 300 gêneros e 8.000 espécies, a raiz apresenta característica tuberosa, é rica em amido e pode produzir glicosídeos cianogênicos (LEBOT, 2009).
A mandioca é cultivada em mais de 100 países, incluindo algumas ilhas do pacífico, sua adaptabilidade em solos de baixa fertilidade, ácidos, com variações nos regimes pluviométricos e seu ciclo de crescimento flexível (capaz de ser produzida o ano todo) fez com que o cultivo difundisse por diversos países (LEBOT, 2009). A demanda por produtos de baixo custo e ricos em nutrientes que compõem principalmente a cesta básica da população de classe baixa também favoreceu a expansão da produção da mandioca, especialmente da farinha de mandioca (SEAB, 2015).
No panorama mundial a produção estimada de mandioca nos anos de 2015/16 foi de 281,1 e 288,4 milhões de toneladas respectivamente, apresentando um aumento na produção de 2,6% (FAO, 2016). Os três países que lideraram o ranking desta produção foram Nigéria, Tailândia e Brasil representando aproximadamente 38,1% do total produzido mundialmente (SEAB, 2015).
A mandioca é cultivada em todos estados brasileiros e se destina principalmente ao consumo na forma in natura, farinhas e féculas (ABAM, 2014). Os estados que possuem a maior produção são: Paraná (4.000 mil toneladas), Mato Grosso do Sul (968 mil toneladas) e São Paulo (1.326 mil
toneladas), sendo que a produção do Paraná além de favorecer a ascenção do parque industrial do estado contribui com cerca de 70% do total produzido de fécula no país (SEAB, 2015).
A expansão da produção da Manihot esculenta Crantz e seus derivados tecnológicos favorece a balança comercial bem como a composição da cesta básica da população de muitos países em desenvolvimento (ABAM, 2014; FAO, 2016; SEAB, 2015). No entanto, a indústria de processamento da mandioca acaba gerando grandes quantidades de resíduos tais como: resíduos sólidos (casca) e águas residuárias (manipueira) (TUMWESIGYE; OLIVEIRA; SOUSA-GALLAGHER, 2016). Manipueira é o resíduo obtido a partir da prensagem da massa triturada da raiz de mandioca já lavada e sem casca (CHISTÉ; COHEN, 2006). A produção da manipueira é estimada em cerca de 30% do peso da matéria prima (WOSIACKI; CEREDA, 2002). Assim, 730 mil toneladas foram destinadas para a produção de fécula em 2015, gerando aproximadamente 219 mil litros de manipueira (ABAM, 2014; SEAB, 2015).
Essa quantidade expressiva de resíduo agroindustrial é rica em macro-nutrientes (amido, açúcares, proteínas) e micro-nutrientes (fosforo, potássio, cálcio, magnésio, enxofre, ferro, zinco, manganês, cobre, boro, nitrato) (MARÓSTICA; PASTORE, 2007). É um potencial poluidor ambiental devido às altas concentrações de matéria orgânica (composição) bem como a presença de glicosídeos cianogênios como a linamarina (93%) e lataustralina (7%) (KUYUCAK; AKCIL, 2013; TUMWESIGYE; OLIVEIRA; SOUSA-GALLAGHER, 2016).
O cianeto tem capacidade de formar complexos com metais, por este motivo é tóxico aos seres humanos e animais. Ao complexar-se com o ferro da hemoglobina ele impede o transporte de oxigênio para as células causando sufocamento do indivíduo (KUYUCAK; AKCIL, 2013). A liberação do cianeto, a partir dos glicosídeos cianogênicos, é iniciada no momento em que o tecido vegetal da mandioca é rompido, favorecendo a ação de enzimas β-glicosidases (linamarase), a clivagem tem como produto glicose e α-hidroxinitrilas. As α-hidroxinitrilas quando hidrolisadas por enzimas podem ser transformadas em ânion cianeto ou ácido cianídrico (HCN) (KUYUCAK; AKCIL, 2013). Logo, devido ao potencial tóxico da manipueira é necessário o
tratamento desse resíduo agroindustrial (KUYUCAK; AKCIL, 2013; PATIL; PAKNIKAR, 2000).
No entanto, ele ainda contém grande quantidade de matéria orgânica que quando descartado em ambientes aquáticos afetam as formas de vida ali presentes (PATIL; PAKNIKAR, 2000). Neste contexto, as técnicas de gerenciamento de resíduos normalmente são de alto custo devido à necessidade de infraestrutura adequada para os tratamentos (físico-químicos). Esse cenário dificulta o tratamento de resíduos por indústrias de pequeno porte (GHOSHEH; BSOUL; ABDULLAH, 2005). Deste modo um grande desafio é o desenvolvimento de métodos de baixo custo e simples para realizar o tratamento adequado e/ou aproveitamento sem afetar negativamente o meio ambiente. Assim, uma alternativa para o aproveitamento da manipueira é seu emprego em processos biotecnológicos como fonte de carbono (ANDRADE et al., 2016b; NITSCHKE; PASTORE, 2006).
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar o efeito da presença das proteínas da manipueira na produção de surfactina por Bacillus subtilis LB5a, e consequente purificação da surfactina por UF.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Capítulo I:
Elaborar uma revisão bibliográfica sobre a utilização de resíduos agroindustriais e técnicas de recuperação usados durante os 50 anos de estudos da surfactina para sua produção.
Capítulo II:
Remover parcialmente as proteínas da manipueira antes da fermentação;
Produzir surfactina utilizando manipueira como meio de cultivo;
Estudar a cinética de crescimento na manipueira com baixo teor de proteínas;
Verificar o efeito da remoção de proteínas sobre a produção de surfactina;
Avaliar o efeito da remoção das proteínas no processo de UF - purificar a surfactina por UF.
REFERÊNCIAS
ABAM. Estatísticas Produção. [s.l: s.n.]. Disponível em: <http://www.abam.com.br/estatisticas-producao.php>. Acessado em: 20 Janeiro de 2018.
ANDRADE, C. J. DE et al. Ultrafiltration based purification strategies for surfactin produced by Bacillus subtilis LB5A using cassava wastewater as substrate. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, v. 91, n. 12, p. 3018–3027, 2016a.
ANDRADE, C. J. DE et al. Optimizing alternative substrate for simultaneous production of surfactin and 2 , 3-butanediol by Bacillus subtilis LB5a. Biocatalysis and Agricultural Biotechnology, v. 6, p. 209–218, 2016b.
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CHAPTER I
SURFACTIN FIFTY YEARS, HOW TO PRODUCE IT AT LOW COST
Aline Wasem Zanotto, Cristiano José de Andrade, Glaucia Maria Pastore
ABSTRACT
In 1968, Arima et al. discovered a heptapeptide known as surfactin, which belongs to a family of lipopeptides. Its non-ribosomal synthesis mechanism was later discovered (1991). Known for its ability to reduce surface tension, it also has biological activities such as, antimicrobial and antiviral. Lipopeptides represent an important class of surfactants, which can be applied in many industrial sectors such as food, pharmaceutical, fungicides, detergents and cleaning products. Currently, 75% of the surfactants used in the various industrial sectors are from the petrochemical industry. Nevertheless, there is a global current demands (green chemistry concept) for replace the petrochemical products by environmentally friendly products, such as surfactants by biosurfactants. In this sense, the biosurfactant production is costly. Thus, an alternative to reduce the production costs is the use of agro-industrial waste as a culture medium associated with an efficient and scalable purification process. This review put a light on the most promising agro-industrial residues that can be used to produce surfactin, and the techniques used for its recovery.
Keywords: Surfactin production, agro-industrial residue and surfactin purification, ultrafiltration.
1. INTRODUCTION
Surfactants are amphiphilic molecules composed of a hydrophilic and a hydrophobic moiety (KOSARIC; VARDAR-SUKAN, 2015). The simultaneous presence of polar and nonpolar groups in the structure of the surfactants allows these substances to diffuse over different polarities interfaces, reducing surface and interfacial tensions (VARJANI; UPASANI, 2017).
Biosurfactants can be produced by plants and microorganisms (KOSARIC; VARDAR-SUKAN, 2015). Microbial production of biosurfactants is mainly by bacteria, for example, Bacillus sp. known for the production of lipopeptides and Pseudomonas sp. for the production of rhamnolipids; although some fungi like Candida sp. and Pseudozyma sp. are well-known to produce biosurfactants such as sophorolipids and mannosylerithritol lipids, respectively (SOBERÓN-CHÁVEZ, 2010). Thus, microorganisms can be used to produce biosurfactants (environmentally friendly products), however about 75% surfactants applied in the most diverse industrial sectors are synthetic substances derived from petroleum (KARSA, 1999; MAKKAR; CAMEOTRA; BANAT, 2011).
Accord to their chemical structure, the biosurfactants can be classified into 5 groups (Figure 1): (I) lipopetides (II) glycolipids (III) phospholipids (IV) polymeric surfactants and (V) particulate surfactants (ANDRADE & PASTORE, 2017; NITSCHKE & PASTORE, 2002). The different chemical structures of the surfactants lead to specific micellar concentration critical (CMC) values and to different self-aggregation, for example, micellar, hexagonal, cubic and lamellar (Figure 1) (SOBERÓN-CHÁVEZ, 2010). The self-aggregation structure of biosurfactants depends on the intermolecular electrostatic interactions, polarity, ionic strength and temperature of the solvent (HOLMBERG et al., 2002; MAI; EISENBERG, 2012; YU et al., 2014).
Figure 1. Forms of self-aggregation of biosurfactants and their respective denomination of phase. Adapted from (HOLMBERG et al., 2002).
In terms of the application of biosurfactants, household detergents and cosmetic are the largest markets. Other promissing market (for biosurfactant application) is the food industry, mainly due to biosurfactants with biocidal properties such as, can used as preservative on fruits, vegetables and meat products (SHUKLA, 2017). In this sense, biosurfactants produced by Bacillus sp. can be used as emulsifiers in organophosphorus pesticide formulations (PATEL; GOPINATHAN, 1986). Another potential application of biosurfactants is bioremediation of petroleum contamination, which in laboratory scale showed good results in the removal of petroleum (EBADI et al., 2017).
Products derived from non-renewable resources may have their production limited due to use of these compounds in various industrial sectors. In addition, there is growing concern about environmental problems with the use of petroleum-derived surfactants. Therefore, it is necessary to advance on
surfactants of microbial origin production and purification (KARSA, 1999; SOBERÓN-CHÁVEZ, 2010). The interest for biosurfactants is due to their characteristics of compatibility with the environment, low toxicity, biodegradable and capable of being produced with agro-industrial residues and/or alternative nutrient source (NITSCHKE; PASTORE, 2002; WHANG et al., 2008).
1.1 MAIN EVENTS AFTER THE DISCOVERY OF SURFACTIN
One of the most promising biosurfactant microorganisms producer is Bacillus sp. isolated around decade 1949 and 1960, known for the production of the lipopetides family. This family has more 30 peptides that gather tree different families such as, iturin, fengycin and surfactin (ZHAO et al., 2017). These families have structural differences in the chain of fatty acids and peptide sequence (SOBERÓN-CHÁVEZ, 2010). The families of iturin and fengycin were discovered in 1949 and 1986, respectively (NISHIKIORI et al., 1986; WALTON; WOODRUFF, 1949).
Surfactin discovered after iturin, is a cyclic (polar) heptapeptide attached to a β-OH (lactone) fatty acid chain (12 to 16 C). Discovered in 1968 by Arima et al., produced by several Bacillus species (Figure 2). Different modifications in the chiral sequence of amino acids in the peptide chain can occur, amino acids of the aliphatic group, Val, Leu and Ile in positions 2nd, 4th
and 7th was already observed (KAKINUMA; TAMURA; ARIMA, 1968). Surfactin
with Ala at position 4th has also been reported (SOBERÓN-CHÁVEZ, 2010).
In 1991, Nakano et al., found out that the synthesis pathway of surfactin is by multi-enzymatic proteins called non-ribosomal peptide synthetases (NRPS), capable of using non-protein substrates. The surfactin family comprises approximately 20 different lipopetides these variations may be associated with the culture conditions as an example, the sources of nutrients (SOBERÓN-CHÁVEZ, 2010). Protein based biological compounds have amino acid residues L stereoisomers, while D stereoisomer amino acid residues are not commonly found, being in only a few peptides. D-amino acids in surfactin structure may influence the different biological properties that it possesses (NELSON; COX, 2014).
1st 2nd 3rd 4th 5th 6th 7th
Glu Leu Leu Ile Asp Leu Ile Glu Ile Leu Ile Asp Leu Ile Glu Leu Leu Ala Asp Leu Leu Glu Leu Leu Val Asp Leu Leu Glu Leu Leu Val Asp Leu Val
Figure 2. Chemical structure of surfactin.
Known for its exceptional emulsion and foam ability, surfactin can reduce water surface tension from 72 to 27 mN/m at a concentration of ≈10 mg/L (ARIMA; KAKINUMA; TAMURA, 1968). Besides altering the physical/chemical properties of the interfaces, surfactin has some bioactive activities, such as: hemolytic activity (DUFOUR et al., 2005), antibacterial, antiviral, antifungal, anticancer, inflammatory (ZHAO et al., 2017) and anti-mycoplasma (VOLLENBROICH; PAULI; MUHSIN, 1997).
Due to the high cost of surfactin production, is difficult to apply it at large scale. The costs for producing a surfactant derived from the petrochemical industry was estimated at US$ 1/lb (MAKKAR; CAMEOTRA; BANAT, 2011). Surfactin standard price marketed by Sigma Chemical Company is approximately US$ 62.75/mg (SIGMA-ALDRICH, 2018). From the economic point of view, when compared to chemical surfactants, surfactin is still not competitive.
The use of agro-industrial residues to produce surfactin has proven an economical alternative (ANDRADE et al., 2016a). However, culture medium is not the only cost in surfactin production, it represents only 30-50% of the total cost of production. In this review, we put a light on the newest approaches on the use of agro-industrial residues for the surfactin production and subsequent surfactin recovery and purification.
2. PRODUCTION OF SURFACTIN USING AGRO-INDUSTRIAL RESIDUES AS CULTURE MEDIUM
When incorrectly disposal, agro-industrial residue can causes environmental problems and for the welfare of humanity. Thus, an interesting strategy to reduce these environmental impacts is to use the agro-industrial residues as culture medium in biotechnological processes (ANDRADE et al., 2016a).
The advantage of the use of agro-industrial residues in biotechnological processes is due to its rich amount of organic matter, which contains all the macronutrients (proteins and carbohydrates) and micronutrients (minerals) that are essential for a microorganism grow and consequent production of high value-added compounds (ANDRADE et al., 2016b). Table 1, shows the residues used for the production of surfactin and the recovery techniques used.
Table 1. Agro-industrial residues applied on surfactin production with different strains of Bacillus, yields and recovery and purification techniques.
Agro-industrial waste Microorganism Yield Recovery and purification Reference
Cassava wastewater B. subtilis LB5a 0.3 – 3.0 g/L Acid precipitation; extraction with solvents;
ultrafiltration
(ANDRADE et al., 2016; NITSCHKE & PASTORE, 2004) Corn steep liquor B. subtilis #573 1.3 – 12.3 g/kg of CSL Acid precipitation;
extraction liquid-liquid
(GUDIÑA et al., 2015; VECINO et al., 2015)
Potato waste B. subtilis ATCC 21332 NQ. Acid precipitation (FOX & BALA, 2000)
Whey powder B. subtilis ATCC 6633 0.18 – 0.24 g/L Acid precipitation and extraction with solvents
(CAGRI-MEHMETOGLU, KUSAKLI, & VENTERT,
2012)
Okara B. pumilus
UFPEDA 448 126 – 359 mg/L Acid precipitation and extraction with solvents (SLIVINSKI et al., 2012) Glycerol B. subtilis LAMI009,
LBMI005, ATCC 6633
286.69, 441.06, 146 and 71 mg/L
Acid precipitation and extraction with solvents; adsorption
(ANDRADE et al., 2016; CRUZ et al., 2018; SOUSA et al., 2012) Cashew apple juice B. subtilis LBMI005 35 – 175 mg/L Acid precipitation and extraction with solvents (OLIVEIRA et al., 2013)
Rice straw
B. amyloliquefaciens
XZ-173
ND.*
Extraction with solvents and filtration 0.22 µm (ZHU et al., 2013)
Rapeseed meal 2.68 mg/gds**
Soybean flour 4.39 mg/gds**
Wheat bran 2.74 mg/gds**
Bean cake 2.18 mg/gds**
Corn meal 1.56 mg/gds**
Rice straw + Rapeseed
meal 3.26 mg/gds**
Rice straw + Soybean
flour 6.25 mg/gds**
Rice straw + Wheat
bran 3.47 mg/gds**
Rice straw + Bean cake 2.77 mg/gds**
Rice straw + Corn meal 2.61 mg/gds**
Rice straw + Soybean
Rice mil polishing B. subtilis MTCC 2423 4.17 g/kg of RMPR Foam fractionation and acid precipitation (GURJAR & SENGUPTA, 2015) Olive oil mill B. subtilis N1 and B.
subtilis DSM 3256 3.12 mg/L – 248.5 mg/L
Extraction liquid-liquid; acid precipitation and dialise
(MAASS et al., 2015; MOYA-RAMÍREZ et al.,
2015)
Olive oil mil hydrolized B. subtilis N1 5.1 – 13.7 g/L extraction liquid-liquid (RAMÍREZ et al., 2016) Sunflower oil B. amyloliquefaciens
SARCC 697 3.3 mg/L
Acid precipitation and extraction with solvents;
(NDLOVU, RAUTENBACH, KHAN,
& KHAN, 2017) Distillers’ grains B. amyloliquefaciens MT45 1.04 g/L Acid precipitation and extraction with
solvents; (ZHI, WU, & XU, 2017) Brewery wastewaters
B. subtilis KP7
6.6 mg/L
Acid precipitation; extraction with solvents; (PARASZKIEWICZ et al., 2018)
Beet molasses 77.9 mg/L
Apple peels extract 95.2 mg/L
Carrot peels extract 140.6 mg/L
Catla catla fish fat B. stratosphericus 41KF2a NQ. Acid precipitation; extraction with solvents;
(SANA, MAZUMDER, DATTA, & BISWAS,
2017) *NQ. not quantified; **gds - grams of dry substrates.
2.1 STARCH RICH RESIDUES
Cassava (Manihot esculenta Crantz) belongs to the family Euphorbiaceae, originating in South America, nowadays is cultivated in more than 100 countries around the Word (LEBOT, 2009). One concern in cassava processing is the amount of waste generated, is estimated that about 30% of the weight of the raw material is liquid waste (cassava wastewater). The cassava wastewater is generated from the pressing of the crushed mass of the cassava root (WOSIACKI; CEREDA, 2002).
Cassava wastewater possess large amounts of organic matter and many nutrients essential for the production of surfactin, making this residue an interesting alternative for surfactin production (NITSCHKE; PASTORE, 2004). Nitschke & Pastore (2004) reported surfactin production by B. subtilis LB5a using cassava wastewater as a culture medium in small-scale production (erlenmeyer 250 mL) with 150 mL working volume, followed by surfactin purification by acid precipitation, in which yield of 2,000 mg/L crude biosurfactant was reached. A pilot-scale production (80 L bioreactor) with 40 L work volume reported by Barros et al., (2008), in which surfactin was recovered by foam overflow followed by acid precipitation and solvent extraction, the yield of 680 mg/L was observed. In addition, Simiqueli (2014) reported the production of surfactin in continuous fermentation process using cassava wastewater. The continuous bioprocess realized in a 7.5 L bioreactor (4 L working volume). The continuous bioprocess mode reached 1,300 mg/L (120 hour fermentation) after acid precipitation and solvent extraction with. Another surfactin production in 7.5 L bioreactor (3 L work volume) reported the recuperation by foam overflow, then semi-purified biosurfactant (acid precipitation followed by solvent extraction) yielded 360 mg/L (ANDRADE et al., 2016).
Corn steep liquor, is a principal residue of corn starch production. Using corn steep liquor (10%) Gudiña et al., (2015) reported the production of surfactin by Bacillus subtilis #573 obtaining a yield of 1.3 g/L, when corn steep liquor was supplemented with metals such as iron, manganese and magnesium, which are cofactors of enzymes in surfactin synthesis, they obtained higher yields. The metals supplementation in corn steep liquor raised the yield to 4.823 g/L of surfactin (GUDIÑA et al., 2015). In another study using
corn steep liquor Vecino et al., (2015) obtained yielding 12.3 g of surfactin per kg of corn steep liquor.
Potato processing residue is another starch rich residue, Fox & Bala (2000) reported the potential of its use as culture medium with capability to reduce surface tension below 30 mN/m (quantification was not performed) after the fermentation process.
Among these residues, the more promising is cassava wastewater because some authores they got until 2,000 mg/L. The cassava wastewater residue is generated throughout the year because the production of cassava can be carried out on low fertility soils. Thus, the production of surfactin does not depend on the seasonality of the cultivar (Manihot esculenta Crantz). Already corn steep liquor and potato processing are dependent on planting and harvest periods. The use cassava wastewater associated with an easy scale-up recovery process with high purity would be extremely promising.
2.2 VEGETABLE OILS RESIDUES
Olive oil mill waste is a residue generated in olive oil extraction, frequently used extraction method for olive oil is the two-stage-process, which yields olive oil and the solid waste (alperujo). Alperujo is a paste with residual oil and high content of lignocellulosic material together with salts and residual oil (MOYA-RAMÍREZ et al., 2015). Moya-ramírez et al., (2015) using this residue produced 3.12 mg/L of surfactin with B. subtilis N1. Another study by Maass et al., (2015) with B. subtilis DSM 3256 had a yield of 248.6 mg/L. In order to improve surfactin productivity Ramírez et al., (2016), subjected olive oil mill to acid hydrolysis with high temperature (AH) and enzymatic hydrolyzate (EH) the yields raised from 3.12 mg/L without treatment to 5.1 and 13.7 g/L, respectively. The authors point out that acid hydrolysis it has formed toxic compounds resulting in a lower yield.
Using sunflower oil (3%) as a supplement on mineral medium Ndlovu et al., (2017) obtained 3.3 mg/L of surfactin using B. amyloliquefaciens SARCC 697.
In one study, the use of olive oil mill subjected the enzymatic hydrolyzate Alperujo provided higher yield (13.7 g/L of surfactin). However, the
production of olive oil depends on specific climatic conditions, and its restricted availability makes it difficult to surfactin production.
2.3 RESIDUES OF WHEY AND PROTEIN SUBSTRATES
Cheese production generate a large amount of residue (9L/Cheese kg), this residue known as whey is rich in protein and lactose. Cagri-Mehmetoglu, Kusakli, & Ventert (2012) using whey powder rehydrated at concentrations of 10, 15 and 20% rehydrated protein, obtained 0.23, 0.18 and 0.24 g/L of surfactin produced by B. subtilis ATCC 6633 for 72 h, respectively.
Another protein-rich (25%) residue okara solid residue is obtained during the production of soybean milk (SLIVINSKI et al., 2012). Slivinskie et al., (2012) using hydrolyzed and non-hydrolyzed okara supplemented with glycerol and sugarcane bagasse as a bulking agent for obtained 359 mg/L of surfactin for hydrolyzate and 126 mg/L for non-hydrolyzed, with B. pumilus UFPEDA 448.
Thus, between the residue of cheese production (whey) e soybean milk (okara), the okara was shown to be more promising for surfactin production, higher yields were obtained.
2.4 OTHER RESIDUES
Other residues already studied for surfactin production include glycerol from biodiesel production, cashew apple juice, rice straw, rapeseed meal, soybean meal, wheat bran, bean cake, corn meal, being brewery wastewaters (BW), beet molasses (M), apple peels extract (APE), carrot peels extract and catla catla fish fat.
Sousa et al., (2012) using a culture medium composed with 2% glycerol and micronutrients, produced 286.69 mg/L and 441.06 mg/L of surfactin using two different Bacillus strains (LAMI005 and LAMI009 respectively) (SOUSA et al., 2012). In other study Cruz et al., (2018) obtained 146 mg/L of surfactin in glycerol (5%) medium supplemented with 0.01 to 0.05 mM manganese, using the strain Bacillus subtilis ATCC 6633. The production with glycerol 10 g/L plus peptone 10 g/L, provided a yield of 71 mg/L (ANDRADE et al., 2016).
Cashew apple juice supplemented with different nutrients was tested by Oliveira et al., (2013), obtaining the highest surfactin production of 140 mg/L in media A (reducing sugars 46.24 g/L and (NH4)2SO4 1.0 g/L and 1% solution
of trace elements). Another apple residue studied, apple peels extract (APE) supplemented with yeast extract was tested by Paraszkiewicz et al., (2018) obtaining 95.2 mg/L of surfactin they also evaluated brewery wastewaters (BW), beet molasses (M) and carrot peels extract supplemented with yeast extract, obtained yields of 6.6 mg/L, 77.9 mg/L, and 140.6 mg/L, respectively using Bacillus subtilis KP7.
Chinese liquor manufacture generates Chinese liquor distillers' grains (DGS) which are distillation-fermented grains residue. Zhi et al., (2017) exploited DGS for the production of surfactin by B. amyloliquefaciens MT45, the strain was able to produce 1.04 g/L.
Zhu et al. (2013), testing different agro-industrial residues reported that rice straw and soybean meal was better for the production of lipopeptides compared to rapeseed meal, soybean meal, wheat bran, bean cake and corn meal. Thus, rice straw and soybean meal combination supplemented with glycerol (2.565%) is the best combination between the residues yielding 15.17 mg of surfactin/gds (grams of dry substrates) (ZHU et al., 2013). Another residue from rice production, rice mill polishing residue (RMPR) was also studied for surfactin production using foam recovery method Gurjar & Sengupta (2015) recupered 4.17 g/kg RMPR, using B. subtilis MTCC 2423 producer microorganism (GURJAR; SENGUPTA, 2015).
Catla catla fat a residue from fish processing was tested by Sana et al., (2017) to produce surfactin, however the authors did not quantify the yield, they only reported the CMC value of 46.8 mg/L (SANA et al., 2017).
Among these residues, the most promising for surfactin production is rice mil polishing residue with a yield of 4.17 g/kg rice mill polishing residue.
Some residues present do not have all nutrients for the microbial growth, thus, there is a need for the supplementation with sources of carbon and nitrogen (peptone and glucose) is necessary, as reported in this review in okara) (SLIVINSKI et al., 2012) and glycerol (CRUZ et al., 2018). Thus, with this review it was possible to observe that residues rich in starch, has more potential to produce surfactin than enriched supplemented medium.
However, all these residues are derived from food processing and their generation depends on the favorable conditions of cultivation of these foods.
3. RECOVERY AND PURIFICATION OF LIPOPEPTIDE: SURFACTIN
The purification process of biosurfactants is the most significant stage in economic aspect, accounting for approximately 60% of the production costs (SIVAPATHASEKARAN; RAMKRISHNA, 2017). The five most used approaches to recovery and purify surfactin are: (1) foam fractionation and acid precipitation (NITSCHKE; FERRAZ; PASTORE, 2004), (2) liquid-liquid extraction (hexane and ethyl acetate) (VECINO et al., 2015) (3) adsorption (CHEN; JUANG, 2008a) (4) ultrasonic assisted extraction (YUAN et al., 2012) and (5) ultrafiltration (ANDRADE et al., 2016). Most of these techniques generates large quantities of residues or uses organic solvents, affecting directly the purification costs. The only exception is ultrafiltration that does not generate residues and is organic solvent free (COUTTE et al., 2017).
3.1 ACID PRECIPITATION
The easiest and oldest technique for recovering lipopeptides is based on the acid precipitation of lipopeptides. In this technique, acid is added in the cell-free fermented broth, usually hydrochloric or sulfuric acid (6 or 10 N) until it reaches pH 2. To precipitate the lipopeptides, the broth stand at 4 °C overnight. In sequence the supernatant is removed by centrifugation and the lipopeptides in the precipitate are extracted with organic solvents such as methanol, chloroform, acetone, acetonitrile, hexane (CAGRI-MEHMETOGLU; KUSAKLI; VENTERT, 2012). The most used solvents are methanol and chloroform used to obtain high recovery rates. However, the recovered crude surfactant has low purity (50-55%), which make necessary additional purification techniques (CHEN; CHEN; JUANG, 2007).
3.2 FOAM FRACTIONATION
Foam fractionation is normally applied when foam formation occurs in the fermentation process, where the agitation generated using impeller and airflow favors foam formation and that can be collected by columns or traps (ALONSO; MARTIN, 2016). This technique works by the principle that soluble surface-active compounds can adsorb in gas-liquid interface layer, this allow foam formation by reducing the surface tension in gas-liquid interface (SILVA et al., 2015). Using foam column fractionation technique Gurjar & Sengupta, (2015) reported surfactin recovery rate of 69.2% produced in rice mill polishing residue (GURJAR; SENGUPTA, 2015).
3.3 ADSORPTION
Adsorption recovery method was only reported for surfactin produced in mineral medium and glycerol. This technique takes advantage of the properties of the biosurfactant, such as emulsion shape capacity and surface activity (CHEN et al., 2008). Chen & Juang (2008a) studied the adsorption on microporous polyvinylidene fluoride (PVDF) and desorption using n-hexane where they obtained a purity of 78%.The high initial concentration of surfactin in the broth affected adversely its recuperation, a concentrated solution provided a recovery of only 20% and using a 300 mg/L the recovery was 60%. Coupling with other techniques is necessary. For example, the cell-free broth was subjected to a two-stage ultrafiltration process whereby a purity of 76% was obtained, so an ion exchange adsorption process with Amberlite XAD-7 neutral resin (slightly polar ) with 98% recovery and 88% purity (CHEN et al., 2008).
Recently, macroporous adsorption resin column chromatography was used for separation of iturin, fengycin and surfactin directly from the cell free broth. This strategy was accomplished by simultaneously varying the solvent composition and pH of the mobile phase, purities up to 68.3% iturin, 77.6% fengycin and 91.6% surfactin (DHANARAJAN; RANGARAJAN; SEN, 2015).
3.4 EXTRACTION LIQUID-LIQUID
The extraction liquid-liquid is a process using immiscible liquids, in most cases the cell-free broth (water phase) and organic solvent, and the interest compound has more affinity with solvent phase. Using liquid-liquid extraction Chen & Juang (2008c) extracted surfactin with ethyl acetate and n-hexane obtaining a 99% and 59% extraction with 84% and 63% purity, respectively (CHEN & JUANG, 2008b). In other study Vecino et al., (2015) carried the extraction of surfactin produced in corn steep liquor with chloroform in a single stage. After extraction the chloroform was removed by rotary evaporation, the biosurfactant extract was dissolved in water with the aid of sonication, yielding 12.3 g of crude biosurfactant per kg of corn steep liquor.
The main problem of liquid-liquid extraction is the use of large amounts of solvents making it unfeasible for large-scale application (CHEN & JUANG, 2008b; VECINO et al., 2014).
3.5 ULTRAFILTRATION
Ultrafiltration (UF) is a membrane separation process, with a pore size range ranging from 0.01 μm to 0.1 μm (CHERYAN, 2000). Currently UF is the most promising technique for lipopeptide recovery due low costs and low scale-up complexity (ANDRADE et al., 2016; COUTTE et al., 2017). However, one problem in UF biosurfactant recovery is the low permeate flux and progressive flux reduction due to the concentration polarization mechanism and fouling, one way to minimize the problem is using cross flow UF (CHEN; CHEN; JUANG, 2008; RANGARAJAN; DHANARAJAN; SEN, 2014).
Surfactin micelles can be recuperated in the retentate and separated from low molecular weight compounds such as amino acids, mineral salts, organic acids, alcohols, small peptides and other small sub-products derived from metabolism (ANDRADE et al., 2016; JAUREGI et al., 2013). This is possible because surfactin molecules above their CMC associate to form supramolecular structures, such as micelles with diameters ranging from 5 to 105 nm, two to three times larger than their monomer units, which allows the the use of high molecular weight cut-off (MWCO) membranes to separate from
low molecular compounds (JAUREGI et al., 2013). When present in the form of monomers can permeate and separated from high molecular weight compounds such as proteins (ANDRADE & PASTORE, 2017). This interesting feature allowed the development of sequential purification strategies UF in two steps, using membranes with different MWCO (COUTTE et al., 2017; JAUREGI et al., 2013).
The two-step UF process with Amicon-Ultra 15 (regenerated cellulose) membranes with a MWCO of 30 and 10 kDa for UF-1 and UF-2 (50% methanol for destabilization) showed a yield of 96 ± 5% with purity greater than 90% (ISA et al., 2007). Isa et al., (2007) further measured the zeta potential for a better understanding of the effects on the interactions between surfactin and UF membrane structures. The authors concluded that surfactin in methanolic solution has a negative surface charge promoting the electrostatic repulsion between the surfactin molecules and the membrane that also has a negative charge.
Andrade et al. (2016) obtained 78.25% recovery of surfactin with 80% purity produced by Bacillus subtilis LB5a in cassava wastewater (bioreactor - 3 L work volume) using two stages UF purification process with Vivaspin 20 membrane (PES-100 and 50 kDa), combined with the acid precipitation. Surfactin micelle were separated in the retentate (100 kDa), then these aggregate were destabilized with 75% ethanol to separate them from proteins. After micelles destabilization, the broth of surfactin monomers and proteins, were passed to the second UF-stage (50 kDa) surfactin is present in the permeate.
Surfactin micelles may exhibit variations in their mean diameter depending on the concentration in the medium. Micelles with high concentrations of surfactin in the medium (500 mg/L) has a diameter of 10 nm, at lower concentrations (10 to 100 mg/L) the diameters range from 100 to 200 nm. The micelles formation occurs due to the intercellular hydrogen interactions that lead to the surfactin aggregates. In higher concentrations, the repulsive interactions are more intense that can impair the aggregates formation, that fact may justify the formation of different micellar sizes as a function of different concentrations (JAUREGI et al., 2013). Thus, the formation of micelles with larger diameters may favor their retention in the first stage of UF.
